Summary
Bakteriecellväggen består av peptidoglykan, ett makromolekylärt nätverk av sockersträngar som är korslänkade av peptider. Ultra Performance Liquid Chromatography ger hög upplösning och genomströmning för nya upptäckter av peptidoglykankomposition. Vi presenterar ett förfarande för isolering av cellväggar (sacculi) och deras efterföljande förberedelse för analys via UPLC.
Abstract
Bakteriecellväggen är avgörande för bestämning av cellform under tillväxt och delning, och upprätthåller cellernas mekaniska integritet inför turgortryck flera atmosfärer i storlek. Över bakterieriket består cellväggen av peptidoglykan, ett makromolekylärt nätverk av sockersträngar som är korslänkade av korta peptider. Peptidoglycans centrala betydelse för bakteriefysiologi ligger till grund för dess användning som ett antibiotikummål och har motiverat genetiska, strukturella och cellbiologiska studier av hur den monteras robust under tillväxt och delning. Icke desto mindre krävs det fortfarande omfattande undersökningar för att fullt ut karakterisera de viktigaste enzymatiska aktiviteterna i peptidoglykansyntesen och den kemiska sammansättningen av bakteriecellsväggar. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) är en kraftfull analysmetod för att kvantifiera skillnader i den kemiska sammansättningen av väggarna i bakterier som odlas under en mängd olika miljömässiga och genetiska förhållanden, men dess genomströmning är ofta begränsad. Här presenterar vi ett enkelt förfarande för isolering och beredning av bakteriella cellväggar för biologiska analyser av peptidoglykan via HPLC och Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), en förlängning av HPLC som använder pumpar för att leverera ultrahögtryck på upp till 15 000 psi, jämfört med 6 000 psi för HPLC. I kombination med beredningen av bakteriella cellväggar som presenteras här, kommer lågvolymprovinjektorer, detektorer med hög samplingshastighet, mindre provvolymer och kortare körtider för UPLC att möjliggöra hög upplösning och genomströmning för nya upptäckter av peptidoglykansammansättning och grundläggande bakteriecellsbiologi i de flesta biologiska laboratorier med tillgång till en ultracentrifuge och UPLC.
Introduction
Målet med den metod som beskrivs häri är att isolera intakta bakteriecellväggar (sacculi) och att smälta peptidoglykanen (PG) så att Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan användas för att ge information som muropeptidkomponenternas identitet och deras koncentrationer, den genomsnittliga längden på glykansträngar och den del av materialet som är involverat i korslänkar mellan strängar. För en detaljerad diskussion om PG biokemi och muropeptide arter, Det finns flera utmärkta recensioner som beskriver PG struktur och dess roll i infektion, resistens, morfofilos, och tillväxt1-6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) för PG-analys utvecklades ursprungligen av Glauner och Schwarz på 1980-talet, och har på senare tid förbättrats och tillämpats i stor utsträckning i laboratorierna miguel de Pedro och Waldemar Vollmer. Tidigare metoder använde aminosyra analys eller papper kromatografi, tidskrävande och tråkiga tekniker som inte ger exakta eller fullständiga bedömningar av cellvägg komponenter.
