Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Снизу вверх и дробовик протеомики для идентификации Комплексную Cochlear Proteome

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

Протеом анализ кохлеарного сенсорного эпителия может оказаться непростой задачей из-за его небольшого размера и потому мембранные белки трудно выделить и идентифицировать. Оба мембрана и растворимые белки могут быть идентифицированы путем объединения нескольких препаративных методов и методик разделения вместе с масс-спектрометрии высокого разрешения.

Abstract

Протеомика является широко используемым подход, который может дать ответ на сложных биологических систем. Кохлеарный чувствующий эпителий содержит рецепторы, которые преобразовывают механическую энергию звука в электро-химической энергии, обработанного периферической и центральной нервной систем. Несколько протеомические методы были разработаны для изучения кохлеарный внутреннее ухо, например, двухмерным электрофорезом в геле (разница 2D-ПГЛП), антител микрочипов, и масс-спектрометрии (МС). MS является наиболее полным и универсальным инструментом в протеомики и в сочетании с методами разделения может обеспечить углубленный протеома биологических образцов. Методов разделения в сочетании с МС имеет возможность обогатить образцов белка, обнаруживать низкую молекулярную массу и гидрофобных белков, и определить низкие обильные белки путем уменьшения динамического диапазона протеома. Различные стратегии пищеварения могут быть применены ко всей лизата или фракционированного лизата белка для повышения пептид и белокохват последовательность. Использование различных методов разделения, в том числе сильного катионного обмена (SCX), обращенно-фазовой (RP), а также гель-электрофореза элюировали жидкой фракции улавливающего (GELFrEE) могут быть применены для уменьшения сложности образца перед анализом MS для идентификации белков.

Introduction

Протеомика является изучение сложных биологических систем на основе анализа экспрессии белка, функции, модификации и взаимодействия 1. Некоторые методы были использованы для протеомного анализа внутреннего уха, в том числе антител микрочипов 2, двухмерным электрофорезом в геле 3-5 и Dige 6. Тем не менее, только ограниченное число белков были идентифицированы и охарактеризованы 2,7-10, по сравнению с более чем 10000 генов и выраженных тегов последовательности (ЭБТ), определенных во внутреннем ухе 11,12, MS является наиболее распространенным и всеобъемлющим техника в протеомики для белка характеристики. Анализ сложных протеомических образцов, таких как улитки, может быть сложной задачей. Тем не менее, сочетание нескольких методов разделения с МС позволяет идентифицировать большее количество пептидов и белков, из-за повышенного диапазона динамического концентрации и пиковой мощности 13. Многомерные хроматограPHY уменьшает весьма сложные белковые смеси, позволяя использование различных механизмов адсорбции. Есть два широко используемых MS подходы анализа протеома, дробовик и снизу вверх протеомика. В дробовика протеомики, смесь интактных белков ферментативно переваривается и разделены с использованием многомерного хроматографии с сильной катионообменной хроматографии (SCX), а затем обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (ОФЖХ) 14,15. Отделенные пептиды подвергают тандемной MS и поиска в базе данных 15. Основным преимуществом этого метода является то, что тысячи белков могут быть определены в одном анализе и метод лучше подходит для мембранных белков.

В снизу вверх, смесь белок отделяется, как правило, одно-или двухмерного электрофореза, а отдельные полосы белка или пятна вырезали и переваривают с ферментом, таким как трипсин, как правило, в результате чего несколько пептидов. Тем не менее, другой более поздниелы разработан электрофоретическую подход, используемый в восходящих протеомики, является GELFrEE. Этот метод фракционируют образцов белка в жидкой фазе и делает их менее сложными до анализа. Этот метод воспроизводимым, предлагает высокое извлечение белка и уменьшает распределение высоких обильных белков в сложных белковых образцов 16. Пептиды, в результате, разделенных белков, анализируются с помощью МС, с помощью пептидной массовой дактилоскопии или тандем MS (MS / MS), для создания тегов последовательности для поиска в базе данных 17-19. Некоторые из основных преимуществ использования подхода снизу вверх являются возможность получения разделения с высоким разрешением и всеобъемлющий охват белка. Восходящие протеомика является наиболее широко используемым методом в протеомики 20, следовательно, несколько биоинформатики инструменты доступны. Кроме того, белки могут быть разделены в сложной смеси перед пищеварения, так что есть большая вероятность идентификации.

