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Immunology and Infection

Photoactivated एकल अणु ट्रैकिंग का प्रयोग लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत Visualizing

Published: March 10, 2014 doi: 10.3791/51177
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Microbiology Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford, 2Biological Physics Research Group, Clarendon Laboratory, Department of Physics, University of Oxford

Summary

एकल अणु ट्रैकिंग के साथ संयुक्त Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) की अनुमति देता है जीना Escherichia कोलाई कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत का प्रत्यक्ष अवलोकन और मात्रा का ठहराव.

Abstract

प्रोटीन डीएनए बातचीत कई मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं के दिल में हैं. उदाहरण के लिए, डीएनए प्रतिकृति, प्रतिलेखन, मरम्मत, और गुणसूत्र संगठन इन विट्रो प्रयोगों डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के कई प्रकार के समारोह के लिए विस्तृत मॉडल उत्पन्न करने के लिए मदद की है. विशिष्ट डीएनए संरचना या दृश्यों को पहचान कि डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा शासित है, अभी तक कर रहे हैं , जीवित कोशिका की जटिल वातावरण में इन प्रक्रियाओं और उनके संगठन की सटीक तंत्र अब तक कम समझा रहते हैं. हमने हाल ही में Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी एकल अणु ट्रैकिंग के साथ संयुक्त (पाम) का उपयोग कर जीना Escherichia कोलाई कोशिकाओं में डीएनए की मरम्मत की गतिविधियों बढ़ाता के लिए एक विधि की शुरुआत की. हमारी सामान्य दृष्टिकोण गुणसूत्र के सहयोग पर एक प्रोटीन की गतिशीलता में बदलाव से व्यक्तिगत डीएनए बाध्यकारी घटनाओं को पहचानती है. बाध्य अणुओं के अंश प्रोटीन कार्य के लिए एक प्रत्यक्ष मात्रात्मक उपाय प्रदान करता हैएकल कोशिका स्तर पर ivity और substrates या बाध्यकारी साइटों की बहुतायत. यहाँ, हम विधि की अवधारणा का वर्णन है और नमूना तैयार करने, डाटा अधिग्रहण, और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.

Introduction

इस प्रोटोकॉल कोलाई जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत का सीधा माप का वर्णन करता है. यह गुणसूत्र (चित्रा 1) बांधता रूप में तकनीक एक एकल fluorescently लेबल प्रोटीन का प्रसार गुणांक में परिवर्तन का इस्तेमाल करता. हम डीएनए पोलीमरेज़ ठंड कतरा प्रतिकृति और छांटना मरम्मत रास्ते 1 में डीएनए अंतराल भरता है कि मैं (Pol1), एक प्रोटोटाइप डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग विधि का प्रदर्शन.

सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के आगमन के संकल्प के साथ नैनोमीटर कोशिकाओं में आणविक संरचना के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) एक फ्लोरोसेंट राज्य (चित्रा 2) के लिए एक प्रारंभिक अंधेरे राज्य से सक्रिय किया जा सकता है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन कार्यरत हैं. केवल सभी लेबल अणुओं का एक सबसेट स्वतंत्र रूप से टी के एक अनुक्रमिक तरीके से अपनी स्थिति को निर्धारित करने के लिए किसी भी समय सक्रिय होता हैवह नमूना 2 में लेबल अणुओं की एकाग्रता कुल. अणु प्रति स्थानीयकरण परिशुद्धता मुख्य रूप से फ्लोरोसेंट बात फैल समारोह (पीएसएफ) के आकार पर निर्भर करता है, एकत्र फोटॉनों की संख्या, और पृष्ठभूमि संकेत 3. इस विधि से कई अनुप्रयोगों सेलुलर संरचनाओं के बेहतर दृश्य पर ध्यान केंद्रित. ट्रैकिंग पाम एकल अणु के साथ जोड़ा जा सकता है कि वसूली के 4 सीधे जीवित कोशिकाओं में लेबल प्रोटीन का मनमाना संख्या के आंदोलन का पालन करने के लिए नए रास्ते खोल दिया. वृद्धि की संवेदनशीलता और प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का अस्थायी समाधान अब बैक्टीरियल कोशिका द्रव्य 5 में एकल diffusing फ्लोरोसेंट प्रोटीन की ट्रैकिंग की अनुमति.

यहाँ, हम PAmCherry, अचल 405 एनएम प्रकाश 6 के साथ विकिरण पर एक फ्लोरोसेंट राज्य के लिए एक प्रारंभिक nonfluorescent राज्य से धर्मान्तरित कि एक इंजीनियर फ्लोरोसेंट प्रोटीन को काम पर. सक्रिय PAmCherry fluorophores छवि हो सकता है561 एनएम पर उत्तेजना और photobleaching तक कई फ्रेम के लिए ट्रैक द्वारा डी. हम Pol1 और PAmCherry की एक संलयन का उपयोग कर एक प्रोटीन की क्षणिक डीएनए बाध्यकारी घटनाओं की पहचान करने के लिए विधि की क्षमता प्रदर्शित करता है. मिथाइल methanesulfonate (एमएमएस) के साथ कोशिकाओं के इलाज के आधार छांटना मरम्मत एंजाइमों से gapped डीएनए substrates में बदल गया है कि डीएनए मेथिलिकरण क्षति का कारण बनता है. हमारे विधि एमएमएस क्षति 7 के जवाब में एकल Pol1 अणुओं के बंधन स्पष्ट पता चलता है.

