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Behavior

Traçar medo condicionado em ratos

Published: March 20, 2014 doi: 10.3791/51180

Summary

No experimento seguinte, descrevemos um protocolo para traço medo condicionado em ratos. Este tipo de memória associativa inclui um período de traço que separa o estímulo neutro eo estímulo incondicionado.

Abstract

Neste experimento, apresentamos uma técnica para medir a aprendizagem ea memória. No protocolo condicionado traço medo aqui apresentada há cinco sorteios entre um estímulo neutro e um estímulo incondicionado. Há um período de rastreio de 20 segundos que separa cada ensaio condicionado. Na próxima congelamento dia é medido durante a apresentação do estímulo condicionado (CS) e período de vestígios. No terceiro dia, há um teste de 8 minutos para medir a memória contextual. Os resultados representativos são de camundongos que foram apresentados com o estímulo incondicionado aversivo (choque) em comparação com ratos que receberam as apresentações de tom, sem o estímulo incondicionado. Rastreamento medo condicionado foi usado com sucesso para detectar déficits e melhorias sutis de aprendizagem e memória em ratos que não são encontrados com outros métodos de medo condicionado. Este tipo de medo condicionado é considerada dependente da ligação entre o córtex pré-frontal e o hipocampo medial. Uma controvérsia atual é saber se este método é acreditado para ser independente de amígdala. Portanto, é necessário outro teste medo condicionado para examinar os efeitos de aprendizagem e memória dependente de amígdala, como através do atraso medo condicionado.

Introduction

Com medo condicionado um estímulo neutro (NS) está emparelhado com um estímulo incondicionado aversivo (EUA). O NS é normalmente um tom e se torna um estímulo condicionado (CS) através de sorteios repetidos com os EUA. O CS pode então induzir uma resposta condicionada (CR), tal como a congelação, na ausência do aversivo EUA. Um protocolo de condicionamento do medo utilizada é atraso condicionado. Neste protocolo o início do NS e os EUA é contíguo ou com alguma sobreposição na apresentação do estímulo. Mesmo que demora medo condicionado é um dos tipos mais usados ​​de condicionamento associativo temporais, existem vários outros tipos de arranjos temporais condicionamento associativo: condicionamento simultâneo, condicionado para trás, e traço condicionado 1. No rastro do medo condicionado há um intervalo livre de estímulo entre o NS e os EUA de vários segundos, resultando em um período de "trace".

Vários estudos relataram déficits em rastreio de condicionamento de medo quando as lesões neurotóxicas são produzidas nas estruturas de entrada em que as hipocampo 2-5 ou quando os agentes farmacológicos são utilizados para bloquear a função do receptor no hipocampo. Lesão aos resultados hipocampo os défices traço e no condicionamento contextual, mas não prejudica atraso medo condicionado 8. Existem várias vantagens de se utilizar traço medo condicionado. O protocolo de condicionamento ao medo pode ser alcançado depois de um período de teste de três dias e permite a memória dependente do hipocampo que não é espacialmente dependente. Traçar medo condicionado pode ser usado como um exame complementar para o labirinto Morris água, romance teste de reconhecimento de objeto, ou outros testes de labirinto em investigar a memória dependente do hipocampo.

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Protocol

Os ratos utilizados no experimento seguinte foram gerados e alojados na Universidade de Baylor em uma temperatura ambiente de 22 ° C, com uma luz de 14 horas e 10 horas escuro (20:00-06:00 hr) ciclo diurno. Os ratinhos foram fornecidas ad libitum acesso a comida e água. Todos os procedimentos para os ratos estavam em conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e do protocolo de animais foi aprovado pela Universidade de Baylor Animal Care e do Comitê Use.

Visão global

A tarefa do medo condicionado traço é baseado em procedimentos descritos por Wiltgen e colegas 9.

1. Preparação do Equipamento

A câmara de aparelho de condicionamento do medo (26 centímetros x 22 cm x 18) consiste de duas partes que são de acrílico, de dois lados, que são de metal, e um chão de grade de fundo, que é usado para fornecer um choque no pé leve. A câmara de teste é a casad em uma câmara de som atenuado. A câmara também é apertado luz para evitar a luz do lado de fora de influenciar o software de detecção de movimento.