UPLC-analys kan enkelt implementeras i alla grundläggande forskningslaboratorier som har tillgång till en ultracentrifuge och UPLC. UPLC-metoden som vi presenterar nedan isolerar kompletta sacculi och ger därmed omfattande, kvantitativ information om alla kemiska arter däri. Denna metod ger exakt kvantifiering av alla muropeptider över en bakteriepopulation, allt inom en 20 minuters UPLC-körning. Genomförandet av denna metod omfattar endast grundläggande laboratoriefärdigheter, utan betydande ekonomiska investeringar i material. För att utföra stegen i denna metod behöver forskare bara vara skickliga på pipetting, förbereda buffertar och enzymer och justera pH, vilket gör det tillgängligt för ett brett spektrum av vetenskapliga discipliner. Valet av enzymer som används i detta protokoll beror på vilken bakterieart som analyseras; det protokoll som beskrivs här är användbart för Escherichia coli, och har i allmänhet visat sig vara tillräckligt för att isolera sacculi från andra Gram-negativa organismer. Samråd med litteraturen rekommenderas vid tillämpning av denna metod på grampositiva bakterier; I dessa arter har sacculus rening traditionellt varit svårare. I synnerhet kan denna metod behöva ändras när det gäller enzymval och matsmältningstid för att rymma de tjockare väggarna och tillbehörspolymerer som teichoicsyror av grampositiva bakterier. Det första enzymet i detta protokoll klyver yttre membran lipoprotein (såsom Brauns lipoprotein, eller Lpp) fastsättning i peptidoglykanen, vilket frigör alla utom C-terminal di- (eller tri-) peptiden av Lpp från cellväggen. Detta steg är nödvändigt vid undersökning av Enterobacteria, men många andra Gram-negativa bakterier har inga Lpp-motsvarigheter, och därför kan detta steg hoppas över. Ett andra enzym klyver specifikt efter peptidoglykanens muramsyrakomponent, vilket gör disackaridunderenheten löslig som bildar muropeptidarten. För att ge en korrekt bedömning av PG: s arkitektur bör man vara försiktig med att smälta sacculi för att förhindra klyvning av korsbroarna eller någon annan del av peptidstammen.
Även om de kemiska sammansättningarna av peptidoglykan från över 100 stammar av ~ 40 bakteriearter har analyserats av HPLC, har inga analyser utförts med UPLC-teknik. Dessutom har tidigare arbete karakteriserat peptidoglykan från endast en liten del av bakteriedomänen, delvis begränsad av genomströmningen av HPLC. Därför kommer spridning av denna metod till så många forskare som möjligt, och implementering på UPLC-plattformar, att vara avgörande för att driva fysiologiska studier av den stora andelen bakteriearter vars peptidoglykan ännu inte har kategoriserats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Odla bakteriekulturer i 2,5 ml media över natten
Ryggspädkulturer 1:100 till 250 ml färska medier och växa till OD600 av 0,7-0,8. Förbered en lösning på 6% natriumdidcylsulfat (SDS) i vatten.
VARNING: SDS pulver är farligt - undvik att andas in SDS pulver; bära mask över näsa och mun.
2. Dag 1 - Lysing bakteriekulturer utförs under en dag och över natten
- Medan utspädda kulturer växer, sätt upp ett kokande vattenbad på en kokplatta i en 1 L bägare. När vattnet kokar, alikvot 6 ml 6% SDS i 50 ml polypropylenrör, tillsätt en liten omrörningsstång till varje rör, säkra rörlocken till fingertäta, placera rören i vattenbadet och slå på omrörningen till 500 rpm på värmeplattan.
- Skörda de 250 ml-odlingarna vid 5 000 × g i 10 min vid rumstemperatur och återanvänd pellets i 3 ml media eller 1x fosfatbuffrad saltlösning. Långsamt ledcellsupphängningar i 50 ml rör med 6% kokande SDS för att lysa cellerna (slutlig koncentration 4% SDS) medan rören är nedsänkta i det kokande vattenbadet och omsluter locken till fingertät. Cellupphängningar måste snabbt överföras till kokande SDS när de har återsuspenderats. Plötsliga miljöförändringar bör undvikas, eftersom detta kan orsaka felaktig förändring av cellväggsstrukturen.
- Täck kokande vattenbad och låt cellerna koka i 3 timmar, kontrollera vattennivån regelbundet och fyll på vattenbadet vid behov. Efter 3 timmar stänger du av värmeelementet på värmeplattan och fortsätter att röra om över natten vid 500 varv/min.
