Summary
En el siguiente experimento se describe un protocolo para rastrear el miedo acondicionado en ratones. Este tipo de memoria asociativa incluye un período de seguimiento que separa el estímulo neutro y el estímulo no condicionado.
Abstract
En este experimento se presenta una técnica para medir el aprendizaje y la memoria. En el protocolo acondicionado rastrear el miedo que se presenta aquí hay cinco emparejamientos entre un estímulo neutro y un estímulo incondicionado. Hay un período de 20 segundos traza que separa cada ensayo acondicionado. En la siguiente congelación día se mide durante la presentación del estímulo condicionado (EC) y el periodo de rastreo. En el tercer día hay una prueba de 8 min para medir la memoria contextual. Los resultados representativos son de los ratones que fueron presentados con el estímulo incondicionado aversivo (shock) en comparación con los ratones que recibieron las presentaciones de tono sin el estímulo incondicionado. Traza el condicionamiento del miedo se ha utilizado con éxito para detectar los déficits de aprendizaje y memoria y mejoras sutiles en los ratones que no se encuentran con otros métodos de condicionamiento del miedo. Este tipo de condicionamiento del miedo se cree que es dependiente de las conexiones entre la corteza medial prefrontal y el hipocampo. Una controversia actual es si se cree que este método es-amígdala independiente. Por lo tanto, es necesaria otra prueba acondicionado miedo para examinar los efectos de aprendizaje y memoria de la amígdala-dependientes, como a través del retardo condicionamiento del miedo.
Introduction
En el condicionamiento del miedo un estímulo neutro (NS) está emparejado con un estímulo aversivo incondicionado (EE.UU.). El NS es normalmente un tono y se convierte en un estímulo condicionado (EC) a través de apareamientos repetidos con los EE.UU.. El CS puede entonces provocar una respuesta condicionada (RC), tales como la congelación, en ausencia de la aversivo EE.UU.. Un protocolo acondicionado temor comúnmente utilizado es el retraso acondicionado. En este protocolo la aparición de la SN y los EE.UU. es contigua o con algún solapamiento en la presentación del estímulo. A pesar de que demora el condicionamiento del miedo es uno de los tipos más comunes de temporal acondicionado asociativo, hay varios otros tipos de arreglos temporales acondicionado asociativa: acondicionamiento simultánea, acondicionamiento de espaldas, y traza acondicionado 1. En traza el condicionamiento del miedo hay un intervalo de estímulo libre entre la SN y los EE.UU. de varios segundos que resulta en un período de "rastro".
Varios estudios han reportado déficits en traza el condicionamiento del miedo cuando lesiones neurotóxicas se producen en las estructuras que la entrada en el hipocampo 2-5 o cuando los agentes farmacológicos se utilizan para bloquear la función del receptor en el hipocampo. Lesión a los resultados del hipocampo en los déficits en rastro acondicionador y acondicionador contextual, pero no perjudica demora el condicionamiento del miedo 8. Hay varias ventajas a usar traza el condicionamiento del miedo. El protocolo acondicionado temor se puede lograr en un período de prueba de tres días de la memoria y permite hipocampo-dependiente que no es espacialmente dependiente. Traza el condicionamiento del miedo puede ser utilizado como una prueba complementaria para el laberinto de Morris agua, nuevo test de reconocimiento de objetos, u otras pruebas de laberinto en la investigación de la memoria dependiente del hipocampo.
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Protocol
Los ratones usados en el experimento siguiente se generaron y se alojaron en la Universidad de Baylor en una temperatura ambiente de 22 ° C, con una luz de 14 horas y 10 horas de oscuridad (20:00-06:00 h) ciclo diurno. Los ratones se les dio acceso ad libitum a comida y agua. Todos los procedimientos a los ratones estaban en el cumplimiento de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el protocolo de los animales fue aprobado por la Universidad de Baylor Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
Visión de conjunto
La traza acondicionado tarea temor se basa en los procedimientos descritos por Wiltgen y colegas 9.
1. Preparación de Equipo
La cámara de aparato de acondicionamiento de miedo (26 cm x 22 cm x 18 cm) se compone de dos partes que son de acrílico, dos lados que son metal, y un fondo suelo de rejilla que se utiliza para entregar un choque leve pie. La cámara de pruebas es la casad en una cámara de sonido atenuado. La cámara también es estanca a la luz para evitar que la luz fuera de influir en el software de detección de movimiento.
