Summary
Бактериальная клеточная стенка состоит из пептидогликана, макромолекулярной сети сахарных нитей, скрещенных пептидами. Ультра производительности жидкой хроматографии обеспечивает высокое разрешение и пропускную способность для новых открытий пептидогликан композиции. Мы представляем процедуру изоляции клеточных стенок (саккули) и их последующей подготовки к анализу через UPLC.
Abstract
Бактериальная клеточная стенка имеет решающее значение для определения формы клеток во время роста и деления, и поддерживает механическую целостность клеток перед лицом тургорного давления нескольких атмосфер в величине. По всей разнообразной формы и размеров бактериального царства, клеточная стенка состоит из пептидоглифа, макромолекулярной сети сахарных нитей, скрещенных короткими пептидами. Центральное значение Peptidoglycan для бактериальной физиологии лежит в основе его использования в качестве цели антибиотиков и мотивировано генетических, структурных и клеточных биологических исследований о том, как он надежно собраны во время роста и деления. Тем не менее, по-прежнему необходимы обширные исследования для полной характеристики ключевых энзиматических действий в синтезе пептидогликана и химического состава стенок бактериальных клеток. Высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC) является мощным аналитическим методом для количественной оценки различий в химическом составе стен бактерий, выращенных в различных экологических и генетических условиях, но его пропускная способность часто ограничена. Здесь мы представляем простую процедуру изоляции и подготовки бактериальных клеточных стенок для биологического анализа пептидогликана через HPLC и Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), расширение HPLC, которая использует насосы для доставки сверхвысокого давления до 15000 пси, по сравнению с 6000 пси для HPLC. В сочетании с подготовкой бактериальных клеточных стенок, представленных здесь, малообнакоченные инжекторы образца, детекторы с высокими показателями отбора проб, меньшие объемы выборки и более короткие сроки ведения UPLC позволят получить высокое разрешение и пропускную способность для новых открытий пептидогликанового состава и фундаментальной биологии бактериальных клеток в большинстве биологических лабораторий с доступом к ультрацентрифугу и UPLC.
Introduction
Цель метода, описанного в настоящем, заключается в том, чтобы изолировать нетронутыми стенки бактериальных клеток (sacculi) и переварить пептидогликан (PG) таким образом, что Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) может быть использован для предоставления информации, такой как идентичность компонентов муропептида и их концентрации, средняя длина гликановых нитей, и доля материала, участвуют в перекрестных нитей. Для детального обсуждения биохимии PG и видов муропептида, Есть несколько прекрасных обзоров, которые описывают структуру PG и ее роль в инфекции, устойчивость, морфогенез,и рост 1-6. Высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC) для анализа PG был первоначально разработан Глаунер и Шварц в 1980-х годах, а в последнее время был расширен и широко применяется в лабораториях Мигель де Педро и Вальдемар Фолльмер. Предыдущие методы использовали аминокислотный анализ или бумажную хроматографию, трудоемкие и утомительные методы, которые не дают точных или полных оценок компонентов клеточной стенки.