Protocol

1. सेल संस्कृति

बाँझ संस्कृति ट्यूब और विंदुक युक्तियाँ का प्रयोग करें. ई. कोलाई तनाव AB1157 पोला-PAmCherry Pol1 की एक सी टर्मिनल PAmCherry फ्यूजन किया जाता है. संलयन एट अल Datsenko में वर्णित के रूप में लैम्ब्डा लाल पुनर्संयोजन का उपयोग जंगली प्रकार के जीन की जगह से देशी गुणसूत्र स्थान पर डाला गया था. सेलुलर विकास दर और डीएनए को नुकसान पहुँचाए एजेंट मिथाइल को संवेदनशीलता से न्याय के रूप में संलयन प्रोटीन की 8 कार्यक्षमता की पुष्टि की थी methanesulfonate (एमएमएस). सेल तनाव के निर्माण पर अधिक जानकारी Uphoff एट अल. 7 में पाया जा सकता है, Datsenko एट अल. 8, और रेयेस-Lamothe एट अल. 9 सेल संस्कृतियों autofluorescence कम करने और खुर्दबीन स्लाइड पर पृष्ठभूमि कणों से बचने के लिए M9 न्यूनतम मध्यम में बड़े हो रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, एक पोषक तत्वों से भरपूर परिभाषित मध्यम 10 इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. स्ट्रीक ई. कोलाई तनाव AB1157 चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं (यहाँ, 25 माइक्रोग्राम / एमएल kanamycin) के साथ एक Luria शोरबा (लेग) agarose थाली पर एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से पोला-PAmCherry और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  2. एक एकल कोशिका कॉलोनी से एक 5 मिलीलीटर लेग संस्कृति टीका लगाना और 3 घंटे के लिए 220 rpm पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है.
  3. 5 मिलीलीटर में संस्कृति 1:10,000 पतला न्यूनतम मध्यम (M9 मध्यम, सदस्य अमीनो एसिड + प्रोलाइन, सदस्य विटामिन, 0.2% ग्लिसरॉल) और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात 220 rpm पर मिलाते पर सेते हैं.
  4. अगली सुबह, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने और आयुध डिपो 0.025 5 एमएल में ताजा न्यूनतम मध्यम संस्कृति पतला. जल्दी घातीय चरण (आयुध डिपो 0.1) के लिए 220 rpm पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए आगे बढ़ें.
  5. 5 मिनट के लिए 2300 XG पर centrifugation द्वारा एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर ध्यान लगाओ. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 20 μl अवशिष्ट मध्यम और भंवर में सेल गोली resuspend.

2. खुर्दबीन स्लाइड preparatआयन

  1. DH 2 ओ में एक 1.5% कम प्रतिदीप्ति agarose समाधान तैयार समाधान स्पष्ट है जब तक agarose पिघला करने के लिए एक माइक्रोवेव का उपयोग करें. धीरे से ऊपर pipetting द्वारा और एक बार कुछ नीचे 2x कम से कम मध्यम के 500 μl के साथ पिघल agarose समाधान के 500 μl मिलाएं.
  2. एक खुर्दबीन coverslip (नो 1.5 मोटाई) के केंद्र पर समान रूप से agarose समाधान बिखरा हुआ है. इस agarose ठंडा होने से पहले बुलबुले से बचने, जल्दी से किया जा सकता है.
  3. एक दूसरे coverslip (नो 1.5 मोटाई) के साथ पैड समतल. पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट कणों को निकालने के लिए coverslips पहले 1 घंटे के लिए 500 डिग्री सेल्सियस पर एक भट्ठी में जला दिया गया. जला हुआ coverslips एल्यूमीनियम पन्नी में कवर कमरे के तापमान पर सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  4. डीएनए की क्षति प्रयोगों के लिए, 100 मिमी एमएमएस युक्त एक agarose पैड तैयार करते हैं. कदम 2.1-2.3 में प्रक्रिया का पालन करें, लेकिन 100 मिमी एम के अंतिम एकाग्रता के लिए, पिघल 1.5% agarose के 500 μl के साथ मिश्रण से पहले M9 मध्यम के 500 μl 8.3 μl एमएमएस जोड़एमएस. (Caution! एमएमएस विषैले और mutagenic है और दस्ताने, मास्क, काले चश्मे, और प्रयोगशाला कोट के साथ संभाला जाना चाहिए).
  5. पैड से ऊपर स्लाइड निकालें और पैड पर केंद्रित सेल निलंबन के 1 μl जोड़ें. एक अप्रयुक्त जला दिया coverslip (नो 1.5 मोटाई, खुर्दबीन उद्देश्य विनिर्देश से मेल खाते) के साथ पैड कवर द्वारा और स्लाइड पर बहुत धीरे दबाकर कोशिकाओं स्थिर. कोशिकाओं agarose पैड dries पहले स्थिरीकरण के 45 मिनट के भीतर imaged किया जाना चाहिए. अब प्रयोगों के दौरान सुखाने को रोकने के लिए, agarose पैड सिलिकॉन गास्केट का उपयोग बंद किया जा सकता.
  6. डीएनए की क्षति प्रयोगों के लिए, इमेजिंग से पहले कमरे के तापमान पर एक humidified कंटेनर में 20 मिनट के लिए 100 मिमी एमएमएस युक्त agarose पैड पर स्थिर कोशिकाओं को सेते हैं.

3. माइक्रोस्कोपी डाटा अधिग्रहण की तैयारी

पाम का पता लगाने और एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का सटीक स्थानीयकरण पर निर्भर करता है. संवेदनशीलता और इष्टतम संरेखणमाइक्रोस्कोप डेटा की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है. एकल अणु प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी आम तौर पर coverslip सतह के ऊपर एक पतली धारा भीतर रोमांचक केवल fluorophores द्वारा संकेत करने वाली शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR) ​​रोशनी रोजगार. ई. के अंदर इधर, इमेजिंग कोली अत्यधिक थोड़ा उत्तेजना प्रकाश का कोण कम करके एक TIRF माइक्रोस्कोप पर प्राप्त किया जा सकता है, जो इच्छुक रोशनी 11, की आवश्यकता है. PAmCherry इमेजिंग आगे एक 405 एनएम photoactivation लेजर और एक 561 एनएम उत्तेजना लेजर की आवश्यकता है. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 114.5 एनएम / पिक्सेल का एक पिक्सेल लंबाई में जिसके परिणामस्वरूप एक बढ़ाई सीसीडी (EMCCD) कैमरा गुणा एक इलेक्ट्रॉन पर दर्ज की गई है. इष्टतम स्थानीयकरण परिशुद्धता के लिए, पिक्सेल आकार लगभग भी कई पिक्सल से अधिक संकेत के प्रसार के बिना पर्याप्त नमूने सुनिश्चित करने के लिए पीएसएफ का मानक विचलन चौड़ाई से मेल खाना चाहिए. 3 आंकड़ा एक न्यूनतम पाम स्थापना के एक योजनाबद्ध दिखाता है. मूवी 1पहले से शर्त खुर्दबीन के निर्माण की प्रक्रिया का एक छाप देता है;. साधन का विस्तृत विवरण के लिए Uphoff एट अल 7 देखें.

