Summary
Un metodo per ottenere nanofibre e nanostrutture complesse da proteine singole o multiple della matrice extracellulare è descritto. Questo metodo utilizza interazioni proteina-superficie per creare materiali a base di proteine-free-standing con la composizione sintonizzabile e l'architettura per l'uso in una vasta gamma di applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) nei tessuti è sintetizzato e assemblato da cellule formano un fibrillare 3D, rete proteina strettamente regolata con diametro delle fibre, composizione e organizzazione. Oltre a fornire supporto strutturale, le proprietà fisiche e chimiche del ECM svolgono un ruolo importante in diversi processi cellulari tra cui l'adesione, la differenziazione e apoptosi. In vivo, l'ECM è assemblato esponendo criptico autoassemblaggio (fibrillogenesi) siti all'interno di proteine . Questo processo varia per diverse proteine, ma fibronectina (FN) fibrillogenesi è ben caratterizzato e serve come sistema modello per il montaggio ECM cellulo-mediata. In particolare, le cellule utilizzano i recettori delle integrine sulla membrana cellulare per legare dimeri FN e le forze contrattili actomyosin generati a spiegare ed esporre siti di legame per il montaggio in fibre insolubili. Questo processo mediata dal recettore permette alle cellule di assemblare e organizzare la ECM dal cellulare alla SCA Tissueles. Qui, vi presentiamo un metodo denominato assembly superficie avviato (SIA), che riassume l'assemblaggio matrice cellulo-mediata tramite interazioni proteina-superficie a svolgersi proteine ECM e li assemblano in fibre insolubili. In primo luogo, le proteine ECM sono adsorbiti su un polidimetilsilossano idrofobo (PDMS), superficie dove si parte snaturano (spieghi) ed espongono domini di legame criptici. Le proteine ripiegate vengono poi trasferiti in ben definite micro-e nanostrutture attraverso la stampa microcontact su un poli termoreattiva (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) di superficie. Dissoluzione termicamente attivato il PIPAAm conduce al montaggio finale e il rilascio di nanofibre proteiche insolubili ECM e nanostrutture con geometrie ben definite. Architetture complesse sono possibili ingegneria definiti modelli sulle PDMS timbri utilizzati per la stampa microcontact. Oltre a FN, il processo SIA può essere utilizzato con laminina, fibrinogeno e collagene di tipo I e IV creare multicomponente ECM nanostrucTures. Così, SIA può essere utilizzato per progettare ECM materiali a base di proteine con un preciso controllo della composizione proteica, geometria fibre e architettura scaffold per ricapitolare la struttura e la composizione della ECM in vivo.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) nei tessuti è composto di proteine multifunzionali coinvolte nella regolazione chimici e fisici di processi cellulari multiple comprendenti adesione, proliferazione, differenziazione e apoptosi 1-3. L'ECM è sintetizzato, assemblato, e organizzato dalle cellule e le fibrille proteiche costituenti hanno composizioni uniche, dimensioni delle fibre, geometrie e architetture interconnesse che variano con il tipo di tessuto e stadio di sviluppo. Studi recenti hanno dimostrato che l'ECM può fornire indicazioni istruttive per guidare le cellule a formare tessuti ingegnerizzati 4, suggerendo che ricapitolando l'ECM in termini di composizione e struttura potrebbe consentire lo sviluppo di materiali biomimetici per applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.
Un certo numero di metodi di fabbricazione sono stati sviluppati per ingegnerizzare supporti polimerici che possono mimare aspetti della ECM nei tessuti. Ad esempio, elettrospinning e fase SEPARzione hanno entrambi dimostrato la capacità di formare matrici porose di fibre con diametri da decine di micrometri fino a decine di nanometri 5-7. Entrambe le tecniche hanno anche dimostrato che matrici altamente porosi di nanofibre possono supportare l'adesione cellulare e l'infiltrazione nel impalcatura 8. Tuttavia, questi approcci sono limitati nelle possibili geometrie fibre, orientamenti e 3D architetture che possono essere creati. Electrospinning produce tipicamente ponteggi con fibre orientate sia casuale o altamente allineati, mentre la separazione di fase produce ponteggi a fibre orientate in modo casuale. Vi sono inoltre limitazioni sui materiali, con i ricercatori in genere utilizzando polimeri sintetici, come poli (ε-caprolattone) 8 e acido poli (lattico-co-glicolico) 9, che vengono successivamente rivestite con proteine ECM per promuovere l'adesione cellulare. Biopolimeri naturali sono anche utilizzati, tra cui collagene di tipo I 10, gelatina 11, fibrinogeno 12,chitosano 13, 14 e seta, ma rappresentano solo un piccolo sottoinsieme di proteine trovate in tessuto nativo. La maggior parte dei tessuti contengono un grande ambiente di proteine ECM e polisaccaridi inclusi fibronectina (FN), laminina (LN), collagene di tipo IV e acido ialuronico che sono difficili o impossibili da realizzare nanofibre con metodi esistenti.
