Summary
I följande experiment beskriver vi ett protokoll för spår rädsla konditionering i möss. Denna typ av associativt minne innefattar ett svepperioden som separerar neutrala stimulit och det obetingade stimulans.
Abstract
I detta experiment presenterar vi en teknik för att mäta inlärning och minne. I spår rädsla konditione protokoll presenteras här finns fem ihopkopplingar mellan en neutral stimulus och ett obetingat stimulus. Det finns en 20 sek spår period som separerar varje konditione rättegång. På följande dag frysning mäts under presentationen av betingad stimulus (CS) och spårperioden. På tredje dagen finns det en 8 min test för att mäta kontextuella minnet. De representativa resultaten är från möss som presenterades med aversiva obetingat stimulus (chock) jämfört med möss som fick tonen presentationer utan obetingat stimulus. Trace rädsla konditione har framgångsrikt använts för att upptäcka subtila inlärning och minne underskott och förbättringar i möss som inte finns med andra metoder rädsla konditionering. Denna typ av rädsla konditione tros vara beroende av förbindelser mellan den mediala prefrontala cortex och hippocampus. En aktuell kontrovers är om denna metod tros vara amygdala oberoende. Därför behövs andra rädsla konditione tester för att undersöka amygdala beroende inlärning och minneseffekter, t.ex. genom fördröjnings rädsla konditionering.
Introduction
I rädsla konditione ett neutralt stimulus (NS) paras med en aversiv obetingat stimulus (US). NS är normalt en ton och blir en betingad stimulus (CS) genom upprepade parningar med USA. CS kan då framkalla en betingad respons (CR), såsom frysning, i frånvaro av den bitter USA. En vanlig rädsla konditione protokollet är fördröjningskonditionering. I detta protokoll starten av NS och USA är sammanhängande eller med viss överlappning i stimulus-presentation. Även om fördröjnings rädsla konditionering är en av de vanligaste typerna av tids associativa conditioning, finns det flera andra typer av associativa konditionetidsmässiga arrangemang: samtidig konditione, bakåtkonditione och spåranläggningar 1. I spår rädsla konditione finns en stimulans fritt intervall mellan NS och USA i flera sekunder resulterar i ett "spår" period.
Flera studier har rapporterat underskottsi trace rädsla konditione när neurotoxiska skador produceras i de strukturer som inmatas i hippocampus 2-5 eller när farmakologiska medel som används för att blockera receptor-funktionen i hippocampus. Lesion på hippocampus leder till underskott i spårkonditionering och kontextuell konditionering, men försämrar inte fördröjnings rädsla konditione 8. Det finns flera fördelar med att använda spår rädsla konditionering. Rädslan Konditione protokollet kan uppnås över en tre-dagars testperiod och möjliggör hippocampus-beroende minne som inte är rumsligt beroende. Trace rädsla konditionering kan användas som ett kompletterande prov till Morris vattenlabyrint, testa nya objektigenkänning, eller andra maze test i att undersöka hippocampus-beroende minne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De möss som användes i följande experiment genererades och inrymt vid Baylor University vid en omgivningstemperatur på 22 ° C, med en 14 timmars ljus och 10 timmar mörker (20:00 till 06:00 tim) dygnscykel. Mössen gavs ad libitum tillgång till mat och vatten. Alla förfaranden för att mössen var i överensstämmelse med National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och djur Protokollet godkändes av Baylor University Djurvård och användning kommittén.
Översikt
Spåret rade rädsla uppgiften bygger på procedurer som beskrivs av Wiltgen och kollegor 9.
1. Beredning av utrustning
Fruktan konditioneringsanordning kammare (26 cm x 22 cm x 18 cm) består av två sidor som är akryl, två sidor som är metall samt ett gallergolv botten som används för att leverera en mild fotchock. Testkammaren är husd i en sund försvagat kammare. Kammaren är också lätt tät för att förhindra utanför ljus från att påverka rörelsedetektering programvara.
- Kalibrera stötnivåer, ljusnivåer, och ljudintensitetsnivåer för testkammaren. Mät bakgrundsnivå av testkammaren. Den bakgrundsljud i denna kammare är 65 dB. Använd en ljudmätare för att mäta denna nivå. Mätaren ska vara inställd på 70 dB, inställd på C, och upptäckt inställning långsam.
