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Neuroscience

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화 Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

Abstract

이 프로토콜은 예쁜 꼬마 선충 배아를 개발 내에서 세포를 분할 이미지 형광 현미경의 사용을 설명합니다. 특히,이 프로토콜은 표피 세포 아래에서 발견되어 표피 형태 형성을 위해 중요 할 수있다 neuroblasts을 분할하는 방법을 이미지에 초점을 맞추고 있습니다. 조직의 형성은 후생 동물의 개발에 매우 중요하고 주변 조직에서 외부 단서에 의존한다. C. 엘레은 현미경을 통해 공부의 조직이 쉽게 만들기 때문에 투명성과 간단한 조직에 생체 내에서 조직의 형태 형성을 연구하는 훌륭한 모델 생물이다. 복부 인클로저는 배아의 복부 표면 상피 세포의 단일 층에 의해 커버되는 과정이다. 이 이벤트는 위에있는 상피 세포의 이동을 중재하기 위해 화학 지침의 단서를 제공하는 기본 neuroblasts에 의해 촉진 될 것으로 생각됩니다. 그러나 neuroblasts 높게 증식 있고 작용할 수있다복부 표피 세포에 대한 기계적인 기질로. 이 실험 프로토콜을 사용하여 연구는 조직 형성 동안 세포 간 통신의 중요성을 발견 할 수 있고, 개발 조직 내 세포 분열에 관련된 유전자의 역할을 나타 내기 위해 사용될 수있다.

Introduction

어떻게 이미지의 세포 분열에 대한 초기 C.에 설명 프로토콜이 있지만 엘레 배아,이 프로토콜은 어떻게 이미지 세포 분열 중순 배아 동안 조직 내에서 설명합니다. 개발하는 동안 생물 이미징의 주요 과제 중 하나는 광독성에 대한 민감성이다. 그러나, 회전 디스크 공 촛점 현미경 또는 휩쓸 필드 현미경에 대한 접근성 향상은 더 광범위한 이미징 어플리케이션을 허용했다. 두 시스템은 생물체에 노출 된 UV의 레벨을 제한 고체 레이저 산란광을 사용한다. 그러나 위드 스탠드는 여전히 높은 감도 (예 : EMCCD), 조리개 제어 및 조명 제어 (예를 들어, LED가 또는 조정 수은 전구)와 카메라 등이 갖추어져 있습니다 특히 경우, 생체 내 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 C. 개발 내에서 이미지 세포 분열에 촛점 기반 시스템 또는 위드 시스템을 사용하는 방법에 대해 설명합니다 엘레 </ EM> 배아. 예를 들어, 우리는 어떻게 이미지 neuroblast의 세포 분열에 대해 설명합니다. Neuroblasts는 상부 표피 세포에 화학적 또는 기계적 신호를 제공하여 표피 형태 형성을 촉진하고, 조직의 형성, 세포 간 통신의 중요성의 좋은 예를 제공 할 수있다.

예쁜 꼬마 선충은 투명성과 간단한 조직의 조직 1에 의한 현미경 기반 연구를위한 이상적인 모델 생물이다. 또한, C. elegans의 유전 적 방법 및 RNAi의 의무이며, 그 유전자의 대부분은 인간 동족체를 갖기 때문에, 그것을 조직 형성 2-5 보존 메커니즘을 식별하는 데 사용될 수있다. C.에서 배아> 300 셀이 때의 elegans, 표피의 형성은, 중간 배 발생하는 동안 발생합니다. 표피의 형태 형성 배아가 수축 표피 세포의 레이어로 둘러싼 EMBR를 변환하는 확장하는 동안 몇 가지 주요 단계로 구성웜 (6)의 가늘고 긴 모양으로 타원형 형태에서 요. 복부 표피 세포가 태아의 복부 표면 (그림 1)을 커버하기 위해 복부 정중선으로 마이그레이션 할 때 복부 인클로저는, 이러한 형태 발생 이벤트 중 하나에 대해 설명합니다. 첫째, 전방에 위치한 리딩 엣지 세포 두 쌍은 반대편 이웃 6 복부가 준수 중간 선, 퓨즈를 향해 이동한다. 이것은 복부 포켓 6-7을 만드는 모양처럼 쐐기를 형성하는 후방에 위치한 포켓 세포의 이주가옵니다. 포켓을 닫 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 하나의 가능성은 supracellular 말라 마이 오신 수축 구조가 8 상처 치유와 유사한, 패션 등 지갑 문자열에 함께 포켓 세포를 묶는 것입니다. 흥미롭게도, 포켓 세포의 일부 마이그레이션 epidermi 아래에 발견되는 기본 neuroblasts 9 (신경 세포 전구체의 특정 부분 집합에 의해 매개된다의, 그림 1B).

이전 연구는 neuroblasts가. VAB-1 (Ephrin 수용체)와 VAB-2 (Ephrin 리간드)이 높은 neuroblasts로 표현하고 서로 전방 및 후방 neuroblasts의 정렬을 용이하게하는 복부 표피 세포의 이동 및 복부 인클로저를 조절하는 것으로 나타났다 및 VAB-1 또는 VAB-2 원인 복부 인클로저에 돌연변이가 10-13 표현형. 그러나 발기인 구조 실험 VAB-1도 neuroblasts 분비 다른지도 단서의 상부 복부 표피 세포 수용체에 필요하다는 것을 보여 주었다은 복부 표피 세포를 9로 표현된다. 이들 수용체의 돌연변이는 복부 인클로저 표현형을 야기하지만 결점 때문에 neuroblast 위치 또는 의한 지침에 응답하는 복부 표피 세포의 실패가 14 큐들에 문제가 발생하는 경우에는, 그것이 명확하지 않다. neuroblasts 위스콘신의 분할을 변경안내 신호를 분비 할 수있는 능력에 영향을 미치는 thout는 neuroblasts의 역할과 표피의 형태 형성 동안 기계적 입력을 제공 할 수있는 능력에 대해 설명해 주실 수 있습니다. 최근에는 세포 분열의 유전자, ANI-1 (anillin)가 높은 neuroblasts (그림 2A)로 표현하고 그 고갈 neuroblast 부문 결함의 원인이되는 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도,이 배아는 복부 인클로저 표현형 (Fotopoulos, Wernike 및 Piekny, 게시되지 않은 관찰)을 표시합니다.