- Calibre los niveles de impacto, los niveles de luz, y los niveles de intensidad sonora de la cámara de prueba. Medir el nivel de fondo de la cámara de prueba. El ruido de fondo en esta cámara es de 65 dB. Utilice un medidor de sonido para medir este nivel. El medidor se debe establecer en 70 dB, establece en C, y para la detección de establecer lento.
- Calibre el nivel de impacto de 0,5 mA. Utilice un dispositivo de ajuste externo para calibrar correctamente el nivel de impacto (véase la Tabla de Materiales). La medición interna del generador de descargas no es exacta. El generador de descargas administra un choque revueltos, que no se puede medir con precisión mediante un medidor de amplificador estándar.
- Coloque un cable en una de las barras de la rejilla y colocar el otro cable de 3 o 4 bares terminado. Utilice el generador de descargas para administrar el shock. Ajuste el nivel de impacto hasta que se alcance el nivel correcto. Haga esto por each temer cámara de acondicionamiento.
- Cierre la puerta de la cámara cuando se mide el nivel de luz de la cámara. Calibre el nivel de luz de aproximadamente 1,0. Este es un número específico para el software freezeframe utilizado en este experimento. Un medidor de luz externa se lee esto como 2 lux. El nivel de luz puede ajustarse moviendo la ubicación de la luz de la casa o ajustando el condensador de la lente. Asegúrese de apretar los tornillos de ajuste de la lente después del ajuste.
- Calibre el nivel de decibeles de sonido de 85 dB. Utilice un medidor de decibelios externa dentro de la jaula de pruebas para calibrar el nivel de decibeles (ver Tabla de Materiales). El sonido se presenta será un tono de 2700 Hz. Nota: Si el uso de ratones mayores de 6 meses de edad, puede ser mejor utilizar ruido blanco ya que los ratones de edad avanzada pueden tener déficits auditivos.
- Después de que el aparato está listo tomar los sujetos a una sala de espera separada. Nota: No albergar el ratón en la habitación con la sala de pruebas.
- ª de la etiquetae la cola de los ratones a los que se pondrán a prueba con el fin de la prueba. Lo mejor es reducir la manipulación excesiva antes de la prueba. Alternativamente, las colas pueden ser etiquetados el día antes del experimento para reducir el manejo de estrés. Después de que los ratones han sido etiquetados les permite aclimatarse al ambiente durante 30 min. Tener jaulas limpias adicional para alojar a los ratones una vez finalizada la prueba.
2. Traza Acondicionado Día 1
- Retire cada ratón de la jaula y colocarlos en jaulas individuales para el transporte a la cámara de acondicionamiento miedo. Utilice ropa de cama limpia para cada jaula. Coloque una nota adhesiva en la caja de transferencia para mantener el orden de los ratones prueba correcta. Nota: Si los ratones son alojados individualmente, entonces pueden ser transportados en sus jaulas.
- Coloque el ratón en la cámara de pruebas y cierre la puerta. Inicie el programa de software.
- En el día de entrenamiento, permiten a los ratones para explorar la cámara durante 3 min. Entonces, el programa presenta un segundo tono de 20 (85 dB, 2700 Hz) to el animal. Después de un período de seguimiento de 20 seg un choque suave (2 seg, 0,5 mA) se administra al animal.
- Registre la reacción del sujeto para confirmar que recibieron los estímulos aversivos viendo el video. Un intervalo entre ensayos de 200 seg separa los ensayos de condicionamiento 5. Cada prueba consiste en un tono de 20 segundos seguida de un retraso de 20 segundos luego un shock.
- Una vez finalizada la prueba que el animal pueda permanecer en la cámara de ensayo durante 1 minuto antes de sacarla de la jaula de la prueba.
- Colocar el animal en la jaula de transferencia y devolverlo a su jaula. Si hay otros ratones en su jaula y luego albergar individualmente el ratón hasta que todos los ratones de prueba completa. Esto reducirá la tensión a la otra ratones que no han sido probados. Una solución alternativa sería para albergar por separado todos los ratones una semana antes de la prueba para reducir la influencia de la eliminación continua de los ratones de una jaula.
- Limpie la cámara de pruebas con isopropanol al 30% después de each animales se prueba.
- Repetir los pasos 2.2 a 2.7 para todos los ratones en la cohorte de pruebas.