Анализ UPLC может быть легко реализован в любой лаборатории фундаментальных исследований, которая имеет доступ к ультрацентрифугу и UPLC. Метод UPLC, который мы представляем ниже, изолирует полный мешок, тем самым предоставляя всеобъемлющую, количественную информацию по всем химическим видам в них. Этот метод дает точную количественную оценку всех муропептидов по всей популяции бактерий, все в течение 20 мин UPLC перспективе. Внедрение этого метода предполагает только базовые лабораторные навыки, без значительных финансовых вложений в материалы. Для того, чтобы выполнить шаги в этом методе, исследователи должны быть квалифицированы только в трубопроводе, подготовка буферов и ферментов, и корректировка рН, что делает его доступным для широкого круга научных дисциплин. Выбор ферментов, используемых в этом протоколе, зависит от анализируемых видов бактерий; протокол, описанный здесь, полезен для кишечной палочки,и, как правило, было установлено, что достаточно для изоляции саккули от других грам-отрицательных организмов. Консультации с литературой рекомендуется при применении этого метода к грамположительных бактерий; в этих видах, sacculus очистки традиционно было сложнее. В частности, этот метод, возможно, придется изменить с точки зрения выбора ферментов и продолжительности времени пищеварения для размещения более толстых стенок и аксессуаров полимеров, таких как тейхойные кислоты грамположительных бактерий. Первый фермент в этом протоколе расщепляет внешний мембранный липопротеин (например, липопротеин Брауна, или Lpp) привязанность к пептиду, тем самым высвобождая все, кроме C-терминального ди- (или три)) пептида Lpp из клеточной стенки. Этот шаг необходим при изучении энтеробактерий, но многие другие грам-отрицательные бактерии не имеют эквивалентов Lpp, и поэтому этот шаг может быть пропущен. Второй фермент специально расщепляется после компонента мурамической кислоты пептидоглыкана, solubilizing disaccharide субъединит, который образует вид муропептида. Чтобы обеспечить точную оценку архитектуры PG, следует позаботиться о переваривании саккули, чтобы предотвратить расщепление кроссбриджей или любой другой части пептидного стебля.
Несмотря на то, что химические составы пептидогликана из более чем 100 штаммов бактериальных видов no40 были проанализированы HPLC, никаких анализов с помощью технологии UPLC не проводилось. Кроме того, предыдущая работа характеризовала пептидогликана лишь из небольшой доли бактериальной области, частично ограниченной пропускной способностью HPLC. Таким образом, распространение этого метода, как многие исследователи, как это возможно, и осуществление на платформах UPLC, будет иметь решающее значение для вождения физиологических исследований большой доли бактериальных видов, чьи пептидогликан до сих пор не классифицированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выращивать бактериальные культуры в 2,5 мл средств массовой информации Ночь
Обратно разбавить культур 1:100 в 250 мл свежих средств массовой информации и расти до OD600 из 0,7-0,8. Приготовьте раствор 6% додекилового сульфата натрия (SDS) в воде.
ВНИМАНИЕ: SDS порошок опасен - избежать вдыхания порошка SDS; носить маску над носом и ртом.
2. День 1 - Лисинг бактериальных культур осуществляется в течение одного дня и ночи
- В то время как разбавленные культуры растут, создать кипящую ванну воды на горячей тарелке в стакане 1 л. После того, как вода кипит, aliquot 6 мл 6% SDS в 50 мл полипропилевых трубок, добавить один небольшой бар перемешать к каждой трубке, безопасные крышки трубки для пальцев герметично, место трубки в водяной бане, и включите перемешивания до 500 об / мин на горячей пластине.
- Урожай 250 мл культур при 5000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре и повторного сбора гранул в 3 мл средств массовой информации или 1x фосфат-буферный солевой раствор. Медленно пипетки ячейки суспензии в 50 мл трубок с 6% кипения SDS для осязать клетки (окончательная концентрация 4% SDS), в то время как трубы погружаются в кипящей водяной бане, и повторно крышки для пальцев герметично. Подвески клеток должны быть быстро переданы в кипящий SDS после повторного перерасхода. Резких изменений окружающей среды следует избегать, так как это может привести к ошибочному изменению структуры клеточнойстенки.
- Обложка кипящей водяной бани и дайте клеткам кипеть в течение 3 часов, проверяя уровень воды периодически и заправки водяной бани, когда это необходимо. Через 3 часа выключите нагревательный элемент горячей пластины и продолжайте шевелиться на ночь при 500 об/мин.
3. День 2 - Энзиматические пищеварения выполняются в течение одного дня
- Если SDS осаждается в 50 мл трубок на ночь, установите водяной бане кипятить еще 1-2 часа. Включите тепловой блок до 60 градусов по Цельсию. Приготовьте запас Проназе E в 10 мМ Трис-ХКл (рН 7,2) и 0,06% ж/в NaCl и активируйте Pronase E при 60 градусах по Цельсию в течение не менее 30 мин.