  1. Calibrar os níveis de choque, os níveis de luz, e os níveis de intensidade sonora para a câmara de testes. Medir o nível de fundo da câmara de testes. O ruído de fundo nesta câmara é de 65 dB. Use um medidor de som para medir este nível. O medidor deve ser ajustado para 70 dB, definido como C, e para a detecção de ajuste lento.
    1. Calibrar o nível de choque de 0,5 mA. Use um dispositivo de calibração externa para calibrar corretamente o nível de choque (ver Tabela Materiais). A medição interna do gerador de choque não é preciso. O gerador de choque administra um choque mexidos que não pode ser medido com precisão por um medidor de amp padrão.
    2. Coloque uma das pontas em um dos bares da rede e colocar os outros levam 3 ou 4 bares mais. Use o gerador de choque para administrar o choque. Ajuste o nível de choque até o nível correto seja atingido. Faça isso por eAch temer câmara de condicionamento.
    3. Feche a porta para a câmara quando se mede o nível de luz da câmara. Calibrar o nível de luz de aproximadamente 1,0. Este é um número específico para o software freezeframe utilizado nesta experiência. Um medidor de luz externa vai ler isso como 2 lux. O nível de luz pode ser ajustada movendo a localização da luz casa ou ajustando o condensador da lente. Certifique-se de apertar os parafusos de ajuste para a lente após o ajuste.
    4. Calibrar o nível do som em decibéis a 85 dB. Use um decibelímetro externo dentro da gaiola de testes para calibrar o nível de decibéis (ver Tabela Materiais). O som apresentado será um tom Hz 2.700. Nota: Se estiver usando camundongos com idade superior a 6 meses de idade, pode ser melhor usar o ruído branco desde ratos mais velhos podem ter déficit auditivo.
  2. Depois que o aparelho está pronto levar os sujeitos a uma sala de espera separada. Nota: Não abrigar o mouse na mesma sala, como a sala de testes.
  3. ª rótuloe a cauda dos ratos que serão testadas em ordem de teste. É melhor reduzir o manuseio excessivo antes do teste. Alternativamente, as caudas podem ser rotuladas no dia anterior ao ensaio para reduzir a lidar com o stress. Após os ratinhos foram rotulados permitir a aclimatar ao ambiente durante 30 minutos. Tenha gaiolas adicional limpas para abrigar os ratos após o teste é concluído.

2. Traçar Condicionado Dia 1

  1. Retire cada rato da gaiola e colocá-los em gaiolas individuais para o transporte para a câmara de medo condicionado. Use roupa de cama limpa para cada gaiola. Coloque uma nota em gaiola transferência para manter a ordem de camundongos testando correta. Nota: Se os ratos são alojados individualmente em seguida, eles podem ser transportadas na sua gaiola de origem.
  2. Posicione o mouse na câmara de teste e fechar a porta. Inicie o programa de software.
  3. No dia de treino, permite que os ratinhos para explorar a câmara durante 3 min. O software em seguida, apresenta a 20 seg de tom (85 dB, 2.700 Hz) to animal. Depois de um período de rastreio de 20 seg um choque ligeiro (2 s, 0,5 mA) é administrado ao animal.
  4. Registre a reação do assunto para confirmar que recebeu os estímulos aversivos, visualizando o vídeo. Um intervalo inter-julgamento 200 seg separa os ensaios 5 condicionamento. Cada ensaio consiste de 20 seg tom seguido por um atraso de 20 segundos, em seguida, um choque.
  5. Após o teste é concluído que os animais possam permanecer na câmara de teste durante 1 minuto antes de a retirar da gaiola de teste.
  6. Colocar o animal de volta na gaiola de transferência e devolvê-lo à sua gaiola. Se houver ratos adicionais em sua gaiola casa, então abrigar individualmente o mouse até que todos os ratos de teste completo. Isto irá reduzir a tensão para o outro ratos que não foram testados. Uma solução alternativa seria a de abrigar individualmente todos os ratinhos uma semana antes do ensaio, para reduzir a influência da remoção contínua ratinhos de uma gaiola.
  7. Limpe a câmara de testes com 30% de isopropanol após each animal é testado.
  8. Repita os passos de 2,2-2,7 para todos os murganhos no grupo do teste.
  9. Retornar todos os ratos para o quarto colônia após o último rato na coorte foi testado.