- Volver a todos los ratones a su habitación después de la última colonia del ratón en la cohorte ha sido probado.
3. Traza el condicionamiento del miedo Día 2: Pruebas de memoria de seguimiento
- Las pruebas de memoria de seguimiento tendrá lugar el día 2. En este protocolo hay 3 presentaciones de tono. Coloque el ratón en un nuevo contexto para la prueba de rastreo acondicionado.
- Preparar el software para ejecutar un programa con un período de línea de base 2 min seguido de tres presentaciones de tono 20 seg. No sa 220 sec ITI entre cada presentación tono.
- Para la nueva condición de contexto, colocar insertos de acrílico transparente en el suelo de la cámara para alterar la forma, la textura, y el color de la cámara de acondicionamiento.
- Cambie el olor en la cámara mediante la colocación de extracto de vainilla en un barco bajo el peso de inserción baja.
- Limpie la cámara con etanol al 70% en lugar del 30% de isopropanol. Nota: Esto ayudará apara crear un nuevo contexto.
- Traiga a los ratones a la sala de espera y volver a etiquetar sus colas para probar si es necesario.
- Preparar las jaulas de transferencia de contexto novedosos mediante la sustitución de la ropa de cama con papel triturado. Nota: Esto le ayudará en la creación de un nuevo contexto.
- Coloque el ratón en la cámara de prueba, se iniciará el programa. Limpiar la cámara con etanol al 70% después de que se complete la prueba.
- Volver a los ratones a su jaula después de que se completó la traza acondicionado. Volver a todos los ratones a su habitación colonia cuando todos los ratones han sido probados.
4. Traza el condicionamiento del miedo Día 3: Pruebas de memoria contextual
- En el tercer día se lleva a cabo el condicionamiento contextual. Preparar el software para ejecutar un programa para grabar el comportamiento de congelación durante 8 min.
- Limpie la cámara con isopropanol al 30% antes de la prueba y después de las pruebas de cada ratón. El contexto debe ser idéntica a la del día 1. Las jaulas de transferencia deben ser el mismo que en el día 1.
- Coloque cada ratón en la cámara de pruebas se iniciará el programa. Limpie la cámara con isopropanol al 30% después de finalizar la prueba.
- Volver a todos los ratones a su habitación colonia cuando esté terminado.
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Representative Results
Para obtener resultados representativos se presentan datos de C57BL/6J ratones adultos control que recibieron los emparejamientos de estímulo neutro con el estímulo no condicionado (condición shock) en comparación con los ratones que recibieron el estímulo neutro, pero no recibieron el estímulo incondicionado (sin condiciones de choque). Es importante ejecutar esta condición cuando el ajuste inicial de esta prueba de comportamiento para determinar si el protocolo se ha realizado correctamente.
Los datos de la Figura 1 representan la jornada de formación de los ratones C57BL/6J en la prueba de acondicionamiento rastrear el miedo. Generalmente no es necesario comparar los grupos en todas las condiciones durante el día de entrenamiento. Sin embargo, es útil examinar el período de línea de base para evaluar si hay diferencias iniciales en la línea de base. No se observó ninguna diferencia en los niveles bajo cero en el estado básico t (1,10) = 0.6, p = 0.56. Esto demuestra que no hay diferencias iniciales en la congelación levels. En general, existen bajos niveles de congelación en las pruebas de aprendizaje temprano, pero hay un aumento en el comportamiento de congelación durante los ensayos acondicionado emparejamiento. Cuando realizamos un modelo mixto de ANOVA que analizó las diferencias entre el choque y ninguna condición de choque durante los 16 períodos se encontró un efecto principal del grupo F (1,10) = 60,3, p <0,001. Hubo un efecto principal de grupo F (1,10) = 215,9, p <0,001, y un grupo por interacción de tiempo F (1,10) = 133,9, p <0,001. El análisis demuestra que existía una diferencia significativa en la adquisición entre los dos grupos.