Per affrontare questa sfida, abbiamo concentrato i nostri sforzi di ricerca sul imitando il modo in cui le cellule sintetizzano, assemblare e organizzare le fibrille della proteina ECM nel loro ambiente. Mentre il processo fibrillogenesi specifico varia per differenti proteine ECM, tipicamente un cambiamento conformazionale nella molecola proteica ECM è attivata da un enzimatica o interazione recettore-mediata, che espone siti autoassemblaggio criptici. Qui usiamo FN come sistema modello per comprendere meglio il processo di fibrillogenesi. Brevemente, omodimeri FN legano ai recettori di integrina sulla superficie cellulare tramite la sequenza amminoacidica RGD nel 10 tipo IIRipeto unità. Una volta legato, le integrine si allontanano via actomyosin contrazione e si sviluppano i dimeri FN per esporre siti di self-assembly criptici. L'esposizione di questi siti di legame FN-FN permette ai dimeri FN per assemblare in un fibrille insolubili proprio sulla superficie cellulare 15. Lavori in sistemi cell-free ha dimostrato che criptici siti di legame FN-FN possono essere rivelati tramite dispiegarsi con denaturanti 16 o tensione superficiale a un-liquido-solido aria interfaccia 17-19. Tuttavia, le fibre FN creata di queste tecniche sono limitate a dimensioni e geometrie fibre specifiche e sono tipicamente legati ad una superficie.
Qui si descrive un chiamato assieme superficie avviato approccio (SIA) 20 che supera queste limitazioni utilizzando interazioni proteina-superficie per creare posa libera nanofibre insolubili, nanofabrics (fogli 2D) e altre nanostrutture composte da proteine ECM singoli o multipli (Figura 1 ). In questo process, proteine ECM vengono assorbiti da un compatto, conformazione globulare in soluzione e parzialmente denaturato (piegato) su una fantasia, polidimetilsilossano idrofobo (PDMS) timbro. Le proteine ECM vengono poi trasferiti in questo stato su un poli termoreattiva (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) superficie attraverso microcontact stampa 22. Quando idratato con acqua 40 ° C la PIPAAm rimane un solido, ma quando raffreddato a 32 ° C che passa attraverso una temperatura di soluzione critica inferiore (LCST) dove diventa idrofila, si gonfia con acqua e poi si dissolve, rilasciando le nanostrutture ECM assemblati off di la superficie. Il metodo SIA consente di controllare le dimensioni con precisione su scala nanometrica. Controllando parametri chiave quali la composizione, geometria fibra, e l'architettura, è possibile ricapitolare molte proprietà della ECM trovati in vivo e di sviluppare scaffold avanzate per applicazioni di ingegneria tissutale e biotecnologia.
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Protocol
1. Fabbricazione del Maestro Mold Uso Fotolito
- Le nanofibre proteiche ECM, nanofabrics e nanostrutture per essere fabbricati vengono prima progettati utilizzando Computer Aided Design (CAD). Questo file CAD viene trasferito in una fotomaschera. Il tipo di fotomaschera dipenderà dalla risoluzione delle caratteristiche; con una fotomaschera a base di trasparenza, adeguata per dimensioni caratteristiche fino a ~ 10 micron. Piccole caratteristiche <10 micron richiederà un cromata su fotomaschera vetro. Tutte le nanofibre e nanostrutture qui presentati sono stati fabbricati utilizzando un fotomaschera base di trasparenza, e quindi erano su scala nanometrica in spessore, ma le dimensioni non laterali.