  1. दिनचर्या खुर्दबीन संरेखण प्रदर्शन. 405 एनएम और उद्देश्य के सामने 561 एनएम निरंतर तरंग लेजर की तीव्रता को मापने. 3.5 मेगावाट (~ 400 डब्ल्यू / 2 सेमी) और 10 μW (~ 1 डब्ल्यू / 2 सेमी) करने के लिए 405 एनएम तीव्रता को 561 एनएम तीव्रता को समायोजित. 0-10 μW से 405 एनएम तीव्रता का क्रमिक समायोजन की अनुमति देता है कि एक लगातार परिवर्तनशील तटस्थ घनत्व फिल्टर पहिया का प्रयोग करें. प्रयोग के शुरू तक लेजर रोशनी बंद कर दें.
  2. खुर्दबीन मंच पर नमूना प्लेस और प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी मोड (चित्रा -4 ए) में ध्यान में कोशिकाओं को ले आओ. EMCCD कैमरे लाभ overexposure द्वारा कैमरे को नुकसान को रोकने के लिए बंद हो गया है.
  3. डेटा आकार को कम करने और कैमरा बाहर से पढ़ने की गति को बढ़ाने के लिए एक फसली FOV परिभाषित करें.
  4. परिवेश प्रकाश और Swit से नमूना कवरEMCCD कैमरे लाभ पर चर्चा.
  5. (0.26 मिसे कैमरा readout समय सहित) 15.26 मिसे / फ्रेम करने के लिए फ्रेम दर निर्धारित. चर्चा अनुभाग में "एक्सपोजर समय और उत्तेजना तीव्रता" देखें.
  6. अंधेरे पृष्ठभूमि संकेत (चित्रा 4 बी) की जांच करने के लिए कैमरा डेटा प्रदर्शित करें.
  7. 561 एनएम लेजर पर स्विच और उत्तेजना पृष्ठभूमि संकेत (चित्रा 4C) की जाँच करें.
  8. Pol1-PAmCherry संलयन प्रोटीन की photoactivation के लिए 405 एनएम लेजर पर स्विच और प्रतिदीप्ति PSFs प्रकट तक तीव्रता में वृद्धि.
  9. Coverslip सतह के करीब नमूना का केवल एक पतली धारा रोशन करने के लिए उत्तेजना बीम के कोण समायोजित करें.
    1. इस प्रयोजन के लिए लेजर बीम एक 100X 1.4 एनए उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ चित्रा (3) में केंद्रित है. किरण को सीधा ध्यान केंद्रित लेंस का अनुवाद दूर एक कोण के तहत उद्देश्य से बाहर निकलने की किरण पैदा उद्देश्य के केंद्र से फोकस बढ़ता रहता है.
    2. आर्टिफिशियल इंटेलीजेंसप्रतिदीप्ति तीव्रता को अधिकतम और पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए मीटर. सख्त TIR उत्तेजना coverslip सतह से 100 एनएम के भीतर छवि fluorophores इष्टतम है कि ध्यान दें, तथापि, इमेजिंग डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन ई. के साथ जुड़े कोली nucleoid 0.8 माइक्रोन गहरी रोशनी ऊपर की आवश्यकता है.

4. डाटा अधिग्रहण

यहाँ, हम एक हथेली फिल्म के अधिग्रहण के लिए सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन. उसी प्रक्रिया undamaged ई. में Pol1-PAmCherry संलयन प्रोटीन इमेजिंग के लिए लागू होता है कोली की कोशिकाओं और एमएमएस के साथ निरंतर डीएनए की क्षति के उपचार के तहत. सेल प्रति अलग आणविक वजन या प्रतिलिपि संख्या के संलयन प्रोटीन के लिए विधि के आवेदन (चर्चा अनुभाग देखें) विभिन्न अधिग्रहण सेटिंग्स की आवश्यकता होगी.

  1. प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी मोड में कोशिकाओं के देखने का एक नया क्षेत्र (FOV) का पता और छवि ध्यान केंद्रित. सेल की रूपरेखा (चित्रा -4 ए) दर्ज करने के लिए एक कैमरा स्नैपशॉट ले लो.
  2. परिवेश प्रकाश से नमूना कवर और EMCCD कैमरे के लाभ पर स्विच.
  3. 561 एनएम लेजर पर स्विच और डाटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले कुछ सेकंड के लिए coverslip पर सेलुलर autofluorescence और पृष्ठभूमि स्पॉट ब्लीच. कोशिकाओं के लिए हो और M9 माध्यम में imaged और बहुत कम प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि आमतौर पर है coverslips जला दिया उपयोग कर, तथापि, prebleaching ऐसे लेग के रूप में एक अमीर मध्यम विकास में कोशिकाओं इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकता है. तीव्र रोशनी तो prebleaching कम से कम रखा जाना चाहिए कोशिकाओं को विषाक्त है कि ध्यान दें.
  4. 15.26 मिसे / फ्रेम में निरंतर 561 एनएम उत्तेजना के तहत एक हथेली फिल्म का अधिग्रहण शुरू.
  5. 405 एनएम लेजर को स्विच ऑन करें और धीरे - धीरे / 2 सेमी 1 डब्ल्यू तक पहुँचने, फिल्म के पाठ्यक्रम पर तीव्रता में वृद्धि. सेलुलर autofluorescence कारण है कि उच्च 405 एनएम तीव्रता से बचें. फ्लोरोसेंट अणु के घनत्व पर ध्यान दे - यह कम सक्रियण दरें रखने के लिए महत्वपूर्ण है PSFs स्पष्ट रूप से कर रहे हैं कि इस तरह केप्रत्येक फ्रेम (आंकड़े 4D एफ) में अलग.
  6. 10,000 फ्रेम / फिल्म (सेल प्रति imaged किया जा अणुओं की संख्या के आधार पर) रिकार्ड, एक फिल्म आमतौर पर 2-3 मिनट लगते हैं और FOV के आकार के आधार पर हार्ड डिस्क स्थान का 0.5-1 जीबी की आवश्यकता है.
  7. कई FOV के लिए अधिग्रहण प्रक्रिया को दोहराएँ. प्रत्येक FOV PAmCherry fluorophores photoactivated मिलता क्योंकि केवल एक बार imaged किया और अचल प्रक्षालित हो सकता है.

5. डेटा विश्लेषण

एक स्वचालित और मजबूत डेटा विश्लेषण ढांचे विधि का प्रदर्शन और दक्षता के लिए आवश्यक है. हम MATLAB में लिखा कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.

