Summary
En metod för att få nanofibrer och komplexa nanostrukturer från en eller flera extracellulära matrixproteiner beskrivs. Denna metod använder interaktioner protein-yta för att skapa fristående proteinbaserade material med avstämbara sammansättning och arkitektur för användning i en mängd olika vävnadstekniska och biotekniska tillämpningar.
Abstract
Den extracellulära matrix (ECM) i vävnader syntetiseras och monteras av celler för att bilda en 3D fibrillärt, proteinnätverk med hårt reglerad fiberdiameter, sammansättning och organisation. Förutom att ge strukturellt stöd, de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos ECM spelar en viktig roll i flera cellulära processer, inklusive vidhäftning, differentiering och apoptos. In vivo, är ECM monteras genom att exponera kryptiska självorganisering (fibrillogenes) platser inom proteiner . Denna process varierar för olika proteiner, men fibronektin (FN) fibrillogenes är väl karakteriserade och fungerar som ett modellsystem för cellmedierad ECM församling. Specifikt celler använder grin receptorer på cellmembranet att binda FN dimerer och aktomyosin genererade sammandragande krafter att utvecklas och exponera bindningsställen för montering i olösliga fibrer. Denna receptormedierad process möjliggör celler att montera och organisera ECM från den cellulära till vävnad scales. Här presenterar vi en metod som kallas yta initierad församling (SIA), vilket recapitulates cellmedierad matris montering med interaktioner protein-yta för att veckla ut ECM-proteiner och sätta ihop dem till olösliga fibrer. Först är ECM-proteiner adsorberas på en hydrofob polydimetylsiloxan (PDMS) ytan där de delvis denaturera (utvikt) och exponera kryptiska bindande domäner. Ovikt proteinerna överförs sedan i väldefinierade mikro-och nanopatterns genom microcontact utskrift på en värmekänsliga poly (N-isopropylakrylamid) (PIPAAm) yta. Värme utlöst upplösning av PIPAAm leder till slutmontering och frisättning av olösliga ECM proteinnanofibrer och nanostrukturer med väldefinierade geometrier. Komplexa arkitekturer är möjligt genom ingenjörs definierade mönster på PDMS stämplar som används för microcontact utskrift. Förutom FN kan SIA processen användas med laminin, fibrinogen och kollagener typ I och IV för att skapa flerkomponent ECM nanostrucrer. Sålunda kan SIA användas för att konstruera ECM proteinbaserade material med exakt kontroll över proteinkompositionen, fibergeometri och scaffold arkitektur för att rekapitulera strukturen och sammansättningen av ECM in vivo.
Introduction
Den extracellulära matrisen (ECM) i vävnader som består av multifunktionella proteiner involverade i fysiska och kemiska regleringen av flera cell processer inkluderande adhesion, proliferation, differentiering och apoptos 1-3. ECM syntetiseras, monteras, och organiseras av celler och de ingående protein fibriller har unika sammansättningar, fiberstorlek, geometrier och sammankopplade arkitekturer som varierar med vävnadstyp och utvecklingsstadiet. Senaste arbete har visat att ECM kan ge läro ledtrådar för att vägleda celler för att bilda manipulerade vävnader 4, vilket tyder på att rekapitulera ECM när det gäller sammansättning och struktur kan möjliggöra utvecklingen av biomimetiska material för vävnadstekniska och biotekniska tillämpningar.
Ett antal fabrikationsmetoder har utvecklats för att modifiera polymerställningar som kan imitera aspekter av ECM i vävnader. Exempelvis electrospinning och fas separation har båda visat förmåga att bilda porösa matriser av fibrer med diametrar som sträcker sig från tiotals mikrometer ner till tiotal nanometer 5-7. Båda teknikerna har också visat att mycket porösa matriser av nanofibrer kan stödja celladhesion och infiltration i ställningen 8. Emellertid är dessa metoder begränsade i de möjliga fiber geometrier, riktlinjer och 3D-arkitekturer som kan skapas. Electro producerar typiskt scaffolds med antingen slumpmässigt orienterade eller är mycket inriktade fibrer medan fasseparation producerar scaffolds med slumpmässigt orienterade fibrer. Det finns också begränsningar på de material, med forskare typiskt med användning av syntetiska polymerer, såsom poly (ε-kaprolakton) 8 och poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) 9, som därefter beläggs med ECM-proteiner att främja cellvidhäftning. Naturliga biopolymerer kan också användas, innefattande kollagen typ I 10, gelatin 11, fibrinogen 12,chitosan 13, och siden 14, men utgör endast en liten delmängd av de proteiner som finns i naturlig vävnad. De flesta vävnader innehåller en större miljö av ECM-proteiner och polysackarider inklusive fibronektin (FN), laminin (LN), kollagen typ IV och hyaluronsyra, som är svåra eller omöjliga att tillverka nanofibrer med användning av befintliga metoder.