3. Dag 2 - Enzymatiska matsmältningar utförs under en dag
- Om SDS har fällts ut i 50 ml-rören över natten, ställ in vattenbadet så att det kokar i ytterligare 1-2 timmar. Slå på ett värmeblock till 60 °C. Förbered ett 1 mg/ml lager av Pronase E i 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl och aktivera Pronase E vid 60 °C i minst 30 min.
- Använd en ultracentrifuge inställd på 400 000 × g för att snurra prover i 20 minuter vid rumstemperatur för att pelleta de stora PG-polymererna och därmed rena dem från andra cellulära komponenter. Ta bort supernatant försiktigt och återanvänd sedan varje pellet i rumstemperatur ultrapure vatten. OBS: Återsuspensionsvolymen beror på volymen på de ultracentrifugrör som används. använd en volym som fyller rören minst halvvägs men som inte överstiger rörens maximala volym. Upprepa centrifugation/tvättning tills vattnet inte bildar bubblor under återsuspension, vilket indikerar att SDS har tagits bort helt (vanligtvis tre tvättar). Sluta tvätta pelleten om en vit fällning bildas, eftersom det indikerar att sacculi klumpar ihop sig. Klumpar är inte katastrofalt, men klumpar binder mycket starkt till plast och glas som orsakar stor provförlust. Fortsätt i så fall med protokollet med det klumpade sacculiprovet.
- På det sista centrifugerings-/tvättsteget återanvände proverna i 900 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl och överför till 2 ml rör som tidigare petats med hål i topparna med en liten nål. Tillsätt 100 μl 1 mg/ml aktiverat Pronase E (100 μg/ml slutlig koncentration) till varje prov och inkubera vid 60 °C i 2 timmar. Ställ in ett annat värmeblock på 100 °C.
- Stoppa Pronase E-matsmältningen genom att tillsätta 200 μl 6 % SDS till varje prov och koka proverna i värmeblocket på 100 °C i 30 minuter. Ställ in ett annat värmeblock på 37 °C och gör ett 1 mg/ml lager av muramidas (mutanolysin) i 50 mM fosfatbuffert (pH 4.9).
- Som i steg 3.2, använd ett ultracentrifuge-set på 400 000 × g för att snurra prover i 20 minuter vid rumstemperatur och tvätta med rumstemperatur ultrapurevatten tills SDS är helt borttaget (vanligtvis tre tvättar). Återsuspensionsvolymen beror på volymen på de ultracentrifugrör som används. använd en volym som fyller rören minst halvvägs men som inte överstiger rörens maximala volym.
- På det sista centrifugerings-/tvättsteget återanvänds prover i 200 μl 50 mM natriumfosfatbuffert (pH 4.9). Denna volym kan justeras beroende på mängden peptidoglykan i provet och kan vara artberoende. Om det tidigare har publicerats rapporter om HPLC-analys för de arter som är av intresse kan denna volym uppskattas baserat på dessa kvantifieringar (en sammanställning av HPLC PG-studier finns i kompletterandereferensinformation 7). För andra arter kan sacculusförberedelserna utföras fram till detta steg och sedan kan olika mängder återsuspensionsvolymer läggas till i replikerade prover för att bestämma den minimala volym som gör att PG kan förbli i lösning (se Diskussion för ytterligare uppskattningar). Om provet innehåller mer peptidoglykan, öka återsuspensionsvolymen; Om provet har liten peptidoglykan, minska återsuspensionsvolymen till minst 50 μl.
- Överför proverna till 1,5 ml rör och tillsätt 1 mg/ml muramidas för att ge en slutlig koncentration på 40 μg/ml. Inkubera 6-8 timmar eller över natten vid 37 °C.
4. Dag 3 - Beredning av prover för UPLC utförs på sista dagen
- Slå på ett värmeblock till 100 °C. Koka proverna utan SDS i 5 minuter för att stoppa muramidas matsmältningen. Centrifugprover i 10 min vid 16 000 × g vid rumstemperatur och överför sedan supernatanten (muropeptider är nu lösliga) till 13 mm x 100 mm glasrör. Försök att återhämta så mycket supernatant som möjligt, komma mycket nära pelleten utan att störa den.