Los datos para la Figura 2 ilustran el comportamiento de congelación entre los ratones que habían emparejamientos de choque tono (Condición de choque) y los ratones que recibieron el mismo procedimiento sin el emparejamiento de choque (Choque no Condición) a través de los 5 ensayos de condicionamiento de tono. Los ratones en el Estado de Conmoción formaron una asociación entre las parejas de choque tono de traza el condicionamiento del miedo. Un mixto-Diseño de ANOVA se utilizó para examinar el efecto principal de aprendizaje para el grupo F (1, 10) = 83.48, p <0.001. También hubo un efecto principal de ensayos de condicionamiento (tiempo) F (3,30) = 24,83, p <0,001, y el grupo de interacción en tiempo X F (3,30) = 4.7, p <0.01. Como no había un grupo de interacción x tiempo, se realizaron pruebas t separadas por punto de tiempo para examinar la diferencia entre los grupos en cada punto de tiempo. Pruebas t independientes revelan diferencias significativas entre los grupos al inicio del estudio t (1,10) = 6.8, p <0,001; tono t (1,10) = 8.6, p <0,001; período rastro t (1,10) = 5,3 , p <0.001, y en el intervalo entre pruebas t (1,10) = 5.1, p <0.001. Por el tono, el período de seguimiento, y el intervalo entre ensayos los datos se promedian entre las tres presentaciones. Los datos demuestran que la traza acondicionado experimento produjo con éxito diferencias de aprendizaje en el protocolo de condicionamiento de huella.
Los datos para la Figura 3 demuestran la Freezción comportamiento entre los ratones que tenían parejas de choque (shock tono de Estado) y los ratones que recibieron el mismo procedimiento sin el emparejamiento de choque (shock No Condition) en la condición de contexto. La prueba de condiciones marco se presentó 48 horas después de que se implementó rastro acondicionado. Los ratones en el Estado de choque tenían significativamente más de congelación en el contexto original que el Choque no Condición ratones F (1,10) = 12.5, p <0,01. También hubo un efecto principal de tiempo F (7,70) = 5.5, p <0,001; sin embargo, no hubo interacción entre el tiempo y el grupo F (7,70) = 0,78, p = 0,61. Los datos demuestran que la traza acondicionado experimento produjo con éxito el aprendizaje contextual cuando el CS fue emparejado con un EE.UU. en traza el condicionamiento del miedo.
Figura 1.Los datos de la jornada de formación de traza el condicionamiento del miedo. Las barras negras representan los datos de los ratones que recibieron el estímulo incondicionado aversivo (shock). Las barras rojas representan los ratones que no recibieron el estímulo incondicionado aversivo (sin descarga), pero recibieron los estímulos de tono. Las barras representan la media ± error estándar de la media (SEM) por ciento de congelamiento para los ratones durante el día de entrenamiento.
Figura 2. Los datos de los ratones en el tono de prueba siguiente traza el condicionamiento del miedo. Los ratones que recibieron el estímulo no condicionado (condición de choque) había más de congelación en comparación con los ratones que no recibieron el choque (no es ningún shock Estado) en la línea de base, el tono, rastrear, y el intervalo entre ensayos (ITI). Las barras representan la media± error estándar de la media (SEM) por ciento de congelamiento para los ratones durante la prueba de sonido. Astericks (***) indican una diferencia significativa entre grupos (p <0,001).
Figura 3. De datos a partir de ratones ensayados en el ensayo de contexto siguiente traza el condicionamiento del miedo. Los ratones que recibieron el choque tenía más de congelación en comparación con los ratones en la condición de no choque en la condición de prueba contexto a través de la prueba 8 min. Los puntos de datos representan la media ± error estándar de la media (SEM) por ciento de congelación para los ratones durante la prueba de contexto. Astericks (***) indican una diferencia significativa entre grupos (p <0,001).
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Discussion
Se han realizado varios estudios que han aclarado el circuito neural que subyace traza el condicionamiento del miedo. Se cree Trazar el condicionamiento del miedo de involucrar a la CA1 del hipocampo 12-14. También hay evidencia de que la corteza prefrontal medial (mPFC) desempeña un papel importante en la traza de ojos parpadean acondicionado 15, y el córtex prefrontal medial se ha encontrado a participar en traza el condicionamiento del miedo. Un estudio encontró que las neuronas mPFC proporcionan una actividad sostenida durante el período de seguimiento, proporcionando así una estructura que pueda sostener la memoria durante el intervalo de traza 17.