Nota: È importante distinguere quali regioni del fotomaschera sarà buio (impedire alla luce UV per passare attraverso) e che sarà trasparente (permettono alla luce di passare attraverso UV) come questo, insieme con il tipo di photoresist (positivo o negativo) , detterà la topografia finale dello stampo master. - Per iniziare la fabbricazione dello stampo maestro, disidratare un wafer 4 "silicio ponendolo su piastra riscaldante impostato a 150 ° C per 15 min.
- Centrare il wafer sul mandrino vuoto di uno spin-verniciatura. Versare SU8-2015 fotoresist negativo sul centro del wafer e continuare versando in cerchi concentrici fino a circa due terzi del wafer è coperto.
Nota: conservare la bottiglia di SU8 vicino al wafer quando si versa per ridurre al minimo la formazione di bolle. - Programmare il spincoater come segue:
- Ciclo di diffusione: 500 rpm con una accelerazione di 100 giri / sec per 10 sec.
- Centrifuga: 4.000 rpm con una accelerazione di 100 giri / sec per 30 sec.
- Morbido cuocere il wafer ponendolo su piastra riscaldante impostato a 95 ° C per 3 min.
- Esporre il wafer con luce UV attraversola fotomaschera per un dosaggio totale di 140 mJ / cm 2.
Nota: SU8 è un photoresist negativo dunque regioni in cui la luce UV è in grado di passare attraverso il photomask rimarranno dopo lo sviluppo e diventare funzioni poste sullo stampo master. - Posta esposizione cuocere il wafer ponendolo su piastra riscaldante impostato a 95 ° C per 4 min.
- Sviluppare il wafer ponendolo in autore SU8 per 3 min. Dopo 3 minuti, risciacquare il wafer con alcol isopropilico. Se un film bianco viene prodotto durante il risciacquo, la cialda non è completamente sviluppato e dovrebbe essere riposto nello sviluppatore per altri 30 sec. Risciacquare con alcol isopropilico. Ripetere questo processo fino a quando un film bianco non si forma durante il risciacquo alcool isopropilico.
- Essiccare il wafer in un flusso di azoto e posto in una capsula di Petri da 150 mm a proteggere dalla polvere.
2. Rendere i PDMS Stamps
- Preparare il prepolimero PDMS combinando la base elastomero e induritore in un10:01 w rapporto / w. Tipicamente 80 g di base e 8 g di induritore vengono utilizzati per garantire il PDMS sufficienti a coprire lo stampo master in uno strato di 1 cm di spessore.
- Mescolare e degassarla PDMS utilizzando un mixer centripeta impostare la seguente:
- Mix: 2,000 rpm per 2 minuti
- Degas: 2,000 rpm per 2 min.
- Se un mixer non è disponibile mescolare i PDMS a mano per 10 minuti utilizzando un 10 ml pipetta sierologica. Degassarla miscela ponendolo in un essiccatore sotto vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle.
- Versare abbastanza prepolimero PDMS sullo stampo master (modellato wafer di silicio) per formare uno strato di 1 cm di spessore. Curare le PDMS dalla cottura a 65 ° C per 4 ore oa temperatura ambiente per 48 ore.
- Una volta indurito, Le regioni contenenti i modelli possono essere tagliate per formare le PDMS francobolli. Per distinguere il lato funzione dal retro del timbro PDMS, tagliare una tacca su uno degli angoli sul retro del timbro.
3. Microcontatto Printing Patterns ECM
- Pulire coprioggetto 25 millimetri di vetro del diametro di sonicazione in etanolo al 95% per 1 ora e poi asciugare in forno a 65 ° C.
- Preparare la soluzione sciogliendo PIPAAm PIPAAm in 1-butanolo ad una concentrazione del 10% (w / v, tipicamente 1 g in 10 ml).
- Centrare vetrino coprioggetti sulla morsa a vuoto dei spincoater e pipetta 200 microlitri della soluzione PIPAAm modo che l'intera superficie del vetro è coperta.
- Spincoat il vetrino a 6.000 rpm per 1 min.
- Pulire i PDMS Stamp mediante sonicazione in etanolo al 50% per 30 min e quindi asciugare sotto flusso di azoto.