- Kalibrera stöttolerans till 0,5 mA. Använd en extern kalibreringsenhet att korrekt kalibrera stötnivå (se Material tabell). Den interna mätning av stötgeneratorn är inte korrekt. Chocken generatorn administrerar en kodad chock, som inte kan mätas noggrant genom en standardamperemätare.
- Placera en ledning på en av gallerstänger och placera de övriga ledning 3 eller 4 barer över. Använd stötgeneratorn att administrera chock. Justera stötnivån tills korrekt nivå uppnås. Gör detta för EAch fruktar konditionekammare.
- Stäng dörren till kammaren vid mätning av ljusnivån i kammaren. Kalibrera ljusnivå till cirka 1,0. Detta är ett nummer som är specifik för den FreezeFrame programvara som används i detta experiment. En extern ljusmätare kommer att läsa detta som 2 lux. Ljusnivån kan justeras genom att flytta placeringen av huset ljus eller genom justering av kondensorn hos linsen. Se till att dra åt justerskruvarna för linsen efter justering.
- Kalibrera ljud decibelnivån på 85 dB. Använd en extern decibelmätare inne i test buren för att kalibrera decibelnivån (se Material tabell). Ljudet som presenteras kommer att vara en 2700 Hz ton. OBS: Om du använder möss äldre än 6 månader kan det vara bättre att använda vitt brus eftersom äldre möss kan ha hörsel underskott.
- När apparaten är redo att ta de ämnen till ett separat innehav rum. Obs: Använd inte hysa musen i samma rum som provningsrummet.
- Märknings the svansen på mössen som kommer att testas för att testa. Det är bäst att minska överdriven hantering före testning. Alternativt kan de svansar märkas dagen före försöket att minska hantera stress. Efter att mössen har märkts tillåta dem att acklimatisera sig till rummet för 30 min. Ha extra rena burar för bostäder mössen efter avslutat prov.
2. Trace Conditioning Dag 1
- Ta bort varje mus från buren och placera dem i enskilda burar för transport till rädsla konditionekammaren. Använd rena sängkläder för varje bur. Placera en anteckning om överlåtelse buren för att hålla ordning på möss testar korrekt. OBS: Om mössen var för sig inrymt då kan de transporteras i sitt hem bur.
- Placera musen i testkammaren och stänga dörren. Starta programmet.
- Å utbildning dag, tillåta mössen att utforska kammaren under tre min. Programmet presenterar sedan en 20 sek ton (85 dB, 2700 Hz) to djuret. Efter att ett spår period av 20 sek en mild stöt (2 sekund, 0,5 mA) administreras till djuret.
- Spela reaktionen av ämnet för att bekräfta att de fått de aversiva stimuli genom att titta på videon. En 200 sek inter-rättegången intervall skiljer de fem försöken konditione. Varje försök består av en 20 sekunder ton följt av en 20 sek fördröjning då en chock.
- Efter avslutat prov låta djuret att stanna i testkammaren under 1 minut innan du tar bort den från test buren.
- Placera djuret tillbaka i överförings buren och returnera den till sitt hem bur. Om det finns ytterligare möss i sitt hem bur sedan individuellt hus musen tills alla möss fullständig kontroll. Detta kommer att minska belastningen på den andra möss som inte har testats. En alternativ lösning vore att var för sig hysa alla möss en vecka innan testning för att minska påverkan av kontinuerligt ta bort möss från en bur.
- Rengör testkammare med 30% isopropanol efter each djur testas.
- Upprepa steg från 2,2 till 2,7 för alla möss i test kohorten.
- Återgå alla möss till sin koloni rum efter den sista musen i kohorten har testats.
3. Trace rädsla Conditioning Dag 2: Trace Memory Test
- Trace minnestester kommer att ske på dag 2. I detta protokoll finns 3 ton presentationer. Placera möss i ett nytt sammanhang för spårkonditione testet.
- Förbered programvaran för att köra ett program med en 2 min baslinjeperiod följt av tre 20 sek tonen presentationer. Det finns sa 220 sek ITI mellan varje ton presentation.
- För det nya sammanhanget skick, placera tydliga akryl skär på golvet i kammaren för att ändra form, textur och färg av konditionekammaren.
- Ändra lukt i kammaren genom att placera vaniljextrakt i en väga båt under golvinsatsen.
- Rengör kammaren med 70% etanol i stället för 30% isopropanol. OBS: Detta kommer att hjälpaför att skapa ett nytt sammanhang.