För att möta denna utmaning har vi fokuserat vår forskning på att härma hur celler syntetisera, montera och organisera ECM protein fibriller i sin omgivning. Medan den specifika fibrillogenes processen varierar för olika ECM-proteiner, typiskt en konformationsförändring i ECM proteinmolekyl utlöses genom en enzymatisk eller receptorförmedlad interaktion, vilket exponerar kryptiska självmontering sajter. Här använder vi FN som ett modellsystem för att bättre förstå fibrilogenes processen. Kortfattat, FN homodimerer binder till integrin-receptorer på cellytan via RGD-aminosyrasekvensen i 10. Typ IIJag upprepar enhet. När bundna, de integriner flyttar isär via aktomyosin kontraktion och vika upp FN dimerer att exponera kryptiska självmonteringsplatser. Exponeringen av dessa FN-FN bindningsställen gör det möjligt för FN dimerer att montera in en olöslig ROTHÅR rätt på cellytan 15. Arbete i cellfria system har visat att kryptiska FN-FN-bindningsställen kan avslöjas genom utfällning med användning av denatureringsmedel 16 och ytspänning vid en luft-vätska-fastmaterial-gränssnitt 17 till 19. Men de FN fibrerna som skapats av dessa tekniker begränsade till vissa fiberstorlekar och geometrier och är vanligtvis bundna till en yta.
Här beskriver vi en metod som går under benämningen yta initierad enheten (SIA) 20 som övervinner dessa begränsningar genom att utnyttja interaktioner protein-yta för att skapa fritt stående olösliga Nanofiber, nanofabrics (2D-ark) och andra nanostrukturer som består av enstaka eller flera ECM-proteiner (figur 1 ). I detta process, är ECM-proteiner adsorberas från en kompakt, klotformiga konformation i lösning och delvis denatureras (ovikt) på en mönstrad, hydrofob polydimetylsiloxan (PDMS) stämpel. The ECM-proteiner överförs sedan i detta tillstånd på en värmekänsliga poly (N-isopropylakrylamid) (PIPAAm) yta genom microcontact printing 22. När hydratiserades med 40 ° C vatten i PIPAAm förblir ett fast ämne, men när de kyls till 32 ° C, den passerar genom en lägre kritisk lösningstemperatur (LCST) där den blir hydrofil, sväller med vatten och därefter upplöses, vilket frigör de hopsatta ECM-nanostrukturer av av ytan. SIA-metoden ger kontroll över dimensionerna med nanometerskala precision. Genom att styra nyckelparametrar såsom sammansättning, fibergeometri och arkitektur, är det möjligt att sammanfatta många egenskaper hos ECM hittats in vivo och för att utveckla avancerade ställningar för vävnadstekniska och biotekniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av master Mold Använda Fotolitografiska
- De ECM protein Nanofiber, nanofabrics och nanostrukturer som ska tillverkas är först utformade med hjälp av Computer Aided Design (CAD). Denna CAD-fil överförs sedan till en fotomask. Den typ av fotomasker beror på upplösningen av funktionerna; med en öppenhet baserad fotomask tillräcklig för funktionen storlekar ner till ~ 10 mikrometer. Mindre funktioner <10 mikrometer kommer att kräva en krom på glas fotomasker. Samtliga Nanofiber och nanostrukturer som presenteras här tillverkades med hjälp av en öppenhet baserad fotomask, och därmed var nanometerskala i tjocklek, men inte sidomått.