- Используйте ультрацентрифуг, установленный на уровне 400 000 × г, чтобы вращать образцы в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать большие полимеры PG и тем самым очистить их от других клеточных компонентов. Удалите супернатант тщательно, а затем повторно каждой гранулы в комнатной температуре ультрачистой воды. ПРИМЕЧАНИЕ: Объем повторного производства зависит от объема используемых ультрацентрифуговых труб; использовать объем, который заполняет трубки по крайней мере на полпути, но не превышает максимальный объем труб. Повторите центрифугу/мытье до тех пор, пока вода не сформирует пузырьки во время повторного ссадины, что указывает на то, что SDS был полностью удален (обычно три моет). Прекратите мыть гранулы, если белый осадок формы, так как это указывает на то, что sacculi слипаются вместе. Clumping не является катастрофическим, но сгустки связывают очень сильно пластика и стеклянной посуды вызывает большие потери образца. В этом случае, приступить к протоколу с использованием слипшиеся sacculi образца.
- На последнем этапе центрифугации/мытья, повторно поместите образцы в 900 мкл 10 мм Tris-HCl (рН 7,2) и 0,06% ж/в NaCl и перенесите на 2 мл трубок, ранее ткнул с отверстиями в вершинах с небольшой иглой. Добавьте 100 мкл активированного Проназе Е (100 мкг/мл конечной концентрации) к каждому образцу и инкубировать при 60 градусах по Цельсию в течение 2 часов. Установите другой тепловой блок до 100 градусов по Цельсию.
- Остановите пищеварение Pronase E, добавив 200 мкл 6% SDS к каждому образцу и варите образцы в тепловом блоке 100 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Установите другой тепловой блок до 37 градусов по Цельсию и сделайте 1 мг/мл бульона мурамидазы (мутанолизин) в 50 мМ фосфатный буфер (рН 4,9).
- Как и в шаге 3.2, используйте ультрацентрифуг, установленный на уровне 400 000 × г, чтобы вращать образцы в течение 20 минут при комнатной температуре и мыть с комнатной температурой ультрачистой воды до тех пор, пока SDS полностью не будет удален (обычно три моет). Объем повторного сейсы зависит от объема используемых ультрацентрифуговых труб; использовать объем, который заполняет трубки по крайней мере на полпути, но не превышает максимальный объем труб.
- На последнем этапе центрифугации/мытья пробы повторного потребления в 200 мкл 50 мм фосфатного буфера натрия (рН 4,9). Этот объем может быть скорректирован в зависимости от количества пептидогликана в образце, и может быть видозависимым. Если есть ранее опубликованные отчеты об анализе HPLC для видов, представляющих интерес, этот том может быть оценен на основе этих количественных данных (компиляция исследований HPLC PG можно найти в дополнительной информации ссылки7). Для других видов, sacculus Prep может быть выполнена до этого шага, а затем различные объемы объемов повторного получения могут быть добавлены для репликации образцов для того, чтобы определить минимальный объем, который позволяет PG оставаться в решении (см. Обсуждение для дальнейших оценок). Если образец содержит больше пептидогликана, увеличьте объем повторного незаменимости; если образец имеет мало пептидогликана, уменьшите объем повторного незаменимости до минимума 50 мкл.
- Перенесите образцы в 1,5 мл трубок и добавьте 1 мг/мл мурамидазы, чтобы дать окончательную концентрацию 40 мкг/мл. Инкубация 6-8 часов или на ночь при 37 градусов по Цельсию.