Anillin은 세포 분열에 필요한, ​​특히 어머니의 세포가 물리적으로 두 개의 딸 세포로 분할하는 과정을 설명 세포질 분열에 대한됩니다. 세포질 분열 긴밀 제대로 자매 염색 분체의 분리와 결합되도록 공간과 시간에서 제어 될 필요 actomyosin 수축 링의 형성에 의해 구동된다. 후생 동물 세포질 분열의 마스터 레귤레이터는 RhoA의 (C. elegans의에서 RHO-1) 인 작은 GTPase의입니다그 GTP-결합 형태 ctive. GEF Ect2/ECT-2는 RhoA의-GTP가 수축 고리를 형성하고 그 ingression 15 중재 하류 음향과 상호 작용 한 후, RhoA의 활성화됩니다. Anillin는 C-말단을 통해 그것의 N-말단을 통해 액틴과 미오신에 RhoA의에 결합하는 다중 도메인 단백질이다. Anillin는 포유 동물 초파리 S2 세포 (16)의 수축 링의 위치를 안정화하는 데 필요합니다. Anillin 고갈 측면 진동을 받아야 수축 반지의 원인과 세포질 분열은 결국 multinucleate 세포에게 17 ~ 19을 형성 실패합니다. 흥미롭게도, 비록 C. 엘레 ANI-1은 세포질 분열에 필수적인 아닌, 초기 배아에서 actomyosin의 수축을 조정합니다. 그러나, 전술 한 바와 같이, ANI-1은 중간 배아 (Fotopoulos, Wernike 및 Piekny, 게시되지 않은 관찰) 동안 neuroblast의 세포질 분열이 필요합니다. 세포질 분열 실패 neuroblasts의 개수와 위치를 변화시키는과 LOC에 영향을 미칠 수화학적 유도 큐 ATION 또는 그 조직의 기계적 특성을 변경할 수있다. 두 모델은 복부 인클로저 neuroblasts의 비 자립적 역할 및 배아 발달 동안 조직 - 조직의 의사 소통의 중요성을 강조.

이 실험 프로토콜을 설명하는 방법을 이미지 세포 분열을하는 동안 C. 엘레 형광 현미경을 이용하여 중간 배아. 세포 분열의 메커니즘을 연구 실험의 대부분은 세포의 제한된 수의 (예를 들면 C. 한 세포 배아, 제노, 또는 극피 동물 엘레 간스와 배양 접시 (예. 헬라 또는 S2 세포) 내에서 단일 세포 또는 초기 배아에서 수행 하였다 배아). 그러나, 분할면의 타이밍 및 배치에 영향을 미칠 수있는 외부 신호가로, 또한 조직 내 세포 분열을 연구하는 것이 중요하다. 또한, 세포는 주변 조직의 발달에 영향을 화학적 또는 기계적 신호를 제공 할 수있다의, 그리고 세포 간 통신을 개발하는 동안 형성하기 위해 조직을하는 데 도움이 방법을 이해하는 것이 중요합니다.

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Protocol

1. 웜 변종을 유지하고 RNAi의 공연 플레이트의 제조

  1. 선충류 성장 미디어 판
    1. 플레이트
      1. 웜 변종을 유지하고 유전 십자가를 수행하는 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시를 준비합니다. 2 L 플라스크에 증류수 1 L에 3g의 NaCl, 17g 한천 2.5 g의 BactoPeptone 결합과 금속 교반 막대를 추가합니다.
      2. 한천을 용해하고 미디어를 소독 플라스크를 압력솥. 그런 다음 저어 접시에 플라스크를 배치하고 교반하면서 미디어를 냉각 할 수 있습니다.
      3. 미디어가 냉각 여전히 (45 ~ 50 °의 C)를 눌러 다소 따뜻하면, 1 ㎖ 1 M 염화칼슘, 1 ㎖ 1 M 망초, 1 ㎖ 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 25 ㎖의 1 M 추가 인산 칼륨 완충액 (PPB, 시약 / 재료의 테이블에 조리법, 필터 재고 솔루션을 소독) 즉시 60mm X 15mm (작은 배양 접시에 미디어를 부어 상단 또는 13 ㎖ / 판에 요리 ~ 3 / 4을 채우기 USI) 자동 디스펜서를 겨. 참고 : 일부 계통의 항생 물질의 장기 유지 보수 세균 이는 RNAse III 유전자의 TN10의 트랜스포존 불 활성화 할 수 있도록 판 (12.5 ㎍ / ㎖)에 추가 할 수 있습니다하십시오.
      4. 미디어 실온에서 하룻밤 응고 보자. 참고 : 후판 생물학적 후드 또는 오염 발생 우려가 적은 실험실의 영역에 보관해야합니다. 또한, 곰팡이 오염을 제한하기 위해 (휴지 등 청소) 뚜껑에 구축했다 응결을 제거합니다. 테트라 사이클린도 판에 추가 된 경우이 항생제에 민감한 라이트로, 다음 알루미늄 호일로 커버.
      5. 다음 날, E.의 서스펜션 건조 NGM 플레이트 씨앗 대장균, 부드럽게 와동되었습니다 (OP50 변형 섹션 1.1.2 참조). 짝짓기에 대 한 번호판을 만들려면 (작은 원을 형성하는) 각 판의 중앙에 OP50의 ~ 50 μl를 추가합니다. 웜 변종을 유지하기위한 판을 만들려면, OP50 100 ~ 200 ㎕의 (에 ~ 각 NGM 플레이트 씨앗가) 판의 큰 영역을 다루고 있는지 확인합니다.
      6. 시드 플레이트 건조 O / N 실온에서 보자.
      7. 다음 날, 거꾸로 건조 NGM 플레이트를 설정하고 4 ℃에서 플라스틱 저장 용기를 쌓아 참고 : 후판 3~4주 ~까지 사용할 수 있습니다. 테트라 사이클린을 포함하는 플레이트는 어두운 곳에서 보관해야합니다.
    2. 음식
      1. E.에게 사용 대장균 OP50 [Caenorhabditis의 유전학 센터 (CGC, http://www.cbs.umn.edu/cgc)에서] C.를위한 음식 소스로 . 엘레 참고 : OP50는 -80 ° C (50 % V / V 글리세롤의 비율 1:1)에서 글리세롤 주식으로 저장 될 수 있습니다.
      2. , NGM 플레이트에 OP50을 글리세롤의 작은 나누어지는 사용하여 줄무늬 판을 만들려면 (, 멸균 피펫 팁을 사용하여 <10 μl를). LB 한천 플레이트 (시약 / 재료의 테이블에 조리법)에 박테리아를 확산 ~ 16 시간 동안 37 ° C에서 둡니다. 참고 : 오염에 문제가있는 경우, 스트렙토 마이신 내성 OP50 사용할 수 있습니다,ND는 스트렙토 LB 아가 플레이트 (50 ㎍ / ㎖)에 첨가 될 수있다.
      3. 다음 날, 하나의 식민지를 선택하고 500 ㎖의 플라스크에 액체 LB 미디어 (시약 / 재료의 테이블에 조리법) 100 ㎖를 접종.
      4. 문화 동요와 37 ° C에서 O / N을 성장하자.
      5. 다음 날, NGM 플레이트 시드의 세균 현탁액을 사용합니다. 참고 : OP50 50 ML 원뿔 튜브에 분주하고 ~ 4~6주 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. RNAi의
    수유는 RNA 간섭을 매개 수행 할 수있는 주요 방법 중 하나입니다 (RNAi의를, 특정 유전자의 제품을 녹다운하는) C로 엘레. C. 엘레의 자웅 동체는 E.을 공급 할 수 있습니다 유도에 dsRNA를 표현 먹이 벡터로 형질 전환 된 대장균 균주 HT115. 이러한 dsRNA를 (또는 단편)은 보통 특정 표적 유전자의 상당한 녹다운 결과 생식선 전달된다.
    1. RNAi의 플레이트
      1. 전술 한 바와 같이 NGM 플레이트를 준비합니다 (섹션 1.1.1)을 참조하십시오뿐만 아니라, 1 M IPTG (이소 프로필-β-D-갈 락토 1 ㎖를 추가,)를 dsRNA의 발현을 유도하고, 50 ㎎ / ㎖ 암피실린 (앰프 500 μL가, dsRNA를 발현 벡터 앰프입니다 저항하는 따뜻한 매체 (45 ~ 50 ° C)까지).
      2. 플레이트는 건조 후, E.의 50 ~ 100 μL ~로 시드 대장균 HT115 (1.2.2 절 참조). 참고 : 시드되고 플레이트 ~ 4-5주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
      3. 시드 플레이트를 실온에서 하룻밤 건조시킵니다.
      4. 다음 날, 거꾸로 건조 RNAi의 번호판을 돌려 15 ~ 20 ℃에서 플라스틱 저장 용기에 저장 참고 : 시드 플레이트 ~ 최대 2 ~ 3 주간의 RNAi 효율을 유지한다.
    2. RNAi의 음식
      1. E.에게 사용 (CGC에서, 섹션 1.1.2 참조) 대장균 HT115는 그 유전자의 cDNA를 포함하는 먹이 벡터 L4440, L4440 또는 형질 전환. 참고 : 게놈에서 오픈 리딩 프레임의 대부분을 대상으로하는 라이브러리를 먹이는이미 만들어 L4440의 클론 HT115로 변환 (사용할 수있는 한, 예를 들면 애니 -1 20 ~ 21에 대한 Y49E10.19에서 조각 포함;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / 페이지 / rnai.html). 참고 : HT115은 -80 ° C (50 % V / V 글리세롤의 비율 1:1)에서 글리세롤 주식으로 유지 될 수있다.
      2. 관심의 유전자를 대상으로하는 새로운 구조를 생성하려면, IPTG로 유도하는 측면에서는 T7 프로모터 사이의 L4440 벡터지도 및 클론의 cDNA를 참조하십시오.
      3. 변환을위한 표준 프로토콜 (예 : 화학적으로 유능한 박테리아를하고 열 충격 변환을 수행)를 사용하여 L4440 구조와 HT115를 변환 할 수 있습니다.
      4. (섹션 1.1.2 참조) OP50 기술 한 바와 같이, LB 한천 플레이트에 글리세롤 스톡 있지만 플레이트에서 연속으로 박테리아는 또한 암피실린 50 ㎍ / mL로 함유한다. 참고 : 사전에 기존 L4440 구조를 사용하는 경우, 섹션 1.2.2.2-1.2.2.3를 건너 뜁니다.
      5. 하나의 식민지를 선택하고 5 ㎖를 접종5 50 ㎎ / 밀리리터 (LB 앰프)에서 암피실린 μL, 떨고으로 37 ° C에서 배치를 포함하는 LB 미디어.
      6. 후 ~ 16 시간, O / N 문화의 50 μL 신선한 LB 앰프 미디어의 5 ㎖를 접종하고 37 ℃에서 진탕 7 ~ 8 시간 동안 문화를 성장
      7. 4,000 ~ 8,000 XG에서 1 분 동안 박테리아를 원심 분리기, 뜨는을 취소하고 신선한 LB 앰프 미디어 500 μL에 펠렛을 재현 탁.
      8. 상술 한 바와 같이 (섹션 1.2.1 참조) RNAi의 판을 시드하는이 박테리아 솔루션을 사용합니다. 참고 : HT115은 즉시 사용해야하며 저장하지 말아야합니다.