- Justera pH-värde genom att tillsätta 500 mM boratbuffert (pH 9) till provet för en slutlig koncentration på 100 mM boratbuffert. Boratbuffert är kompatibel med reducerande medel natriumhydrid. Tillsätt 1-2 korn natriumhydrid för att minska varje prov och låt reaktionen fortsätta i minst 30 minuter vid rumstemperatur. VARNING: Natriumhydrid är mycket reaktiv och farlig att hantera - undvik kontakt med huden (använd handskar) och undvik kontakt med ögonen (använd skyddsglasögon).
- Justera proverna till pH 3-4 (muropeptidisoelektrisk punkt är ~3,5) med 50% v/v ortofosforsyra med 20 μl steg till pH 6, mätt med pH-indikatorpapper, och använd sedan 2 μl steg. VARNING: Ortofosforsyra är frätande och farlig att hantera - undvik kontakt med huden (använd handskar) och undvik kontakt med ögonen (använd skyddsglasögon). Provet ska bubbla som svar på tillsats av ortofosforsyra. När provet slutar bubbla indikerar detta vanligtvis att ett pH-värdet på 6 har uppnåtts. Om inget bubblande inträffar i provet kan detta tyda på att mängden natriumhydrid som tillsattes var för liten. I det här fallet, sluta sänka pH, tillsätt försiktigt ett eller två korn natrium borohydrid, låt reagera i 5-10 min och återuppta sedan pH-justeringen.
- Filtrera provet genom ett 0,22 μm sprutfilter direkt i en UPLC-injektionsflaska. Om en fällning har bildats, värm röret med flera pass genom en flamma innan du filtrerar. Om provet inte injiceras i UPLC-instrumentet inom dagen, frys in vid -20 °C över natten. Prover kan förvaras i upp till ett år vid -80 °C. Provet kan tinas genom att passera genom en flamma flera gånger.
- Injicera 10 μl av varje prov på ett UPLC-instrument utrustat med en C18 1,7 μm omvänd faskolonn och en absorbansdetektor inställd för att övervaka 202-208 nm. Prover injiceras sekventiellt, men autosamplerfunktioner gör att upp till 96 prover kan bearbetas i batch. Använd 50 mM natriumfosfat (pH 4.35) + 0,4% v/v natriumazid för lösningsmedel A och 75 mM natriumfosfat (pH 4,95) + 15% v/v metanol för lösningsmedel B. OBS: Natriumazid tillsätts för att kompensera för 205 nm absorption av metanol för att undvika baslinjedrift. Ställ in flödet på 0,25 ml/min och använd en linjär gradient över 25 min för att uppnå 100% lösningsmedel B och sekventiell eluering av muropeptider inom 30 min. Om masspektrometri kommer att användas för att karakterisera muropeptider efter UPLC, samla in fraktioner av toppen av intresse för en fraktionssamlare och torka fraktionerna med hjälp av en centrifugalförångare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av det förfarande som beskrivs i figur 1bör det slutliga provet bestå av minst 200 μl klar lösning som har filtrerats direkt till en UPLC-injektionsflaska (steg 4.4). UPLC-separation av de olika muropeptiderna i ett bakteriellt prov förlitar sig på deras relativa löslighet mellan den flytande mobila fasen och kolumnens stillastående fas. C18-kolonner i omvänd fas ger en starkt hydrofobisk matris för att separera muropeptidarterna baserat på hydrofobi och storlek8; polära monomerer med låg molekylvikt eluerar först och apolära, högre oligomerer med molekylvikt eluerar efter (figur 2). Ett typiskt UPLC-resultat visas i figur 2, med detektion via UV-absorbans vid 202-208 nm som en tidsfunktion som fastställer en viss muropeptids retentionstid. Detta representativa resultat visar tydlig upplösning mellan de flesta muropeptidarter och stark signalstyrka över spektrumet, vilket möjliggör analysiz och genomsnittlig glykanstränglängd.