3. Rastreamento Medo Condicionado Day 2: Teste de memória Rastreamento

  1. Teste de memória rastreamento ocorrerá no dia 2. Neste protocolo há 3 apresentações de tom. Coloque os ratos em um novo contexto para o teste traço condicionado.
  2. Prepare o software para executar um programa com um período inicial de 2 min seguido por três apresentações de 20 segundos de tom. Há sa 220 sec ITI entre cada apresentação tom.
  3. Para a nova condição contexto, colocar inserções de acrílico no chão da câmara para alterar a forma, textura e cor da câmara de condicionamento.
  4. Alterar o odor na câmara, colocando extrato de baunilha em um barco pesar sob a inserção chão.
  5. Limpar a câmara com etanol a 70% em vez de 30% de isopropanol. Nota: Isso vai ajudarpara criar um novo contexto.
  6. Traga os ratos para a sala de detenção e relabel suas caudas para testes, se necessário.
  7. Prepare novas gaiolas de transferência contexto, substituindo a cama com papel picado. Nota: Isso vai ajudar na criação de um novo contexto.
  8. Coloque os ratos na câmara de teste, em seguida, iniciar o programa. Limpar a câmara com etanol a 70% após o teste é concluído.
  9. Retorne os ratos para sua gaiola para casa após o traço condicionado está concluída. Retornar todos os ratos para o quarto colônia quando todos os ratos foram testados.

4. Rastreamento Medo Condicionado Dia 3: Teste de memória Contextual

  1. No terceiro dia de condicionamento contextual é conduzida. Prepare o software para executar um programa para gravar o comportamento de congelamento por 8 min.
  2. Limpe a câmara com 30% isopropanol antes de testar e depois de testar cada rato. O contexto deve ser idêntica à do dia 1. As gaiolas de transferência deve ser o mesmo que no dia 1.
  3. Coloque cada rato na câmara de teste, em seguida, iniciar o programa. Limpe a câmara com 30% de isopropanol após o teste é concluído.
  4. Retornar todos os ratos para o quarto colônia quando concluído.

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Representative Results

Para os resultados representativos são apresentados dados de ratos adultos da estirpe C57BL/6J de controlo que receberam os emparelhamentos de estímulo neutro com o estímulo não condicionado (choque condição) em comparação com os ratos que receberam o estímulo neutro, mas não receberam o estímulo não condicionado (nenhum estado de choque). É importante executar esta condição quando a primeira criação deste teste comportamental para determinar se o protocolo foi realizado corretamente.

Os dados apresentados na Figura 1 representam a dia de treino de ratos C57BL/6J no ensaio de rastreio de condicionamento de medo. Geralmente, não é necessário comparar os grupos em todas as condições durante o dia de treinamento. No entanto, é útil examinar o período de linha de base para avaliar se existem diferenças iniciais na linha de base. Não foram observadas diferenças em níveis de congelamento no estado inicial t (1,10) = 0,6, p = 0,56. Isso demonstra que não há diferenças iniciais no congelamento levels. Em geral, existem baixos níveis de congelamento nos julgamentos de aprendizagem precoce, mas há um aumento no comportamento de congelamento durante os ensaios condicionado emparelhamento. Quando realizamos uma análise de variância de modelo misto, que analisou as diferenças entre o choque ea Nenhuma condição de choque ao longo dos 16 períodos encontramos um efeito principal do grupo F (1,10) = 60,3, p <0,001. Houve um efeito principal do grupo F (1,10) = 215,9, p <0,001, e um grupo por interacção do tempo F (1,10) = 133,9, p <0,001. A análise demonstra que houve uma diferença significativa na aquisição entre os dois grupos.

