Summary
Bakteri hücre duvarı peptidoglikan, peptitler tarafından çaprazlanmış şeker iplikçiklerinden oluşan bir makromoleküler ağdır. Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi, peptidoglikan kompozisyonunun yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlar. Hücre duvarlarının izolasyonu (sakculi) ve daha sonra UPLC aracılığıyla analize hazırlanmaları için bir prosedür sunuyoruz.
Abstract
Bakteri hücre duvarı, büyüme ve bölünme sırasında hücre şeklinin belirlenmesi için kritik öneme sahiptir ve turgor basınçları karşısında hücrelerin mekanik bütünlüğünü korur. Bakteri krallığının çeşitli şekil ve boyutlarında, hücre duvarı kısa peptitlerle birbirine bağlanmış bir makromoleküler şeker iplikçik ağı olan peptidoglikan'dan oluşur. Peptidoglikanın bakteriyel fizyolojiye verdiği merkezi önem, antibiyotik hedefi olarak kullanılmasının altındadır ve büyüme ve bölünme sırasında nasıl sağlam bir şekilde bir araya getirildiğine dair genetik, yapısal ve hücre biyolojik çalışmalarını motive etmektedir. Bununla birlikte, peptidoglikan sentezindeki temel enzimatik faaliyetleri ve bakteri hücre duvarlarının kimyasal bileşimini tam olarak karakterize etmek için hala kapsamlı araştırmalar yapılması gerekmektedir. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), çeşitli çevresel ve genetik koşullar altında yetişen bakterilerin duvarlarının kimyasal bileşimindeki farklılıkları ölçmek için güçlü bir analitik yöntemdir, ancak verimi genellikle sınırlıdır. Burada, HPLC ve Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC) aracılığıyla peptidoglikan'ın biyolojik analizleri için bakteri hücre duvarlarının izolasyonu ve hazırlanması için basit bir prosedür sunuyoruz, HPLC için 6.000 psi ile karşılaştırıldığında, 15.000 psi'ye kadar ultra yüksek basınç sağlamak için pompaları kullanan HPLC'nin bir uzantısı. Burada sunulan bakteri hücre duvarlarının hazırlanmasıyla birlikte, düşük hacimli numune enjektörleri, yüksek örnekleme oranlarına sahip dedektörler, daha küçük numune hacimleri ve UPLC'nin daha kısa çalışma süreleri, ultrasantrifüje ve UPLC'ye erişimi olan çoğu biyolojik laboratuvarda peptidoglikan bileşiminin ve temel bakteri hücre biyolojisinin yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlayacaktır.
Introduction
Burada açıklanan yöntemin amacı, bozulmamış bakteri hücre duvarlarını (sakculi) izole etmek ve peptidoglikan'ı (PG) sindirmektir, böylece Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC), muropeptid bileşenlerinin kimliği ve konsantrasyonları, glikan iplikçiklerinin ortalama uzunluğu ve iplikçikler arasındaki çapraz bağlantılarda yer alan malzemenin fraksiyonu gibi bilgileri sağlamak için kullanılabilir. PG biyokimyası ve muropeptid türlerinin ayrıntılı bir tartışması için, PG yapısını ve enfeksiyon, direnç, morfogenez ve büyümedeki rolünü açıklayan birkaç mükemmel inceleme vardır1-6. PG analizi için Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ilk olarak 1980'lerde Glauner ve Schwarz tarafından geliştirilmiştir ve daha yakın zamanda Miguel de Pedro ve Waldemar Vollmer laboratuvarlarında geliştirilmiş ve yaygın olarak uygulanmıştır. Önceki yöntemlerde amino asit analizi veya kağıt kromatografisi, hücre duvarı bileşenlerinin doğru veya tam değerlendirmelerini yapmayan zaman alıcı ve sıkıcı teknikler kullanılmıştır.