Det sista steget i figur 1 innebär att man justerar pH och filtrerar eventuella fina partiklar som kan täppa till de små dimensionerna på slangarna som används i UPLC. Om ett prov är superkoncentraterat, till exempel genom återutnyttjande i 100 μl natriumfosfatbuffert i steg 3,5 i stället för 200 μl, kan provet bli grumligt, vilket indikerar att en kritisk koncentration har uppnåtts och muropeptiderna har fällts ut. Denna förlust av löslighet kommer att resultera i igensättning av sprutfiltret som används i steg 4.4, vilket förhindrar nedfall av muropeptider i UPLC-flaskan och / eller igensättning av UPLC-maskinledningarna och kolumnen, som är kostsamma föremål att byta ut. Ett exempelkromatogram som återspeglar denna bearbetning av avvikande prov visas i figur 3. Inga toppar eluterade, vilket resulterar i att inga data om PG-sammansättningen saknas. Feljustering av pH till långt under muropeptidens isoelektriska punkt(t.ex. till ett pH-kort på 2) kan också resultera i utfällning av muropeptider och därmed frånvaron av urskiljbara toppar från UPLC-analys.
Figur 1. Schematisk av sacculi förberedelse. Denna metod förlitar sig på iterativa rundor av ultracentrifugation för att rena SDS bort från pelleterade sacculi.
Figur 2. Exempel UPLC kromatogram av PG från sacculi smält från E. coli MG1655 celler. Observera att jämförbar upplösning av alla muropeptider uppnås i 10% av tiden för en typisk HPLC-körning. Muropeptidetiketter - M = monomer, D = dimer, T = trimer; (2,3,4,5) anger antalet aminosyrastampeptider; modifieringar - G = glycin ersätter L-alanin, L = två ytterligare aminosyror från Pronase E klyvning, D = 3,3-diaminopimelic syra (DAP)-DAP crossbridge, N = avslutande anhydro-muropeptid. Till exempel är D33DL en dimer med 3-aa stampeptider, länkade genom en DAP-DAP crossbridge, som innehåller ytterligare två aminosyror från Pronase E klyvning.
Figur 3. Misslyckad UPLC analys av sacculi smält från E. coli MG1655 celler. Frånvaron av toppar, som indikerar att det inte fanns några muropeptider i provet, beror på att muropeptider kraschar ut ur lösningen före extraktion i en UPLC-flaska (steg 4.4). Denna nederbörd kan ha berott på överkoncentration av muropeptiderna eller på att pH är för låg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kritiskt steg i denna procedur är steg 3.1 av den andra dagen av provberedning. Om SDS har fällts ut över natten, eller om proverna har lagrats i 4% SDS i flera veckor vid rumstemperatur, måste proverna återboileras i minst 1 timme för att omissolve SDS. En vanlig orsak till SDS nederbörd är användningen av media med kaliumsalter, så kalium bör undvikas i media om möjligt. Som nämnts i avsnittet Representativa resultat är det också viktigt att justera pH-h:t till inom muropeptidens isoelektriska punkt (~3,5), men inte för mycket lägre än pH 3, eller så kan materialet fällas ut. Slutligen måste återsuspension av provet ske i lämplig volym natriumfosfatbuffert (steg 3.5), som måste bedömas av forskaren. När man väljer återsuspensionsvolymen av natriumfosfatbuffert är det viktigt att överväga hur mycket muropeptidmaterial som sannolikt kommer att genereras från en viss bakteriekultur. Om den slutliga odlingsvolymen till exempel är 250 ml, enligt ovan, måste provet återanvändas i minst 200 μl natriumfosfatbuffert. Om forskaren ändrar metoden till 50 ml kulturer kan proverna återanvändas i 100 μl natriumfosfatbuffert eller mindre. Hänsyn till de förväntade mängderna peptidoglykan hos en art är också viktigt; Till exempel innehåller E. coli-sfäroplaster betydligt mindre peptidoglykan (cirka 7% av mängden i vilda E. coli-celler 10), och därför är återsuspension i 100 μl eller mindre av natriumfosfatbuffert lämplig. Om det är svårt att odla en viss bakterieart eller stam till stora mängder (250 ml), kan den slutliga odlingsvolymen minskas och/ eller utspädningen av nattkulturen kan minskas. Slutligen kräver injektion på ett HPLC-system en minsta volym på 200 μl, medan 10 μl är tillräckligt för ett UPLC-system.
