Summary
細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。
Abstract
細菌細胞壁は、成長および分裂時の細胞形状の決定に重要であり、大きさの複数の雰囲気のターゴール圧力に直面して細胞の機械的完全性を維持する。細菌の王国の多様な形状と大きさにわたって、細胞壁は、短いペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成されています。細菌生理学におけるペプチドグリカンの中心的な重要性は、抗生物質標的としての使用の根底にあり、成長と分裂の間にどのように強固に組み立てられるかの遺伝的、構造的、細胞生物学的研究を動機づけている。それにもかかわらず、ペプチドグリカン合成における主要な酵素活性と細菌細胞壁の化学組成を完全に特徴付けるためには、依然として広範な調査が必要である。ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー(HPLC)は、様々な環境・遺伝的条件下で増殖する細菌の壁の化学組成の違いを定量化するための強力な分析方法ですが、そのスループットは、多くの場合、制限されています。ここでは、HPLC用6,000 psiと比較して、ポンプを利用して最大15,000 psiの超高圧を供給するHPLCの拡張であるHPLCおよび超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)を介したペプチドグリカンの生物学的分析のための細菌細胞壁の単離および調製のための簡単な手順を提示します。ここで紹介する細菌細胞壁の調製と組み合わせて、少量のサンプルインジェクター、高いサンプリングレート、より小さいサンプル量、およびUPLCの短い実行時間を備えた検出器は、超遠心分離機およびUPLCへのアクセスを持つほとんどの生物学的実験室でのペプチドグリカン組成物および基本的な細菌細胞生物学の新しい発見のための高解像度およびスループットを可能にする。
Introduction
本明細書に記載されている方法の目的は、無傷の細菌細胞壁(sacculi)を分離し、超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)がムロペプチド成分の同一性とその濃度、グリカン鎖の平均長さ、および鎖間の架橋に関与する材料の割合などの情報を提供するために使用できるようにペプチドグリカン(PG)を消化することです。PG生化学およびムロペプチド種の詳細な議論のために、PG構造および感染、抵抗性、形態形成、および成長におけるその役割を1〜6に記述するいくつかの優れたレビューがある。PG分析のための高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、1980年代にグラナーとシュワルツによって最初に開発され、最近ではミゲル・デ・ペドロとワルデマール・ヴォルマーの研究室で広く強化され、適用されています。これまでの方法では、アミノ酸分析またはペーパークロマトグラフィー、細胞壁成分の正確または完全な評価を得ない時間と退屈な技術を使用しました。
UPLC分析は、超遠心分離機やUPLCにアクセスできる基礎研究所で簡単に実装できます。以下に提示するUPLC法は、完全なサキュリを分離し、その中のすべての化学種に関する包括的かつ定量的な情報を提供する。この方法は、20分UPLCラン内のすべての細菌集団にわたってすべてのムロペプチドの正確な定量化をもたらす。この方法の実装は、材料に多額の財政的投資をすることなく、基本的な実験室のスキルのみを含みます。この方法のステップを実行するためには、研究者はピペット処理、バッファーおよび酵素の調製、およびpHの調整に熟練するだけで、幅広い科学的分野にアクセス可能になります。このプロトコルで使用される酵素の選択は、分析される細菌の種に依存します。ここで説明するプロトコルは 、大腸菌に有用であり、一般的に他のグラム陰性生物からサキュリを単離するのに適していることが分かってきた。グラム陽性菌にこの方法を適用する場合は、文献との相談をお勧めします。これらの種では、伝統的に糖分精製がより困難であった。特に、この方法は、グラム陽性菌のテイコ酸などの厚い壁および補助ポリマーに対応するために、酵素の選択および消化時間の長さの点で変更されなければならない。このプロトコルの最初の酵素は、外膜リポタンパク質(ブラウンのリポタンパク質、またはLppなど)をペプチドグリカンに切断し、それによって細胞壁からLppのC末端ジ(またはトリ)ペプチドを除くすべてを放出する。このステップは腸内細菌を調べるときに必要ですが、他の多くのグラム陰性菌にはLpp相当物がないため、このステップはスキップできます。第2酵素は、ペプチドグリカンのムラミン酸成分の後に特異的に切断し、ムロペプチド種を形成する二糖サブユニットを可溶化する。PGのアーキテクチャの正確な評価を提供するために、クロスブリッジまたはペプチドステムの他の部分の切断を防ぐために、サキュリを消化する際に注意する必要があります。