2. 웜 변종 육성

C.에게 유지 표준 프로토콜 1 항에있어서, NGM 플레이트에 CGC에서 주문 elegans의 변종. 이 프로토콜에 사용되는 균주는 다음을 포함한다 : C.를 엘레 VAR 브리스톨, 야생형 (CGC N2의 변형 ID), UNC-119 (tm4063) wgIs102 [햄 - 1 UNC-119 (+)] (CGC OP102에서 변형 ID), UNC-119 (ED3) ltIs44pAA173 [파이-1P-mCherry :: PH (PLC1delta1) + UNC-11 9 (+)] (CGC OD70에서 변형 ID) AJM-1 (ok160) jcEx44 [AJM-1 :: GFP + ROL-6 (su1006)] (CGC SU159에서 변형 ID), UNC-119 (ED3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1P :: HMR-1 :: GFP :: UNC-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (CGC FT250에서 변형 ID).

  1. ~ 3에게 신선한 NGM 플레이트에 정확한 표현형을 표시 젊은 성인 자웅 동체를 선택합니다. 주 : N2 (var. 브리스톨; 야생형)은 15-25 ° C의 사이에 유지 될 수 있지만, 더 높은 온도에서 더 빠른 밀도에 도달한다. 웜 밀도가 높은 경우 새로운 주식이 지불되어야한다.
  2. 형광 단백질의 최적 발현을위한 20 ~ 25 ° C에서 모든 형광 변종 (예 : GFP 및 / 또는 mCherry - 표현 웜)를 유지한다. 웜 밀도가 높고, 식품이 낮을 때 새로운 주식이 지불되어야한다.
  3. 웜을 선택하려면를 사용뽑아 끝 (~ 길이 3 ~ 5 CM)에서 융합 백금 와이어 뽑아 유리 피펫 만든을 선택합니다. 부드러운 가장자리 선을 평평하게. 자웅 동체까지 '특종'에 픽을 사용하여 새로운 판에 전송할 수 있습니다. 균주의 교차 오염을 방지하기 위해 사용 사이에 와이어를 불꽃.