OBS: Det är viktigt att skilja på vilka områden av fotomasken blir mörkt (förhindra UV-ljus att passera) och som kommer att vara transparent (tillåta UV-ljus för att passera igenom) som detta, tillsammans med den typ av fotoresist (positiv eller negativ) , kommer att diktera den slutliga topografin för master mold. - För att börja tillverkning av den huvudsakliga gjutformen, dehydratisera en 4 "kiselskiva genom att placera den på en värmeplatta inställd på 150 ° C under 15 min.
- Centrera rånet på vakuum chuck med spinn-bestrykare. Häll SU8-2015 negativ fotoresist på mitten av skivan och fortsätta att hälla i koncentriska cirklar tills ungefär två tredjedelar av skivan är täckt.
Anmärkning: Behåll flaska SU8 nära skivan när hälla för att minimera uppkomsten av bubblor. - Programmera spincoater enligt följande:
- Spread cykel: 500 rpm med en acceleration på 100 rpm / sek till 10 sek.
- Centrifugering: 4000 rpm med en acceleration på 100 rpm / sek till 30 sek.
- Mjuk baka rånet genom att placera den på en värmeplatta inställd på 95 ° C i 3 min.
- Exponera wafern med UV-ljus genomfotomasken för en total dos av 140 mJ / cm 2.
OBS: SU8 är en negativ fotoresist därför områden där UV-ljus kan passera genom fotomasken kvar efter att utveckla och bli upphöjda funktioner på master mögel. - Efter exponering baka rånet genom att placera den på en värmeplatta inställd på 95 ° C under 4 min.
- Utveckla wafern genom att placera den i SU8 utvecklare för 3 min. Efter 3 minuter, skölj wafern med isopropylalkohol. Om en vit film produceras under sköljning, är skivan inte är fullt utvecklad och det bör placeras tillbaka i framkallaren för en annan 30 sek. Skölj igen med isopropylalkohol. Upprepa processen tills en vit film inte utgör under isopropylalkohol sköljning.
- Torka oblat i en ström av kväve och placera i en 150 mm petriskål för att skydda mot damm.
2. Göra PDMS stämplar
- Förbered PDMS prepolymer genom att kombinera elastomer bas och härdare i en10:01 vikt / vikt-förhållande. Typiskt 80 g bas och 8 g härdare används för att se till att det finns tillräckligt med PDMS för att täcka huvud mögel i ett 1 cm tjockt lager.
- Blanda och avlufta PDMS med en centripetal blandare inställd på följande:
- Mix: 2000 rpm under 2 min
- Degas: 2000 rpm under 2 min.
- Om en bländare är inte tillgänglig blanda PDMS för hand under 10 min med användning av en 10 ml serologisk pipett. Avgasa blandningen genom att placera den i en vakuumexsickator under 30 min för att avlägsna bubblor.
- Häll tillräckligt PDMS prepolymer över huvudsakliga gjutformen (mönstrade kiselskiva) för att bilda en 1 cm tjockt skikt. Bota PDMS genom bakning vid 65 ° C i 4 h eller vid rumstemperatur under 48 timmar.
- Efter härdning, kan Regionerna innehåller mönstren skäras ut för att bilda PDMS frimärken. För att skilja funktionen sidan från baksidan av PDMS stämpeln, skär en skåra av ett av hörnen på baksidan av stämpeln.
3. Microcontact Printing av ECM Mönster
- Rengör glas 25 mm diameter täck genom ultraljudsbehandling i 95% etanol i 1 timme och därefter torka i en ugn 65 ° C.
- Förbered PIPAAm lösning genom att lösa PIPAAm i 1-butanol vid en koncentration av 10% (vikt / volym, typiskt 1 g i 10 ml).
- Centrera ett täckglas på vakuumchuck av spincoater och pipettspetsar 200 ul av PIPAAm lösning så att hela glasytan är täckt.
- Rotationsbestryka täckglas vid 6000 rpm i 1 minut.
- Rengör PDMS stämplar genom sonikering i 50% etanol under 30 minuter och därefter torka under en ström av kväve.