100種以上の菌種からペプチドグリカンの化学組成をHPLCで分析したが、UPLC技術では分析は行われていない。さらに、以前の研究では、細菌ドメインのごく一部からペプチドグリカンを特徴付けており、一部はHPLCのスループットによって制限されています。したがって、この方法をできるだけ多くの研究者に広め、UPLCプラットフォーム上での実施は、ペプチドグリカンがまだ分類されていない細菌種の大部分の生理学的研究を促進するために重要である。
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Protocol
1. 一晩で2.5 mlの培地で細菌培養を成長させる
バック希釈培養 1:100 から 250 ml の新鮮な培地に、0.7-0.8 の OD600 に成長します。6%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の溶液を水中に調製する。
注意:SDS粉末は危険です - SDS粉末を吸入しないでください。鼻と口の上にマスクを着用してください。
2. 1日目 - 細菌培養を一日と一晩にわたって行う
- 希釈された培養物が成長している間、1 Lビーカーのホットプレートに熱湯浴を設置します。水が沸騰したら、6%SDSのアリコート6mlを50mlポリプロピレンチューブに加え、各チューブに小さな炒め棒を1つ加え、チューブの蓋を指密に固定し、チューブを水浴に入れ、ホットプレートで500rpmに攪拌します。
- 室温で10分間5,000×gで250ml培養物を収穫し、3mlの培地または1xリン酸緩衝生理食塩水でペレットを再懸濁します。ピペットセルは、6%の沸騰SDSで50mlチューブにゆっくりとピペットセル懸濁液を使用して細胞をライスし(最終濃度4%SDS)、チューブは沸騰水浴中に沈み、蓋を指密に再密閉します。細胞懸濁液は、再懸濁後に沸騰SDSに素早く移す必要があります。突然の環境変化は、細胞壁構造の誤った変化を引き起こす可能性がありますので、避けるべきです。
- 沸騰水浴を覆い、細胞が3時間沸騰させ、定期的に水位をチェックし、必要に応じて水浴を補充します。3時間後、ホットプレートの発熱体をオフにし、500rpmで一晩撹拌し続ける。
3. 2日目 - 酵素消化は1日の間に行われます
- SDSが一晩50mlチューブに沈殿した場合は、水浴を1〜2時間沸騰させます。ヒートブロックを60°Cに切り上げる。 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% w/v NaClでプロナーゼEの1mg/mlストックを準備し、少なくとも30分間60°CでプロナーゼEを活性化します。
- 400,000×gに設定された超遠心分離機を使用して、大きなPGポリマーをペレット化し、他の細胞成分から精製するために、室温で20分間サンプルを回転させます。上清を慎重に取り出し、室温超純水中の各ペレットを再懸濁します。注:再懸濁液の量は、使用される超遠心チューブの体積に依存します。チューブを少なくとも半分の方法で満たすが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用してください。再懸濁中に水が気泡を形成しなくなるまで遠心分離/洗浄を繰り返し、SDSが完全に除去されたことを示します(通常は3回の洗浄)。白色の沈殿物が形成された場合はペレットの洗浄を中止し、これは、サキュリが一緒に凝集していることを示している。凝集は壊滅的ではありませんが、塊はプラスチックやガラス製品に非常に強く結合し、大きなサンプル損失を引き起こします。この場合、束状のサキュリサンプルを用いてプロトコルを進める。
- 最後の遠心分離/洗浄ステップで、サンプルを10 mM Tris-HCl(pH 7.2)+0.06%w/v NaClの900 μlで再中断し、以前に小さな針で上部に穴を開けて突いた2mlチューブに移します。各サンプルに1mg/ml活性化プロナーゼE(100μg/ml最終濃度)の100 μlを加え、60°Cで2時間インキュベートします。別のヒートブロックを100°Cに設定します。