  1. क्रोकर एट अल. 12 में वर्णित एल्गोरिदम का उपयोग स्थानीयकरण विश्लेषण प्रदर्शन, होल्डन एट अल. 13, HoldenI एट अल. 14, और Wieser एट अल. 15 PSFs पहले 7 पिक्सेल के साथ एक गाऊसी कर्नेल के प्रयोग से एक बैंड पास फ़िल्टर की छवि में पहचाने जाते हैंएस व्यास (चित्रा 5A). उम्मीदवार पदों पृष्ठभूमि संकेत (चित्रा 5 ब) के 4.5 गुना मानक विचलन ऊपर शिखर पिक्सेल तीव्रता के साथ PSFs के अनुरूप हैं. उम्मीदवार पीएसएफ प्रति स्थानीय स्तर पर प्रतिभाशाली पिक्सेल एक अण्डाकार गाऊसी समारोह (चित्रा 5C) फिटिंग के लिए प्रारंभिक अनुमान के रूप में कार्य करता है. फ्री फिट मापदंडों हैं: X-स्थिति, वाई स्थिति, एक्स चौड़ाई, वाई चौड़ाई, रोटेशन कोण, आयाम, और पृष्ठभूमि ऑफसेट. अण्डाकार गाऊसी मुखौटा पीएसएफ blurs और विकृत जो जोखिम समय के दौरान अणु के लिए खातों.
  2. एक ही FOV के प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि पर पाम फिल्म के सभी तख्ते से उत्पन्न (एक्स, वाई) localizations प्लॉट. Pol1-PAmCherry की localizations ई. के मध्य क्षेत्र के भीतर प्रकट करना चाहिए कोली कोशिकाओं (चित्रा 6A). कई localizations कोशिकाओं के बाहर दिखाई देते हैं, स्थानीयकरण सीमा बहुत कम सेट या नमूना पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट कणों निहित था.
  3. स्वचालित ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए, क्रोकर एट में वर्णित एल्गोरिथ्म के MATLAB कार्यान्वयन अल. 12 (चर्चा अनुभाग में "प्रसार विश्लेषण" देखें) का इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्रयोक्ता परिभाषित ट्रैकिंग खिड़की के भीतर बाद फ्रेम में दिखाई देने वाली पोजिशन एक प्रक्षेपवक्र फार्म से जुड़े हैं. कई localizations एक ही विंडो में होते हैं उस मामले में, पटरियों अनोखे कदम लंबाई की राशि कम करके सौंपा है. एकल कण ट्रैकिंग डेटा से प्रसार गुणांक की गणना करते समय विभिन्न कारणों में से एक विस्तृत चर्चा के लिए, Wieser एट अल. 15 देखें
    1. एल्गोरिथ्म एक ट्रैक के दौरान क्षणिक पलक या चूक localizations के लिए खाते में एक स्मृति पैरामीटर का उपयोग करता है. यहाँ, हम 1 फ्रेम करने के लिए स्मृति पैरामीटर सेट, उच्च मूल्यों लंबे समय रहते अंधेरे राज्यों के साथ fluorophores पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    2. निम्नलिखित अंशांकन कदम के आधार पर एक उपयुक्त ट्रैकिंग विंडो चुनें. Pol1 के लिए, हम 0.57 माइक्रोन (5 पिक्सल) का उपयोग करें.
    3. खिड़की मापदंडों पर नज़र रखने के लिए एक सीमा ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म चलाएँ. पटरियों (चित्रा 6B) विभाजित नहीं करता है कि छोटी से छोटी संभव ट्रैकिंग खिड़की की पहचान करने के लिए ट्रैकिंग खिड़की के एक समारोह के रूप में सेल प्रति मापा पटरियों की संख्या की गणना.
    4. कोशिकाओं के भीतर अणु आंदोलन के स्थानिक वितरण कल्पना करने के लिए एक ही FOV के प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि पर जिसके परिणामस्वरूप पटरियों प्लॉट. Pol1 पटरियों एकल कक्षों (आंकड़े 6C डी) के भीतर ही सीमित प्रसार प्रदर्शित करना चाहिए.
    5. पटरियों के एक अंश की कोशिकाओं के बीच पार करने के लिए प्रकट होता है, तो इस पर नज़र रखने खिड़की बहुत बड़ी है और / या photoactivation दर (चित्रा 6E) बहुत अधिक था चुना गया था क्योंकि अलग अणुओं ग़लती से जुड़े हुए थे कि पता चलता है.
    6. लगातार localizations (चित्रा 6f) के बीच कदम लंबाई की संचयी वितरण प्लॉट. वक्र उगता है और पर्याप्त रूप से बड़े ट्रैकिंग खिड़कियों के लिए सुचारू रूप से संतृप्तखिड़की बहुत छोटा चुना गया था लेकिन अगर एक कटऑफ बढ़त दिखाता है.
  4. Pol1 के प्रसार विशेषताओं का विश्लेषण करने, एन कदमों की कुल के साथ प्रत्येक ट्रैक के लिए लगातार localizations के बीच का मतलब चुकता विस्थापन (एमएसडी)) गणना:
    एमएसडी = 1 / (एन -1) Σ मैं = 1 एन 1 (एक्स मैं एक - एक्स मैं) 2 + (y मैं एक - Y मैं) 2.
    केवल एमएसडी मूल्यों में सांख्यिकीय अनिश्चितता को कम करने के लिए कम से कम 4 कदम (एन ≥ 5 localizations) के साथ पटरियों को शामिल करें.
  5. कई फ्रेम (चित्रा 6G) पर विस्थापन की गणना के द्वारा अंतराल टाइम्स की एक सीमा से अधिक एमएसडी मूल्यों का एक वक्र प्लॉट. एमएसडी वक्र के आकार मनाया आणविक गति (चित्रा 6H) वर्गीकृत करने के लिए कर सकते हैं.
  6. एमएसडी से ट्रैक प्रति स्पष्ट प्रसार गुणांक डी * की गणना:
    डी * = एमएसडी / (4 Δt) - नियंत्रण रेखा 2 / Δt σ.
    दूसरा टीएर्म (Wieser एट अल. 15 देख, यहाँ σ नियंत्रण रेखा = 40 एनएम और Δt = 15.26 मिसे) का अनुमान स्थानीयकरण त्रुटि के लिए सही.
  7. FOV (चित्रा 7A) में सभी पटरियों से मापा डी * मूल्यों का एक हिस्टोग्राम साजिश है.
  8. ट्रैक प्रति मापा डी * मूल्य पर आधारित गुणसूत्र के लिए बाध्य दिखाई देते हैं कि व्यक्ति Pol1 अणुओं की पहचान. बाध्य की आबादी अलग (पर केन्द्रित तेज वितरण डी * ~ 0 माइक्रोन 2 / सेक) और डी * <0.15 माइक्रोन 2 / सेक एक सीमा निर्धारित करके स्वतंत्र रूप से diffusing अणुओं (व्यापक वितरण डी पर केन्द्रित * ~ 0.9 माइक्रोन 2 / सेक) ( आंकड़े 7A और 7 दिन) में लाल सलाखों.
  9. Undamaged कोशिकाओं (आंकड़े 7A-सी) में और एमएमएस (आंकड़े 7 दिन ई) के साथ डीएनए की क्षति के उपचार के तहत कोशिकाओं में स्थानीयकरण, ट्रैकिंग, और Pol1 के लिए प्रसार विश्लेषण करना. बाध्य पटरियों के अंश डी.एन. का एक सीधा मात्रात्मक उपाय प्रदान करता हैविवो में Pol1 की मरम्मत गतिविधि.