3. RNAi의

  1. RNAi의 수행
    1. 첫째, 30 ~ 60 분 ~를위한 시드되고 NGM 접시에 장소 ~ 8 번과 자웅 동체는 웜 OP50 박테리아를 제거합니다.
    2. 그런 다음 그 유전자에 dsRNA를 표현 L4440 플라스미드 수행 HT115 시드 NGM 앰프 IPTG 판에 8 자웅 동체를 배치 (. 예를 들어, ANI-1, 1.2 참조) ~ 24 시간 동안. 참고 : 관심 유전자 또는 원하는 표현형 (어느 넉다운의 강도에 의존 할 수있다)에 따라, 웜은 24 시간 후, 신선한의 RNAi에 자웅 동체를 배치 (더 짧은 시간 또는 더 긴 기간 동안의 RNAi 플레이트 상에 남아있을 수있다 플레이트).
    3. NEG의 경우는 ative 제어, RNAi의 접시에 장소 벌레는 빈 L4440 벡터를 들고 HT115 시드. 참고 :이 배아가 더 표현형이 없어야합니다.
    4. 긍정적 인 제어를 위해 잘 특성화 표현형을 가진 유전자를 표적으로하는 dsRNA을 표현 RNAi의 접시에 벌레를 배치합니다. 참고 : 24 시간과 자웅 동체는 48 시간 후 멸균 한 후, ρ-1 (Y51H4A.3)의 경우, 태아는 100 % 치명적이다.
  2. RNAi의 효능
    RNAi에 의한 최저의 수준은 어떤 조직이 다른 사람보다 더 저항 할 수있다 특히 이후, 테스트해야합니다. 초 중반 배아 동안, 대부분의 조직은 RNAi를 구분하지만, 후반 배아 또는 유충에, 뉴런은 RNAi의 저항이다. 다른 균주 RNAi의 감도 (예 RRF-3)을 향상시키기 위해, 또는 (신경 프로모터 UNC-119에 의해 표현 된 유전자와 조합 예 SID-1) 조직 특이 적 RNAi를 생성하는데 사용될 수있다.
    1. 웨스턴 블로 팅
      C.를 사용하여 면역 블롯 엘레 단백질이 될 수 있습니다표준 프로토콜 22에 따라 수행.
      1. RNAi의를 수행 한 후, microcentrifuge 관에서 나온 것을 (배아로 가득) ~ (10)은 임신을 수집 ~ 2 분간 끓여 20 ~ 30 μL 1X SDS-PAGE 샘플 버퍼를 Lyse를 추가합니다. 마찬가지로, 제어 샘플에 대한 별도의 튜브에 N2 벌레를 수집합니다. 참고 : 자웅 동체의 수는 기본 항체의 민감도에 따라 다를 수 있습니다.
      2. 샘플 버퍼의 제어 샘플 (예 3~100%)의 희석을 만듭니다. 제어 및 RNAi의 샘플을로드하고 표준 프로토콜 (% 젤 관심의 단백질의 크기에 따라 달라집니다)에 따라 SDS-PAGE에 의해 실행합니다.
      3. 막에 젤을 전송하고 표준 프로토콜에 따라 면역 블롯을 수행합니다. 참고 : 사용하여 다른 기본 및 보조 항체 희석을 각 항체에 대한 권장.
      4. 개발 (예 : 화학 발광을 사용하는 경우) 또는 스캔 (예를 들어 형광을 사용하는 경우) 면역 블롯을하고 일을 비교전자 RNAi에 레인 대 N2 레인의 밴드 밀도 및 최저의 레벨을 결정 (예 RNAi의 차선의 밀도가 12 % 컨트롤 레인 선수를,이 단백질은 88 %만큼 감소 제안). 참고 :. 매덕스 등 23 참조, ANI-1 최저의 효율성을 보려면
    2. 면역 염색
      C.에 면역 염색 엘레 표준 프로토콜 22에 따라 수행 될 수있다.
      1. RNAi의를 수행 한 후, 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 임신하는 자웅 동체 및 수확 배아를 수집합니다. 원심 분리 (1,000-4,000 XG)를 통해 마이크로 원심 튜브와 펠렛을 실리콘 처리 1.5 ML에서 M9 버퍼 (시약 / 재료의 테이블에 조리법)의 방법, 장소에 나온 것 중 하나. 참고 : 마찬가지로 N2에게 임신하는 자웅 동체를 수집합니다.
      2. M9 솔루션을 제거합니다.
      3. 3 분의 microcentrifuge 관에 표백 용액 1 ㎖ (1 M NaOH를, 5 % 표백제)를 추가하여 배아를 추방. 마찬가지로, 표백제 N2 그제어 슬라이드 있도록 rmaphrodites.
      4. 소용돌이 부드럽게, 즉시 원심 분리 (4,000 ~ 8,000 XG)를 통해 배아를 펠렛과 표백 용액을 제거. 참고 : 벌레는 표백제와 함께 배양하는 총 시간이 5 분을 초과하지 않아야합니다.
      5. 및 폴리-L-라이신 코팅 현미경 슬라이드에 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 전송 배아, 배아는 트리스 살린 버퍼 (50 MM 트리스 산도 7.5, 150 mM의 NaCl을 TBS)로 3 배 씻으십시오. 참고 : 코트에 폴리-L-라이신과 유리 현미경 슬라이드는 먼저 슬라이드를 닦아 다음, 폴리-L-라이신의 드롭 (~ 20 ~ 30 μL)을 추가하고 표면에 걸쳐 균일하게 분산하고 건조 할 수 있습니다. 최적의 결과, 코트 슬라이드를 두 번 더하십시오. 배아 (섹션 3.2.2.1-3.2.2.5) 수집하는 다른 방법은 폴리-L-라이신 코팅 현미경 슬라이드에 M9 한 방울을 배치하고 드롭에 10 ~ 임신하는 자웅 동체를 선택하는 것입니다.
      6. 각 현미경 슬라이드 위에 커버 슬립 (배아의 대부분을 포함하는 지역)과 장소를 추가액체 질소에서 슬라이드. 참고 : 드롭에 직접 배치 자웅 동체를 들어, 자웅 동체이 파손 및 배아를 추방 할 수있는 커버 슬립에 넣어 압력을.
      7. 바로 액체 질소에서 그들을 동결 후 커버 슬립을 쓸어 넘겨 배아를 냉동 균열.
      8. 배아를 해결하기 위해 20 분 동안 얼음 냉 메탄올의 슬라이드를 놓습니다. 참고 : 일부 항원 들어, 파라 포름 알데히드 등의 가교 정착이 바람직 할 수있다. Duerr (22)로부터의 프로토콜을 참조하십시오.
      9. 재수와 슬라이드를 세척하여 배아를 투과 트리스 버퍼 식염수 트윈 20 함유로 4 배 (TBST를, 50 MM 트리스 산도 7.5, 150 MM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈 20) 10 분마다.
      10. 배아의 대부분을 포함하는 지역의 주위에 각 슬라이드를 건조 및 액체 차단 펜 (예 : PAP 펜)를 사용하여 배아 주위에 원을 그립니다.
      11. 5 % 정상 당나귀 혈청 (NDS, 블록)와 TBST의 ~ 100 μl를 추가 각 슬라이드 (동그라미 부분) 및 부화실온에서 20 분. 참고 : '젖은 실'(젖은 종이 타월이 들어있는 뚜껑 예를 들어 요리)에 슬라이드를 놓습니다.
      12. 블록을 제거 각 슬라이드 (동그라미 부분)에 (TBST에 희석) 일차 항체의 ~ 50 ~ 100 μl를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 주 : 항체에 따라, 희석 및 배양 시간이 다를 수 있습니다. GFP를 감지하기 위해, 우리는 1 / 200으로 희석 방지 마우스 항-GFP 차 항체를 사용합니다. ANI-1을 감지하기 위해, 우리는 (친절 에이미 Shaub 매덕스, UNC 채플 힐에서 제공) 1천6백분의 1 희석 안티 - 토끼 안티 - ANI-1 차 항체를 사용합니다. 이상 배양 시간의 경우, 4 ℃에서 슬라이드를 배치
      13. (가능하면, 향후 사용을 위해 보관) 기본 항체를 제거하고 5 분마다 TBS와 함께 슬라이드를 3 배 씻는다.
      14. 마지막 세척을 제거하고 각 슬라이드 (동그라미 부분)에 (TBST에 희석) 2 차 항체의 ~ 50 ~ 100 μl를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 주 : 항체에 따라 희석이 다를 수 있습니다. GFP를 감지하기 위해, 우리는을 사용하여1 / 250으로 희석 NTI 마우스 알렉사 플 루어 488 차 항체. ANI-1을 감지하기 위해, 우리는 1 / 250으로 희석 안티 - 토끼 알렉사 플 루어 568 차 항체를 사용합니다.
      15. 이차 항체를 제거하고 세척 슬라이드는 5 분마다 TBS로 3 배. 참고 : DNA를 얼룩 DAPI의 ~ 50 ~ 100 ㎕를 추가하려면 (4 ', 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌를, 1 ㎎ / ㎖) 5 분 TBST의 1 / 500로 희석.
      16. DAPI를 제거하고 5 분마다 TBS로 2 배 슬라이드를 씻으십시오. 참고 : DAPI 염색이 수행되지 않은 경우,이 여분의 세척 단계를 건너 뜁니다.
      17. 0.1M 트리스 (산도 9) 하나의 빠른 세척을 수행, 설치 미디어의 15 μl를 37 ° C (4 % n-프로필 3.4.5-trihydroxybenzoate (몰식자산 프로필), 50 MM 트리스, 산도 9 데워진 ~ 제거하고 추가 각 슬라이드 (동그라미 부분)에 50 % 글리세롤).
      18. 초과 액체를 심지와 매니큐어와 슬라이드를 밀봉 (동그라미 영역에 설치 미디어의 상단에) 각 슬라이드에 coverslip에 추가. 참고 : 슬라이드는 -20 ℃에서 저장 될 수있다
      19. 의 배아를 관찰위드 형광 현미경이나 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 슬라이드. 중요한 것은, 제어 (N2 또는 비의 RNAi) 배아를 사용하여 최적의 픽셀 강도의 이미지를 수집하기 위해 설정을 조정합니다. 그런 다음, 동일한 설정을 사용하여 RNAi의 배아에서 이미지를 수집합니다. 제어 대에 대해 수집 된 이미지의 예 애니 1 RNAi의 배아 그림 (b)에 표시됩니다.