Одна из основных проблем,при помощи внутреннего уха для протеомного анализа является ее небольшой размер, ограничивается доступность и тип клеток разнообразие 21. Кроме того, ключевые белки, которые отличают его функциональность, такие как ионные каналы, перевозчиков и рецепторов, являются мембранные белки, которые могут быть трудно выделить 22. Таким образом, подготовка проб фильтр автоматизированного (ФАСП) является выгодным для протеомных анализа тканей, которые ограничены для извлечения белка и которые требуют моющие средства для растворения мембраны 23. Этот фильтр позволяет MS анализа мембраны и растворимых белков и на способность выделения пептидов от низкой молекулярной массой загрязняющих веществ 23,24.

Настоящий протокол описывает часто используемые протеомических подходы, которые объединяются и изменены, чтобы проанализировать как растворимые, так и мембранные белки и максимально увеличить количество идентификаторов белка от кохлеарного сенсорного эпителия. Мы опишем с помощью дробовика протеомики с ФАСП мульти-дайджестион, ионообменной хроматографии, с высоким разрешением МС, и анализ данных. Кроме того, мы опишем снизу вверх протеомики с GELFrEE, FASP мульти-пищеварения, высокое разрешение MS, и анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление по этике

Эксперименты с использованием мышей ткани были утверждены Университета Южной Флориды Институциональная уходу и использованию животных комитета (Протоколы 3931R, 3482R), как изложено в соответствии с руководящими Национальных Институтов Здоровья.

1. Белок Добыча

  1. Изолировать кохлеарной сенсорного эпителия с 16 30-дневных (P30) CBA / J мышей и хранить при температуре -80 ° С
  2. В день эксперимента, мыть ткани с 500 мкл 1х забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Центрифуга течение 3 минут при 1000 х г и удалите супернатант. Повторите в общей сложности три раза.
  3. Разрушать ультразвуком ткань в течение 30 сек на льду в 100 мкл буфера для лизиса, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 120 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 5 мМ ЭДТА, 500 мкг / мл AEBSF, 10 мкг / мл лейпептина, 100 мкг / мл пепстатина, 2 мкг / мл апротинина и 0,5 мкг / мл микроцистин с использованием звуковой dismembrator (модель 100; Thermo Fisher). Прохладный лизат на льдув течение 1 мин между каждым ультразвуком. Разрушать ультразвуком в общей сложности 3 раза.
  4. Центрифуга экстракта при 750 х г при 4 ° С в течение 2 мин и удалить супернатант в новую микропробирки. Экстракт осадок в 50 мкл буфера для лизиса путем обработки ультразвуком в течение 30 сек на льду. Центрифуга экстракта при 750 х г при 4 ° С в течение 2 мин. Объединить оба лизатов и центрифуги в 28 600 мкг при 4 ° С в течение 60 мин. Удалить супернатант в новую микропробирки и добавить 20 мкл лизирующего буфера, содержащего 0,1% ASB-14 к осадку. Vortex в течение 1 мин и инкубировать в течение 60 мин при 4 ° С.
  5. Нагреть образец при 95 ° С в течение 5 мин, затем охлаждают при 4 ° С в течение 60 мин. Последующие с центрифугированием при 16000 х г при 25 ° С в течение 10 мин. Сбор супернатант и передачи в новую пробирку.
  6. Центрифуга суспензии при 16000 х г при 4 ° С в течение 5 мин и надосадочную жидкость сохраняют для пищеварения.