Al examinar el papel del córtex prefrontal medial es posible examinar la línea de tiempo de eventos moleculares en la formación de una memoria asociativa. Runyan et al 16. Encontraron que la inhibición de la señal extracelular regulada quinasa (ERK) en el córtex prefrontal medial interfirió con la retención de la memoria, pero no interfirió con la codificación de la memoria. Además, un aumento en phosphorylated ERK en la corteza prefrontal se informó antes que en el hipocampo. Ya que se cree ERK estar involucrado en la memoria a largo plazo, el córtex prefrontal medial puede ser una estructura crítica implicada en la retención de la memoria a largo plazo. Otros estudios podrían examinar el papel de otras vías de señalización en la memoria a largo plazo y la interacción entre el córtex prefrontal medial y el hipocampo.
Otro uso de la huella es el condicionamiento del miedo en el examen de aprendizaje y memoria alteraciones dependientes del hipocampo sutiles. Las manipulaciones genéticas que reducen la inhibición GABAérgica mejorar condicionamiento de huella sin alterar demora el condicionamiento del miedo. Otro estudio encontró que rastrear el miedo acondicionado se mejoró sólo en ratones hembra que carecían del GABAA δ subunidad 9. Otro estudio encontró que rastrear el miedo acondicionado es mayor en los ratones que carecen de α4 GABAA 22. Por lo tanto, rastrear el condicionamiento del miedo puede ser útil examinar de aprendizaje y memoria sutiles mejoras del hipocampo-dependiente odéficits r. Traza acondicionado puede ser lo suficientemente sensible como para detectar el efecto de neuroesteroides en la actividad GABAeric similares a lo que se ha encontrado el uso de un miedo contextual acondicionado protocolo 23. Esto puede ser una consideración importante cuando se examinan los déficits de aprendizaje y memoria en un nocaut o ratón transgénico donde se utilizan ratones machos y hembras.
A pesar de que hay una gran cantidad de evidencia que rastrear el miedo acondicionado puede ser útil para examinar el papel del córtex prefrontal medial y el hipocampo, existe cierta controversia sobre si rastrear el miedo acondicionado es-amígdala independiente. En un informe que se realizó un estudio doble disociación para examinar la contribución de la amígdala y el hipocampo de rastrear y retrasar el condicionamiento del miedo 24. Cuando se inactivan la amígdala por el agonista de GABAA muscimol hubo deterioro en el condicionamiento contextual y demora sin interrumpir la adquisición o consolidación de traza el condicionamiento del miedo. La inactivación de thhipocampo dorsal e deteriorados condicionamiento de huella y la memoria contextual sin perjudicar demora el condicionamiento del miedo. A pesar de que estos resultados apoyan firmemente que rastrear el miedo acondicionado no requiere la amígdala, otros estudios han encontrado resultados contradictorios 25-27. Kwapis et al. 25 encontraron que la consolidación de la demora y rastrear el condicionamiento del miedo se ve interrumpida por la infusión de la síntesis de proteínas inhibidor anisomysin en la amígdala basolateral. A pesar de que estos documentos parecen contradecirse entre sí hay varias diferencias de procedimiento que deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza rastrear el miedo acondicionado.
Al examinar traza el condicionamiento del miedo, es importante tener en cuenta varios parámetros experimentales. Uno es el tipo de animal para usar en este tipo de acondicionado asociativo. El estudio realizado por Kwapis et al. 25 ratas utilizadas y el estudio 24 ratones usados Raybuck y Lattal por lo que haypueden ser las diferencias entre especies en la neurocircuitry que subyace traza el condicionamiento del miedo. El protocolo se describe en este documento se ha diseñado para los ratones. Este protocolo se puede utilizar para las ratas u otras especies, pero tendrá que ser realizado para determinar la validez en otros animales estudios de validación que utilizan un diseño experimental doble disociación para inactivar la amígdala y el hipocampo.
Otra consideración es el número de ensayos de condicionamiento traza en la jornada de formación. Puede ser que más o menos ensayos de condicionamiento podrían influir en los que las estructuras neurales son reclutados en traza el condicionamiento del miedo. En este protocolo se utilizaron cinco ensayos de condicionamiento. Si se añaden los ensayos de condicionamiento adicionales entonces podría ser la activación adicional de otras estructuras nerviosas que llegan a ser contratados con las combinaciones adicionales. Además, el período de seguimiento podría alargar o acortar si el número de emparejamientos se va a modificar. Sin embargo, hay alguna evidencia de que shointervalos de traza rt no se involucran el hipocampo y pueden producir resultados similares a retrasar el condicionamiento del miedo, que no tiene intervalo entre la presentación de la CS y los EE.UU.. Por lo tanto un intervalo de traza que van desde 15 hasta 20 segundos ha sido reportado en varios estudios para dedicarse al hipocampo. Otra alteración podría ser la fuerza del estímulo no condicionado. En el protocolo presentado aquí el choque fue ajustado a 0,5 mA. Si se necesitan emparejamientos adicionales del nivel de impacto podría reducirse a 0,3 mA. Si se necesitan menos golpes, a continuación, nivel de impacto se podría establecer a 0,7 mA. A nivel de impacto superior a 0,7 mA debe ser evitado.