4. 라이브 이미징 및 수확 태아에 대한 슬라이드의 준비

  1. 실시간 이미징을위한 아가 패드의 제조
    1. 그 테이프의 1-2 스트립과 두 개의 다른 슬라이드, 각 사이의 깨끗하고 미리 예열 현미경 슬라이드를 놓습니다.
    2. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드로 (가열 된 증류수에 용해) V 아가로 오스 / W의 2 % 한 방울을 추가합니다.
    3. 빨리 아가로 오스 드롭을 평평하게 수직 방식으로 첫 번째 슬라이드의 상단에 두 번째, 깨끗한 현미경 슬라이드를 놓습니다. 참고 : 주변에 테이프가 하락에스 패드의 두께를 제공한다.
    4. 상단 슬라이드를 제거하기 전에 1 ~ 2 분 아가로 오스 패드를 건조 시키십시오. 아래의 아가로 오스 패드를 깨는 않도록주의 상단 슬라이드를 밀어 넣습니다. 참고 : 때때로 패드 상단 슬라이드로 전송되고 여전히 사용할만큼이 그대로 유지되는 한.
    5. 몇 분 이내에 아가로 오스 패드에 배아를 전송의 준비 후 (단계 4.2 참조) 아래에 설명 된대로. 참고 : 패드가 불투명 한 외관을 가지고 있어야, 그것은 분명되면, 그것은 사용하기에 너무 건조합니다.
  2. 수확 배아
    1. Sulston 등. 24에서 파생 된 라이브 영상에 대한 배아를 수집하기 위해 다음과 같은 프로토콜을 사용하여
    2. NGM 또는 RNAi의 플레이트에서 (굶어 없습니다) 약 4-6 임신하는 성인을 선택하고 우울증 슬라이드에 잘에서 M9 버퍼의 20 ~ 30 μL에 배치합니다.
    3. (또는 선택적으로 외음부 근처) spermatheca의 양쪽에있는 벌레를 잘라 멸균 메스를 사용하여솔루션으로 배아를 놓습니다.
    4. 유리 모세관 / 피펫에 연결된 마우스 피스와 고무 호스를 사용하여 작은 구멍을 가지고 입 피펫으로 배아를 흡입하는 당겼다. 대안 적으로, 파스퇴르 피펫 고무 전구에 연결된 모세관 유리관 배아를 모은다.
    5. 웜 파편을 구분하는 데 도움이, 또한 M9 버퍼를 포함하는 제 2 웰에 흡입 된 배아를 전송합니다.
    6. 이어서, 흡인 갓 준비한 아가 패드에 배아 (단계 4.1 참조).
    7. 함께 하나의 X, Y 평면에서 촬영 될 수있다 배아의 수를 증가 (이쑤시개에 붙어) 속눈썹을 사용하여 덩어리의 배아. 참고 : 산소 결핍을 방지하기 위해, 함께 10 개 이상의 배아를 응집하지 않습니다.
    8. 다음으로, 커버 슬립과 슬라이드를 커버하고 부분적으로 사전 가열 된 액체 VALAP로 밀봉, 영상 중에 태아의 탈수를 방지하기 위해 (바셀린, 라놀린과 파라핀 용융 1시 1분 1초 결합). 주 : 추가 M9 버퍼 CA를N 배아 이미징을위한 충분한 액체가 있는지 확인하기 위해 패드에 추가 될 수있다. VALAP 대신에 바셀린 부분적으로 커버 슬립을 밀봉하기 위해 사용될 수 있지만, 커버 슬립 미끄러하고 현미경 목표로 얻을 수 있었다 일으키는 덜 경질이다.

5. 라이브 영상

  1. neuroblasts를 시각화하기 위해 형광 단백질에 부착 된 neuroblast 특정 단백질을 표현하는 웜의 변형을 획득 (예 : HAM-1 : GFP, CGC OP102에서 변형 ID). 세포막을 감지도 다른 형광 단백질에 부착 지질 인식하는 단백질 도메인 표현 웜 변형 사용하려면 (예를 mCherry :. PH, CGC OD70에서 변형 ID).
  2. 형광 자웅 동체로부터 수확 배아 (프로토콜 4 참조) (프로토콜 3 및 4 참조), 전술 한 바와 같이 슬라이드를 준비 제어 또는 애니 1 RNAi의 플레이트 상에 유지했다.
  3. 표면 형광 현미경으로 4D의 이미지 배아 (X, Y, Z 및 시간 경과). 위스콘신 중 하나를 사용defield 시스템 [GFP 및 TexasRed에 대한 필터, 60X 나 100X, 고해상도 CCD (전하 결합 소자) 카메라에 목적을 위로 자동 형광 현미경, 높은 단계를 자동화 (예. 피에조 Z) 및 전문 수집 소프트웨어] 또는 livescan 필드를 휩쓸 공 초점 현미경 [100X, EMCCD (전자 곱한 CCD) 카메라에 488 nm의 561 nm의 레이저, 목표쪽으로 형광 스캐닝 현미경을 자동화, 높은 (예 : 압전 Z) 및 전문 수집 소프트웨어 단계를 자동화]. 참고 : 위드 시스템의 경우, LED와 EMCCD 카메라를 사용하여 광독성을 제한합니다. 또한, 회전 디스크 공 촛점 현미경 휩쓸 필드 시스템 대신에 사용될 수있다.
  4. 각 시스템에 이미지 neuroblast 세포 분열에, 배를 찾아, Y, 10 배 또는 20 배 목표를 사용하여 배아의 프레임 및 최적의 X, 배아 등의 층간 겪고 Y 프레임을 선택한다 (단계 이전에 복부 인클로저를, 그림 1A)을하거나 수 있습니다 초기 단계에서복부 인클로저 (~ 첫 번째 세포 분열 후 350 분; 그림 1A).
  5. 스위프 필드 현미경에서 50 슬릿 40 % 전력에서 488 nm의 561 nm의 100 mW의 레이저를 사용합니다. 위드 시스템에서 낮은 매체 광 강도 (제어하는 경우)와 GFP 및 TexasRed 필터를 사용합니다. 주 : 위드 시스템의 경우, LED는 낮은 광독성이 있고 바람직하다.
  6. 어느 시스템에서 60X 나 100X 기름 침지 목표를 사용하여 10 분의 총 0.2 μm의 각 2 분의 20 Z-스택을 수집합니다. 참고 : 비록 HAM-1 : GFP 및 mCherry : PH 프로브는 상대적으로 높은 수준의 표현, 각 프로브에 대한 노출 시간이 다른 현미경에 최적화해야합니다. 참고 : 위드 시스템의 경우, 적은 Z-스택은 광독성을 제한하는 것이 좋습니다 시간의 긴 기간 동안 이미징 적은 시점을 사용합니다.
  7. 먹을 사용하는 경우 (위드 시스템에서 UV 광에 배아의 노출로 인한 광독성을 최소화하려면URY 전구), 30 %로 조리개를 닫고 () 조정 가능한 조명 시스템을 이용하여 광 강도를 감소시킨다. 참고 : 게인이 시스템을 사용하여 필요하지 않지만, 다른 현미경 최적 픽셀 강도의 영상을 구하는 게인의 사용을 요구할 수있는 상이한 개구와 하부 농도 나 목적으로 광원을 가질 수있다. 모든 관찰 된 표현형은 인공적인 광독성에 의한되지 않도록 제어 배아를 사용하여 조건을 테스트합니다.