4. День 3 - Подготовка образцов для UPLC осуществляется в последний день
- Включите тепловой блок до 100 градусов по Цельсию. Отварить образцы без SDS в течение 5 минут, чтобы остановить пищеварение muramidase. Образцы центрифуг в течение 10 мин при температуре 16 000 × г при комнатной температуре, а затем перенести супернатант (муропептиды теперь растворимы) на 13 мм х 100 мм стеклянные трубки. Попробуйте восстановить как можно больше супернатантов, как это возможно, получить очень близко к гранулы, не нарушая его.
- Отрегулируйте рН, добавив буфер бората 500 мМ (рН 9) к образцу для окончательной концентрации буфера бората 100 мМ. Буфер бората совместим с борогидридом натрия. Добавьте 1-2 зерна борогидрида натрия, чтобы уменьшить каждый образец и дайте реакции продолжиться, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: Борогидрид натрия очень реактивный и опасный для обработки - избегайте контакта с кожей (перчатки для ношения) и избегайте контакта с глазами (износ защитных очков).
- Отрегулируйте образцы до рН 3-4 (муропептидная изоэлектрическая точка составляет 3,5 евро) с 50% v/v ортопедической кислотой с использованием 20 йл шагом до рН 6, как измеряется бумагой индикатора рН, затем используя 2 хл шагом. ВНИМАНИЕ: Ортофосфорная кислота коррозионна и опасна для обработки - избегайте контакта с кожей (перчатки) и избегайте контакта с глазами (износ защитных очков). Образец должен пузыриться в ответ на добавление ортофосфорной кислоты; когда образец перестает пузыриться, это обычно указывает на то, что рН 6 был достигнут. Если в образце не происходит восходящей крови, это может свидетельствовать о том, что количество добавленного борогидрида натрия было слишком небольшим. В этом случае прекратите снижение рН, аккуратно добавьте одно-два зерна борогидрида натрия, дайте воспомхить в течение 5-10 мин, затем возобновите регулировку рН.
- Образец фильтра через фильтр шприца 0,22 мкм непосредственно в флакон UPLC. Если осадок сформировался, нагреть трубку с несколькими проходит через пламя перед фильтрацией. Если образец не будет введен в инструмент UPLC в течение дня, заморозить при -20 градусов по Цельсию на ночь. Образцы могут храниться до года при -80 градусах Цельсия. Образец можно разморозить, пройдя через пламя несколько раз.
- Ввись 10 мкл каждого образца на прибор UPLC, оснащенный реверсивной фазой C18 1,7 мкм и детектором абсорбтора, установленным для мониторинга 202-208 нм. Образцы вводятся последовательно, но возможности autosampler позволяют обрабатывать до 96 образцов в пакете. Используйте 50 мМ фосфат натрия (рН 4,35) - 0,4% в/в азид натрия для растворителя А и 75 мМ фосфата натрия (рН 4,95) и 15% в/в метанол для растворителя B. ПРИМЕЧАНИЕ: Азаид натрия добавляется для компенсации 205 нм поглощения метанола, чтобы избежать дрейфа базового уровня. Установите поток до 0,25 мл/мин и используйте линейный градиент более 25 мин для достижения 100% растворителя B и последовательного элаута муропептидов в течение 30 мин. Если масс-спектрометрия будет использоваться для характеристики муропептидов после UPLC, собрать фракции пика интереса в сборщике фракций и высушить фракции с помощью центробежного испарителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя процедуру, изложенную на рисунке 1,окончательная выборка должна состоять по крайней мере из 200 мкл четкого раствора, который был отфильтрован непосредственно в флакон UPLC (шаг 4.4). Разделение UPLC различных муропептидов в бактериальном образце зависит от их относительной солуственности между жидкой мобильной фазой и стационарной фазой колонны. Колонны обратной фазы C18 обеспечивают сильно гидрофобную матрицу для размезрения видов муропептида на основе гидрофобности и размера8; полярные, низкоямодерно-весовых мономеров elute во-первых, и аполярные, более высокий молекулярно-вес олигомеров elute после (Рисунок 2). Типичный результат UPLC показан на рисунке 2, с обнаружением с помощью УФ-абсорбтности на 202-208 нм в качестве функции времени, которая устанавливает определенное время удержания муропептида. Этот репрезентативный результат показывает четкое разрешение между большинством видов муропептида и сильной силой сигнала по всему спектру, что позволяет анализ, и средняя длина гликановой нити.