UPLC analizi, ultracentrifuge ve UPLC erişimi olan herhangi bir temel araştırma laboratuvarında kolayca uygulanabilir. Aşağıda sunduğumuz UPLC yöntemi tam sakkuliyi izole eder, böylece buradaki tüm kimyasal türler hakkında kapsamlı, nicel bilgiler sağlar. Bu yöntem, 20 dakikalık bir UPLC çalışması içinde, bakteri popülasyonu boyunca tüm muropeptitlerin hassas bir şekilde ölçülmesini verir. Bu yöntemin uygulanması, malzemelere önemli bir finansal yatırım yapılmadan sadece temel laboratuvar becerilerini içerir. Bu yöntemdeki adımların yürütülmesi için, araştırmacıların sadece pipetleme, tampon ve enzim hazırlama ve pH'ı ayarlama konusunda yetenekli olmaları ve çok çeşitli bilimsel disiplinler için erişilebilir hale getirmeleri gerekir. Bu protokolde kullanılan enzimlerin seçimi analiz edilen bakteri türlerine bağlıdır; burada açıklanan protokol Escherichia coliiçin yararlıdır ve genellikle diğer Gram-negatif organizmalardan sakculi izole etmek için yeterli bulunmuştur. Gram-pozitif bakterilere bu yöntem uygulanırken literatüre danışılma önerilir; bu türlerde, sakculus saflaştırma geleneksel olarak daha zor olmuştur. Özellikle, gram-pozitif bakterilerin teikoik asitleri gibi kalın duvarları ve aksesuar polimerlerini barındırmak için enzim seçimi ve sindirim sürelerinin uzunluğu açısından bu yöntemin değiştirilmesi gerekebilir. Bu protokoldeki ilk enzim, peptidoglikan'a dış membran lipoprotein (Braun'un lipoprotein veya Lpp gibi) bağlanmasını ayırır, böylece Lpp'nin C-terminali di- (veya üç) peptidi hariç hepsini hücre duvarından serbest bırakır. Bu adım Enterobacteria'yı incelerken gereklidir, ancak diğer birçok Gram-negatif bakterinin Lpp eşdeğeri yoktur ve bu nedenle bu adım atlanabilir. İkinci bir enzim, peptidoglikanın muramik asit bileşeninden sonra özellikle bölünür ve muropeptid türünü oluşturan disakkarit alt birliğini yatıştırır. PG'nin mimarisinin doğru bir değerlendirmesini sağlamak için, çapraz köprülerin veya peptit sapının başka bir kısmının bölünmesini önlemek için sakculi sindirmeye özen edilmelidir.
Peptidoglikanın 100'den fazla ~40 bakteri türünden kimyasal bileşimleri HPLC tarafından analiz edilmiş olsa da, UPLC teknolojisi ile herhangi bir analiz yapılmamıştır. Ek olarak, önceki çalışmalar peptidoglikanı bakteriyel etki alanının sadece küçük bir kısmından karakterize etti, kısmen HPLC'nin verimi ile sınırlı. Bu nedenle, bu yöntemin mümkün olduğunca çok araştırmacıya yayılması ve UPLC platformlarında uygulanması, peptidoglikan henüz kategorize edilmemiş bakteri türlerinin büyük bir kısmının fizyolojik çalışmalarını yönlendirmek için kritik olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bir Gecede 2,5 ml Medyada Bakteri Kültürleri Yetiştirin
Kültürleri 1:100'den 250 ml taze ortama geri seyreltin ve0.7-0.8'in 600'üne kadar büyüyün. Suda% 6 sodyum dodecyl sülfat (SDS) çözeltisi hazırlayın.
DİkKAT: SDS tozu tehlikelidir - SDS tozunu solumaktan kaçının; burun ve ağız üzerine maske takın.
2. Gün 1 - Lysing Bakteri Kültürleri Bir Gün ve Gece Boyunca Gerçekleştirilir
- Seyreltilmiş kültürler büyürken, 1 L beherde sıcak bir tabağa kaynar su banyosu kurun. Su kaynadıktan sonra, 50 ml polipropilen tüplere 6 ml%6 SDS aliquot, her tüpe bir küçük karıştırma çubuğu ekleyin, tüp kapaklarını parmakla sıkıya sabitleyin, tüpleri su banyosuna yerleştirin ve sıcak plakada 500 rpm'ye kadar karıştırmayı açın.