Os dados para a Figura 2 ilustra o comportamento de congelação entre os ratos que tinham emparelhamentos tom de choque (choque Estado) e os ratinhos que receberam o mesmo procedimento sem o emparelhamento de choque (n Choque Estado) entre os cinco ensaios tom condicionado. Os ratos na condição de choque formada uma associação entre os pares de choque em tom traço medo condicionado. Um misto-Design ANOVA foi utilizada para examinar o efeito principal do aprendizado para o grupo F (1, 10) = 83,48, p <0,001. Houve também um efeito principal de ensaios condicionado (tempo) F (3,30) = 24,83, p <0,001, e interação grupo X tempo F (3,30) = 4,7, p <0,01. Uma vez que não havia uma interacção x tempo grupo, t-testes separados por ponto de tempo foram realizados para examinar a diferença entre os dois grupos em cada ponto de tempo. Testes t separados revelou diferença significativa entre os grupos na linha de base t (1,10) = 6,8, p <0,001; tom t (1,10) = 8,6, p <0,001; período traço t (1,10) = 5,3 , p <0,001, e no intervalo inter-ensaio T (1,10) = 5,1, p <0,001. Para o tom, o período de rastreio, eo intervalo inter-julgamento dos dados foi calculada a média dos três apresentações. Os dados demonstram que o condicionamento experimento traço produzido com sucesso diferenças de aprendizagem para o protocolo de rastreio condicionado.

Os dados para a Figura 3 demonstram o congelamentoção de comportamento entre os ratos que tinham pares de choque tom (choque Condição) e os ratos que receberam o mesmo procedimento sem o emparelhamento choque (Sem Choque Condição) na condição de contexto. Os testes de condição contexto foi apresentado 48 horas após traço condicionado é implementado. Os ratos no Estado de choque tinha significativamente mais frio no contexto original do que o n Choque Estado ratinhos F (1,10) = 12,5, p <0,01. Houve também um efeito principal de tempo F (7,70) = 5,5, p <0,001, no entanto, não houve interação entre tempo e grupo F (7,70) = 0,78, p = 0,61. Os dados demonstram que o condicionamento experimento traço produzido com sucesso a aprendizagem contextual quando o CS foi emparelhado com um traço dos EUA no medo condicionado.

Figura 1
Figura 1.Os dados do dia a formação de vestígios de condicionamento de medo. As barras pretas representam os dados obtidos com ratos que receberam o estímulo não condicionado aversivo (choque). As barras vermelhas representam os ratos que não receberam o estímulo incondicionado aversivo (sem choque), mas receberam os estímulos de tom. As barras representam a média ± erro padrão da média (SEM) por cento de congelamento para os ratos durante o dia de treinamento.

Figura 2
Figura 2. Dados de ratos no teste tom seguinte rastreamento de medo condicionado. Os ratos que receberam o estímulo incondicionado (condição Choque) tinha mais de congelamento em comparação com os ratos que não receberam o choque (Sem Choque condição) na linha de base, tom, rastrear e intervalo entre tentativas (ITI). As barras representam a média± erro padrão da média (SEM) por cento de congelamento para os ratos durante o teste de tom. Astericks (***) indicam uma diferença grupo significativo (p <0,001).

Figura 3
Figura 3. Dados a partir de ratos testados no teste seguinte contexto de rastreio de condicionamento de medo. Os ratos que receberam o choque tinha mais de congelação em comparação com os ratos no estado n choque na condição teste contexto através do ensaio 8 min. Os pontos de dados representam a média ± erro padrão da média (SEM) por cento de congelamento para os ratos durante o teste de contexto. Astericks (***) indicam uma diferença grupo significativo (p <0,001).

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Discussion

Houve vários estudos que têm elucidado o circuito neural que subjaz traço medo condicionado. Traçar medo condicionado é acreditado para envolver CA1 do hipocampo 12-14. Existe também evidência de que o córtex pré-frontal medial (CPFm) desempenha um grande papel no rastreio do pestanejar condicionado 15, e o CPFm foi encontrado para ser envolvido no rastreio de condicionamento de medo. Um estudo descobriu que os neurônios mPFC fornecer atividade sustentada durante o período de rastreio, proporcionando, assim, uma estrutura que possa sustentar a memória durante o intervalo de traço 17.