Заключительный шаг, изложенный на рисунке 1, включает в себя регулировку рН и фильтрацию любых мелких частиц, которые могут засорять небольшие размеры труб, используемых в UPLC. Если выборка сверхконцентрирована, например путем повторного перерасхода в 100 мл фосфатного буфера натрия в шаге 3,5 вместо 200 мкл, образец может стать облачным, что указывает на то, что критическая концентрация была достигнута и муропептиды ускорились. Эта потеря слуговости приведет к засорения шприц-фильтра, используемого в шаге 4.4, предотвращая осаждение муропептидов в флакон UPLC и/или засорение машинных трубопроводов и колонн UPLC, которые являются дорогостоящими элементами для замены. Пример хроматограммы, отражающей эту аномарантную обработку образца, показан на рисунке 3; пиков не было, что привело к отсутствию каких-либо данных о составе PG. Неправильное корректировка рН значительно ниже изоэлектрической точки муропептидов(например, до рН 2) может также привести к осадкам муропептидов и, следовательно, отсутствие заметных пиков от анализа UPLC.
Рисунок 1. Схема подготовки саккули. Этот метод опирается на итеративные раунды ультрацентрифугации, чтобы очистить SDS от гранулированных саккулей.
Рисунок 2. Пример UPLC хроматограммы PG из саккули, переваренной из клеток E. coli MG1655. Обратите внимание, что сопоставимое разрешение всех муропептидов достигается в 10% времени типичного запуска HPLC. Muropeptide этикетки - M и мономер, D и димер, T и тример; (2,3,4,5) указывают на количество аминокислотных стволовых пептидов; модификации - G й глицин, заменяющий L-аланин, L - две дополнительные аминокислоты из расщепления Pronase E, D - 3,3-диаминопимеловая кислота (DAP)-DAP crossbridge, N - прекращение ангидро-муропептида. Например, D33DL является димер с 3-аа стволовых пептидов, связанных через DAP-DAP кроссбридж, содержащий дополнительные две аминокислоты из Pronase E декольте.
Рисунок 3. Неудачный анализ UPLC саккули, переваренной из клеток E. coli MG1655. Отсутствие пиков, указывающих на отсутствие муропептидов в образце, объясняется тем, что муропептиды выходят из раствора перед извлечением в флакон UPLC (шаг 4.4). Это количество осадков, возможно, было связано с чрезмерной центрацией муропептидов или слишком низким рН.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важным шагом в этой процедуре является шаг 3.1 второго дня подготовки образца. Если SDS осаждается в одночасье, или если образцы хранились в 4% SDS в течение нескольких недель при комнатной температуре, образцы должны быть reboiled, по крайней мере 1 час, чтобы переокрасить SDS. Распространенной причиной выпадения SDS является использование средств массовой информации с солями калия, поэтому калия следует избегать в средствах массовой информации, если это возможно. Как уже упоминалось в разделе Результаты представителя, также важно настроить рН в пределах изоэлектрической точки муропептидов (No3,5), но не слишком много ниже, чем рН 3, или материал может осаждаться. Наконец, повторное использование образца должно происходить в соответствующем объеме фосфатного буфера натрия (шаг 3.5), о котором должен судить исследователь. При выборе объема повторного незаменимия фосфатного буфера натрия важно учитывать, сколько материала муропептида может быть получено из определенной бактериальной культуры. Например, если окончательный объем культуры составляет 250 мл, как указано выше, образец должен быть повторно использован в буфере фосфатов натрия, по крайней мере, в 200 мл. Если исследователь модифицирует метод до 50 мл культур, образцы могут быть повторно использованы в 100 мл буфера фосфатов натрия или меньше. Рассмотрение прогнозируемого количества пептидогликана у вида также имеет важное значение; например, сферопласты кишечной палочки содержат значительно меньше пептидогликана (примерно 7% от количества в клетках кишечной палочки дикого типа 10),и поэтому целесообразно повторное успение в 100 мл или менее фосфатного буфера натрия. Если трудно вырастить определенный бактериальный вид или штамм в больших количествах (250 мл), окончательный объем культуры может быть уменьшен и/или разбавление ночной культуры может быть уменьшено. Наконец, для впрыска в систему HPLC требуется минимальный объем в 200 мкл, в то время как для системы UPLC достаточно 10 мкл.