6. 현미경 데이터 분석

  1. TIFFs을 같은 이미지, 수출 파일을 분석하고 자바 기반의 이미지 처리 프로그램 (예를 들어 ImageJ에, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/)와 같은 전문 소프트웨어를 사용하여 스택으로 TIFFs을 엽니 다. 참고 : 이미지를 수집하는 데 사용되는 수집 소프트웨어에 따라, 파일은 원래 형태로 유지 될 수 있고 ImageJ에 오픈. 메타 데이터가 파일로 보관 될 때이 바람직하다.
  2. 스택을 분리'이미지'를 선택 시점과 원하는 Z-평면에. 참고 : 20 Z-평면의 스택을 촬영하지만, neuroblasts의 많은 <1 중간 후반 배아 동안 두께 μm의 단 몇 Z-평면이 필요하다.
  3. 각 시점의 선택 Z 평면을 Restack 별도의 Z-스택 예측을합니다. 그리고, 각각의 시간 동안 돌기 시계열을 만들기 위해 함께 포인트 스택.
  4. 각 채널에 대한 밝기 및 / 또는 대비를 조정합니다.
  5. 그런 다음, 관심, 작물의 지역을 선택 (필요한 경우 회전) 지역.
  6. '통합 채널'기능을 사용하여 병합 된 이미지를 생성하고 각 채널에 대해 서로 다른 색상을 선택합니다. RGB에 병합 된 이미지를 변환합니다.
  7. 더 명확하게 이미지를 시각화하는 단계 6.3 또는 6.4 ( '편집'에서 사용하는 '반전'함수)에서 각 채널의 그레이 스케일 이미지를 반전.
  8. 벡터 기반 softw의 수치를 만들기 위해 8 비트 TIFFs을 모든 최종 이미지를 저장프로그램 또는 QuickTime 파일이 영화를 만들기 위해 수 있습니다.
  9. 픽셀 크기의 측정은 (예를 들어 이미지에 눈금 막대를 포함하는) 필요하면 배아의 크기 측정 ImageJ에, 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용한다. 참고 : 다른 목표를 사용하여 수집 된 이미지는 다른 픽셀 크기가있을 것이다.

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Representative Results

이 실험 프로토콜은 어떻게 C에서 이미지 세포 분열에 대해 설명합니다 엘레 중반 배아 동안 배아. 특히, 표피 형태 형성을 촉진 할 수있는 방법을 화상 neuroblasts에, 설명한다. 표피 형태 형성으로 인해 표피 세포 모양의 변화, 마이그레이션 및 밀착성, 또한 내부 neuroblasts (도 1b)에서 화학적 또는 기계적 신호에 의존의 조합으로 발생한다. neuroblasts는 이주 10,14,25을 조절 복부 상피 세포 표면 수용체에 의해 수신되는 신호를 유도 분비. 또한, neuroblasts는 복부 표피 세포 (26)의 이동에 기여하는 기계적인 힘을 제공 할 수있는 고도의 증식 있습니다. 이 프로토콜은 중앙의 배 발생시 neuroblast 세포 분열을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 첫째, neuroblasts 시각화하는 마커를 coexpressing 배아 : 세포질 분열 진행 (HAM-1 GFP)을 (mCherry : PH)가 생성됩니다. HAM-1 : GFP는 GFP (녹색 형광 단백질) 핵 27 neuroblast하는 지역화 단백질을 태그 표현, 중간 배아를 진행하는 동안 많은 다른 세포 유형 (> 300 세포, 그림 3)이 있기 때문에 사용할 필요가있다. DNA가 유사 분열시 염색체로 응축 때문에 이것은 또한, 세포를 분할하는 좋은 마커 역할을합니다. mCherry : PH는 산모의 프로모터 (파이-1)로 표현된다 mCherry - 태그 형광 단백질이며, 세포막을 셀에 지역화 PLC1 ∂ 1 (28)로부터의 지질 결합 도메인을 포함하고 있습니다. 도 3;; 비디오 1)이 단백질은 세포막과 세포질 두 개의 딸세포로 모세포를 분리하기에 끼우는 경우 세포질 분열을 시각화하기 위하여. 다른 마커가 다른 세포 유형을 시각화하는 데 사용할 수있는이 프로토콜은 방법 (GFP 표현 HAM-1로 표시) 이미지 neuroblast 부문에 설명하지만.

neuroblasts을 분할 시각화, 배아는 coexpressing HAM-1 : GFP 및 mCherry : PH는 (10 분의 총) 매 2 분을 이미지하고 있습니다. 각 neuroblast 직경 만 ~ 1-4 μM이고, 1 μm의 두께 <이며 고배율 (예. 100X)과 대물을 사용하는 것이 최선이다. 또한, 다수의 Z-스택 (~ 20) (모양의 구형) 각 셀의 다양한 각도가 몇 군데되는 것을 보장하기 위해 작은 단계 크기 (0.2 μM)로 수집된다. 시점을 손상시키지 않고이 많은 이미지를 수집하기 위해 고도의 자동화 단계 (예 : 압전 Z 단계)을 추천합니다. 일련의 이미지를 수집 한 후, 그들은 DNA가 응축되어 막이 ingressed되고 새로운 딸 세포는 (병합 채널 투영 스택의 시점은 형성되고, 분할되는 몇 Z-스택 내에서 셀을 찾기 위해 분석 ) 영상 1]도 3a에 도시 한 병합 채널 선택 스택이도 3b에 나타낸다. 더 나은 세포를 시각화하기 위해서는 추천합니다그레이 스케일로 각 채널을 유지하고 (예를 들어 그림 4) 이미지를 반전.