OBS: Torkning och efterföljande steg bör utföras i en biosäkerhet skåp för att bibehålla sterilitet för applikationer där ECM nanostrukturer kommer att användas med celler. - Coat den mönstrade ytan av vardera PDMS stamp med 200 | il av proteinlösningen, typiskt 50 ng / ml i sterilt destillerat vatten för FN. Inkubera under en timme vid rumstemperatur.
Notera: Thär beläggning volymen är för en 1,5 cm 2 PDMS stämpel och kommer att behöva justeras beroende på storleken av PDMS stämpeln, ECM protein som används och koncentrationen av ECM protein i lösning. - Tvätta PDMS frimärken i destillerat vatten för att avlägsna överskott av protein och torka noggrant under en ström av kväve.
OBS: Vatten som är kvar på stämpeln utlöser förtida upplösning av PIPAAm beläggning på täckglas och hindra normal proteinöverföring. - För steril tillverkning, placera PIPAAm-belagda täckglas i en stängd petriskål och sterilisera använda UV-exponering, 45 min under UV-ljus i en biosäkerhet skåp är tillräckligt. Om sterilitet krävs inte detta steg är valfritt.
- Utför mikrokontakttryckning genom att placera funktionen sidan av PDMS stämpel i kontakt med PIPAAm belagda täckglas. Vid behov använder pincett för att knacka lätt på baksidan av stämplarna för att ta bort eventuella luftbubblor och säkerställa en enhetlig kontakt.
- Efter 5 miln, dra av PDMS stämpel från täckglas.
- I detta skede kan ytterligare ECM-proteiner mönstras för att skapa mer komplexa och flerkomponentstrukturer. Upp till 3 tryckningar har verifierats att fungera med den här processen, och mer kan vara möjligt.
4. Frisättning av ECM Nanofiber och nanostrukturer
- Placera mönstrade PIPAAm belagda täckglas i en 35 mm petriskål och inspektera mönster trohet hjälp av faskontrastmikroskopi. Beroende på mönstret, kan en CCD-kamera vara nödvändigt att lösa de funktioner i mönstret. Fluorescensmikroskopi kan också användas för att inspektera det mönster som anges ECM-proteiner är fluorescensmärkt.
- Tillsätt 3 ml 40 ° C destillerat vatten till petriskålen och låta vattnet successivt svalt.
- Upplösningen av PIPAAm skiktet och frigörandet av ECM proteinmönster kan övervakas med användning av faskontrastmikroskopi. Om programmet inte tillåter användning av optiska techniques kan frisättnings övervakas genom mätning av lösningens temperatur. Normalt är vattnet kyls till rumstemperatur, långt under LCST av PIPAAm (32 ° C), för att säkerställa de ECM proteinnanostrukturer har släppts.
- Efter frisläppandet, är Nanofiber, nanofabrics och andra nanostrukturer flyter i vattnet. För att använda dem för ytterligare applikationer de behöver manipuleras. Det exakta tillvägagångssättet kommer att bero på den experimentella målet och kan innefatta steg såsom immobilisering på en annan yta, rör sig med en mikromanipulator system eller inbäddning i en hydrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SIA klarar av ingenjörs ECM protein Nanofiber med exakt kontroll över fiberdimensioner. För att demonstrera detta har arrayer av FN Nanofiber med plana dimensioner av 50 x 20 | im mönstrade på ett PIPAAm belagda täckglas (Figur 2A). Vid övergång, fibrerna contracted eftersom de var under en inneboende förspänning när mönstrade på PIPAAm yta (Figur 2B). Analys av FN Nanofiber avslöjade att de var monodisperst pre-release med en medellängd på 50,19 ± 0,49 m och bredd på 19,98 ± 0,17 ìm (figur 2C). Trots contracting märkbart, FN fibrer efter utsättningen fortfarande var monodispers med en genomsnittlig längd av 14,15 ± 0,92 ^ m och bredd av 2,65 ± 0,32 | im (figur 2D). Atomkraftsmikroskopi gav en högre upplösning perspektiv fiberdimensionsförändringar i samband med releasen SIA. Noterbart fibrer förhandsversioner hadeen enhetlig tjocklek på ~ 5 nm (Figur 2E) medan fibrer efter utsättning hade en heterogen tjocklek i storleksordningen flera hundra nanometer (Figur 2F).