- Ta mössen till djurrummet och märka om sina svansar för att testa om det behövs.
- Förbered nya sammanhang överförings burar genom att ersätta strö med strimlat papper. OBS: Detta kommer att bidra till att skapa ett nytt sammanhang.
- Placera möss i testkammaren sedan starta programmet. Rengör kammaren med 70% etanol vid test är slutfört.
- Återgå mössen till sina hem bur efter spårkonditioneringen är klar. Återgå alla möss till sin koloni rum när alla möss har testats.
4. Trace rädsla Conditioning Dag 3: kontextuell Memory Test
- På tredje dagen kontextuella konditionering sker. Förbered programvaran för att köra ett program för inspelning frysning beteende under 8 min.
- Rengör kammaren med 30% isopropanol innan du testar och efter att ha testat varje mus. I sammanhanget bör vara identisk med dag 1. Överförings burar bör vara densamma som i dag ett.
- Placera varje mus i testkammaren sedan starta programmet. Rengör kammaren med 30% isopropanol vid test är slutfört.
- Återgå alla möss till sin koloni rum när den är klar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För de representativa resultaten presenterar vi data från kontroll C57BL/6J vuxna möss som fick de neutrala stimulansligaspel med obetingat stimulus (chocktillstånd) jämfört med möss som fick neutralt stimulus men inte fått den obetingat stimulus (ingen chock tillstånd). Det är viktigt att köra detta tillstånd då först sätta upp detta beteende-test för att avgöra om protokollet har utförts korrekt.
Data i figur 1 representerar utbildningsdag för C57BL/6J-möss i spår rädsla konditionetest. Det är i allmänhet inte nödvändigt att jämföra de grupper i alla förhållanden under utbildningsdagen. Men det är lämpligt att undersöka referensperioden för att utvärdera om det finns initiala skillnader i baslinjen. Vi observerade inte några skillnader i frysning nivåer i det ursprungliga tillståndet t (1,10) = 0,6, p = 0,56. Detta visar att det inte finns några initiala skillnader i frysning levåer. I allmänhet finns det låg frys nivåer på inlärningsförsök tidigt, men det finns en ökning av frys beteende under konditioneparningsförsök. När vi utförde en blandad modell ANOVA som analyserat skillnader mellan chock och No Shock skick under de 16 perioderna vi hittade en huvudeffekt av grupp F (1,10) = 60,3, p <0,001. Det fanns en huvudeffekt av grupp F (1,10) = 215,9, p <0,001, och en grupp av tids interaktion F (1,10) = 133,9, p <0,001. Analysen visar att det fanns en signifikans skillnad i förvärvet mellan de två grupperna.
Data för figur 2 illustrerar frysbeteende mellan de möss som hade tonen chockpair (Shock skick) och möss som fick samma förfarande utan chocken hoppar (Defibrillering skick) över 5 ton försöken konditionering. Mössen i Shock skick bildade en associering mellan tonen chockligaspel i spår rädsla konditionering. En blandadDesign ANOVA användes för att undersöka den huvudsakliga effekten av lärande för grupp F (1, 10) = 83,48, p <0,001. Det fanns också en huvudeffekt av konditione prövningar (tid) F (3,30) = 24.83, p <0,001, och gruppen X tid interaktion F (3,30) = 4,7, p <0,01. Eftersom det fanns en grupp x tid interaktion, var separata t-tester per tidpunkt genomfördes för att undersöka skillnaden mellan grupperna vid varje tidpunkt. Separata t-tester visar signifikant skillnad mellan grupperna vid baslinjen t (1,10) = 6.8, p <0,001, tonen t (1,10) = 8.6, p <0,001, spår period t (1,10) = 5,3 , p <0,001, och i den inter-rättegången intervall t (1,10) = 5.1, p <0,001. På ton, spår period, och den inter-rättegången intervall data var i genomsnitt över de tre presentationerna. Data visar att spårningskonditione experiment framgångsrikt producerat inlärningsskillnader till trace conditioning protokoll.
Data för figur 3 visar frysningsbeteendet mellan de möss som hade tonen chockihopkopplingar (Shock skick) och de möss som fått samma förfarande utan chocken hoppar (Defibrillering skick) i samband med tillståndet. Sammanhanget konditionstest presenterades 48 timmar efter spår konditionering genomförs. Mössen i Shock skick hade betydligt mer frysning i den ursprungliga sammanhang än No Shock skick möss F (1,10) = 12,5, p <0,01. Det fanns också en huvudeffekt av tid F (7,70) = 5,5, p <0,001, men det fanns ingen växelverkan mellan tid och grupp F (7,70) = 0,78, p = 0,61. Data visar att spårkonditione experimentet framgångsrikt producerat kontextuellt lärande när CS var parat med ett USA i spår rädsla konditionering.