이미지 해상도는 고해상도 CCD 카메라 (1344 X 1024 픽셀)을 이용하여 대 위드 시스템에 대해 상이하다. 고감도 (~ 35 프레임 / 초, 512 X 512 픽셀)로 고속 EMCCD 카메라를 사용 휩쓸 필드 시스템. 두 시스템 모두와 함께 찍은 제어 배아 neuroblasts 분할의 반전 이미지는 비교 (. 5 대 그림 4)에 표시됩니다. 그림 4A (위드 시스템, 비디오 2)에서와 같이., 이미지는 그림 5A 대 명확하다 (휩쓸 필드 시스템, 비디오 4). 위드 시스템을 사용하는 경우에는, 배아 광독성 될 수 있으며, 더 빠른 시점은 고해상도 카메라에서는 불가능하다. 예를 들어, 다양한 단백질의 현지화 (예. t의 변화를 조사O) 자신의 역학의 변화를 연구, 시점은 더 자주 수집해야 할 수도 있습니다. 또한, Z-스택 및 시점의 수를 감소시키지 않고 오랜 시간 동안 영상이 불가능할 수있다. 위드 시스템 EMCCD 카메라를 사용하는 이미징 응용의 넓은 범위를 허용 할 수있다. 높은 해상도와 빠른 속도를 모두 가지고 카메라가 개발되어 있지만 드라이버가 사용되는 수집 소프트웨어에 따라 사용할 수없는 경우가 있습니다, 그들은 여전히​​ EMCCD 카메라와 같은 민감하지 않을 수 있습니다. 일반적으로 영상 C.에 사용되는 다른 시스템 엘레 또한 낮은 광독성을 가지고 (토론 참조) EMCCD 또는 CCD 카메라 하나이 장착 될 수있는 회전 디스크 공 촛점입니다.

(; 섹션 1.2 및 프로토콜의 3 참조 예를 들어, ANI-1)과 그 배아는 관제사와 같은 방법으로 이미지를 만들 세포 분열에 필요한 유전자를 연구하기 위해, 자웅 동체는 그 유전자에 대한 RNAi의로 처리L 배아. 배아를 제어하기 위해 RNAi의 배아에서 세포를 비교하기 위해, (성냥 세포 모양과 위치를하는 데 도움) 배아 발달의 유사한 단계에서 이미지에 가장 적합합니다. 예를 들어, 촬상 neuroblasts위한 좋은 기준점 역할 (도 4 및 5) 수 복부 격납시 배아의 중심에 보이는 큰 셀이있다. 유전자가 이곳에서 공부, ANI-1 (anillin), actomyosin 수축성을 구성하지만, 초기 배아 23,29-30에서 세포질 분열에 필요하지 않습니다. Anillin의 상동 기관은, 그러나, 더 높은 진핵 생물 (16)에 세포질 분열에 필요하고, ANI-1 neuroblast의 세포질 분열 (Fotopoulos, Wernike 및 Piekny, 게시되지 않은 관찰)이 필요합니다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, (비디오 1) 및도 5b (비디오 5), 몇개 neuroblasts는 세포질 분열을 개시하고 그들의 멤브레인에 끼우는 대신 두 개의 딸 형성세포는 세포막은 퇴보하고 세포 (> 1 핵 / 셀) multinucleate된다. 그것은 ANI-1이 프로토콜에 의해 공개되지 않은 다른 세포 유형의 분할 또는 형태 변화에 대한 요구 될 수 있음에 유의해야합니다. 또한,이 프로토콜은 특정 조직의 RNAi (토론 참조)의 결과를 표시하지 않습니다.