Representative Results

vivo में प्रोटीन डीएनए बातचीत का अध्ययन करने के लिए ट्रैकिंग photoactivated एकल अणु की अवधारणा चित्र 1 में सचित्र है. PAmCherry संलयन प्रोटीन रहते ई. में पता चला रहे हैं एक समय में सेल प्रति कम से कम एक अणु के एक आवृत्ति पर 405 एनएम प्रकाश के साथ stochastically एकल अणुओं photoactivating द्वारा एक अनुक्रमिक तरीके से कोलाई कोशिकाओं. सक्रिय अणुओं निरंतर 561 एनएम उत्तेजना के तहत imaged हैं. सेल में आण्विक आंदोलन अपरिवर्तनीय photobleaching तक फ्रेम की एक श्रृंखला में पास localizations को जोड़ने से लगाया जा सकता है. डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन का प्रसार गुणसूत्र बंधन पर धीमा है, क्योंकि डी * ट्रैक प्रति प्राप्त स्पष्ट प्रसार गुणांक सीधे व्यक्तिगत प्रोटीन डीएनए बातचीत पर रिपोर्ट.

चित्रा 2 लाइव ई. में Pol1-PAmCherry संलयन प्रोटीन की photoactivation दर्शाता कोलाई कोशिकाओं. ओ 405 एनएम तीव्रता का प्रभावn फ्लोरोसेंट अणु का घनत्व चित्रा 4 में देखा जा सकता है. घनत्व केवल 405 एनएम तीव्रता से लेकिन अतिरिक्त सक्रियण के लिए उपलब्ध हैं जो अणुओं की संख्या से निर्धारित नहीं है कि ध्यान दें, शेष अणुओं के पूल एक हथेली फिल्म के पाठ्यक्रम पर समाप्त हो गया है.

स्थानीयकरण विश्लेषण चित्रा 5 में सचित्र के रूप में एक ताड़ फिल्म की प्रत्येक फ्रेम के लिए किया जाता है. हम जीवित कोशिकाओं में तय कोशिकाओं या बाध्य अणुओं में स्थिर अणुओं का उपयोग स्थानीयकरण परिशुद्धता मापा. हमारे अधिग्रहण सेटिंग्स सैद्धांतिक भविष्यवाणी 3 के साथ समझौते में, σ नियंत्रण रेखा = 40 एनएम का स्थानीयकरण परिशुद्धता दिया.

परिणामस्वरूप Pol1 localizations मोटे तौर पर ई. के स्थानिक संगठन recapitulating, सेल के केंद्रीय क्षेत्र (चित्रा 6A) पर कब्जा कोली 7 nucleoid. Pol1 के बहुमत अलग प्रदर्शित undamaged कोशिकाओं में पटरियोंचित्रा 6C के रूप में दिखाया संलयन. एक ठेठ सेल ई. के अनुसार लगभग 400 Pol1 अणुओं की नकल संख्या के साथ लगातार कई सौ Pol1 पटरियों (चित्रा 6D), शामिल हैं . कोलाई सेल 1 6B आंकड़े और 6E एफ एक उपयुक्त ट्रैकिंग खिड़की पैरामीटर के चयन पर मार्गदर्शन प्रदान - ट्रैकिंग खिड़की बहुत बड़ी है, तो अलग अणुओं ग़लती से एक ट्रैक से जुड़ा हुआ हो जाने की संभावना है, ट्रैकिंग खिड़की बहुत छोटा है, तो पटरियों अब कदम के साथ विभाजित किया जाएगा. Pol1 के लिए एमएसडी वक्र सेल कारावास (चित्रा 6G) की वजह से लंबे समय तक अंतराल समय पर कम अंतराल समय और संतृप्त लिए रैखिक बढ़ जाता है. आणविक गति के विभिन्न प्रकार एमएसडी विश्लेषण से पहचाना जा सकता है. निर्देशित प्रस्ताव एक परवलयिक वक्र देता है, ब्राउनियन गति एक सीधी रेखा की विशेषता है, सीमित प्रसार वक्र एक पठार तक पहुँच जाता है, स्थिर कणों के लिए एमएसडी वक्र की भरपाई एक एल का प्रतिनिधित्व करता हैocalization अनिश्चितता (चित्रा 6H). एकल कण ट्रैकिंग और समस्या निवारण सुझावों पर अतिरिक्त जानकारी Arnauld एट अल. 16 में पाया जा सकता है

हम पहले से एक्सोजेनस डीएनए alkylation क्षति 7 के जवाब में Pol1 के डीएनए की मरम्मत गतिविधि को मापने के लिए विधि लागू होता है. Pol1 के डी * हिस्टोग्राम अणुओं (आंकड़े 7A-सी) diffusing के एक प्रमुख आबादी से पता चलता undamaged कोशिकाओं में पटरियों. 2.7% बाध्य Pol1 अणुओं का एक छोटा सा अंश संभावना ठंड कतरा प्रतिकृति और अंतर्जात डीएनए की क्षति की मरम्मत में शामिल है. निरंतर 100 मिमी एमएमएस क्षति के तहत, 13.8% (चित्रा 7 दिन) के लिए डी * ~ 0 माइक्रोन 2 / सेक वृद्धि के साथ पटरियों की आबादी. इन पटरियों आधार छांटना मरम्मत मार्ग के हिस्से के रूप में एकल nucleotide अंतराल को भरने के लिए डीएनए की मरम्मत संश्लेषण प्रदर्शन व्यक्ति Pol1 अणुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. बाध्य पटरियों के पदों व्यक्ति के स्थानों को दिखानेडीएनए की क्षति और मरम्मत साइटों (चित्रा 7E एफ).