Reningen av PG-komponenter i olika organismer eller för olika tillämpningar kan justeras genom att variera typen av mobil fas, kolonn och lutning på UPLC-instrumentet. Mobila faser som är lösningsmedelsbaserade, såsom acetonitril, kan användas för att avsalta prover före masspektrometri. Olika kolonnkemister kan också behöva avsalta prover noggrant för efterföljande analys. Figur 2 visar den vanliga elueringsprofilen för muropeptider för den gramnegativa stavformade bakterien E. coli MG1655; Analysen av PG från grampositiva bakterier och/eller arter med andra former kan kräva finjustering av den lutning som beskrivs i steg 4.5. Även om UPLC-spektra som det som visas i figur 2 genererar många klasser av information om peptidoglykan, såsom muropeptididentitet, korslänkningsprocent och glykanstränglängd, har metoden flera begränsningar, inklusive oförmågan att kartlägga den rumsliga fördelningen av strukturella egenskaper över sacculi. Till exempel kan varken platserna för korsningar längs en glykankedja eller platserna för bundna lipoproteiner urskiljas via HPLC eller UPLC.
Fördelarna med att analysera den kemiska sammansättningen av PG med HPLC inkluderar högre upplösning, kortare analystid och noggrann kvantifiering11 jämfört med traditionella tekniker som aminosyraanalys12-14 eller papperskromatografi15,16. UPLC erbjuder högre hastighet och känslighet än HPLC på grund av högre tryck som möjliggör snabbare flöden och därmed kortare körtider. Upplösning offras inte med UPLC, eftersom sub-2 μm partikelstorlekskolonner, hög samplingshastighetsdetektorer och injektorer med låg volym kan motstå mycket höga tryck och därmed fungera exakt vid högahastigheter 17,18. Detta resulterar i förmågan att analysera provvolymer i storleksordningen 1 μl på tiotals minuter, jämfört med 200 μl och timmar för HPLC.
Tekniker som kompletterar UPLC inkluderar muropeptid massanalys genom masspektrometri. UPLC är inte en destruktiv teknik; Eluatet från kolonnen kan samlas in efter UV-detektion och torkas med hjälp av en centrifugalförångare som är allmänt tillgänglig i de flesta laboratorier. Även om provet kan avsaltas för att förbereda det för masspektrometri (steg 4.5), möjliggör Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight Mass Spectrometry analys utan mycket känslighet för saltkoncentration19, och ger massdata som kan definitivt identifiera muropeptider. Kostnaden för att förbereda ett cellväggsprov för UPLC är cirka $ 6-7, inklusive kostnaderna för enzymer, kemikalier och leveranser som används. Med tanke på dess billiga driftskostnader, tillgänglighet och demonstrerade nytta för studier av bakteriecellväggen, bör UPLC bli den metod som är valbar för högupplöst, hög genomströmning, korrekt kvantifiering av peptidoglykankomposition över hela bakterieriket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Produktionskostnaderna för denna artikel sponsrades av Waters Corporation.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Director's New Innovator Award DP2OD006466 (till K.C.H.). Författarna tackar Russell Monds för en praktisk demonstration av metoden och för vetenskapliga diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