Använda SIA processen är det möjligt att konstruera en mängd olika ECM proteinnanostrukturer med avstämbara storlek, form och sammansättning (Figur 3). Till exempel, FN Nanofiber initialt 20 mikrometer i bredd och 1 cm i längd var mönstrad på ett PIPAAm belagd täckglas. Vid kylning och PIPAAm upplösning Nanofiber släpptes bildar långa trådar (Figur 3A). Vidare, eftersom mönstret definieras av yttopografi av PDMS stämpel som används för mikrokontakttryckning, är det möjligt att konstruera komplexa ECM proteinnanostrukturer. Som proof-of-concept, skapade vi flera beväpnade FN stjärnor som behållit sin allmänna form efter frigivning (Figur 3B). Intressant armarna på FN stjärnan kontrakte som Nanofiber menkroppen av stjärnan bibehöll sin storlek. Medan FN är viktig, ville vi också visa att SIA fungerar med andra ECM-proteiner såsom LN och att multipla ECM-proteiner kan inkorporeras i samma struktur. Exempelvis engineered vi en 2-D nanofabric sammansatt av ortogonala och sammankopplade nanofibrer av Fn och LN i en kvadrat galler array (figur 3C). Pre-släpp FN Nanofiber var 20 nm bred och LN Nanofiber var 50 pm bred. När man släpper båda typerna av Nanofiber kontrakte men den totala sammankoppling och offentlig gitterstruktur bibehölls. Dessa resultat visar att SIP kan användas för att konstruera ECM-material med en mängd olika kompositioner och strukturer.
Instanser av misslyckades SIA av ECM-nanofibrer visas i Figur 4. En orsak är felaktig frigöring av ett ofullständigt mönster beroende på dålig överföring av ECM-protein till PIPAAm ytan under mikrokontakttryckning (Figur 4A). Förekomsten av hål, oregelbundna kanter och andra defekter kommer att skapa nanofibrer och nanostrukturer som är ofullständiga och benägna att gå sönder och fragmentering vid övergång. Snabb upplösning av PIPAAm kan också orsaka dålig mönster trohet efter release (Figur 4B). Exempelvis med användning av rumstemperatur 20 ° C Dl-vatten redan under LCST av PIPAAm stället för 40 ° C vatten kommer att orsaka att PIPAAm att snabbt svälla och upplösas. Detta kan förorsaka två problem; (I) den snabba expansionen kan slita sönder några ECM Nanofiber och (ii) en snabb expansion kan orsaka störningar i mönsterarrangemanget efter release.
Figur 1. Schematisk av SIA processen. (A) En kiselskiva är spinnbelagd med SU8 negativ fotoresist och exponeras för UV-ljus genom en fotomask. Icke-exponerade områdena utvecklas bort lämnar ett topografiskt mönstrade m aster mögel. (B) PDMS prepolymer hälls över master mögel och härdas i 4 timmar vid 65 ° C. (C) Efter härdning är en PDMS stämpel utskuren. (D) Stämpeln inkuberas sedan med en ECM proteinlösning där proteinerna bindas till stämpel i en delvis ovikt konformation. (E) Stämpeln sköljs för att avlägsna överskott av protein, torkas, och placeras i anpassad kontakt med en PIPAAm belagt täckglas. (F) Stämpeln avlägsnas sedan lämnar kvar mönstrad ECM protein på PIPAAm belagda täckglas är mönstret bestäms av topografin hos stämpeln. (G) Täckglaset placeras sedan i en Petri-skål och täcks med 40 ° C vatten och kyldes sedan under LCST av PIPAAm (~ 32 ° C), som utlöser en upplösning av PIPAAm och frisläppandet av sammansatta ECM proteinnanofibrer och / eller nanostrukturer från ytan.