चित्रा 1
चित्रा 1. विधि की चित्रमय प्रतिनिधित्व. (ए) फ्लोरोसेंट प्रोटीन PAmCherry 405 एनएम प्रकाश के साथ विकिरण पर एक प्रारंभिक nonfluorescent राज्य से photoactivated किया जा सकता है. उज्ज्वल राज्य 561 एनएम पर उत्साहित है और अचल फ्लोरोफोरे विरंजकों तक 600 एनएम के आसपास प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है. (बी) photoactivation दर को नियंत्रित करने की अनुमति देता है इमेजिंग ही किसी भी समय सेल प्रति एक stochastically सक्रिय PAmCherry संलयन प्रोटीन एक अंधेरे राज्य में रहता है अभी तक सक्रिय नहीं किया गया है या पहले से ही प्रक्षालित किया गया है कि अणुओं की मनमाने ढंग से बड़े पूल है. (सी) फ्लोरोसेंट अणु की स्थिति अलग पीएसएफ और tr के केंद्र से निर्धारित किया जाता हैphotobleaching तक कई फ्रेम के लिए acked. कई अणुओं (डी) पटरियों एक अनुक्रमिक तरीके से दर्ज की गई हैं. (एफई) एक गुणसूत्र लक्ष्य अनुक्रम या संरचना के साथ एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की बातचीत यादृच्छिक वाचाल प्रस्ताव है. बन्धे और अपार अणुओं डी * एकल पटरियों से निकाले स्पष्ट प्रसार गुणांक द्वारा प्रतिष्ठित हैं. बाध्य अणुओं के परिणामस्वरूप अंश विवो में एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की गतिविधि के लिए एक मात्रात्मक उपाय देता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. लाइव ई. में Pol1-PAmCherry के photoactivation कोलाई कोशिकाओं. स्केल सलाखों: 1 माइक्रोन. Schematics प्रत्येक पैनल के नीचे दिखाया गया है. ( ए) एक agarose पैड पर स्थिर कोशिकाओं के प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि प्रेषित. (बी) के एक कक्ष में एक भी PAmCherry फ्लोरोफोरे Phototactivating. (ग) एक उच्च photoactivation दर फ्लोरोसेंट अणु की संख्या बढ़ जाती है. (डी) एक ताड़ फिल्म से एकीकृत PAmCherry प्रतिदीप्ति. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. Photoactivating और इमेजिंग PAmCherry संलयन प्रोटीन के लिए एक न्यूनतम पाम सेटअप के योजनाबद्ध डी 1:. Dichroic दर्पण (जैसे 550 एनएम लंबे पास). डी 2: Dichroic दर्पण (जैसे 570 एनएम लंबे पास). एल 1: collimating लेंस. एल 2: TIR लेंस. L3: ट्यूब लेंस.1177/51177fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. . 15.26 मिसे / फ्रेम स्केल सलाखों के साथ एक पाम फिल्म से छवियों प्रतिनिधि: 1 माइक्रोन. (ए) एक agarose पैड पर स्थिर कोशिकाओं के प्रकाश छवि प्रेषित. (बी) लेज़रों के साथ EMCCD कैमरे पर मापा डार्क पृष्ठभूमि छवि बंद कर दिया. Photoactivation पहले निरंतर 561 एनएम उत्तेजना के तहत (सी) उत्तेजना पृष्ठभूमि छवि. (डीएफ) में वृद्धि 405 एनएम तीव्रता निरंतर 561 एनएम उत्तेजना के तहत imaged PAmCherry के उच्च photoactivation दरों, की ओर जाता है. बॉक्सिंग क्षेत्रों नीचे बढ़ाया दिखाए जाते हैं. (डी) कम 405 एनएम तीव्रता (<1 μW) actives FOV प्रति बहुत कुछ फ्लोरोसेंट अणु. (ई) मध्यम 405स्थानीयकरण और ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए एक अच्छा पीएसएफ घनत्व में एनएम तीव्रता (~ 2 μW) photoactivation परिणाम. (एफ) हायर 405 एनएम तीव्रता (~ 10 μW) स्थानीयकरण और ट्रैकिंग विश्लेषण obscures जो कुछ कोशिकाओं में एक से अधिक फ्लोरोसेंट अणु, सक्रिय. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. स्थानीयकरण विश्लेषण का चित्रण. स्केल सलाखों: 1 माइक्रोन (ए) बैंड पास छानने नकली पिक्सेल शोर हटा और FOV भर तीव्रता ढ़ाल दुबला बना देती है.. (बी) के उम्मीदवार PSFs झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी detections को कम करने के लिए चुना जाता है कि एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित सीमा के आधार पर फ़िल्टर छवि में पहचाने जाते हैं. threshoएलडी पृष्ठभूमि मानक विचलन (संकेत करने वाली शोर अनुपात, SNR) द्वारा विभाजित एक उम्मीदवार पिक्सेल की न्यूनतम तीव्रता से मेल खाती है. (सी) सीमा एक दो आयामी अण्डाकार गाऊसी फिट करने के लिए प्रारंभिक स्थानीयकरण अनुमान (नारंगी क्रॉस) के रूप में कार्य करता है गुजरता है कि स्थानीय स्तर पर प्रतिभाशाली पिक्सेल. स्केल सलाखों: 0.5 माइक्रोन. जिसके परिणामस्वरूप सुपर संकल्प स्थानीयकरण (ब्लू क्रॉस) σ नियंत्रण रेखा के एक औसत सटीक है = 40 एनएम. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
.. ट्रैकिंग विश्लेषण के 6 चित्र चित्रण स्केल सलाखों: 1 माइक्रोन. (ए) एक उदाहरण के सेल में Pol1-PAmCherry के सभी का पता चला localizations. (बी) पटरियों की संख्या का पता लगाने केट्रैकिंग खिड़की के एक समारोह के रूप में उदाहरण के सेल में एड. लघु ट्रैकिंग Windows पटरियों की उच्च संख्या artifactual की ओर जाता है, जो अणु trajectories, विभाजित. धराशायी लाइन ट्रैकिंग खिड़की पैरामीटर (0.57 मीटर, 5 पिक्सल) के लिए हमारी पसंद इंगित करता है - इस कदम का पूरा वितरण का पता लगाने और अक्षुण्ण अलग अणुओं के trajectories रखने के बीच एक अच्छा समझौता देता है. एक एकल Pol1-PAmCherry अणु (सी) उदाहरण ट्रैक. (डी) यादृच्छिक रंगों में सब दिखाया मापा पटरियों. ट्रैकिंग खिड़की चुना जाता है अगर (ई) ट्रैकिंग कलाकृतियों (यहां 0.8 माइक्रोन, 7 पिक्सल) या फ्रेम प्रति PSFs का घनत्व बहुत अधिक बहुत बड़ी है. ट्रैकिंग खिड़कियों के लिए कदम लंबाई (एफ) संचयी वितरण: 0.34 माइक्रोन (3 पिक्सल, लाल रेखा), 0.57 माइक्रोन (5 पिक्सल, नीली रेखा), और 0.80 मीटर (7 पिक्सल, ग्रीन लाइन). 0.34 माइक्रोन ट्रैकिंग खिड़की 0.34 माइक्रोन से अधिक समय कदम कटौती से ध्यान दें कि जो स्पष्ट रूप सेचरणों का पूरा वितरण truncates. 0.80 माइक्रोन ट्रैकिंग खिड़की के रूप में करता 0.57 माइक्रोन ट्रैकिंग खिड़की कदम के लगभग एक ही वितरण का पता लगाता है. (जी) एमएसडी वक्र Pol1 की सीमित प्रसार को दर्शाता है. निर्देशित गति, ब्राउनियन गति, सीमित प्रसार, और स्थिर कणों के लिए (एच) योजनाबद्ध एमएसडी घटता. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
चित्रा 7. लाइव ई. में Pol1 के डीएनए की मरम्मत गतिविधि का सीधा माप . कोलाई कोशिकाओं स्केल सलाखों: 1 माइक्रोन. (ए) एक undamaged कोशिकाओं के FOV (एन = 4162 पटरियों) में 4 या अधिक चरणों के सभी पटरियों के लिए स्पष्ट प्रसार गुणांक डी * के हिस्टोग्राम. बी के रूप में वर्गीकृत अणुओं की आबादी ound लाल रंग में प्रकाश डाला है. Pol1-PAmCherry की (ईसा पूर्व) पटरियों एक प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि पर दिखाए जाते हैं. उनके प्रसार गुणांक के अनुसार बाध्य के रूप में वर्गीकृत पटरियों लाल रंग में दिखाया गया है. (डी) डी * (एन = 2128 पटरियों) इमेजिंग से पहले 100 मिमी एमएमएस के साथ एक agarose पैड पर स्थिर है और 20 मिनट के लिए incubated कोशिकाओं में मापा Pol1 पटरियों के लिए हिस्टोग्राम. डीएनए की मरम्मत में लगे हुए बाध्य अणुओं की आबादी लाल रंग में दिखाया गया है. (एफई) Pol1-PAmCherry लाल रंग में एकल Pol1 डीएनए की मरम्मत की घटनाओं की पटरियों दिखा प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि पर पटरियों. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 1
मूवी 1. एक bespoke पाम सेटअप का निर्माण.JoVE_Uphoff_Movie1.avi "लक्ष्य =" _blank "> वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