2. Двухместный триптический Белок Переваривание всей Lysate Использование FASP

  1. Добавить 30 μл аликвоты (≤ 400 мкг) кохлеарного белкового экстракта, содержащего 4% додецилсульфат натрия (SDS), 100 мМ Трис-HCl, рН 7,6 и 0,1 М дитиотреитола (DTT) непосредственно к спинового фильтра 30К и смешать с 200 мкл 8 М мочевины в трис-HCl. Центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин.
  2. Развести концентрат с 200 мкл раствора 8 М мочевины и центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин.
  3. Добавить 10 мкл 10Х иодацетамида (IAA) в 8 М раствора мочевины к концентрату в фильтре и вихря в течение 1 мин. Инкубировать спиновый фильтр в течение 20 мин при комнатной температуре (RT) в темноте с последующим центрифугированием при 14000 х г в течение 10 мин.
  4. Добавить 100 мкл раствора 8 М мочевины к концентрату на блоке фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин. Повторите этот шаг 2x. Добавить 100 мкл 50 мМ бикарбоната аммония (ABC) раствора в блок фильтра и центрифуге при 14000 мкг в течение 10 мин. Повторите этот шаг 2x.
  5. Добавить 0,4 мкг / мкл трипсина в 1:100 (вес / вес) фермента к-Белок отношение и инкубировать в течение ночи (O / N) при 37 ° С
  6. После инкубации добавить 40 мкл 50 мМ раствора ABC для фильтрации устройство и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  7. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl к фильтру спина и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий триптических пептидов в свежую микропробирки и подкисляют муравьиной кислоты (FA) до 1,0%, чтобы остановить пищеварение.
  8. Промыть фильтрующий блок с 40 мкл 8 М мочевины, и затем промыть 2x с 40 мкл 18 МОм воды.
  9. Промойте фильтрующий блок 3x 100 мкл 50 мМ раствора ABC. После последней промывки добавить 0,4 мкг / мкл трипсина в 1:100 (в / в) соотношение фермент-на-белка и инкубировать O / N при 37 ° С
  10. Элюции триптических пептидов из второго переварить добавлением 40 мкл раствора 50 мМ БКА к устройству фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  11. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl вБлок фильтра и центрифуги при 14000 мкг в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий триптических пептидов в свежую микропробирки и подкисляют FA до 1,0%.
  12. Образцы могут быть количественно с помощью микропланшет колориметрического анализа с использованием БСА в качестве стандарта.

3. Эндопротеиназой LysC и триптический Белок Переваривание всей Lysate Использование FASP

  1. Добавить 30 мкл аликвоты (≤ 400 мкг) кохлеарного белкового экстракта, содержащего 4% SDS, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,6 и 0,1 М DTT непосредственно к спинового фильтра 30К и смешать с 200 мкл 8 М мочевины в трис-HCl . Центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин.
  2. Развести концентрат с 200 мкл раствора 8 М мочевины и центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин.
  3. Добавить 10 мкл 10Х IAA в 8 М раствора мочевины к концентрату в фильтре и вихря в течение 1 мин. Выдержите спин фильтр в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте затем центрифуги при 14000 мкг в течение 10 мин.
  4. Добавить 100 мкл 8 М мочевины зольution к концентрату на блоке фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 15 мин. Повторите этот шаг 2x. Добавить 100 мкл 100 мМ ABC решения блока фильтров и центрифуге при 14000 мкг в течение 10 мин. Повторите этот шаг 2x.
  5. Добавить 0,1 мкг / мкл эндопротеиназой LysC в 1:50 (в / в) соотношение фермент-на-белка и инкубировать O / N при 30 ° С
  6. После инкубации добавляют 40 мкл 100 мМ БКА решения блока фильтров и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  7. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl к фильтру спина и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий пептиды LysC к новому микропробирки и подкисляют FA до 1,0%, чтобы остановить пищеварение.
  8. Промыть фильтрующий блок с 40 мкл 8 М мочевины, и затем промыть 2x с 40 мкл 18 МОм воды.
  9. Промойте фильтрующий блок 3x 100 мкл 50 мМ раствора ABC. После последней промывки добавить 0,4 мкг / мкл трипсина в 1:100 фермент-к-проСоотношение белок и инкубировать O / N при 37 ° С
  10. Элюции триптических пептидов путем добавления 40 мкл раствора 50 мМ БКА к устройству фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
  11. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl в блок фильтра и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий триптических пептидов в свежую микропробирки и подкисляют 1,0% FA.
  12. Образец может быть определена количественно с помощью микропланшет колориметрического анализа с BSA в качестве стандарта.