Figur 1.Data från träningsdagen spår rädsla konditionering. De svarta staplarna representerar data från möss som fick aversiva obetingat stimulus (chock). De röda staplarna representerar möss som inte fick det aversiva obetingat stimulus (ingen chock) men emot tonen stimuli. Staplarna representerar medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM) procent frysning för möss under utbildningsdagen.
Figur 2. Data från möss i tonen testet efter spår rädsla konditionering. Mössen som fick obetingat stimulus (Shock skick) hade mer frysning jämfört med möss som inte fick chocken (No Shock skick) i baslinjen, tonen, spåra, och intertrial intervall (ITI). Staplarna representerar medelvärdet± standardfelet för medelvärdet (SEM) procent frysning för möss under tonen test. Astericks (***) anger en betydande grupp skillnad (p <0,001).
Figur 3. Data från möss testades i samband med testet efter spår rädsla konditionering. Mössen som fick chocken hade mer frysning jämfört med mössen i No Shock tillstånd i samband provtillstånd över 8 min rättegång. Datapunkterna representerar medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM) procent frysning för möss under sammanhang testet. Astericks (***) anger en betydande grupp skillnad (p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreezeFrame | Coulbourn | ||
| 30% Isopropanol | Purchase 90% isopropanol and dilute it down to 30% | ||
| 70% Ethanol | |||
| Amp-meter | Med-Associates | ENV-420 | Windows XP, Vista, and 7 Compatible (32-bit only) |
| Digital Sound Level Meter | 33-2055 | ||
| Vanilla Extract | McCormick Pure Vanilla Extract | ||
| Sticky Notes | Post-it | 3 in x 3 in |
References
- Powell, R. A., Honey, P. L., Symbaluk, D. G. Introduction to learning and behavior. , 4th ed, Wadsworth Cengage Learning. Forthcoming.
- Tsaltas, E., Preston, G. C., Gray, J. A. The effects of dorsal bundle lesions on serial and trace conditioning. Behav. Brain Res. 10, 361-374 (1983).
- McAlonan, G. M., Dawson, G. R., Wilkinson, L. O., Robbins, T. W., Everitt, B. J. The effects of AMPA-induced lesions of the medial septum and vertical limb nucleus of the diagonal band of Broca on spatial delayed non-matching to sample and spatial learning in the water maze. Eur. J. Neurosci. 7, 1034-1049 (1995).
- Chowdhury, N., Quinn, J. J., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus involvement in trace fear conditioning with long, but not short, trace intervals in mice. Behav. Neurosci. 119, 1396-1402 (2005).
- Quinn, J. J., Oommen, S. S., Morrison, G. E., Fanselow, M. S. Post-training excitotoxic lesions of the dorsal hippocampus attenuate forward trace, backward trace, and delay fear conditioning in a temporally specific manner. Hippocampus. 12, 495-504 (2002).
- Misane, I., et al. Time-dependent involvement of the dorsal hippocampus in trace fear conditioning in mice. Hippocampus. 15, 418-426 (2005).
- Quinn, J. J., Loya, F., Ma, Q. D., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus NMDA receptors differentially mediate trace and contextual fear conditioning. Hippocampus. 15, 665-674 (2005).
- McEchron, M. D., Bouwmeester, H., Tseng, W., Weiss, C., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts auditory trace fear conditioning and contextual fear conditioning in the rat. Hippocampus. 8, 638-646 (1998).
- Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Ferguson, C., Homanics, G. E., Fanselow, M. S. Trace fear conditioning is enhanced in mice lacking the delta subunit of the GABAA receptor. Learn. Mem. 12, 327-333 (2005).
- Davis, R. R., et al. Genetic basis for susceptibility to noise-induced hearing loss in mice. Hear. Res. 155, 82-90 (2001).
- Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hear. Res. 130, 94-107 (1999).
- Moyer, J. R., Thompson, L. T., Disterhoft, J. F. Trace eyeblink conditioning increases CA1 excitability in a transient and learning-specific manner. 16, 5536-5546 (1996).