हम प्रयोग की सफलता के लिए कई महत्वपूर्ण विचार पर चर्चा की.

चुनाव और फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति: photoactivatable और photoswitchable फ्लोरोसेंट प्रोटीन 17 की एक बड़ी पैलेट है. विशिष्ट विकल्प माइक्रोस्कोप विशेषताओं, उपलब्ध विशेष रूप से लेज़रों और फिल्टर पर निर्भर करता है. 405 एनएम और 561 एनएम का संयोजन आम photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए आदर्श है. हम यह मोनोमेरिक है क्योंकि PAmCherry 6 चुना है और कोशिकाओं में कोई एकत्रीकरण दिखाया. इसके अलावा, अपरिवर्तनीय photoactivation सेल प्रति प्रोटीन प्रतिलिपि संख्या को मापने के लिए सक्रिय fluorophores की संख्या की गणना की अनुमति देता है. इसके बजाय एक प्लाज्मिड से संलयन प्रोटीन व्यक्त की, हम जंगली प्रकार ठिकाना पर संलयन प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग के गुणसूत्र सम्मिलन पसंद करते हैं. इस फ्लोरोसेंट ve के साथ ब्याज की प्रोटीन की पूरी प्रतिस्थापन सुनिश्चित करता हैrsion और जंगली प्रकार अभिव्यक्ति के स्तर को बनाए रखने.

Photoactivation दर: यह औसत पर सेल प्रति कम से कम एक अणु फिल्म के किसी भी फ्रेम में फ्लोरोसेंट राज्य में है कि इस तरह के photoactivation दर को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह 405 एनएम तीव्रता पर निर्भर करता है और अणुओं की संख्या को सक्रिय करने के लिए छोड़ दिया. बहुत कम इमेजिंग घनत्व में, हालांकि, नहीं सभी अणुओं फिल्म के अंत से पहले imaged किया जाएगा या बहुत लंबे फिल्मों का अधिग्रहण किया जाना है. फिल्म के प्रति दर्ज की फ्रेम की संख्या संलयन सेल प्रति प्रोटीन और इस्तेमाल उत्तेजना की स्थिति में PAmCherry का मतलब photobleaching जीवनकाल की प्रतिलिपि संख्या पर निर्भर करता है. Pol1 की प्रतिलिपि संख्या ~ है 400 अणुओं / सेल 1 और घातीय photobleaching जीवनकाल वितरण का मतलब मूल्य ~ 4 फ्रेम था. धीरे - धीरे 405 एनएम तीव्रता में वृद्धि करके, सक्रियण समान रूप से फिल्म के 10,000 तख्ते पर वितरित किया जाता है. इसलिए, प्रत्येक कोशिका occup हैPSFs और 10,000 फ्रेम की एक फिल्म में नज़र रखने की जटिलताओं के कम ओवरलैप सुनिश्चित करने, ~ 1600 तख्ते की कुल के लिए फ्लोरोसेंट अणु द्वारा आइईडी.

एक्सपोजर समय और उत्तेजना तीव्रता: अग्रणी, जोखिम बार थोड़ा गति धुंधला साथ तेज PSFs निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त रूप से कम करने की आवश्यकता है. हालांकि, फ्रेम दर स्थानीयकरण अनिश्चितता परे लगातार फ्रेम के बीच नमूदार आणविक गति उपज के लिए चुना जाना चाहिए, अन्यथा महत्वपूर्ण फोटॉनों ट्रैक oversampling द्वारा बर्बाद कर रहे हैं. अनबाउंड अणुओं की गति स्थानीयकरण अनिश्चितता की वजह से बंधे हुए अणुओं के स्पष्ट प्रस्ताव से स्पष्ट रूप से अलग होने के लिए पर्याप्त रूप से लंबे समय के अंतराल पर जांचा जाना चाहिए. जोखिम समय सेट किया जाता है, पीएसएफ तीव्रता समायोजित किया जाना चाहिए. एक पीएसएफ का स्थानीयकरण सटीक एक फ्रेम की अवधि के दौरान पता चला फोटॉनों की संख्या के साथ बढ़ जाती है. हायर उत्तेजना तीव्रता फोटान उत्सर्जन दर बू वृद्धिटी भी photobleaching दर और पृष्ठभूमि संकेत. वांछित स्थानीयकरण सटीक देता है कि सबसे कम उत्तेजना तीव्रता का प्रयोग करें. Pol1-PAmCherry के लिए हम 15.26 मिसे / फ्रेम और 3.5 मेगावाट 561 एनएम उत्तेजना (400 डब्ल्यू / 2 सेमी) चुना. यह (Uphoff एट अल. 7 में पूरक जानकारी देखें) डाटा अधिग्रहण से पहले और बाद सेल के विकास और आकृति विज्ञान की निगरानी के द्वारा विशेष इमेजिंग स्थितियों के लिए सेल व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है.