Cuando se realizan estudios de validación para dependiente del hipocampo rastro acondicionado una consideración es cuando se inactiva la estructura neural. Se ha encontrado que los circuitos alternativos pueden ser utilizados en condicionamiento de miedo contextual que no utilizan el hipocampo cuando se inactiva antes de la formación. Por lo tanto, el momento de la inactivación de destructuras neurales ifferent durante condicionamiento de huella es una consideración importante.
Otra consideración importante para los experimentos de condicionamiento del miedo es el nivel de referencia. El nivel de referencia es importante informar ya que muchos estudios se restan los niveles de referencia de los niveles de congelación durante la presentación del tono 32 o restar los niveles de referencia a partir del intervalo entre ensayos 33. Estas manipulaciones tienen el supuesto subyacente de que los niveles de línea de base son los mismos grupos de todo. Sin embargo, una correlación positiva se ha informado entre los niveles de miedo de referencia y los niveles de miedo de tono 34. El trabajo de Jacobs et al. 34 se describen varias estrategias para reducir los niveles de referencia y la forma de dar cuenta de los niveles de referencia durante el condicionamiento del miedo. Estas son consideraciones importantes cuando se utiliza el método de la razón de la congelación en el tono acondicionado sobre los niveles de referencia, utilizando el método de sustracción, o cuando se utiliza the método de línea de base de covarianza para dar cuenta de las diferencias de nivel de línea de base.
Al establecer primero el condicionamiento del miedo, otro control importante es el uso de un grupo de control no apareado. El grupo de control no apareado puede consistir en un montaje experimental donde hay intervalos aleatorios entre la presentación de la CS y los EE.UU.. Otro enfoque puede ser en el que el CS y EE.UU. se presentan en diferentes días 29. El grupo de control no apareado es útil para determinar los efectos no asociativas tales como la sensibilización, el estrés de la novedad, pseudoconditioning, y otros factores que pueden contribuir al comportamiento de congelación. Smith et al. 29, describe el uso de diferentes tipos de protocolos de acondicionamiento rastrear el miedo y la forma en que se pueden optimizar para reducir los efectos no asociativo en tres cepas diferentes de ratones. Estas son consideraciones importantes cuando se optimiza el condicionamiento del miedo en ratones.
Rastrear el miedo acondicionado ofrece Several ventajas que pueden complementar los hallazgos en la demora condicionamiento del miedo y el aprendizaje espacial. Sin embargo, uno debe ser consciente de que la elección de los roedores, el número de ensayos de condicionamiento traza, y el momento de la manipulación de circuitos puede alterar significativamente los resultados y la interpretación de los resultados. Otra limitación es que es controversial si rastrear el miedo acondicionado puede ser usado para examinar el aprendizaje de la amígdala-dependiente. Esto puede ser una limitación cuando primero examinar el efecto de un tratamiento o un animal knockout. En términos de estrategia, sería mejor usar primero un condicionamiento protocolo retraso temido que puede examinar el aprendizaje y la memoria dependiente de la amígdala y contextual acondicionado, que es dependiente del hipocampo. Uno puede entonces utilizar otra cohorte de sujetos para examinar más de aprendizaje y memoria diferencias en traza el condicionamiento del miedo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por una beca de la Universidad de Baylor Research Council y de una beca de investigación de la Fundación para la Epilepsia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreezeFrame | Coulbourn | ||
| 30% Isopropanol | Purchase 90% isopropanol and dilute it down to 30% | ||
| 70% Ethanol | |||
| Amp-meter | Med-Associates | ENV-420 | Windows XP, Vista, and 7 Compatible (32-bit only) |
| Digital Sound Level Meter | 33-2055 | ||
| Vanilla Extract | McCormick Pure Vanilla Extract | ||
| Sticky Notes | Post-it | 3 in x 3 in |
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