4. Обессоливания Пептиды Использование Spin Columns

  1. Активация колонку с C 18 MacroSpin добавлением 500 мкл ацетонитрила (ACN) и центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточных после центрифугирования.
  2. Равновесие колонку с 500 мкл 0,1% ФА и центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточных и повторить этот шаг 1x.
  3. Добавьте до 500 мкл пептида переварить в колонну ANг центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Если объем образца превышает 500 мкл затем повторите этот шаг.
  4. Промыть колонку с 500 мкл 0,1% FA и центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточные. Повторите этот шаг 1x.
  5. Добавить 250 мкл соотношении 90:10 АКС-вода в колонну и центрифуге при 1100 мкг в течение 1 мин. Соберите элюент, содержащий обессоленной пептиды и трансфер в свежем микропробирку. Повторите этот шаг 1x.
  6. Высушите обессоленной образец пептида в вакуумной центрифуге и не позволить образец полного высыхания.

5. Ионообменная хроматография

  1. Введите 50-100 мкг переваренной образца белка на 200 х 2,1 мм, 5 SCX мкм колонке (полисульфоэтиловым A), чтобы отделить пептиды.
  2. Использование градиент 2-40% В в течение 50 мин с расходом 250 мкл / мин. Растворитель составляет 5 мМ формиата аммония, рН 3,0 в 25% ацетонитрила и 75% DDH 2 O. Растворитель В 500 мМ формиата аммония, рН6.0 в 25% ACN и 75% DDH 2 O.
  3. Монитор пептидных фракций при 280 нм и собирать фракций в 2-минутными интервалами, используя коллектор фракций.
  4. Сухие дроби в вакуумном концентраторе и ресуспендируют в 500 мкл 50% ацетонитрила в DDH 2 O, содержащей 5% FA, чтобы помочь с удалением соли.
  5. Redry фракции и хранить при температуре -80 ° С до готовности использовать для анализа нано LC-MS/MS.

6. Ацетон Осадки

До разделения GELFrEE кохлеарный супернатант белок должен быть обессоливали. Ацетон осадки могут быть использованы для обессоливания и концентрат белков.

  1. Добавить три тома ледяной ацетона кохлеарного супернатанта. Аккуратно вихрь и инкубировать при температуре -20 ° СО / Н.
  2. Центрифуга образца смеси при 15000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и удалить супернатант.
  3. Промыть 3 раза белка гранул с охлажденным ацетоном и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин при 4° C.
  4. Высушите осадок и растворяют в 112 мкл 18 МОм воды.
  5. Определить концентрацию белка с помощью микропланшет колориметрического анализа.