Nota: Asciugatura e passi successivi devono essere eseguite in un armadio biosicurezza per mantenere la sterilità per le applicazioni in cui saranno utilizzati i nanostrutture ECM con le cellule. - Ricoprire la superficie modellata di ogni timbro PDMS con 200 ml di soluzione proteica, tipicamente 50 mg / ml in acqua distillata sterile per FN. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
Nota: Thè rivestimento volume è un timbro PDMS 1,5 centimetri 2 e dovrà essere regolato a seconda delle dimensioni del timbro PDMS, la proteina ECM utilizzato e la concentrazione della proteina ECM in soluzione. - Lavare i PDMS francobolli in acqua distillata per rimuovere l'eccesso di proteine e asciugare accuratamente sotto un flusso di azoto.
Nota: L'acqua a sinistra sul timbro attiverà lo scioglimento prematuro del rivestimento PIPAAm sul vetrino ed impedire il corretto trasferimento delle proteine. - Per la fabbricazione sterile, posizionare i coprioggetti PIPAAm rivestite all'interno di una scatola di Petri chiusa e sterilizzare con l'esposizione ai raggi UV, 45 minuti sotto la luce UV in un armadio biosicurezza è sufficiente. Se non è richiesta la sterilità questo passaggio può essere omesso.
- Eseguire la stampa microcontact posizionando il lato caratteristica del timbro PDMS in contatto con il coprioggetto PIPAAm rivestite. Se necessario, utilizzare pinze per toccare leggermente sul retro dei francobolli per rimuovere eventuali bolle d'aria e assicurare il contatto uniforme.
- Dopo 5 kmn, staccare il timbro PDMS dal vetrino.
- In questa fase, proteine ECM aggiuntivi possono essere configurate in modo da creare strutture più complesse e multicomponenti. Fino a 3 stampe sono state verificate per lavorare con questo processo, e più può essere fattibile.
4. Rilascio di ECM nanofibre e Nanostrutture
- Posizionare il vetrino rivestito PIPAAm modellato in una capsula di Petri 35 millimetri e controllare la fedeltà del modello usando la microscopia a contrasto di fase. A seconda del modello, una camera CCD può essere necessario risolvere le caratteristiche del modello. Microscopia a fluorescenza può anche essere utilizzato per controllare il pattern ottenute le proteine ECM sono fluorescente.
- Aggiungere 3 ml di acqua distillata a 40 ° C per capsula di Petri e consentire all'acqua di raffreddare gradualmente.
- La dissoluzione dello strato PIPAAm e il rilascio dei modelli proteici ECM possono essere monitorati con microscopio a contrasto di fase. Se l'applicazione non consente l'utilizzo di tec otticahniques, il rilascio può essere monitorato misurando la temperatura della soluzione. Tipicamente, l'acqua viene raffreddata a temperatura ambiente, ben al di sotto di LCST PIPAAm (32 ° C), per garantire le nanostrutture proteiche ECM sono stati rilasciati.
- Dopo il rilascio, le nanofibre, nanofabrics e altre nanostrutture sono galleggianti in acqua. Per usarli per ulteriori applicazioni hanno bisogno di essere manipolato. L'approccio esatto dipenderà dell'obiettivo sperimentale e può includere passaggi come immobilizzare su un'altra superficie, muovendosi con un sistema micromanipolatore o incorporare in un idrogel.
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Representative Results
SIA è in grado di ingegneria ECM nanofibre proteiche con un controllo preciso sopra le dimensioni di fibre. Per dimostrare questo, matrici di nanofibre FN con dimensioni planari di 50 x 20 micron sono stati modellati su un vetrino PIPAAm rivestita (Figura 2A). Al rilascio, le fibre contratte perché erano sotto un pre-sollecitazione inerente quando modellata sulla superficie PIPAAm (Figura 2B). Analisi delle nanofibre FN ha rivelato che erano monodispersa pre-release, con una lunghezza media di 50,19 ± 0,49 micron e una larghezza di 19,98 ± 0,17 micron (Figura 2C). Nonostante contrarre sensibilmente, fibre FN post-rilascio erano ancora monodispersa con una lunghezza media di 14,15 ± 0,92 micron e una larghezza di 2,65 ± 0,32 micron (Figura 2D). Microscopia a forza atomica fornito risoluzione prospettiva più elevata delle fibre variazioni dimensionali associati al processo di rilascio SIA. In particolare, le fibre pre-release avevanouno spessore uniforme di ~ 5 nm (Figura 2E) mentre le fibre, dopo l'emissione aveva uno spessore eterogeneo dell'ordine di diverse centinaia di nanometri (Figura 2F).