Очистка компонентов PG в различных организмах или для различных приложений может быть настроена путем изменения типа мобильной фазы, столбца и градиента на инструменте UPLC. Мобильные фазы, основанные на растворителях, такие как ацетонитрил, могут быть использованы для опреснии образцов до массовой спектрометрии. Различные химические столбцы также могут потребоваться для тщательного опреснии образцов для последующего анализа. Рисунок 2 показывает общий профиль элауциона муропептидов для грам-отрицательных стержнеобразной бактерии E. coli MG1655; анализ PG от грамположительных бактерий и/или видов с другими формами может потребовать тонкой настройки градиента, изложенного в шаге 4.5. Хотя спектры UPLC, такие как тот, который показан на рисунке 2, генерируют много классов информации, касающейся пептидогликана, таких как muropeptide identity, перекрестный процент и длина гликановых нитей, метод имеет несколько ограничений, включая невозможность сопоставить пространственное распределение структурных объектов между саккулями. Например, ни места скрещивания по цепочке гликан, ни расположение связанных липопротеинов не могут быть различимы через HPLC или UPLC.
Преимущества анализа химического состава PG с HPLC включают более высокое разрешение, более короткое время анализа и точную количественнуюоценку 11 по сравнению с традиционными методами,такими как аминокислотный анализ 12-14 или бумажнаяхроматография 15,16. UPLC предлагает более высокую скорость и чувствительность, чем HPLC из-за более высокого давления, которые позволяют быстрее потоков и, следовательно, более короткие сроки времени работать. Разрешение не приносятся в жертву с UPLC, как к югу от 2 мкм столбцы размера частиц, детекторы высокой скорости выборки, и малотонмацовые инжекторы способны выдерживать очень высокое давление и, таким образом, функционировать точно на высокихскоростях 17,18. Это приводит к возможности анализировать объемы выборки порядка 1 мл в десятки минут, по сравнению с 200 мл и часов для HPLC.
Методы, дополняющие UPLC, включают анализ массы муропептида с помощью масс-спектрометрии. UPLC не является разрушительным методом; элуат из колонки может быть собран после обнаружения УФ и высушен с помощью центробегольного испарителя, обычно доступного в большинстве лабораторий. Хотя образец может быть опресн, чтобы подготовить его к масс-спектрометрии (шаг 4.5), Матрица Помощь Лазерная Desorption / Ионизация - Время полета масс-спектрометрии позволяет анализ безособой чувствительности к концентрации соли 19, и дает массовые данные, способные окончательное выявление muropeptides. Стоимость подготовки одного образца клеточной стенки для UPLC составляет примерно $6-7, включая затраты на ферменты, химические вещества и используемые материалы. Учитывая его недорогие эксплуатационные расходы, доступность, и продемонстрировали полезность для исследований бактериальной клеточной стенки, UPLC должен стать методом выбора для высокого разрешения, высокой пропускной способности, точной количественной оценки состава пептидогликана по всему бактериальному царству.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Производственные затраты на эту статью были спонсированы корпорацией Уотерс.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана директором NIH Новый новатор премии DP2OD006466 (к K.C.H.). Авторы благодарят РасселаМондса за практическую демонстрацию метода и за научные дискуссии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