7. GELFrEE Фракционирование Cochlear сенсорного эпителия

  1. Добавить 30 мкл 5х буфера для образцов (0,25 М Трис-HCl рН 6,8, 10% (вес / объем) SDS, 50% глицерина, 0,5% (вес / объем) бромфеноловый синий) в обессоленной белка, суспендированного в 112 мкл 18 МОм вода.
  2. Добавить 8 мкл 1М DTT и нагревали при 95 ° С в течение 5 мин, чтобы уменьшить белка дисульфидных связей. После нагрева позволяют охлаждения до комнатной температуры.
  3. Добавить 8 мл рабочего буфера для анодного резервуара, 150 мкл рабочего буфера, чтобы пробовать сборную камеру и 6 мл рабочего буфера в катодную водохранилища.
  4. Удалите буфер, который, возможно, текла в образец-загрузочной камеры с помощью пипетки.
  5. Нагрузка 150 мкл (≤ 1 мг) кохлеарного белковой смеси, в выборки загрузочной камеры с использованием 8% Trявляется ацетат картридж с массовым диапазоне 3.5-150 кДа.
  6. Нижние электроды и закройте крышку прибора, чтобы начать бег.
  7. На первом паузы времени на приборе добавить 2 мл рабочего буфера в резервуар катода и возобновить бег.
  8. На каждом паузы интервала на инструменте, собирать пробы из забора пробы камеры с помощью пипетки и добавить свежей надписью микропробирку. Вымойте камеры для сбора 2x 150 мкл рабочего буфера и выбросить.
  9. Добавить 150 мкл свежей проточной буфера на сбор образец камеры и возобновить бег. Сбор белковых фракций в течение периода времени от 2,6 ч в общем объеме 150 мкл / фракции.

8. 1D гель-электрофореза из GELFrEE фракций

Гель-электрофорез 1D может быть использован для визуализации результатов GELFrEE фракционированием до ферментативного расщепления и анализа MS. GELFrEE белковые фракции могут быть разделены на 4-15% Трис-HCl геле.

  • Смешайте 5 мкл аликвоты каждого GELFrEE фракции с 5 мкл образца разбавляющего буфера (350 мМ DTT в буфере для образцов).
  • Тепло образцов при 95 ° С в течение 3 мин.
  • Прохладный образцы до комнатной температуры.
  • Нагрузка 10 мкл каждого GELFrEE фракции в отдельных полос геля и нагрузка 5 мкл стандарта молекулярного веса в последней неиспользованного пер.
  • Запуск гель при 125 В в течение 1,5 часа или до передней краситель не достигнет дна геля.
  • Осторожно снимите гель и окрашивают с серебряной пятна Plus визуализировать разделение белков.

    • 9. Белок Переваривание GELFrEE фракции с использованием FASP

    Модифицированная процедура ФАСП используется для удаления детергента и переваривания GELFrEE фракций.

    1. Добавить каждую отдельную фракцию непосредственно к фильтра блока 30К; смешать с 200 мкл 8 М мочевины в трис-HCl и центрифуге при 14000 х г в течение 25 мин.
    2. Развести концентрат с 200 мкл раствора мочевиныи центрифуги при 14000 мкг в течение 12 мин. Повторите этот шаг 1x.
    3. Добавить 10 мкл 10Х IAA в растворе мочевины к концентрату в каждом блоке фильтров, вихря в течение 1 мин, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
    4. Добавить 100 мкл раствора мочевины к концентрату на фильтровальные установки и центрифуге при 14000 мкг в течение 15 мин. Повторите этот шаг 2x. Добавить 100 мкл 100 мМ ABC решения фильтрующих блоков и центрифуге при 14000 мкг в течение 10 мин. Повторите этот шаг 2x.
    5. Добавить 0,1 мкг / мкл LysC для 1:50 (м / м) соотношение фермент-на-белка фильтрующих блоков и инкубировать O / N при 30 ° С
    6. После инкубации добавляют 40 мкл 100 мМ БКА решения спиновых фильтров и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
    7. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl в спиновых фильтров и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий пептиды LysC от каждого спинового фильтра к новому микропробирки и подкисляют trifluoroacуксусная кислота (TFA).
    8. Промыть спиновые фильтры с 40 мкл 8 М мочевины, затем промыть 2x с 40 мкл 18 МОм воды.
    9. Промыть спиновые фильтры 3x 100 мкл 50 мМ раствора ABC. После последней промывки добавить 0,4 мкг / мкл трипсина в 1:100 (в / в) соотношение фермент-на-белка и инкубировать O / N при 37 ° С
    10. Элюции триптических пептидов из каждого фильтра, добавляя 40 мкл 50 мМ раствора ABC и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг 1x.
    11. Добавить 50 мкл 0,5 М раствора NaCl к фильтровальные установки и центрифуге при 14000 х г в течение 10 мин. Передача фильтрат, содержащий триптических пептидов из каждого фильтра к новому микропробирки и подкисляют TFA.
    12. Высушите все дайджестов в вакуумной концентратора.