Utilizzando il processo SIA è possibile progettare una varietà di proteine ECM nanostrutture con dimensioni sintonizzabile, forma e composizione (Figura 3). Ad esempio, nanofibre FN inizialmente 20 micron di larghezza e 1 cm di lunghezza sono stati modellati su un vetrino PIPAAm rivestite. Su raffreddamento e PIPAAm scioglimento delle nanofibre sono stati rilasciati formare lunghi fili (Figura 3a). Inoltre, poiché il modello è definito dalla topografia superficiale del timbro PDMS utilizzato per la stampa microcontact, è possibile progettare complesse nanostrutture proteine ECM. Come proof-of-concept, abbiamo creato multi-armati FN stelle che hanno conservato la loro forma generale dopo il rilascio (Figura 3B). È interessante notare che, tra le braccia della stella FN contratti come le nanofibre, mail corpo della stella mantenuto la sua dimensione. Mentre FN è importante, abbiamo anche voluto dimostrare che SIA funziona con altre proteine ECM come LN e che più proteine ECM possono essere incorporati nella stessa struttura. Ad esempio, abbiamo costruito un nanofabric 2-D composto da nanofibre ortogonali e interconnesse di FN e LN in una matrice reticolo quadrato (Figura 3C). Pre-rilasciare le nanofibre FN erano 20 micron di larghezza e le nanofibre LN erano 50 micron di larghezza. Dopo il rilascio entrambi i tipi di nanofibre contratto, ma l'interconnettività e la struttura reticolo quadrato è stata mantenuta. Questi risultati dimostrano che SIA può essere utilizzato per progettare materiali ECM con una varietà di composizioni e strutture.
Le istanze di fallito SIA di nanofibre ECM sono mostrati in Figura 4. Una causa è improprio rilascio di un modello incompleto a causa della scarsa trasferimento di proteine ECM alla superficie PIPAAm durante la stampa microcontact (Figura 4A). La presenza di fori, bordi irregolari, e altri difetti creerà nanofibre e nanostrutture che sono incompleti e incline alla rottura e frammentazione al momento del rilascio. Rapido scioglimento della PIPAAm può anche causare una cattiva modello di fedeltà dopo il rilascio (Figura 4B). Ad esempio, utilizzando temperatura ambiente di 20 ° C acqua deionizzata già al di sotto della LCST di PIPAAm invece di 40 ° C l'acqua causerà il PIPAAm a gonfiarsi e dissolversi rapidamente. Ciò può causare due problemi; (I) la rapida espansione può strappare a parte alcuni nanofibre ECM e (ii) la rapida espansione può causare la rottura della disposizione di modello dopo il rilascio.
Figura 1. Schema del processo SIA. (A) Un wafer di silicio è spincoated con SU8 photoresist negativo ed esposto alla luce UV attraverso una fotomaschera. Regioni non esposte vengono sviluppate via lasciando un m topograficamente fantasia stampo aster. (B) PDMS prepolimero viene versato sopra lo stampo master e vulcanizzato per 4 ore a 65 ° C. (C) Dopo la vulcanizzazione, un timbro PDMS è tagliato. (D) il punzone viene poi incubata con una soluzione proteica ECM dove le proteine assorbono il timbro in una conformazione parzialmente spiegato. (E) Il timbro viene risciacquato per rimuovere le proteine in eccesso, secca, e messo in contatto conforme con un vetrino di vetro PIPAAm rivestito. (F) Il francobollo viene quindi rimosso lasciando modellata proteina ECM sul vetrino PIPAAm spalmati, il modello è dettata dalla topografia del timbro. (G) Il vetrino viene quindi posto in una capsula di Petri e coperto con 40 ° C acqua e quindi raffreddata sotto del LCST di PIPAAm (~ 32 ° C), che innesca lo scioglimento del PIPAAm e la liberazione di assemblate nanofibre proteiche ECM e / o nanostrutture dalla superficie.