tp_upload/51176/51176fig2.jpg "/>
Figur 2. Använda SIA till ingenjör populationer av monodispersa Nanofiber. (A) En array med FN rektanglar, 50 pm i längd och 20 nm i bredd var mönstrad på PIPAAm ytan. (B) Tillsats av 40 ° C DI vatten och efterföljande kylning nedanför LCST av PIPAAm utlöste upplösningen av PIPAAm och frisläppandet av de FN Nanofiber. Vid release, fibrerna kontrakte eftersom de är under en pre-stress när mönstrade på PIPAAm ytan. (C) Analys av nanofiber mått pre-release avslöjar fibrerna är monodispersa med en längd och bredd på 50,19 ± 0,49 m och 19,98 ± 0,17 um, respektive. (D) Vid frigöring Nanofiber kontrakte men förblev monodispers med efter utsättningen längd och bredd 14.15 ± 0,92 m och 2,65 ± 0,32 um, respektive. (E) AFM visade att pre-release Nanofibervar ~ 5 nm tjockt. (F) AFM efter frigörNanoFiber visade att tjockleken hade stigit till flera hundra nanometer medan längden och bredden minskas. -Skala barer är (A) 50 m och (B) 10 nm.
Figur 3. Använda SIA till ingenjör ECM proteinnanofibrer och nanostrukturer med inställbar storlek, form och sammansättning. (A) fn Nanofiber var mönstrad på ett PIPAAm-belagd täckglas som 1 cm långa och 20 nm i bredd. Termisk utgåvan resulterade i SIA av långa, intakta FN Nanofiber med en reducerad bredd på ~ 3 mikrometer. (B) Ett exempel på en mer komplicerad med flera beväpnade FN stjärna, representativa för de olika nanostrukturer som kan skapas med hjälp av SIA. Termisk frigivning ledde till kontraktion av armarna, men inte de centrala delarna av stjärnan, där armarna samman. (C) Det är ocksåmöjligt att integrera flera ECM-proteiner i samma struktur. Till exempel var ortogonala, sammankopplade 20 um breda linjer av FN (röd) och 50 nm breda linjer av LN (grön) linjer integrerade i en 2D nanofabric mönstrad och sedan släppas. Även efter release, mönstret behållit sin ursprungliga geometri och sammanlänkning. Skala barer är 50 pm.
Figur 4. Exempel på problem som kan hindra korrekt SIA och proteinfrisättningen från PIPAAm ytan. (A) Dåligt microcontact utskrift av ECM-proteiner på de PIPAAm medför fragmentering och andra defekter i en 20 nm bred FN linje hindrar SIA av en kontinuerlig FN nanofiber och i stället resulterar i bildandet många mindre FN-fragment. (B) Snabbt släppa på Fn Nanofiber från PIPAAm underlaget kan också påverka den slutliga fiberarrangemanget. I detta fall är vatten ent 20 ° C, som redan under LCST av PIPAAm, tillsattes och utlöste snabb upplösning orsakar Nanofiber att knäppa tillbaka, bryta (30 sek) och bildar slump, oorganiserade konfigurationer (52 sek). Skala barer är 50 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SIA metod som presenteras här härmar cellmedierad matris montering och möjliggör konstruktion av ECM proteinnanofibrer och nanostrukturer med avstämbara storlek, organisation och sammansättning. Även om inte identisk med cell-genererade ECM skapar SIA ECM består av nanoskala protein fibriller 20 som genomgår reversibel beredning / utbredning under mekanisk påfrestning 21 och kan binda celler 20. Detta ger en unik möjlighet att bygga ECM proteinmaterial som rekapitulera många egenskaper för ECM som finns in vivo. Till exempel kan ECM Nanofiber tillverkas i specifika längder med en kontrollnivå omöjligt med andra tekniker. Vi visa förmåga att skapa arrayer av monodispersa Nanofiber (Figur 2) med exakt kontroll av längd och bredd pre-release (figur 2C) och efter utsättningen (figur 2D). Dessa ECM nanofibrer kan vara valfri längd, vilket visas genom att tillverka FN nanofibrer i ~ 1 cm längder (Figur 3A). I motsats därtill kan andra tillverkningstekniker såsom electro och fasseparering skapa nanofibers men inte med exakt kontroll av längd, som producerar mestadels kontinuerliga fibrer. Dessa tekniker är också begränsade i fibergeometrier och organisation inom en byggnadsställning. SIA kan användas för att bygga ECM nanostrukturer med godtycklig plan geometri, såsom en stjärna (fig 3B), och i 2-D-ark med godtycklig kontroll av fiberorganisation, t.ex. en nanofabric (Figur 3C). Vidare kan andra tillverkningsmetoder använder oftast syntetiska material eller endast ett begränsat antal naturliga såsom chitosan och fibrin. I jämförelse, SIA möjliggör monteringen av nanofibrer och nanostrukturer är sammansatta helt av ECM-proteiner, såsom Fn och LN, som inte kan framställas med dessa andra metoder.