- Leuner, B., Falduto, J., Shors, T. J. Associative memory formation increases the observation of dendritic spines in the hippocampus. J. Neurosci. 23, 659-665 (2003).
- McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Hippocampal encoding of non-spatial trace conditioning. Hippocampus. 9, 385-396 (1999).
- McLaughlin, J., Skaggs, H., Churchwell, J., Powell, D. A. Medial prefrontal cortex and pavlovian conditioning: trace versus delay conditioning. Behav. Neurosci. 116, 37-47 (2002).
- Runyan, J. D., Moore, A. N., Dash, P. K. A role for prefrontal cortex in memory storage for trace fear conditioning. J. Neurosci. 24, 1288-1295 (2004).
- Gilmartin, M. R., McEchron, M. D. Single neurons in the medial prefrontal cortex of the rat exhibit tonic and phasic coding during trace fear conditioning. Behav. Neurosci. 119, 1496-1510 (2005).
- Crow, T., Xue-Bian, J. J., Siddiqi, V., Kang, Y., Neary, J. T. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinase by one-trial and multi-trial classical conditioning. J. Neurosci. 18, 3480-3487 (1998).
- Martin, K. C., et al. MAP kinase translocates into the nucleus of the presynaptic cell and is required for long-term facilitation in Aplysia. Neuron. 18, 899-912 (1997).
- Crestani, F., et al. Trace fear conditioning involves hippocampal alpha5 GABA(A) receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8980-8985 (2002).
- Crestani, F., et al. Decreased GABAA-receptor clustering results in enhanced anxiety and a bias for threat cues. Nat. Neurosci. 2, 833-839 (1999).
- Moore, M. D., et al. Trace and contextual fear conditioning is enhanced in mice lacking the alpha4 subunit of the GABA(A) receptor. Neurobiol. Learn. Mem. 93, 383-387 (2010).
- Cushman, J. D., Moore, M. D., Jacobs, N. S., Olsen, R. W., Fanselow, M. S. Behavioral pharmacogenetic analysis on the role of the alpha4 GABA(A) receptor subunit in the ethanol-mediated impairment of hippocampus-dependent contextual learning. Alcohol Clin. Exp. Res. 35, 1948-1959 (2011).
- Raybuck, J. D., Lattal, K. M. Double dissociation of amygdala and hippocampal contributions to trace and delay fear conditioning. PLoS ONE. 6, (2011).
- Kwapis, J. L., Jarome, T. J., Schiff, J. C., Helmstetter, F. J. Memory consolidation in both trace and delay fear conditioning is disrupted by intra-amygdala infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin. Learn. Mem. 18, 728-732 (2011).
- Gilmartin, M. R., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Trace and contextual fear conditioning are impaired following unilateral microinjection of muscimol in the ventral hippocampus or amygdala, but not the medial prefrontal cortex. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 452-464 (2012).
- Baysinger, A. N., Kent, B. A., Brown, T. H. Muscarinic receptors in amygdala control trace fear conditioning. PLoS ONE. 7, (2012).
- Wanisch, K., Tang, J., Mederer, A., Wotjak, C. T. Trace fear conditioning depends on NMDA receptor activation and protein synthesis within the dorsal hippocampus of mice. Behav. Brain. 157, 63-69 (2005).
- Smith, D. R., Gallagher, M., Stanton, M. E. Genetic background differences and nonassociative effects in mouse trace fear conditioning. Learn. Mem. 14, 597-605 (2007).
- Rudy, J. W., O'Reilly, R. C. Contextual fear conditioning, conjunctive representations, pattern completion, and the hippocampus. Behav. Neurosci. 113, 867-880 (1999).
- Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Anagnostaras, S. G., Sage, J. R., Fanselow, M. S. Context fear learning in the absence of the hippocampus. J. Neurosci. 26, 5484-5491 (2006).
- Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. Localization of a stable neural correlate of associative memory. Science. 317, 1230-1233 (2007).
- Huerta, P. T., Sun, L. D., Wilson, M. A., Tonegawa, S. Formation of temporal memory requires NMDA receptors within CA1 pyramidal neurons. Neuron. 25, 473-480 (2000).
- Jacobs, N. S., Cushman, J. D., Fanselow, M. S. The accurate measurement of fear memory in Pavlovian conditioning: Resolving the baseline issue. J. Neurosci. Methods. 190, 235-239 (2010).