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Figura 2. Usando SIA di ingegnerizzare popolazioni di nanofibre monodisperse. (A) Matrice di rettangoli FN, 50 micron di lunghezza e 20 micron di larghezza sono stati modellati sulla superficie PIPAAm. (B) aggiunta di 40 ° C acqua deionizzata e successivo raffreddamento sotto la LCST del PIPAAm innescato la dissoluzione PIPAAm e il rilascio dei nanofibre FN. Dopo il rilascio, le fibre contratte come sono sotto un pre-stress quando modellata sulla superficie PIPAAm. (C) Analisi di dimensioni nanofibre pre-release rivela le fibre sono monodisperse con una lunghezza e larghezza di 50,19 ± 0,49 micron e 19,98 ± 0,17 micron, rispettivamente. (D) Dopo il rilascio delle nanofibre contratta ma è rimasto monodispersa con una lunghezza di post-rilascio e la larghezza di 14.15 ± 0.92 micron e 2,65 ± 0,32 micron, rispettivamente. (E) AFM ha mostrato che le nanofibre pre-releaseerano spessore ~ 5 nm. (F) AFM di nanofibre post-rilascio ha mostrato che lo spessore era aumentato a diverse centinaia di nanometri, mentre la lunghezza e la larghezza sono diminuite. -Scale bar sono (A) 50 pm e (B) 10 micron.
Figura 3. Usando SIA per progettare ECM nanofibre proteiche e nanostrutture con dimensioni sintonizzabile, forma e composizione. (A) nanofibre FN sono stati modellati su un vetrino PIPAAm rivestito di 1 cm di lunghezza e 20 micron di larghezza. Rilascio termico ha portato alla SIA di lunghe nanofibre FN intatti con una larghezza ridotta di circa 3 micron. (B) Un esempio di un più complesso stella FN multi-armati, rappresentativi delle diverse nanostrutture che possono essere creati usando SIA. Sganciatore termico provocato la contrazione delle braccia ma non la regione centrale della stella, in cui i bracci uniti. (C) È altresìpossibile integrare più proteine ECM nella stessa struttura. Ad esempio, ortogonale, interconnessi 20 micron di larghezza linee di FN (rosso) e 50 micron di larghezza linee di LN (verde) linee integrate in un nanofabric 2D fosse modellato e poi rilasciato. Anche dopo il rilascio, il modello ha mantenuto la sua geometria iniziale e interconnettività. Barre di scala sono 50 micron.
Figura 4. Esempi di problemi che potrebbero impedire la corretta SIA e il rilascio di proteine dalla superficie PIPAAm. (A) Scarso stampa microcontact di proteine ECM sui risultati PIPAAm di frammentazione e di altri difetti di un micron di larghezza linea 20 FN impedisce la SIA di una continua FN nanofibre e invece provoca la formazione di molti frammenti più piccoli FN. (B) liberando rapidamente le nanofibre FN dal substrato PIPAAm possono anche influenzare la disposizione della fibra finale. In questo caso l'acqua unat 20 ° C, già al di sotto della LCST di PIPAAm, è stata aggiunta e innescato la rapida dissoluzione causando le nanofibre di scattare indietro, pausa (30 sec) e formano casuale, le configurazioni non organizzate (52 sec). Barre di scala sono 50 micron.
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Discussion
Il metodo SIA presentato qui imita assemblaggio matrice cellulo-mediata e consente la progettazione di ECM nanofibre proteiche e nanostrutture con dimensioni sintonizzabile, l'organizzazione e la composizione. Anche se non identica alla ECM cellule generate, SIA crea ECM composto da nanoscala fibrille della proteina 20 che subiscono piegatura reversibili / spiegamento durante sollecitazioni meccaniche 21 e possono legarsi cellule 20. Ciò fornisce una capacità unica di costruire ECM materiali proteici che ricapitolano molte proprietà della ECM trovati in vivo. Ad esempio, nanofibre ECM possono essere fabbricate in lunghezze fisse con un livello di controllo fattibile con altre tecniche. Dimostriamo la possibilità di creare array di nanofibre monodispersi (Figura 2) con controllo preciso della lunghezza e larghezza pre-release (Figura 2C) e post-rilascio (Figura 2D). Questi nanofibre ECM possono essere di qualsiasi lunghezza, come dimostrato dalla fabbricazione FN nanofibre in ~ 1 centimetro di lunghezza (Figura 3a). Al contrario, altre tecniche di fabbricazione quali elettrospinning e separazione di fase possono creare nanofibre ma non con il controllo preciso della lunghezza, producendo prevalentemente fibre continue. Queste tecniche sono anche limitati nelle geometrie fibra e organizzazione all'interno di un ponteggio. SIA può essere utilizzato per costruire nanostrutture ECM con geometria planare arbitraria, come una stella (Figura 3B), e in fogli 2-D con controllo arbitrario di organizzazione fibre, come per esempio un nanofabric (Figura 3C). Inoltre, altri metodi di fabbricazione in genere utilizzano materiali sintetici o solo un numero limitato di quelle naturali quali chitosano e fibrina. In confronto, SIA consente il montaggio di nanofibre e nanostrutture composte completamente di proteine ECM come FN e LN, che non può essere fabbricato con questi metodi.