    10. Подготовка образцов для LC-MS/MS

    1. Восстановить сушат LysC и триптического пептид переваривает фракции в 20 мкл 0,1% FA и вихря.
    2. Центрифуга образцов при 20000 мкг в течение 10мин и снимите верхнюю 95% образца в новый флакон образца.
    3. Введите 5 мкл каждой пептидной фракции на х 25 мм образца 100 мкм ловушку для удаления солей и загрязнителей и выполнять хроматографического разделения на 75 мкм × 10 см C 18 колонки.
    4. Использование градиент 2-40% В в течение 100 мин при скорости потока 200 л / мин. Растворитель 95% ddH2O и 5% ацетонитрила, содержащего 0,1% FA. Растворитель В составляет 80% ACN и 20% ddH2O, содержащего 0,1% FA.
    5. Соберите десять масс-спектры тандем для каждого MS сканировать на масс-спектрометре высокого разрешения. Масс-спектрометр LTQ Orbitrap был использован в этом эксперименте.

    11. Белок Идентификация

    1. Определить белки с использованием базы данных UniProt мыши, содержащий прямом и обратном белковых последовательностей и общих загрязнений. MaxQuant программное обеспечение с MASCOT поисковой системы используется для поиск по базе данных белков.
    2. Параметры поиска, которые могут быть использованы, включают, фиксированный модификAtion из carbamidomethyl цистеина, переменная модификации окисления метионина, белка N-концевое ацетилирование, максимум 2 пропустил расщепление. Минимальная длина пептида, чтобы рассмотреть для идентификации является 6 аминокислот. Введите пептидный массовой концентрации погрешность ± 8 млн и фрагмент массового допуском 1,2 Da (масса ошибок зависит от масс-спектрометр используется).
    3. В программном обеспечении MaxQuant, используйте 1% ложных обнаружения (FDR) для пептидов и белков идентификации. Определение белка в списке с числом соответствующих пептидов, покрытия последовательности процентов белка и пептидных последовательностей.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Чтобы получить наиболее полный протеома кохлеарного сенсорного эпителия, быстро ткани рассечение требуется до извлечения белка и пробоподготовки. Два протеомные методы могут быть использованы, дробовика и снизу вверх протеомики. Для подготовки образцов для дробовика протеомики, ФАСП процедура пищеварение был использован, как показано на рисунке 1. Способ FASP позволяет концентрации белков, удаление моющих средств, и переваривания белков с использованием нескольких ферментов. Были две двойные процедуры, используемые для разложения, первый был трипсином пищеварение с последующим вторым расщеплением трипсином, который собирали, фракционируют на колонке SCX в 18 фракций и анализируют с помощью LC-MS/MS нано. В общей сложности 1485 белков были идентифицированы с 1% FDR при выполнении одного-бежать LC-MS/MS использовании этого экспериментальный подход. Среди идентифицированных белков, 329 и 258 белки были классифицированы в митохондрии и плазменной мембране, соответственно (рис.2А). Вторая спальня с двуспальной процедура пищеварение состояла из LysC пищеварения с последующей трипсина пищеварения. Каждый сборник был загружен в отдельности и разделяли на колонке SCX в 18 фракций и анализируют с помощью LC-MS/MS нано. Результаты LysC и трипсина пищеварения произвел в общей сложности 3503 белков с 1% FDR. Фиг.2В показывает, что 605 и 617 белки были классифицированы в митохондрии и плазменной мембране, соответственно. Такой подход дал наибольшее число ассоциированных с мембранами идентификаторов белка. Дубликат анализ LysC и трипсин фракций показал более 65% белков, определенных были разделены между экспериментами. Однако, было также недавно идентифицированных белков в анализе репликации. Дополнительные пептиды и белки были идентифицированы из-за небольших изменений в хроматографии, поэтому приводит к различным пептидов для дробления 25.