Pol1 विवो 7 में एक दरारयुक्त डीएनए सब्सट्रेट करने के लिए ~ 2 सेकंड के लिए एक बाध्यकारी समय को दर्शाती है, इसलिए हम अणुओं के बहुमत एक ट्रैक की पूरी अवधि के लिए बाउंड या अनबाउंड राज्य में या तो होने की उम्मीद है. गुणसूत्र साइटों कोशिका द्रव्य में Pol1 प्रसार (~ 1 माइक्रोन 2 की तुलना में एक प्रसार गुणांक परिमाण कम के कई आदेशों (~ 10 -5 माइक्रोन 2 / सेक, Elmore एट अल. 18) है क्योंकि बाध्य अणुओं अनिवार्य रूप से स्थिर दिखाई देते हैं

प्रसार विश्लेषण: स्पष्ट प्रसार गुणांक डी * व्यक्तिगत पटरियों के एमएसडी से गणना की है, सांख्यिकीय त्रुटि को कम करने के लिए 4 कदम (5 फ्रेम) की एक न्यूनतम से अधिक औसत. उस ~ अणुओं की 75% वर्णित इमेजिंग स्थितियों के लिए कम से कम 5 फ्रेम के भीतर ब्लीच नोट. इतने कम पटरियों बाध्य और अपार अणुओं भेद करने के लिए पर्याप्त सांख्यिकीय निश्चितता प्रदान नहीं करते हैं. हालांकि, प्रोटीन गतिविधि पर रिपोर्ट है कि बाध्य और अपार अणुओं के रिश्तेदार अंशों का विश्लेषण पटरियों की कुल संख्या की स्वतंत्र हैं.

अनिश्चितता एक अणु 15 में से प्रत्येक के स्थानीयकरण के लिए एक स्पष्ट यादृच्छिक कदम कहते हैं, क्योंकि यह डी * की गणना में पीएसएफ स्थानीयकरण त्रुटि (σ एलओसी) के लिए खाते में करने के लिए उपयोगी है.

बाध्य और diffusing के अणुओं के वर्गीकरण में सुधार, हम डी * बॉट की गणना करने की अनुशंसादो फ्रेम के समय के साथ एकल कदम विस्थापन व विस्थापन से घंटे. यह दो अलग डी * सीमा को सेट करने के लिए तो संभव है: डी * (15 मिसे) <0.15 माइक्रोन 2 / सेकंड और डी * (30 मिसे) <0.075 माइक्रोन 2 / सेक.

डी * जोखिम समय के दौरान की वजह से प्रसार को धुंधला पटरियों और गति की सेल कारावास से प्रभावित है कि एक स्पष्ट प्रसार गुणांक है कि ध्यान दें. सही निष्पक्ष प्रसार गुणांक निकालने के लिए, यह एक stochastic ब्राउनियन गति मॉडल 5,7 के आधार पर नकली डेटा को मनाया प्रस्ताव तुलना करने के लिए उपयोगी साबित हो गया है. नकली डेटा भी डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस विधि के संभावित अनुप्रयोगों: हम गुणसूत्र के लिए बाध्य करने पर एक प्रोटीन की गतिशीलता में बदलाव से इन विवो में प्रोटीन डीएनए बातचीत visualizing और बढ़ाता के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण का वर्णन किया. डीएनए या की गतिविधियोंमरम्मत में शामिल शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, प्रतिकृति, प्रतिलेखन, और गुणसूत्र रखरखाव इस प्रकार ऑप्टिकल विवर्तन सीमा से नीचे एक स्थानिक संकल्प के साथ एकल कोशिका स्तर पर वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता. Photoactivated एकल अणु ट्रैकिंग सेल प्रति कुछ लेबल अणुओं के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं कि पारंपरिक ट्रैकिंग तरीकों फैली हुई है. Vivo में आणविक प्रसार उपाय है कि एक वैकल्पिक तरीका photobleaching (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली है. FRAP बड़े कोशिकाओं में वैश्विक प्रसार विशेषताओं को मापने के लिए बहुत उपयोगी है, यह विशेष रूप से छोटे जीवाणु कोशिकाओं के लिए, एक spatially विषम वातावरण में विभिन्न mobilities साथ कई आणविक प्रजातियों को हल करने की क्षमता में सीमित है.

हम डीएनए बाध्यकारी गतिविधियों और ई. में विभिन्न प्रोटीन की एक श्रृंखला के subcellular localizations को मापने के लिए ट्रैकिंग photoactivated एकल अणु आवेदन किया है कोली Pol1, डीएनए ligase, वित्तीय संस्थाओं प्रोटीन, डीएनए सहितपोलीमर्स तृतीय 7, साथ ही गुणसूत्रों प्रोटीन MukB, ई, एफ और 19 की स्ट्रक्चरल रखरखाव. हम विधि भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता आशा.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

हम स्थानीयकरण सॉफ्टवेयर के लिए कहे गए माइक्रोस्कोप और सीमस होल्डन के निर्माण के साथ मदद के लिए जस्टिन Pinkney और जोहानिस Hohlbein को स्वीकार करते हैं. रॉड्रिगो रेयेस-Lamothe ई. प्रदान करने के लिए आभार व्यक्त किया जाता है कोलाई तनाव. अनुसंधान यूरोपीय आयोग के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम अनुदान FP7/2007-2013 स्वास्थ्य F4-2008-201418, ब्रिटेन जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद अनुदान BB/H01795X/1, और ANK के लिए यूरोपीय अनुसंधान परिषद अनुदान 261227 द्वारा वित्त पोषित किया गया. डीजे एक वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम अनुदान WT083469 द्वारा वित्त पोषित किया गया. र एक MathWorks डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein created by Lambda-Red recombination
MEM amino acids Invitrogen 11130-051 minimal medium supplement
MEM vitamins Invitrogen 11120-052 minimal medium supplement
Agarose BioRad 161-3100 certified molecular biology grade
Microscope coverslips No 1.5 thickness Menzel BB024060SC remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1 hr
Methyl methanesulfonate (MMS) Sigma-Aldrich 129925 CAUTION: toxic
PALM setup home-built described in Uphoff et al.7
MATLAB MathWorks for data analysis and visualization
Localization software custom-written, available online http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al.13 if used in publication.
Tracking software available online http://physics.georgetown.edu/matlab/ MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier12 if used in publication.

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 85 सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी एकल कण ट्रैकिंग लाइव सेल इमेजिंग डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन डीएनए की मरम्मत आणविक प्रसार
Photoactivated एकल अणु ट्रैकिंग का प्रयोग लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत Visualizing
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Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. J. Vis. Exp. (85), e51177, doi:10.3791/51177 (2014).

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