Il passo fondamentale nel processo di SIA è il rilascio termicamente innescato da thsuperficie e PIPAAm. Per garantire il corretto rilascio, ci sono alcuni passaggi chiave che dovrebbero essere considerati. In primo luogo, dopo la fase di stampa microcontact, la fedeltà del modello ECM trasferito deve essere controllato sia usando la microscopia a contrasto di fase o microscopia a fluorescenza (se le proteine ECM sono contrassegnati fluorescente). Se ci sono difetti nel reticolo proteina sulla superficie PIPAAm, poi il successivo rilascio produrrà nanostrutture che contengono questi difetti (come osservato nella Figura 4A). Se un timbro PDMS produce ripetutamente profili proteici con difetti, è probabile che il lato micropatterned del timbro PDMS è stato graffiato o contiene difetti e un nuovo timbro e potenzialmente un nuovo stampo maestro deve essere fatta. Inoltre, la cura dovrebbe essere presa quando idratando la proteina fantasia, coprioggetto PIPAAm rivestite. L'acqua deve essere in prossimità o 40 ° C e viene lasciato raffreddare lentamente. Se l'acqua non è abbastanza caldo o si raffredda troppo rapidamente, il PIPAAm si gonfiano unnd dissolvono troppo velocemente causando le nanofibre proteiche ECM e nanostrutture per essere potenzialmente lacerato dalle forze e casaccio rilasciato tale che qualsiasi organizzazione strutturale simile a secco, stato di pre-released andrà persa (Figura 4B).
Nanofibre proteiche ECM, nanostrutture e nanofabrics assemblati utilizzando SIA hanno molte applicazioni in biomeccanica, l'ingegneria dei tessuti, e le biotecnologie. Ad esempio, recenti evidenze indicano che le proprietà meccaniche di ECM fibrille proteiche regoleranno la loro funzionalità biologica 23. SIA è ideale per creare ECM nanofibre proteiche in forma purificata per l'analisi meccanica. Per eseguire questi esperimenti, rilasciati nanofibre proteiche ECM possono essere manipolati tramite micropositioners di precisione e poi allungati. Deravi et al hanno recentemente utilizzato questo approccio per dimostrare che le nanofibre FN in grado di sopportare fino a estensioni 8-fold e che subiscono elastica, plastica e st-pioggia irrigidimento regimi con tensioni crescenti 21. In ingegneria tissutale, proteine ECM ponteggi riferiscono in forma di gel (per esempio, collagene di tipo I e fibrina) o tessuti decellularized 4 sono ampiamente utilizzati. Rispetto a queste tecniche, il vantaggio di SIA è la capacità di progettare scaffold con un'architettura ben definita in fibre 1-D e 2-D fogli (Figura 3C). Ad esempio, abbiamo già dimostrato che i cardiomiociti possono essere seminate su nanofibre FN per formare filoni funzionali del muscolo cardiaco 20. Ciò dimostra che le nanofibre FN sono vincolanti cellule e che possono dirigere l'assemblaggio anisotropo di celle in strutture tissutali allineati. Le nanofabrics 2-D possono riprodurre la struttura e composizione laminare della membrana basale per l'applicazione nell'ingegneria dei tessuti epiteliali ed endoteliali. Inoltre, stiamo sviluppando nuovi modi per distribuire queste nanofibre ECM e nanofabrics in 3-D incorporandoli all'interno di matrici di idrogel.Dal processo descritto in questo articolo, è possibile utilizzare SIA di ingegnerizzare ECM a base di proteine, materiali nanostrutturati per un'ampia varietà di applicazioni.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Il sostegno finanziario è stato fornito a JMS dal NIH Biomeccanica in Medicina Rigenerativa Training Program T32 (2T32EB003392), per QJ dal Dowd-ICES Fellowship e AWF da New Innovator Award del direttore NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
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