Ao examinar o papel do CPFm é possível examinar a linha de tempo de eventos moleculares na formação de uma memória associativa. Runyan et al. 16 descobriram que inibindo a regulada por sinal extracelular quinase (ERK), no mPFC interferiu com a retenção de memória, mas não interferiu com a codificação de memória. Além disso, um aumento na phosphorylated ERK no córtex pré-frontal foi relatado mais cedo do que no hipocampo. Uma vez que ERK se acredita estar envolvido na memória de longo prazo, o CPFm pode ser uma estrutura fundamental envolvido na retenção da memória de longo prazo. Outros estudos poderiam examinar o papel de outras vias de sinalização na memória de longo prazo e da interação entre o mPFC e hipocampo.

Outro uso do traço medo condicionado está em examinar as alterações de aprendizagem e memória dependentes do hipocampo sutis. Manipulações genéticas que reduzem a inibição GABAérgica melhorar traço condicionado sem alterar atraso medo condicionado. Outro estudo descobriu que traço medo condicionado foi reforçada apenas em ratos fêmeas que não tinham o GABAA δ subunidade 9. Um estudo separado descobriu que traço medo condicionado é reforçada em ratos que faltam GABAA α4 22. Portanto, trace o condicionamento do medo pode ser útil para examinar de aprendizagem e memória dependente do hipocampo melhorias sutis odéfices r. Rastreamento condicionado pode ser sensível o suficiente para detectar o efeito de neuroesteróides sobre a atividade GABAeric semelhante ao que foi encontrado usando um protocolo de condicionamento do medo contextual 23. Esta poderia ser uma consideração importante ao examinar os déficits de aprendizagem e memória em um nocaute ou um rato transgênico onde homens e camundongos fêmeas são usados.

Mesmo que haja uma grande quantidade de evidências de que trace o condicionamento do medo pode ser útil para examinar o papel do mPFC eo hipocampo, há alguma controvérsia se trace medo condicionado é independente de amígdala. Em um relato eles realizaram um estudo duplo dissociação para examinar a contribuição da amígdala e hipocampo para rastrear e atrasar o condicionamento do medo 24. Quando a amígdala inativado pelo agonista GABAA muscimol houve deficiência no condicionamento contextual e atraso sem interromper a aquisição ou consolidação do traço medo condicionado. Inativação do the hipocampo dorsal prejudicada traço condicionado e memória contextual sem prejudicar atraso medo condicionado. Mesmo que estes resultados suportam fortemente que traço medo condicionado não requer a amígdala, outros estudos têm encontrado resultados conflitantes 25-27. Kwapis et al. 25 encontraram que a consolidação de atraso e traçar o condicionamento do medo é interrompido pela infusão da proteína síntese inibidor anisomysin na amígdala basolateral. Mesmo que esses papéis parecem contradizer-se há várias diferenças processuais que precisam ser levados em consideração quando executar traço medo condicionado.

Ao examinar traço medo condicionado é importante considerar vários parâmetros experimentais. Um deles é o tipo de animal a utilizar neste tipo de condicionamento associativo. O estudo realizado por Kwapis et al. 25 ratos utilizados e os Raybuck e Lattal 24 estudo ratos utilizados para que hajaPode haver diferenças de espécies no neurocircuitry que subjaz traço medo condicionado. O protocolo descrito neste artigo é projetado para camundongos. Este protocolo pode ser utilizado para ratazanas ou outras espécies, mas estudos de validação que utilizam um design experimental dupla dissociação para inactivar a amígdala e o hipocampo terão de ser realizados para determinar a validade em outros animais.

Outra consideração é o número de tentativas de traço condicionado no dia de treinamento. Pode ser que mais ou menos testes de condicionamento pode influenciar que estruturas neurais são recrutados em traço medo condicionado. Neste protocolo foram utilizados cinco ensaios condicionado. Se forem adicionados ensaios adicionais condicionado então poderia haver ativação adicional de outras estruturas neurais que se tornam recrutados com os pares adicionais. Além disso, o período de rastreio pode ser alongado ou encurtado, se o número de emparelhamentos está a ser alterada. No entanto, há alguma evidência de que shointervalos de traço rt não envolver o hipocampo e podem produzir resultados semelhantes para atrasar o condicionamento do medo, que não tem intervalo entre a apresentação do CS e os EUA. Portanto, um intervalo de traço que varia a partir de 15-20 seg foi avaliado em vários estudos para engatar no hipocampo. Outra modificação pode ser a força do estímulo não condicionado. No protocolo aqui apresentado o choque foi ajustado a 0,5 mA. Se forem necessários pares adicionais a nível de choque poderia ser reduzida a 0,3 mA. Se forem necessários menos choques, então o nível de choque poderia ser ajustado para 0,7 mA. Deve ser evitado um nível de choque superiores a 0,7 mA.