    Восходящие протеомика был применен с использованием GELFrEE фракционированиядо LC-MS/MS, как показано на рисунке 3. Были 12 GELFrEE Фракции, собранные. До пищеварения и анализа LC-MS/MS, окрашивали серебром гель был готов для визуализации результатов от GELFrEE фракционирования, как показано на рисунке 4. Гель показал разделение белка за счет увеличения молекулярной массы для каждого последовательного фракции. Таким образом, жидкие фракции 12 GELFrEE расщепляли с помощью двух различных мульти-FASP пищеварения подходы и анализируют с помощью LC-MS/MS. Первый подход пищеварение проводили с использованием двойной трипсина пищеварение, что привело к идентификации 2165 белков с 1%-FDR при выполнении одного перспективе LC-MS/MS. 5А показывает, что было 516 и 399 белки классифицированы в митохондрии и плазматической мембраны, соответственно. Второй подход пищеварение проводили с использованием эндопротеиназную LysC с последующим усвоением трипсина. Одноместный перспективе анализ ЖХ-МС/МС определены 2211 белки с 1% FDR. Этоподход показал такое же количество мембранных белков, ассоциированных как при использовании трипсина / трипсина подход (рис. 5б). Данные масс-спектрометрии протеомики были сданы на хранение в ProteomeXchange консорциума 26 с набором данных идентификатора PXD000231 25. Объединяя результаты из разных методов привело к большому количеству мембраны и растворимых белков от мыши сенсорного эпителия улитки (рис. 6).

    Рисунок 1
    Рисунок 1. Схема дробовика протеомики эксперименте с использованием FASP, ионообменной хроматографии, и в высоком разрешении MS. Белки извлекаются, солюбилизированный, и расщепляли с помощью FASP с LysC и трипсина endoproteinases. LysC (зеленый тюбик) и триптические пептиды (фиолетовый трубка) разделены на менее сложных фракции с использованием SCX хроматографии и анализировали с использованием нано LC-MS/MS. Поиск MASCOT двигатель был использован для обработки данных MS для идентификации белков. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

    Рисунок 2
    Рисунок 2. GO клеточных компонентов профиля идентификаторов белков при выполнении (A) первого и второго Гидролиз трипсином с последующим разделением SCX и (б) первый расщеплением LysC с последующей второй расщеплением трипсином с последующим разделением SCX. Все категории подсчитывают неисключительно, когда белок имеет более чем одну категорию для клеточных компонентов.ES.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Схематическое изображение снизу вверх протеомного эксперименте с использованием GELFrEE, FASP и высокого разрешения MS. Извлеченные белки растворяются и белки осаждают с помощью ацетона (синий трубки) для удаления солей и нежелательных загрязняющих веществ из лизата. Белок осадок солюбилизируется и белки фракционировали с использованием GELFrEE. Каждая фракция расщепляли с помощью FASP с LysC и трипсина endoproteinases. LysC (зеленые трубы) и триптические пептиды (сиреневые трубы) от каждой фракции анализируются с помощью нано LC-MS/MS и белки найдены при поиске данных MS помощью талисмана. Нажмите здесь, чтобы посмотреть большое г изображения.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. Серебро окрашенных гель кохлеарные сенсорного эпителия GELFrEE фракций, визуализировать разделение белка в каждой фракции до МС-анализ. (M) Белковый маркер, (1) Фракцию 1, (3) Фракцию 2, (5) фракция 5, (7) Фракцию 7, (8) Фракция 8, (9) Фракция 9, (10) Фракцию 10, (11) Фракцию 11, (12) Фракцию 12. Печатается (адаптировано) с разрешения Darville и Соколовского 24. Copyright 2013 по Американского химического общества. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

    / Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
    Рисунок 5. GO клеточных компонентов профиля идентификаторов белков при выполнении (A) первого и второго Гидролиз трипсином после отделения GELFrEE и (б) первый расщеплением LysC с последующей второй расщеплением трипсином после отделения GELFrEE. Все категории подсчитывают неисключительно, когда белок имеет более чем одну категорию для клеточных компонентов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

    Рисунок 6
    Рисунок 6. GO клеточных компонентов профиль для всех белков, выявленных с помощью SCX, воск, или разделение GELFrEE. Когда белок было больше, чем одну категорию для клеточных компонентов, все его категориис подсчитывали неисключительно. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Ключевые шаги к максимизации идентификации белка от кохлеарного сенсорного эпителия являются: 1) использование нескольких endoproteinases для пищеварения, 2) использование нескольких методов разделения, и 3) использование масс-спектрометра с высоким разрешением. Применение нескольких ферментов увеличивает количество пептидов и улучшает покрытие последовательность белка, что приводит к повышению количества идентифицированных белков от кохлеарного ткани. Трипсин, наиболее часто используемый протеазы обеспечивает эффективное и специфическое расщепление белков, пептидов генерации, которые полезны для MS ионизации и фрагментации. Тем не менее, с помощью другого фермента перед трипсина, такие как LysC, который также расщепляет остаток лизина в, обеспечивает более эффективное расщепление пептида. Было обнаружено, что покрытие последовательность из белков, полученных из LysC / трипсин-переваривание показали увеличение белка покрытия последовательность относительно покрытия последовательности белка из трипсин / трипсина переварить.

    ove_content "> Осуществление многомерного разделения до MS снизили высокую сложность кохлеарный образца в дробовика протеомики подхода. Это позволило идентифицировать более белков, в том числе мембранных белков, которые обычно трудно определить. большее количество мембранных белков были определены с использованием подход дробовика в отличие от восходящего подхода. Однако подход снизу вверх, используя GELFrEE допустимую для идентификации более низких обильных белков. Это связано с изоляцией выше обильных белков, таких как cochlin от улитки, на отдельные фракции.

    Данные высокого качества, достигнутые в настоящем протоколе помощью масс-спектрометра с высоким разрешением, таким как LTQ-Orbitrap, улучшает и увеличивает количество белков, которые могут быть выявлены в улитке. LTQ-Orbitrap предлагает высокое разрешение, высокую точность массу, и высокую чувствительность для анализа пептидов. Таким образом, применение этого инструмента Enabле идентификация белков из сложных биологических образцов, таких как улитки сенсорного эпителия и усиливает идентификацию низких обильных пептидов. Использование этих объединенных экспериментальных подходов с мощного инструмента MS помогает значительно увеличить кохлеарной набор данных белков, что улучшает возможность определить новый белок биомаркеров, связанных с слуха и глухота.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Авторы заявляют никакого конкурирующие интересы.

    Acknowledgments

    Авторы благодарят доктора Кента Сили, директор Центра по борьбе с наркотиками открытий и инноваций (CDDI) протеомика основной комплекс в Университете Южной Флориды для использования этого объекта. Эта работа была поддержана NIH / NIDCD гранта R01 DC004295 чтобы BHAS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
    2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
    3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
    4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
    5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
    6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
    7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
    8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
    9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
    10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
    11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
    12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
    13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
    14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
    15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
    16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
    17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
    18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
    19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
    20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
    21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
    22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
    23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
    24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
    25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
    26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

    Tags

    Биохимия выпуск 85 Cochlear хроматографии ЖХ-МС/МС масс-спектрометрия протеомика чувствующий эпителий
    Снизу вверх и дробовик протеомики для идентификации Комплексную Cochlear Proteome
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter