Summary
De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.
Abstract
De bacteriële celwand is van cruciaal belang voor de bepaling van de celvorm tijdens groei en deling en behoudt de mechanische integriteit van cellen in het gezicht van turgordrukken verschillende atmosferen in omvang. In de verschillende vormen en maten van het bacterierijk bestaat de celwand uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door korte peptiden. Peptidoglycan's centrale belang voor bacteriële fysiologie ligt ten grondslag aan het gebruik ervan als een antibioticumdoel en heeft genetische, structurele en celbiologische studies gemotiveerd over hoe het robuust wordt geassembleerd tijdens groei en deling. Niettemin zijn er nog steeds uitgebreide onderzoeken nodig om de belangrijkste enzymatische activiteiten in peptidoglycansynthese en de chemische samenstelling van bacteriële celwanden volledig te karakteriseren. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is een krachtige analytische methode voor het kwantificeren van verschillen in de chemische samenstelling van de wanden van bacteriën die onder verschillende omgevings- en genetische omstandigheden worden gekweekt, maar de doorvoer ervan is vaak beperkt. Hier presenteren we een eenvoudige procedure voor de isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor biologische analyses van peptidoglycan via HPLC en Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), een uitbreiding van HPLC die pompen gebruikt om ultrahoge drukken tot 15.000 psi te leveren, vergeleken met 6.000 psi voor HPLC. In combinatie met de voorbereiding van hier gepresenteerde bacteriële celwanden, zullen de low-volume monsterinjectoren, detectoren met hoge bemonsteringssnelheden, kleinere monstervolumes en kortere looptijden van UPLC een hoge resolutie en doorvoer mogelijk maken voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycansamenstelling en fundamentele bacteriële celbiologie in de meeste biologische laboratoria met toegang tot een ultracentrifuge en UPLC.
Introduction
Het doel van de hierin beschreven methode is om intacte bacteriële celwanden (sacculi) te isoleren en de peptidoglycan (PG) zodanig te verteren dat Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan worden gebruikt om informatie te verstrekken zoals de identiteit van de muropeptidecomponenten en hun concentraties, de gemiddelde lengte van glycanstrengen en de fractie materiaal die betrokken is bij crosslinks tussen strengen. Voor een gedetailleerde bespreking van PG biochemie en muropeptide soorten, zijn er verschillende uitstekende beoordelingen die PG structuur en zijn rol in infectie, resistentie, morfogenese, en groei1-6beschrijven . High Performance Liquid Chromatography (HPLC) voor PG-analyse werd aanvankelijk ontwikkeld door Glauner en Schwarz in de jaren 1980, en meer recentelijk is uitgebreid verbeterd en toegepast in de laboratoria van Miguel de Pedro en Waldemar Vollmer. Eerdere methoden maakten gebruik van aminozuuranalyse of papierchromatografie, tijdrovende en vervelende technieken die geen nauwkeurige of volledige beoordelingen van celwandcomponenten opleveren.
UPLC-analyse kan eenvoudig worden geïmplementeerd in elk fundamenteel onderzoekslaboratorium dat toegang heeft tot een ultracentrifuge en UPLC. De UPLC-methode die we hieronder presenteren, isoleert volledige sacculi en biedt daarmee uitgebreide, kwantitatieve informatie over alle chemische soorten daarin. Deze methode levert nauwkeurige kwantificering van alle muropeptiden over een populatie van bacteriën, allemaal binnen een 20 minuten UPLC run. De toepassing van deze methode omvat alleen basislaboratoriumvaardigheden, zonder aanzienlijke financiële investeringen in materialen. Om de stappen in deze methode uit te voeren, hoeven onderzoekers alleen bekwaam te zijn in pipetten, het voorbereiden van buffers en enzymen en het aanpassen van de pH, waardoor het toegankelijk is voor een breed scala aan wetenschappelijke disciplines. De keuze van enzymen die in dit protocol worden gebruikt, hangt af van de soort bacterie die wordt geanalyseerd; het hier beschreven protocol is nuttig voor Escherichia coli, en is over het algemeen voldoende gebleken voor het isoleren van sacculi van andere Gram-negatieve organismen. Overleg met de literatuur wordt aanbevolen bij het toepassen van deze methode op grampositieve bacteriën; bij deze soorten is sacculuszuivering van oudsher moeilijker. In het bijzonder kan deze methode worden gewijzigd in termen van enzymkeuze en lengte van de spijsverteringstijden om de dikkere wanden en accessoirepolymeren zoals teichoïnezuren van grampositieve bacteriën te huisvesten. Het eerste enzym in dit protocol splijt buitenste membraan lipoproteïne (zoals Braun's lipoproteïne, of Lpp) gehechtheid aan de peptidoglycan, waardoor alles behalve de C-terminale di- (of tri-) peptide van de Lpp uit de celwand. Deze stap is nodig bij het onderzoeken van Enterobacteriën, maar veel andere Gram-negatieve bacteriën hebben geen Lpp-equivalenten, en daarom kan deze stap worden overgeslagen. Een tweede enzym splijt specifiek na de muramische zuurcomponent van de peptidoglycan, waardoor de disaccharidesubeenheid die de muropeptidesoort vormt, wordt opgelost. Om een nauwkeurige beoordeling van de architectuur van de PG te bieden, moet voorzichtig worden omgegaan met het verteren van de sacculi om decolleté van de dwarsbruggen of een ander deel van de peptidestam te voorkomen.
Hoewel de chemische samenstellingen van peptidoglycan uit meer dan 100 stammen van ~40 bacteriesoorten zijn geanalyseerd door HPLC, zijn er geen analyses uitgevoerd met UPLC-technologie. Bovendien heeft eerder werk peptidoglycan gekenmerkt uit slechts een klein deel van het bacteriële domein, deels beperkt door de doorvoer van HPLC. Daarom zal de verspreiding van deze methode onder zoveel mogelijk onderzoekers en de implementatie op UPLC-platforms van cruciaal belang zijn voor het stimuleren van fysiologische studies van de grote fractie van bacteriële soorten waarvan peptidoglycan nog moet worden gecategoriseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kweek bacteriële culturen in 2,5 ml media 's nachts
Verdun culturen 1:100 in 250 ml verse media en groei tot OD600 van 0,7-0,8. Bereid een oplossing van 6% natriumdodecylsulfaat (SDS) in water.
LET OP: SDS-poeder is gevaarlijk - vermijd het inademen van SDS-poeder; draag een masker over neus en mond.
2. Dag 1 - Lysing bacteriële culturen wordt uitgevoerd in de loop van een dag en 's nachts
- Terwijl verdunde culturen groeien, zet je een kokend waterbad op een hete plaat in een bekerglas van 1 L. Zodra het water kookt, aliquot 6 ml van 6% SDS in 50 ml polypropyleen buizen, voeg een kleine roerstaaf toe aan elke buis, bevestig buisdeksels aan vingerdicht, plaats buizen in waterbad en zet roeren aan tot 500 tpm op de kookplaat.
- Oogst de culturen van 250 ml op 5.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en resuspend pellets in 3 ml media of 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing. Pipetteer celsuspensusingen langzaam in buizen van 50 ml met 6% kokende SDS om de cellen te lyseren (eindconcentratie 4% SDS) terwijl de buizen in het kokende waterbad worden ondergedompeld en sluit de deksels opnieuw tot vingerdicht. Celsuspensingen moeten snel worden overgebracht in kokende SDS zodra ze opnieuw zijn begeven. Abrupte veranderingen in het milieu moeten worden vermeden, omdat dit een onjuiste wijziging van de celwandstructuur kan veroorzaken.
- Bedek het kokendwaterbad en laat de cellen 3 uur koken, controleer het waterniveau regelmatig en vul het waterbad indien nodig bij. Schakel na 3 uur het verwarmingselement van de kookplaat uit en blijf 's nachts roeren bij 500 tpm.
3. Dag 2 - Enzymatische spijsverteringen worden uitgevoerd in de loop van één dag
- Als SDS 's nachts in de 50 ml-buisjes is neergeslagen, zet het waterbad dan nog eens 1-2 uur aan de kook. Zet een warmteblok aan tot 60 °C. Bereid een voorraad van 1 mg/ml Pronase E in 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl en activeer Pronase E bij 60 °C gedurende ten minste 30 minuten.
- Gebruik een ultracentrifugeset van 400.000 × g om monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te laten draaien om de grote PG-polymeren te pelleteren en daardoor te zuiveren van andere cellulaire componenten. Verwijder supernatant voorzichtig en resuspend elke pellet in ultrapure water op kamertemperatuur. OPMERKING: Het resuspensievolume is afhankelijk van het volume van de gebruikte ultracentrifugebuizen; gebruik een volume dat de buizen ten minste halverwege vult, maar het maximale volume van de buizen niet overschrijdt. Herhaal centrifugeren/wassen totdat het water geen bellen vormt tijdens resuspensie, wat aangeeft dat de SDS volledig is verwijderd (meestal drie wasbeurten). Stop met het wassen van de pellet als er een wit neerslag ontstaat, omdat dit aangeeft dat de sacculi samenklonteren. Klonteren is niet catastrofaal, maar klonten binden zeer sterk aan plastic en glaswerk waardoor grote monsterverlies ontstaat. Ga in dit geval verder met het protocol met behulp van het samengeklonterde sacculi-monster.
- Bij de laatste centrifugeer-/wasstap de monsters opnieuw in 900 μl van 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl en overbrengen naar 2 ml buizen die eerder met een kleine naald met gaten in de bovenkanten waren gestoken. Voeg 100 μl geactiveerde Pronase E (100 μg/ml eindconcentratie) van 100 μl toe aan elk monster en incubeer gedurende 2 uur bij 60 °C. Stel een ander warmteblok in op 100 °C.
- Stop de Pronase E-vergisting door 200 μl 6% SDS aan elk monster toe te voegen en kook de monsters gedurende 30 minuten in het warmteblok van 100 °C. Zet een ander warmteblok op 37 °C en maak een voorraad van 1 mg/ml muramidase (mutanolysine) in 50 mM fosfaatbuffer (pH 4,9).
- Gebruik net als in stap 3.2 een ultracentrifugeset van 400.000 × g om monsters gedurende 20 minuten op kamertemperatuur te draaien en te wassen met ultrapure water op kamertemperatuur totdat SDS volledig is verwijderd (meestal drie wasbeurten). Het resuspensievolume is afhankelijk van het volume van de gebruikte ultracentrifugebuizen; gebruik een volume dat de buizen ten minste halverwege vult, maar het maximale volume van de buizen niet overschrijdt.
- Bij de laatste centrifugeer-/wasstap worden de monsters geresuspendeerd in 200 μl natriumfosfaatbuffer van 50 mM (pH 4,9). Dit volume kan worden aangepast aan de hoeveelheid peptidoglycan in het monster en kan afhankelijk zijn van soorten. Als er eerder gepubliceerde rapporten van HPLC-analyse voor de soort van belang zijn, kan dit volume worden geschat op basis van deze kwantificaties (een compilatie van HPLC PG-studies is te vinden in de aanvullende informatie van referentie7). Voor andere soorten kan de sacculus prep tot deze stap worden uitgevoerd en vervolgens kunnen verschillende hoeveelheden resuspensievolumes worden toegevoegd om monsters te repliceren om het minimale volume te bepalen waarmee de PG in oplossing kan blijven (zie Discussie voor verdere schattingen). Als het monster meer peptidoglycan bevat, verhoog dan het resuspensievolume; als het monster weinig peptidoglycan heeft, vermindert u het resuspensievolume tot minimaal 50 μl.
- Breng de monsters over in tubes van 1,5 ml en voeg 1 mg/ml muramidase toe om een eindconcentratie van 40 μg/ml te geven. Incubeer 6-8 uur of 's nachts bij 37 °C.
4. Dag 3 - Voorbereiding van monsters voor UPLC wordt uitgevoerd op de laatste dag
- Zet een warmteblok aan tot 100 °C. Kook de monsters 5 minuten zonder SDS om de muramidasevertering te stoppen. Centrifugeer monsters gedurende 10 minuten bij 16.000 × g bij kamertemperatuur en breng het supernatant (muropeptiden zijn nu oplosbaar) over naar glazen buizen van 13 mm x 100 mm. Probeer zoveel mogelijk supernatant te herstellen en kom heel dicht bij de pellet zonder deze te verstoren.
- Stel de pH in door 500 mM boraatbuffer (pH 9) aan het monster toe te voegen voor een eindconcentratie van 100 mM boraatbuffer. Boraatbuffer is compatibel met het reductiemiddel natrium borohydride. Voeg 1-2 korrels natrium borohydride toe om elk monster te verminderen en laat de reactie minstens 30 minuten bij kamertemperatuur doorgaan. LET OP: Natrium borohydride is zeer reactief en gevaarlijk om te hanteren - vermijd contact met de huid (draag handschoenen) en vermijd contact met de ogen (draag een veiligheidsbril).
- Pas de monsters aan op pH 3-4 (het muropeptide iso-elektrisch punt is ~3,5) met 50% v/v orthofosforzuur met stappen van 20 μl tot pH 6, gemeten met pH-indicatorpapier, en vervolgens met stappen van 2 μl. LET OP: Orthofosforzuur is corrosief en gevaarlijk om mee om te gaan - vermijd contact met de huid (draag handschoenen) en vermijd contact met de ogen (draag een veiligheidsbril). Het monster moet borrelen als reactie op toevoeging van orthofosforzuur; wanneer het monster stopt met borrelen, geeft dit meestal aan dat een pH van 6 is bereikt. Als er geen borreling in het monster optreedt, kan dit erop wijzen dat de toegevoegde hoeveelheid natrium borohydride te klein was. Stop in dit geval met het verlagen van de pH, voeg voorzichtig een of twee korrels natrium borohydride toe, laat 5-10 minuten reageren en hervat vervolgens de pH-aanpassing.
- Filtermonster door een spuitfilter van 0,22 μm rechtstreeks in een UPLC-injectieflacon. Als er een neerslag is gevormd, verwarmt u de buis met meerdere gangen door een vlam voordat u filtert. Als het monster niet binnen de dag in het UPLC-instrument wordt geïnjecteerd, vriest u 's nachts bij -20 °C in. Monsters kunnen tot een jaar worden bewaard bij -80 °C. Het monster kan worden ontdooid door meerdere keren door een vlam te gaan.
- Injecteer 10 μl van elk monster op een UPLC-instrument dat is uitgerust met een omgekeerde fasekolom van C18 1,7 μm en een absorptiedetector die is ingesteld om 202-208 nm te bewaken. Monsters worden opeenvolgend geïnjecteerd, maar met automatische bemonsteringsmogelijkheden kunnen maximaal 96 monsters in batch worden verwerkt. Gebruik 50 mM natriumfosfaat (pH 4,35) + 0,4% v/v natrium azide voor oplosmiddel A en 75 mM natriumfosfaat (pH 4,95) + 15% v/v methanol voor oplosmiddel B. OPMERKING: Natrium azide wordt toegevoegd om de absorptie van methanol van 205 nm te compenseren om baseline drift te voorkomen. Stel de stroom in op 0,25 ml/min en gebruik een lineaire gradiënt van meer dan 25 min om binnen 30 minuten 100% oplosmiddel B en sequentiële elutie van muropeptiden te bereiken. Als massaspectrometrie zal worden gebruikt om muropeptiden na UPLC te karakteriseren, verzamel dan fracties van de piek van belang in een fractiecollector en droog de fracties met behulp van een centrifugaalverdamper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de procedure in figuur 1moet het uiteindelijke monster bestaan uit ten minste 200 μl heldere oplossing die rechtstreeks in een UPLC-flacon is gefilterd (stap 4.4). UPLC-scheiding van de verschillende muropeptiden in een bacterieel monster is afhankelijk van hun relatieve oplosbaarheid tussen de vloeibare mobiele fase en de stationaire fase van de kolom. Omgekeerde fase C18-kolommen bieden een sterk hydrofobe matrix om de muropeptidesoorten te scheiden op basis van hydrofobiciteit en grootte8; polaire, laagmoleculaire monomeren elute eerst, en apolaire, hogere moleculaire-gewicht oligomeren elute na (Figuur 2). Een typisch UPLC-resultaat wordt weergegeven in figuur 2, met detectie via UV-absorptie bij 202-208 nm als functie van de tijd die de retentietijd van een bepaald muropeptide vaststelt. Dit representatieve resultaat toont een duidelijke resolutie tussen de meeste muropeptidesoorten en een sterke signaalsterkte over het hele spectrum, waardoor de analysiz en de gemiddelde glycan-strenglengte mogelijk zijn.
De laatste stap in figuur 1 omvat het aanpassen van de pH en het filteren van fijne deeltjes die de kleine afmetingen van de in UPLC gebruikte buizen kunnen verstoppen. Als een monster supergeconcentreerd is, bijvoorbeeld door resuspendatie in 100 μl natriumfosfaatbuffer in stap 3.5 in plaats van 200 μl, kan het monster troebel worden, wat aangeeft dat een kritische concentratie is bereikt en de muropeptiden zijn neergeslagen. Dit verlies van oplosbaarheid zal resulteren in verstopping van het spuitfilter dat in stap 4.4 wordt gebruikt, waardoor de afzetting van muropeptiden in de UPLC-flacon wordt voorkomen en/of de UPLC-machineleidingen en -kolom verstopt raken, wat dure items zijn om te vervangen. Figuur 3geeft een voorbeeld van een chromatogram dat deze afwijkende monsterverwerking weergeeft; geen pieken geëofd, wat resulteert in het ontbreken van gegevens over pg-samenstelling. Het verkeerd aanpassen van de pH tot ver onder het iso-elektrische punt van de muropeptiden(bijv. tot een pH van 2) kan ook leiden tot de neerslag van muropeptiden en dus de afwezigheid van waarneembare pieken uit UPLC-analyse.
Figuur 1. Schematisch van sacculi voorbereiding. Deze methode is gebaseerd op iteratieve rondes van ultracentrifugatie om SDS weg te zuiveren van de pelletsnauwkeurigheid.
Figuur 2. Voorbeeld UPLC chromatogram van PG uit sacculi verteerd uit E. coli MG1655 cellen. Merk op dat een vergelijkbare resolutie van alle muropeptiden wordt bereikt in 10% van de tijd van een typische HPLC-run. Muropeptide etiketten - M = monomeer, D = dimer, T = trimer; (2,3,4,5) het aantal aminozuurstampeptiden aangeven; modificaties - G = glycine ter vervanging van L-alanine, L = twee extra aminozuren uit Pronase E decolleté, D = 3,3-diaminopimelic acid (DAP)-DAP crossbridge, N = beëindigen van watervrij-muropeptide. Bijvoorbeeld, D33DL is een verkleinaar met 3-aa stam peptiden, verbonden door een DAP-DAP crossbridge, met een extra twee aminozuren van Pronase E decolleté.
Figuur 3. Mislukte UPLC-analyse van sacculi verteerd uit E. coli MG1655 cellen. De afwezigheid van pieken, wat aangeeft dat er geen muropeptiden in het monster aanwezig waren, is te wijten aan muropeptiden die uit de oplossing crashen voordat ze in een UPLC-flacon worden geëvenmeerd (stap 4.4). Deze neerslag kan te wijten zijn geweest aan overconcentratie van de muropeptiden of aan een te lage pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciale stap in deze procedure is stap 3.1 van de tweede dag van de monstervoorbereiding. Als het SDS 's nachts is neergeslagen of als de monsters gedurende enkele weken bij kamertemperatuur in 4% SDS zijn bewaard, moeten de monsters ten minste 1 uur opnieuw worden gekookt om de SDS opnieuw te laten koken. Een veel voorkomende oorzaak voor SDS-neerslag is het gebruik van media met kaliumzouten, dus kalium moet indien mogelijk in media worden vermeden. Zoals vermeld in de sectie Representatieve resultaten, is het ook van cruciaal belang om de pH aan te passen aan het iso-elektrische punt van de muropeptiden (~ 3,5), maar niet te veel lager dan pH 3, of het materiaal kan neerslaan. Ten slotte moet de resuspensie van het monster plaatsvinden in het juiste volume natriumfosfaatbuffer (stap 3.5), dat door de onderzoeker moet worden beoordeeld. Bij het kiezen van het resuspensievolume van natriumfosfaatbuffer is het belangrijk om te overwegen hoeveel muropeptidemateriaal waarschijnlijk wordt gegenereerd uit een bepaalde bacteriële cultuur. Als het uiteindelijke kweekvolume bijvoorbeeld 250 ml bedraagt, zoals hierboven beschreven, moet het monster opnieuw worden gesuspendeerd in ten minste 200 μl natriumfosfaatbuffer. Als de onderzoeker de methode wijzigt in culturen van 50 ml, kunnen monsters worden geresuspendeerd in 100 μl natriumfosfaatbuffer of minder. Overweging van de voorspelde hoeveelheden peptidoglycan bij een soort is ook belangrijk; E. coli sferoplasten bevatten bijvoorbeeld aanzienlijk minder peptidoglycan (ongeveer 7% van de hoeveelheid in wild-type E. coli cellen10), en dus is resuspensie in 100 μl of minder natriumfosfaatbuffer aangewezen. Als het moeilijk is om een bepaalde bacteriesoort of stam tot grote hoeveelheden (250 ml) te laten groeien, kan het uiteindelijke kweekvolume worden verminderd en/of kan de verdunning van de nachtcultuur worden verminderd. Ten slotte vereist injectie op een HPLC-systeem een minimumvolume van 200 μl, terwijl 10 μl voldoende is voor een UPLC-systeem.
De zuivering van PG-componenten in verschillende organismen of voor verschillende toepassingen kan worden afgestemd door het type mobiele fase, kolom en gradiënt op het UPLC-instrument te variëren. Mobiele fasen op basis van oplosmiddelen, zoals acetonitril, kunnen worden gebruikt om monsters te ontsalten voorafgaand aan massaspectrometrie. Verschillende kolomchemieën kunnen ook nodig zijn om monsters grondig te desalt voor latere analyse. Figuur 2 toont het gemeenschappelijke elutieprofiel van muropeptiden voor de Gramnegatieve staafvormige bacterie E. coli MG1655; de analyse van PG van grampositieve bacteriën en/of soorten met andere vormen kan een verfijning van de in stap 4.5 beschreven gradiënt vereisen. Hoewel UPLC-spectra zoals die in figuur 2 veel klassen van informatie over peptidoglycan genereren, zoals muropeptide-identiteit, crosslinkingpercentage en glycan-strenglengte, heeft de methode verschillende beperkingen, waaronder het onvermogen om de ruimtelijke verdeling van structurele kenmerken over sacculi in kaart te brengen. Bijvoorbeeld, noch de locaties van crossbridging langs een glycan keten, noch de locaties van gebonden lipoproteïnen kunnen worden onderscheiden via HPLC of UPLC.
De voordelen van het analyseren van de chemische samenstelling van PG met HPLC zijn een hogere resolutie, kortere analysetijd en nauwkeurige kwantificering11 in vergelijking met traditionele technieken zoals aminozuuranalyse12-14 of papierchromatografie15,16. UPLC biedt een hogere snelheid en gevoeligheid dan HPLC door hogere drukken die snellere stromen en dus kortere looptijden mogelijk maken. Resolutie wordt niet opgeofferd met UPLC, omdat de deeltjesgroottekolommen van sub-2 μm, detectoren met hoge bemonsteringsfrequentie en injectoren met een laag volume bestand zijn tegen zeer hoge drukken en dus nauwkeurig functioneren bij hoge snelheden17,18. Dit resulteert in de mogelijkheid om monstervolumes te analyseren in de orde van 1 μl in tientallen minuten, vergeleken met 200 μl en uren voor HPLC.
Technieken die complementair zijn aan UPLC omvatten muropeptide massa-analyse door massaspectrometrie. UPLC is geen destructieve techniek; het eluaat uit de kolom kan na UV-detectie worden verzameld en gedroogd met behulp van een centrifugaalverdamper die in de meeste laboratoria algemeen verkrijgbaar is. Hoewel het monster kan worden ontzoutd om het voor te bereiden op massaspectrometrie (stap 4.5), maakt Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight Mass Spectrometry analyse mogelijk zonder veel gevoeligheid voor zoutconcentratie19, en levert massagegevens op die in staat zijn om muropeptiden definitief te identificeren. De kosten voor het bereiden van een celwandmonster voor UPLC bedragen ongeveer $ 6-7, inclusief de kosten van enzymen, chemicaliën en gebruikte benodigdheden. Gezien de goedkope bedrijfskosten, toegankelijkheid en aangetoond nut voor studies van de bacteriële celwand, moet UPLC de methode bij uitstek worden voor hoge resolutie, hoge doorvoer, nauwkeurige kwantificering van peptidoglycansamenstelling in het bacteriële koninkrijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De productiekosten voor dit artikel werden gesponsord door Waters Corporation.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door nih Director's New Innovator Award DP2OD006466 (naar K.C.H.). De auteurs danken Russell Monds voor een praktische demonstratie van de methode en voor wetenschappelijke discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