- プロナーゼEの消化を各サンプルに200 μlの6%SDSを加えて、100°Cのヒートブロックで30分間沸騰させます。異なるヒートブロックを37°Cに設定し、50 mMリン酸緩衝液(pH 4.9)に1mg/mlのムラミドーゼ(ムタノリシン)ストックを作ります。
- ステップ3.2のように、400,000×gに設定された超遠心分離機を使用して、室温で20分間サンプルを回転させ、SDSが完全に除去されるまで室温の超純水で洗浄します(通常は3回の洗浄)。リサスペンションの体積は、使用される超遠心管の体積に依存します。チューブを少なくとも半分の方法で満たすが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用してください。
- 最後の遠心分離/洗浄ステップで、サンプルを50 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 4.9)の200 μlで再中断します。この体積は、試料中のペプチドグリカンの量に応じて調整することができ、種依存であってもよい。対象となる種のHPLC分析に関する報告が以前に公表されている場合、この量は、これらの定量に基づいて推定することができます(HPLC PG研究のコンパイルは、参照7の補足情報で見つけることができます)。他の種の場合、このステップまでサキュラスの準備を実行することができ、PGが溶液にとどまることを可能にする最小量を決定するために、サンプルを複製するために異なる量の再懸濁液量を追加することができます(さらなる推定値については、議論を参照)。サンプルにペプチドグリカンが多く含まれている場合は、再懸濁液の体積を増やします。サンプルにペプチドグリカンがほとんどない場合は、再懸濁液の体積を最低50 μlに減らします。
- サンプルを1.5mlチューブに移し、1mg/mlのムラミデを加え、最終濃度40μg/mlを与えます。6-8時間または37°Cで一晩インキュベートする。
4. 3日目 - UPLCのサンプルの準備は最終日に行われます
- ヒートブロックを100°Cに切り上げる。 SDSを使用せずにサンプルを5分間煮て、ムラミドーゼの消化を止めます。遠心分離機サンプルを室温で16,000×gで10分間、上清(ムロペプチドは現在溶けやすい)を13mm x 100mmのガラス管に移します。できるだけ多くの上清を回復してみてください, それを乱すことなく、ペレットに非常に近づく.
- 500 mM ホウ酸塩バッファー (pH 9) をサンプルに加えて、最終濃度の 100 mM のホウ酸塩バッファーを調整します。ホウ酸塩緩衝液は、還元剤のホウ水素化ナトリウムと相性がある。1~2粒のホウ水素化ナトリウムを加えて各試料を減らし、室温で少なくとも30分間反応を進めます。注意:水素化水素ナトリウムは非常に反応性が高く、取り扱いに危険です - 皮膚との接触を避け(手袋を着用)、目との接触を避けてください(安全眼鏡を着用)。
- pHインジケーター用紙で測定したpH 6まで20μlの増分を使用して50%v/vオルトリン酸を用いてpH 3-4(ムロペプチド等電点は〜3.5)にサンプルを調整し、2 μlインクリメントを使用します。注意:オルソリン酸は腐食性であり、扱いに危険です - 皮膚との接触を避け(手袋を着用)、目との接触を避けてください(安全眼鏡を着用)。サンプルは、オルトリン酸の添加に応答して気泡する必要があります。サンプルがバブリングを停止すると、通常は pH 6 に達したことを示します。試料中にバブリングが起こらない場合、これは、添加されたホウ化水素ナトリウムの量が少なすぎることを示している可能性がある。この場合、pHの低下を止め、1粒または2粒のホウ化水素ナトリウムを慎重に加え、5〜10分間反応させてから、pH調整を再開する。
- 0.22 μmのシリンジフィルターを通して、サンプルをUPLCバイアルに直接フィルターします。沈殿物が形成された場合は、濾過する前に炎を通していくつかのパスでチューブを加熱します。サンプルが一日以内にUPLC装置に注入されない場合は、一晩で-20°Cで凍結してください。サンプルは-80 °Cで1年間まで保存することができます。 試料は、炎を数回通過させることによって解凍することができます。
- 各サンプルの10 μlを、C18 1.7 μm反転相カラムと202-208 nmを監視するように設定された吸光度検出器を備えたUPLC機器に注入します。サンプルは順次注入されますが、オートサンプラー機能を使用すると、最大 96 個のサンプルをバッチで処理できます。50 mM リン酸ナトリウム (pH 4.35) + 0.4% v/v 溶媒のアジドナトリウム、75 mM リン酸ナトリウム (pH 4.95) + 15% v/v メタノールを溶媒 B.流れを0.25 ml/minに設定し、25分以上の線形勾配を使用して、100%の溶媒Bと30分以内のムロペプチドの順次溶出を達成します。UPLC後のムロペプチドを特徴付けるために質量分析を使用する場合は、分画集電体で目的のピークの分画を収集し、遠心エバポレーターを使用して分画を乾燥させます。