Det kritiska steget i SIA processen är den termiskt utlöst frisättning från the PIPAAm yta. För att säkerställa korrekt release, finns det några viktiga steg som bör beaktas. Först efter microcontact utskrift steget, trohet den överförda ECM mönstret ska inspekteras antingen faskontrastmikroskopi eller fluorescensmikroskopi (om ECM-proteiner är fluorescerande taggade). Om det finns några brister i proteinmönstret på PIPAAm ytan, då den senare utgåvan kommer att producera nanostrukturer som innehåller dessa defekter (som observeras i figur 4A). Om en PDMS stämpel producerar upprepade proteinmönster med defekter, är det troligt att den micropatterned sidan av PDMS stämpeln har repad eller innehåller fel och en ny stämpel och eventuellt en ny mästare mögel bör göras. Dessutom bör man vara försiktig när hydratisering proteinet mönstrat, PIPAAm belagda täckglas. Vattnet bör vara vid eller nära 40 ° C och tillåtas att svalna långsamt. Om vattnet inte är tillräckligt varmt eller svalnar för snabbt kommer PIPAAm svälla ennd upplöses för snabbt vilket gör att ECM proteinnanofibrer och nanostrukturer som potentiellt slits sönder av de krafter och måfå släppt så att alla organisationsstruktur som liknar den torra, pre-utsläppt staten kommer att gå förlorade (Figur 4B).
ECM protein Nanofiber, nanostrukturer och nanofabrics monterade med hjälp av SIA har många tillämpningar inom biomekanik, vävnadsteknik, och bioteknik. Exempelvis visar färska uppgifter att de mekaniska egenskaperna hos ECM protein fibriller styr deras biologiska funktioner 23. SIA är idealisk för att skapa ECM protein Nanofiber i renad form för mekanisk analys. För att utföra dessa experiment kan släppt ECM protein Nanofiber manipuleras med hjälp av precisions micropositioners och sedan sträcks. Deravi m.fl. har nyligen använt denna metod för att visa att FN Nanofiber tål upp till 8-faldig förlängningar och att de genomgår elastisk, plastisk, och stregn-hårdnande regimer med ökande stam 21. I vävnadsteknik, ECM protein baserade stödstrukturer i form av geler (t.ex. typ av kollagen I och fibrin) eller decellularized vävnader 4 används i stor utsträckning. Jämfört med dessa tekniker, är fördelen med SIA förmågan att konstruera byggnadsställningar med väldefinierade arkitektur i 1-D-fibrer och 2-D-ark (figur 3C). Till exempel har vi tidigare visat att hjärtmuskelceller kan ympas på FN nanofibrer för att bilda funktionella delar av hjärtmuskeln 20. Detta visar att FN Nanofiber är cell bindande och att de kan styra den anisotropa montering av celler i linje vävnadsstrukturer. De 2-D-nanofabrics kan härma sammansättningen och laminära strukturen av basalmembranet för användning i konstruktion av epiteliala och endoteliala vävnader. Vidare utvecklar vi nya sätt att distribuera dessa ECM Nanofiber och nanofabrics i 3-D genom att bädda in dem i hydrogelmatriser.Från den process som beskrivs i den här artikeln, är det möjligt att använda SIA till ingenjör ECM proteinbaserade, nanostrukturerade material för en mängd olika tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd gavs till JMS från NIH biomekanik i regenerativ medicin T32 Training Program (2T32EB003392), till QJ från Dowd-ICES Fellowship och till AWF från NIH direktörens Nya Innovator Award (1DP2HL117750).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