Ao realizar estudos de validação para dependentes de hipocampo traço condicionado a consideração é quando a estrutura neural é inativado. Verificou-se que os circuitos alternativos podem ser usados ​​na condicionamento do medo contextual que não utilizam o hipocampo quando é inactivado antes da formação. Portanto, o tempo de inactivação de destruturas neurais iferentes durante traço condicionado é uma consideração importante.

Outra consideração importante para as experiências de medo condicionado é o nível de referência. O nível de base é importante para relatar uma vez que muitos estudos subtrair os níveis basais de os níveis de congelamento durante a apresentação tom 32 ou subtrair os níveis basais do intervalo inter-julgamento 33. Estas manipulações têm a suposição de que os níveis da linha de base são os mesmos grupos de diâmetro. No entanto, tem sido relatada uma correlação positiva entre os níveis de medo da linha de base e os níveis de tom de medo 34. O trabalho de Jacobs et al. 34 descreve várias estratégias para reduzir os níveis de linha de base e como contabilizar os níveis basais durante o medo condicionado. Estas considerações são importantes quando se utiliza o método da razão de congelação em tom condicionado em relação aos níveis de linha de base, utilizando o método de subtracção, ou quando se utiliza the método de base co-variável para explicar as diferenças de nível de linha de base.

Quando pela primeira vez estabelecer medo condicionado, outro controle importante é o uso de um grupo de controle não pareado. O grupo de controlo não emparelhado pode consistir de uma montagem experimental onde existem intervalos aleatórios entre a apresentação do CS e os EUA. Outra abordagem pode ser onde o CS e os EUA são apresentados em diferentes dias 29. O grupo controle não pareado é útil para determinar os efeitos não associativas, tais como sensibilização, stress novidade, pseudoconditioning, e outros fatores que podem contribuir para o comportamento de congelamento. Smith et al. 29, descreve o uso de diferentes tipos de medo protocolos de condicionamento de traço e como eles podem ser otimizados para reduzir os efeitos não associativas em três diferentes linhagens de camundongos. Estas são considerações importantes quando se otimizar o condicionamento do medo em camundongos.

Rastreamento medo condicionado oferece several vantagens que podem complementar as descobertas em atraso medo condicionado e aprendizagem espacial. No entanto, é preciso estar ciente de que a escolha de roedor, número de tentativas de condicionamento de traço, eo tempo de manipulação circuito pode alterar significativamente o resultado e interpretação dos resultados. Outra limitação é que é controverso se traço medo condicionado pode ser utilizado para analisar a aprendizagem dependente da amígdala. Esta pode ser uma limitação ao primeiro examinar o efeito de um tratamento ou um animal knockout. Em termos de estratégia, seria melhor primeiro usar um protocolo temia-delay condicionado que pode examinar aprendizagem dependente da amígdala ea memória e contextual-condicionado, que é dependente do hipocampo. Pode-se então usar um outro grupo de indivíduos para examinar melhor as diferenças de aprendizagem e memória em traço medo condicionado.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa da Universidade de Baylor e de uma bolsa de pesquisa da Fundação de Epilepsia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreezeFrame Coulbourn
30% Isopropanol Purchase 90% isopropanol and dilute it down to 30%
70% Ethanol
Amp-meter Med-Associates ENV-420 Windows XP, Vista, and 7 Compatible (32-bit only)
Digital Sound Level Meter 33-2055
Vanilla Extract McCormick Pure Vanilla Extract
Sticky Notes Post-it 3 in x 3 in

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Comportamento Edição 85 o condicionamento do medo aprendendo traço condicionado memória condicionado e estímulo incondicionado o estímulo neutro dependente da amígdala aprendizagem
Traçar medo condicionado em ratos
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Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley,More

Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace Fear Conditioning in Mice. J. Vis. Exp. (85), e51180, doi:10.3791/51180 (2014).

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