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Representative Results
図1に示す手順を使用して、最終的なサンプルは、UPLCバイアルに直接フィルタリングされた少なくとも200 μlのクリアソリューションで構成されている必要があります(ステップ4.4)。細菌サンプル中の様々なムロペプチドのUPLC分離は、液体移動相とカラムの静止相との間の相対的な溶解性に依存する。逆相C18カラムは、疎水性およびサイズ8に基づいてムロペプチド種を分離する強力な疎水性マトリックスを提供する。極性、低分子量モノマーは最初に溶出し、そして非極性、より高い分子量オリゴマーは後にエルテする(図2)。典型的なUPLC結果は、特定のムロペプチドの保持時間を確立する時間の関数として202〜208nmのUV吸光度を介した検出を有する図2に示されている。この代表的な結果は、ほとんどのムロペプチド種とスペクトル全体の強い信号強度の間の明確な解像度を示し、これは、アナリシスを可能にし、平均グリカンストランド長さを示す。
図 1で概説した最後のステップでは、PH を調整し、UPLC で使用されるチューブの小さな寸法を詰まらせる可能性のある微粒子をフィルタリングします。サンプルが超濃縮されている場合、例えば200μlではなくステップ3.5で100μlのリン酸ナトリウムバッファーを再懸濁して、試料が濁り、臨界濃度が達成され、ムロペプチドが沈殿したことを示す。この溶解性の喪失は、ステップ4.4で使用されるシリンジフィルターの詰まりを引き起こし、UPLCバイアルへのムロペプチドの堆積および/またはUPLC機械導管およびカラムの詰まりを防止し、交換する高価なアイテムである。この異常なサンプル処理を反映したクロマトグラムの例を図3に示します。ピークが溶け出ず、PG組成上のデータが存在しなかった。pHをムロペプチドの等電点(例えば2のpH)より大きく下回るように誤調節すると、ムロペプチドの沈殿が生じ、UPLC分析から識別可能なピークが存在しない可能性があります。
図 1.サキュリ製剤の概略図。 この方法は、ペレット状のサキュリから離れてSDSを浄化するために、超遠心分離の反復ラウンドに依存しています。
図 2.例えば大 腸菌 MG1655細胞から消化した糖からPGのUPLCクロマトグラムを挙げる。 なお、全てのムロペプチドの同等の分解能は、典型的なHPLCの実行の10%の時間で達成される。ムロペプチドラベル - M =モノマー、D =ダイマー、T=トリマ;(2,3,4,5)は、アミノ酸幹細胞ペプチドの数を示します。修飾 - G =L-アラニンを置換するグリシン、L=プロナーゼE切断からの2つの追加アミノ酸、D=3,3-ジアミノピメル酸(DAP)-DAPクロスブリッジ、N=末流アンヒドロムロペプチド。例えば、D33DLは、3-aaステムペプチドを有する二量体であり、DAP-DAP架橋を介して連結され、プロナーゼE切断からさらに2つのアミノ酸を含む。
図 3. 大腸菌 MG1655細胞から消化した糖のUPLC分析に失敗した。 ピークの欠如は、試料中に存在するムロペプチドが存在しなかったことを示す、UPLCバイアルへの抽出前に溶液からクラッシュするムロペプチドによるものである(ステップ4.4)。この沈殿は、ムロペプチドの過剰濃度またはpHが低すぎるためであった可能性があります。
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Discussion
この手順の重要なステップは、サンプル調製の2日目のステップ3.1です。SDSが一晩沈殿した場合、またはサンプルが室温で数週間4%のSDSに保存されている場合、サンプルを再溶解させるために少なくとも1時間再沸騰させる必要があります。SDS沈殿の一般的な原因はカリウム塩を含む培地の使用であるため、可能であればカリウムは培地で避けるべきです。代表結果セクションで述べたように、ムロペプチドの等電点内(〜3.5)以内にpHを調整することも重要であるが、pH3より低すぎず、または物質が沈殿する可能性がある。最後に、試料の再懸濁は、研究者によって判断されなければならないリン酸ナトリウム緩衝液(ステップ3.5)の適切な容積で起こらなければならない。