- 250 ml'lik kültürleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 5.000 × g'da hasat edin ve peletleri 3 ml ortam veya 1x fosfat tamponlu salin içinde yeniden depolayın. Tüpler kaynar su banyosuna batırılırken hücreleri (son konsantrasyon% 4 SDS) izdirmek için% 6 kaynar SDS ile 50 ml'lik tüplere yavaşça pipet hücresi süspansiyonları ve kapakları parmak sıkıya ayırın. Hücre süspansiyonları, yeniden dirildikten sonra hızla kaynar SDS'ye aktarılmalıdır. Hücre duvarı yapısının hatalı değiştirilmesine neden olabileceği için ani çevresel değişikliklerdenkaçınılmalıdır.
- Kaynar su banyoyu örtün ve hücrelerin 3 saat kaynamasını bekleyin, su seviyesini periyodik olarak kontrol edin ve gerektiğinde su banyoyu yeniden doldurun. 3 saat sonra, sıcak plakanın ısıtma elemanını kapatın ve 500 rpm'de gece boyunca karıştırmaya devam edin.
3. 2. Gün - Enzimyasal Sindirimler Bir Gün Boyunca Gerçekleştirilir
- SDS bir gecede 50 ml'lik tüplere çökmüşse, su banyoyu 1-2 saat daha kaynamaya ayarlayın. Bir ısı bloğunu 60 °C'ye açın. 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + %0.06 w/v NaCl'de 1 mg/ml Pronaz E stoğu hazırlayın ve Pronaz E'yi 60 °C'de en az 30 dakika etkinleştirin.
- Büyük PG polimerlerini peletmek ve böylece diğer hücresel bileşenlerden arındırmak için numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika döndürmek için 400.000 × g'da 400.000 g'da bir ultrasantrifüj seti kullanın. Süpernatant dikkatlice çıkarın ve ardından her peletin oda sıcaklığında ultra saf suya yeniden depolayın. NOT: Resüspensyon hacmi, kullanılan ultrasantrifüj tüplerinin hacmine bağlıdır; tüpleri en az yarı yolda dolduran ancak tüplerin maksimum hacmini aşmayan bir hacim kullanın. SDS'nin tamamen çıkarıldığını (genellikle üç yıkama) gösteren, resüspensyon sırasında kabarcıklar oluşmayana kadar santrifüjü tekrarlamayı /yıkamayı tekrarlayın. Beyaz bir çökeltme oluşursa peletin yıkanmasını durdurun, çünkü bu sakculilerin bir araya geldiğini gösterir. Topaklama felaket değildir, ancak kümeler plastik ve cam eşyalara çok güçlü bir şekilde bağlanır ve büyük numune kaybına neden olur. Bu durumda, topaklanmış sakculi örneğini kullanarak protokole devam edin.
- Son santrifüjleme/yıkama adımında, numuneleri 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + % 0.06 w/v NaCl'nin 900 μl'sinde yeniden biriktirin ve daha önce küçük bir iğne ile üst kısımlarda deliklerle dürtülen 2 ml tüplere aktarın. Her numuneye 100 μl 1 mg/ml aktif Pronaz E (100 μg/ml son konsantrasyon) ekleyin ve 2 saat boyunca 60 °C'de kuluçkaya yatırın. Farklı bir ısı bloğunu 100 °C'ye ayarlayın.
- Her numuneye 200 μl%6 SDS ekleyerek Pronaz E sindirimini durdurun ve numuneleri 100 °C ısı bloğunda 30 dakika kaynatın. Farklı bir ısı bloğunu 37 °C'ye ayarlayın ve 50 mM fosfat tamponunda (pH 4.9) 1 mg/ml muramidaz (mutanolysin) stoku yapın.
- Adım 3.2'de olduğu gibi, numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika döndürmek için 400.000 g'× bir ultrasantrifüj seti kullanın ve SDS tamamen çıkarılana kadar oda sıcaklığında ultra saf suyla yıkayın (genellikle üç yıkama). Resüspensyon hacmi, kullanılan ultracentrifuge tüplerinin hacmine bağlıdır; tüpleri en az yarı yolda dolduran ancak tüplerin maksimum hacmini aşmayan bir hacim kullanın.
- Son santrifüjleme/yıkama adımında, numuneleri 200 μl 50 mM sodyum fosfat tamponunda (pH 4.9) yeniden biriktirin. Bu hacim, numunedeki peptidoglikan miktarına göre ayarlanabilir ve türlere bağlı olabilir. İlgi gören türler için hplc analizinin daha önce yayınlanan raporları varsa, bu hacim bu miktarlara dayanarak tahmin edilebilir (HPLC PG çalışmalarının bir derlemesi referans7Ek Bilgilerinde bulunabilir). Diğer türler için, sacculus hazırlığı bu adıma kadar yürütülebilir ve daha sonra PG'nin çözümde kalmasını sağlayan minimum hacmi belirlemek için örnekleri çoğaltmak için farklı miktarlarda resüspensiyon hacimleri eklenebilir (daha fazla tahmin için Tartışma konusuna bakın). Örnek daha fazla peptidoglikan içeriyorsa, resüspenzyon hacmini artırın; numunede az peptidoglikan varsa, resüspenzyon hacmini en az 50 μl'ye düşürün.
- Örnekleri 1,5 ml tüplere aktarın ve 40 μg / ml'lik son bir konsantrasyon vermek için 1 mg / ml muramidaz ekleyin. 6-8 saat veya 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
4. Gün 3 - UPLC için Numunelerin Hazırlanması Son Gün Gerçekleştirilir
- Bir ısı bloğunu 100 °C'ye açın. Muramidaz sindirimini durdurmak için örnekleri SDS olmadan 5 dakika kaynatın. Oda sıcaklığında 16.000 × g'da 10 dakika santrifüj örnekleri, ardından süpernatantı (muropeptidler artık çözünür) 13 mm x 100 mm cam tüplere aktarın. Mümkün olduğunca fazla süpernatant kurtarmaya çalışın, peleti rahatsız etmeden çok yaklaştırın.
- 100 mM borat tamponunun son konsantrasyonu için numuneye 500 mM borat tamponu (pH 9) ekleyerek pH'ı ayarlayın. Borat tamponu, azaltıcı ajan sodyum borohidrit ile uyumludur. Her numuneyi azaltmak için 1-2 sodyum borohidrit taneleri ekleyin ve reaksiyonun oda sıcaklığında en az 30 dakika devam etmesine izin verin. DİkKAT: Sodyum borohidrit oldukça reaktiftir ve bakımı tehlikelidir - ciltle temastan kaçının (eldiven giyin) ve gözlerle temastan kaçının (güvenlik gözlüğü takın).
- Örnekleri pH 3-4'e ayarlayın (muropeptid izoelektrik nokta ~3,5'tir) ve pH 6'ya kadar 20 μl artış kullanarak% 50 v/v ortofosforik asit, pH gösterge kağıdı ile ölçüldüğü gibi, daha sonra 2 μl artışlar kullanarak. DİkKAT: Ortofosforik asit aşındırıcıdır ve işlenmesi tehlikelidir - ciltle temastan kaçının (eldiven giyin) ve gözlerle temastan kaçının (güvenlik gözlüğü takın). Örnek, ortofosforik asit ilavesine yanıt olarak kabarcıklanmalıdır; örnek köpürterek durduğunda, bu genellikle 6 pH'a ulaşıldığını gösterir. Örnekte kabarcıklanma meydana gelirse, bu eklenen sodyum borohidrit miktarının çok küçük olduğunu gösterebilir. Bu durumda, pH'ı düşürmeyi bırakın, bir veya iki sodyum borohidrit tanesi ekleyin, 5-10 dakika reaksiyona izin verin, ardından pH ayarına devam edin.
- Numuneyi 0,22 μm şırındıcı filtre ile doğrudan bir UPLC şişesine filtreleyin. Bir çökeltme oluşmuşsa, tüpü filtrelemeden önce bir alevden birkaç geçişle ısıtın. Numune gün içinde UPLC cihazına enjekte edilmeyecekse, gece boyunca -20 °C'de dondurun. Numuneler -80 °C'de bir yıla kadar saklanabilir. Örnek birkaç kez bir alevden geçerek çözülebilir.
- Her numunenin 10 μl'sini C18 1.7 μm ters fazlı sütun ve 202-208 nm'yi izlemek için ayarlanmış bir absorbans dedektörü ile donatılmış bir UPLC cihazına enjekte edin. Örnekler ardışık olarak enjekte edilir, ancak otomatik örnekleyici yetenekleri 96 numunenin toplu olarak işlenmesine izin verir. Solvent A için 50 mM sodyum fosfat (pH 4.35) + %0.4 v/v sodyum azit kullanın, ve solvent B için 75 mM sodyum fosfat (pH 4.95) + % 15 v/v metanol. NOT: Temel sürüklenmeyi önlemek için metanolün 205 nm emilimini telafi etmek için sodyum azit eklenir. Akışı 0,25 ml/dk olarak ayarlayın ve 30 dakika içinde %100 solvent B ve sıralı muropeptid salınımı elde etmek için 25 dk'nın üzerinde doğrusal bir gradyan kullanın. UPLC'den sonra muropeptidleri karakterize etmek için kütle spektrometresi kullanılacaksa, bir kesir toplayıcıda ilgi zirvesinin kesirlerini toplayın ve fraksiyonları bir santrifüj evaporatör kullanarak kurutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'deözetlenen yordamı kullanarak, son örnek doğrudan bir UPLC şişesine filtrelenmiş en az 200 μl net çözeltiden oluşmalıdır (adım 4.4). Bakteriyel bir numunedeki çeşitli muropeptitlerin UPLC ayrımı, sıvı mobil faz ile sütunun sabit fazı arasındaki göreceli çözünürlüklerine dayanır. Ters fazlı C18 sütunları, hidrofobiklik ve boyut8'egöre muropeptid türlerini ayırmak için güçlü bir hidrofobik matris sağlar; polar, düşük moleküler ağırlıklı monomerler önce elute ve apoler, daha yüksek moleküler ağırlıklı oligomerler sonra elute (Şekil 2). Tipik bir UPLC sonucu Şekil 2'de gösterilmiştir , 202-208 nm'de UV absorbansı ile algılama, belirli bir muropeptid'in tutma süresini belirleyen bir zaman fonksiyonu olarak. Bu temsili sonuç, çoğu muropeptid türü ile spektrum boyunca güçlü sinyal gücü arasında net bir çözünürlük gösterir, bu da analizsiz ve ortalama glikan iplikçik uzunluğunu sağlar.
Şekil 1'de özetlenen son adım, pH'ın ayarlanmasını ve UPLC'de kullanılan borunun küçük boyutlarını tıkayabilecek ince partiküllerin filtresini içerir. Örneğin, bir örnek 200 μl yerine 3,5 adımda 100 μl sodyum fosfat tamponunda yeniden örneklenerek süperkonsanslanırsa, örnek bulanıklaşabilir ve bu da kritik bir konsantrasyon elde edildiğini ve muropeptidlerin çökeldiğini gösterir. Bu çözünürlük kaybı, adım 4.4'te kullanılan şırınna filtresinin tıkanmasına neden olacak ve muropeptidlerin UPLC şişesine birikmesini ve/veya değiştirilmesi maliyetli öğeler olan UPLC makine kanallarının ve sütununun tıkanmasını önleyecektir. Bu sapkın örnek işlemeyi yansıtan örnek bir kromatogram Şekil 3'tegösterilmiştir; PG bileşimi hakkında herhangi bir verinin olmamasına neden olan hiçbir tepe noktası yakalanmadı. pH'ın muropeptidlerin izoelektrik noktasının çok altına(örneğin 2 pH'a) yanlış yönlendirilmesi de muropeptidlerin çökeltmesine ve dolayısıyla UPLC analizinden ayırt edilebilir zirvelerin bulunmamasına neden olabilir.
Şekil 1. Sakculi hazırlığı şeması. Bu yöntem, SDS'yi peletlenmiş sakculiden arındırmak için yinelemeli ultracentrifugation turlarına dayanır.
Şekil 2. E. coli MG1655 hücrelerinden sindirilen sakkuliden PG'nin ÖRNEK UPLC kromatogramı. Tüm muropeptidlerin karşılaştırılabilir çözünürlüğünün tipik bir HPLC çalışmasının %10'unda elde edildiğini unutmayın. Muropeptide etiketleri - M = monomer, D = dimer, T = trimer; (2,3,4,5) amino asit sapı peptit sayısını gösterir; değişiklikler - G = L-alaninin yerini alan glisinin, L = Pronaz E bölünmesinden iki ek amino asit, D = 3,3-diaminopimelik asit (DAP)-DAP crossbridge, N = anhidro-muropeptid sonlandırma. Örneğin, D33DL, Pronase E bölünmesinden ek iki amino asit içeren bir DAP-DAP çapraz köprüsü ile birbirine bağlanmış 3-aa gövde peptitleri olan bir dimerdir.
Şekil 3. E. coli MG1655 hücrelerinden sindirilen sakkulilerin başarısız UPLC analizi. Örnekte muropeptid bulunmadığını gösteren zirvelerin yokluğu, muropeptidlerin bir UPLC şişesine ekstraksiyondan önce çözeltiden düşmesinden kaynaklanmaktadır (adım 4.4). Bu yağış, muropeptidlerin aşırı merkezine bağlı olması veya pH'ın çok düşük olması nedeniyle olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu prosedürde kritik bir adım, numune hazırlamanın ikinci gününün 3.1. SDS bir gecede çöktüyse veya numuneler oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca% 4 SDS'de saklanmışsa, SDS'yi yeniden analiz etmek için numuneler en az 1 saat boyunca yeniden ayrılmalıdır. SDS yağışının yaygın bir nedeni potasyum tuzları olan ortamın kullanılmasıdır, bu nedenle mümkünse medyada potasyumdan kaçınılmalıdır. Temsili Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi, pH'ı muropeptidlerin izoelektrik noktasına (~3.5) ayarlamak da önemlidir, ancak pH 3'ten çok daha düşük değildir veya malzeme çökebilir. Son olarak, örneğin yeniden doğuşu, araştırmacı tarafından denetilmesi gereken uygun sodyum fosfat tamponu hacminde (adım 3.5) gerçekleşmelidir. Sodyum fosfat tamponunun resüspenzyon hacmini seçerken, belirli bir bakteri kültüründen ne kadar muropeptid malzemesinin üretileceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneğin, son kültür hacmi yukarıda belirtildiği gibi 250 ml ise, numune en az 200 μl sodyum fosfat tamponunda yeniden harcanmalıdır. Araştırmacı yöntemi 50 ml kültürlerle değiştirirse, örnekler 100 μl sodyum fosfat tamponunda veya daha azında yeniden kullanılabilir. Bir türdeki öngörülen peptidoglikan miktarlarının dikkate alınması da önemlidir; örneğin, E. coli sferoplastları önemli ölçüde daha az peptidoglikan içerir (vahşi tip E. coli hücrelerindeki miktarın yaklaşık% 7'si10) ve bu nedenle 100 μl veya daha az sodyum fosfat tamponunda resüspenzyon uygundur. Belirli bir bakteri türünü yetiştirmek veya büyük miktarlarda (250 ml) süzünmek zorsa, nihai kültür hacmi azaltılabilir ve / veya gece kültürünün seyreltilmesi azaltılabilir. Son olarak, bir HPLC sistemine enjeksiyon minimum 200 μl hacim gerektirirken, UPLC sistemi için 10 μl yeterlidir.
Farklı organizmalarda veya farklı uygulamalarda PG bileşenlerinin saflaştırılması, UPLC cihazındaki mobil faz, sütun ve degradenin türü değiştirilerek ayarlanabilir. Asetonitril gibi solvent bazlı mobil fazlar, kütle spektrometresinden önce numuneleri tuzdan arındırmak için kullanılabilir. Sonraki analiz için örnekleri iyice tuzdan arındırmak için farklı sütun kimyaları da gerekebilir. Şekil 2, Gram negatif çubuk şeklindeki E. coli MG1655 bakterisi için muropeptitlerin ortak elüasyon profilini gösterir; PG'nin Gram-pozitif bakterilerden ve/veya diğer şekillere sahip türlerden analizi, 4.5. Şekil 2'de gösterilen gibi UPLC spektrumları, muropeptid kimliği, çapraz bağlama yüzdesi ve glikan iplikçik uzunluğu gibi peptidoglikan ile ilgili birçok bilgi sınıfı oluştursa da, yöntemin yapısal özelliklerin sakculiler arasındaki mekansal dağılımını haritalamadaki yetersizlik de dahil olmak üzere çeşitli sınırlamaları vardır. Örneğin, glikan zinciri boyunca çaprazlama yerleri veya bağlı lipoproteinlerin konumları HPLC veya UPLC ile ayırt edilebilir.
HPLC ile PG'nin kimyasal bileşimini analiz etmenin avantajları arasında amino asit analizi12-14 veya kağıt kromatografisi 15 ,16 gibi geleneksel tekniklere kıyasla daha yüksekçözünürlük,daha kısa analiz süresi ve doğru nicelik11bulunur. UPLC, daha hızlı akış ve dolayısıyla daha kısa çalışma süreleri sağlayan daha yüksek basınçlar sayesinde HPLC'den daha yüksek hız ve hassasiyet sunar. Çözünürlük UPLC ile feda edilir, çünkü alt 2 μm parçacık boyutu sütunları, yüksek örnekleme hızı dedektörleri ve düşük hacimli enjektörler çok yüksek basınçlara dayanabilir ve böylece yüksek hızlarda doğru çalışabilir17,18. Bu, HPLC için 200 μl ve saat ile karşılaştırıldığında, numune hacimlerini onlarca dakika içinde 1 μl sırasına göre analiz etme yeteneğine sahiptir.
UPLC'nin tamamlayıcısı olan teknikler arasında kütle spektrometresi ile muropeptid kütle analizi yer almaktadır. UPLC yıkıcı bir teknik değildir; sütundan elde edilen elüat, UV tespitinden sonra toplanabilir ve çoğu laboratuvarda yaygın olarak bulunan bir santrifüj evaporatör kullanılarak kurutulabilir. Numune kütle spektrometresine (adım 4.5) hazırlamak için tuzdan arındırılabilse de, Matris Destekli Lazer Desorpsiyon / İyonizasyon - Uçuş Kütle Spektrometresi Zamanı, tuz konsantrasyonuna çok fazla hassasiyet olmadan analiz sağlar19ve muropeptidlerin kesin tanımlamasını yapabilen kütle verileri verir. UPLC için bir hücre duvarı örneği hazırlamanın maliyeti, kullanılan enzimlerin, kimyasalların ve malzemelerin maliyetleri de dahil olmak üzere yaklaşık 6-7 $ 'dır. Ucuz işletme maliyetleri, erişilebilirliği ve bakteri hücre duvarı çalışmaları için gösterilen faydası göz önüne alındığında, UPLC bakteri krallığında peptidoglikan bileşiminin yüksek çözünürlüklü, yüksek verimli, doğru nicel ölçülmesi için tercih edilen yöntem haline gelmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu makalenin üretim maliyetleri Waters Corporation tarafından desteklenmiştir.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH Director'un Yeni Yenilikçi Ödülü DP2OD006466 (K.C.H.'ye) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Russell Monds'a yöntemin pratik bir gösterimi ve bilimsel tartışmalar için teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