リン酸ナトリウムバッファーの再懸濁液量を選択する際には、特定の細菌培養物からどれくらいのムロペプチド物質が生成される可能性が高いかを考慮することが重要です。例えば、最終培養量が250mlの場合、上記で概説したように、サンプルは少なくとも200μlのリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁されなければならない。研究者が50ml培養液に変更を加えた場合、サンプルは100μl以下のリン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁され得る。種中のペプチドグリカンの予測量の考慮も重要です。例えば、 大腸菌 スフェロプラストは、ほぼ少ないペプチドグリカン(野生型 大腸菌 細胞10の約7%の量)を含有するので、100μl以下のリン酸ナトリウム緩衝液中で再懸濁が適切である。ある種の細菌種または株を大量(250ml)に増殖することが困難な場合、最終培養量を減少させ、また一晩培養の希釈を減らすことができる。最後に、HPLCシステムへの注入には最小体積200μlが必要ですが、UPLCシステムには10μlで十分です。
異なる生物または異なる用途でのPG成分の精製は、UPLC機器の移動相、カラム、勾配の種類を変えることによって調整することができます。アセトニトリルなどの溶媒ベースの移動相は、質量分析の前にサンプルを脱塩するために使用できます。また、その後の分析のためにサンプルを完全に脱塩するために、異なるカラムケミストが必要になる場合があります。 図2 は、グラム陰性棒状細菌のムロペプチドの共通溶出プロファイルを示しています 。 グラム陽性菌や他の形状を有する種からのPGの分析には、ステップ4.5で概説した勾配の微調整が必要な場合があります。 図2 に示すようなUPLCスペクトルは、ムロペプチド同一性、架橋率、グリカンストランド長さなど、ペプチドグリカンに関する多くのクラスの情報を生成しますが、この方法には、サキュリ全体の構造特徴の空間分布をマッピングできないことなど、いくつかの制限があります。例えば、グリカン鎖に沿ったクロスブリッジの位置も、結合したリポタンパク質の位置も、HPLCまたはUPLCを介して識別することはできません。
HPLCを用いたPGの化学組成を分析する利点としては、アミノ酸分析12-14や紙クロマトグラフィー15,16などの従来技術と比較して、高分解能、分析時間短縮、正確定量11が挙げられる。UPLCは、より高速な流れを可能にする高い圧力と、より短い実行時間を可能にするため、HPLCよりも高速で感度が高くなります。2μm以下の粒子径カラム、高サンプリングレート検出器、および低容量インジェクターは非常に高い圧力に耐え、したがって、高速17、18で正確に機能することができるように、UPLCで分解能は犠牲にされません。これにより、HPLCの200 μlと時間に比べ、1μlの数十分の順序でサンプルボリュームを分析できます。
UPLCと相補的な技術には、質量分析によるムロペプチド質量分析が含まれる。UPLC は破壊的な手法ではありません。カラムからの溶出物は、UV検出後に回収し、ほとんどの実験室で一般的に入手可能な遠心エバポレーターを使用して乾燥させることができます。サンプルは、質量分析(ステップ4.5)のためにそれを調製するために脱塩することができますが、マトリックス補助レーザー脱離/イオン化 - 飛行質量分析の時間は、塩濃度19に対してあまり感受性のない分析を可能にし、ムロペプチドの決定的同定が可能な質量データを生成します。UPLC用の1つの細胞壁サンプルを調製するコストは、使用される酵素、化学物質、および供給のコストを含め、約$ 6-7です。その安価なランニングコスト、アクセシビリティ、細菌細胞壁の研究のための実証された有用性を考えると、UPLCは細菌界全体のペプチドグリカン組成物の高解像度、ハイスループット、正確な定量化のための選択の方法であるべきです。
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Disclosures
この記事の生産コストはウォーターズコーポレーションが後援しました。
Acknowledgments
この作品は、NIHディレクターの新しいイノベーター賞DP2OD006466(K.C.H.)によって支えられていました。 著者らは、この方法の実践的なデモンストレーションと科学的な議論のためにラッセル・モンズに感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
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