그림 1
그림 1. C. 동안 복부 인클로저 elegans의 표피 형태 형성. 제어 AJM-1) Z-스택 예측 (두께 0.5 μm의 3 Z-스택) : GFP (표피 세포의 경계를 시각화 할 수있는 adherens 접합 마커, CGC SU159에서 변형 ID) 배아 진행 등의 윤달 (왼쪽, 지느러미보기 ) 및 제어 AJM-1 : GFP 배아가 겪고 복부 인클로저 (오른쪽, 복부보기). 이미지는 더 힘을 반전셀 경계를 ualize. B) 만화는 C.의 복부 뷰를 표시 복부 인클로저를 겪고 elegans의 배아. 첫째, 첨단 세포 (파란색) 두 쌍의 복부 정중선 (왼쪽 배아)으로 마이그레이션하는 굴지의 풍부한 filopodia (검은 선)을 사용합니다. (; 검은 점선 / 원, 상처 치유를 연상시키는 B ') (25) 다음으로, 후방 복부 포켓 세포 (적색) 메커니즘과 같은 지갑 문자열로 닫을 수 있습니다 복부 표면에 구멍을 만드는 중간 선을 향해 이동한다. 또한 (회색 원)을 기본 neuroblasts은 제시된. 두 번째 배아 (B ")는 표피 세포의 특정 부분 집합의 마이그레이션이 PLX-2/plexin 및 VAB-1/Ephrin 수용체 발현 'plexin 밴드'세포 (녹색의 재 배열에서 형성된 '다리'에 의해 매개되는 방법을 보여줍니다 동그라미). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
C. 그림 2. ANI-1 현지화 elegans의 배아.) ​​고정 C. HMR-1을 표현 elegans의 배아 : GFP, GFP (녹색), ANI-1 (빨간색)에 costained (E-cadherin의 표피 세포 경계 마커). . 외부 세포층 (두께 0.2 ㎛의 4 Z-스택)의 공 촛점 이미지는 N2 및 N2 고정 덮고있는 표피 세포와 ANI-1 양성 B입니다 기본 neuroblasts을) 보여, ANI-1 RNAi의 배아는 스테인드 공동 있습니다 ANI-1. ANI -1 크게 ANI -1 - 고갈 배아 감소된다. 스케일 바 :. 10 ㎛가 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 3. 떠올리는 C. 동안 neuroblast 분할 엘레 간스의 배아. 그리고 mCherry GFP (녹색 neuroblast 핵을 시각화) : (A) Z-스택 예측 (두께 0.2 ㎛, 20 Z-스택은) HAM-1 coexpressing 제어 배아에서 표시됩니다 PH (세포막을 시각화하는, 빨강) . 많은 neuroblasts와 다른 세포 유형이 돌기에 볼 수 있습니다 Z 평면의 작은 번호를 사용 (B) Z-스택 돌기 coexpressing 다른 컨트롤 배아에서 표시됩니다 HAM-1. GFP (녹색) 및 mCherry : PH (빨간색). 지역은 더 명확하게 개별 분할 neuroblast을 표시 (백색 상자)로 확대된다. 흰색 화살표 머리가 새로 유사 분열 동안 응축 된 DNA를 강조 표시하고 분할 세포와 녹색 동그라미의 ingressing의 세포막을 가리유사 분열의 끝으로 딸의 핵을 형성한다. 대 세포는 배아 내에 발달 단계 및 위치를 결정하는 기준점 (화이트 별표)로서 기능한다. 스케일 바 :. 10 ㎛ (흰색)와 3.5 μm의 (노란색) 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. C. 동안 neuroblast의 세포질 분열을 시각화 엘레 위드 시스템을 사용하여 배아. A) 반전 Z-스택 예측 (두께 0.2 μm의 2 Z-스택이) coexpressing 제어 배아에서 표시됩니다 HAM-1 : GFP 및 mCherry : 높은 해상도의 CCD 카메라를 사용하여 위드 시스템에서 수집 된 PH. 레드 화살촉 내가 함께 나누어 neuroblasts를 가리세포막을 ngressing. 녹색 원은 유사 분열의 초기 단계에서 압축 된 DNA를 강조하거나 새로 유사 분열 / 세포질 분열의 끝으로 딸의 핵을 형성한다. 표시된 대 세포는 발달 단계를 결정하는 기준점 (노란색 별표) 역할을한다. B) 이미지)와 유사하지만, ANI-1의 RNAi 치료 배아에서이다. 세포막의 세포 유사 분열을 통해 진행되지만 multinucleate 셀을 떠나, 직후 이완로 ingresses. 스케일 바 :. 10 ㎛ (블랙), 3.5 μM (노란색) 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. C. 동안 neuroblast의 세포질 분열을 시각화 엘레 휩쓸 필드 시스템을 사용하여 배아. 0.2 μm의 (총 0.4 μm의 2 Z-스택)의 A) 반전 Z-스택 예측은 HAM-1 coexpressing 배아에서 표시됩니다 GFP 및 mCherry : 고감도 EMCCD 카메라를 사용하여 스윕 필드 시스템에서 수집 PH하지만, 낮은 해상도. neuroblast을 겪고의 세포질 분열에 빨간 화살촉 점. 녹색 원은 유사 분열과 세포질 분열 후 새로 형성 딸의 핵 동안 응축 된 DNA를 강조 표시합니다. 대 세포는 발달 단계를 결정하는 기준점 (노란색 별표) 역할을합니다. 표시 B) 이미지)와 유사하지만, ANI-1의 RNAi 치료 배아에서, 그리고 3 Z-스택은 (총 0.6 μm의 사용 ). 전술 한 바와 같이, 다음 막 유사 분열을 통해 셀 진행됨에 ingresses 있지만 셀이 multinucleate되도록 유발 이완. 스케일 바 : 10 ㎛ (블랙), 3.5 μm의 (노란색).188/51188fig5highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1. C. 동안 분할 neuroblasts 시각화 엘레 간스의 배아. HAM-1 coexpressing 제어 배아에서 두 Z 평면 (0.4 μm의 / 평면)의 Z-스택 예측 : GFP (녹색) 및 mCherry : PH (빨간색). 위드 현미경에서 수집 된 이미지는 두 채널에 표시됩니다. 비디오는 그림 (b)의 세 번째 패널에 표시된 배아에 해당합니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2. C. 동안 분할 neuroblasts 시각화 엘레 간스의 배아. HAM-1 coexpressing 제어 배아에서 두 Z 평면 (0.4 μm의 / 평면)의 Z-스택 예측 : GFP (녹색) 및 mCherry : PH (빨간색). 비디오는 mCherry의 위드 현미경에서 수집 반전 이미지에 해당 PH 채널 ONL을Y (그림 4A의 배아). 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 3. C. 동안 분할 neuroblasts 시각화 엘레 간스의 배아. ANI-1의 RNAi 치료 배아에서 두 Z 평면 (0.4 μm의 / 평면)의 Z-스택 돌기 coexpressing HAM-1 : GFP (녹색) 및 mCherry : PH (빨간색). 비디오는 mCherry의 위드 현미경에서 수집 반전 이미지에 해당합니다. PH 채널 만 (그림 (b)에 배아) 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 4. C. 동안 neuroblast 나누어 시각화 엘레 간스의 배아. HAM-1 coexpressing 제어 배아에서 두 Z 평면 (0.4 μm의 / 평면)의 Z-스택 예측 : GFP (녹색) 및 mCherry : PH (빨간색). 비디오는 반전에 해당mCherry에 대한 휩쓸 필드 공 초점 현미경에서 수집 한 이미지를 넣어주세요. PH 채널 만 (그림 5A의 배아) 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 5. C. 동안 neuroblast 나누어 시각화 엘레 간스의 배아. ANI-1의 RNAi 치료 배아로부터 3 Z 평면 (0.4 μm의 / 평면)의 Z-스택 돌기 HAM-1 coexpressing : GFP (녹색) 및 mCherry : PH (빨간색). 비디오는 mCherry에 대한 휩쓸 필드 공 초점 현미경에서 수집 반전 이미지에 해당합니다. PH 채널 만 (그림 (b)에 배아) 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 중간 배아 발생 동안 화상 세포 분열에 대한 현미경의 각종 유형의 사용을 설명한다. 특히,이 프로토콜에서는 표피의 형태 형성을 촉진 할 수 neuroblasts의 분열, 세포를 이미지에 강조 표시합니다. 세포 - 세포 통신은 후생 동물 개발 및 C. 동안 조직 형성에 중요 엘레은 생체 내에서 조직 형성을 연구하는 훌륭한 모델입니다. 잘 조직의 상호 작용을 묘사 한 이벤트는 상피 세포의 층에 배아를 커버하는 표피의 형태 형성이다. 특히, 복부 인클로저는 복부 표피 세포가 태아의 복부 표면을 둘러싸는 마이그레이션 과정이며, 기본 neuroblasts에 의존합니다. neuroblasts은 화학적 또는 기계적 신호를 제공하고, neuroblasts의 위치를​​ 변경하면 복부 인클로저는 손실이 크다. 복부 인클로저가 제대로 발생하도록 neuroblasts의 번호 (또는 극성)도 필수적 일 수있다그리고 그들의 분열 조절 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 어떻게 이미지 세포 분열에 C를 사용하여 생체 조직 내에서 설명 엘레 두 형광 프로브 (mCherry : PH 세포막과 HAM-1을 간략하게 설명하는 : neuroblast 핵을 레이블에 GFP를) coexpressing 배아.
C. 생활 이미지의 가장 중요한 단계 엘레 형광 프로브를 표현 배아은 : ⅰ) ⅱ) 조직을 형성하는 동안 유전자 요구 사항을 연구하는 돌연변이 체를 사용하거나 RNAi를, 20 ~ 25 ° C에서 유지 원하는 형광 마커를 표현하는 건강한 젊은 성인 자웅 동체 ()를 사용, ⅲ)에서 배아를 수집 현미경에 적합한 단계 (예를 들면. 중간 배아), 및 IV)는 낮은 광독성을 유지하기 위해 최적화 된 설정을 사용하여 형광 현미경을 수행하지만 높은 이미지 품질을 유지할 수 있습니다.

특정 셀 및 / 또는 그 조직 내에서 세포 내 구획을 확인하려면, 형광 프로 태그 마커를 발현하는 웜을 사용BES. Caenorhabditis의 유전학 센터 (CGC, http://www.cbs.umn.edu/cgc)는 여러 마커를 coexpress 긴장을 이용할 수 있습니다. 그러나, 두 균주 (각 관심의 단일 마커를 표현)를 안정적으로 두 프로브를 표현하는 변형을 생성하기 위해 여러 세대에 걸쳐 교차하고 형광 현미경으로 검사를해야 할 수도 있습니다. neuroblast 핵 시각화 마커를 발현하는 균주 교차되었다 : 예를 들어,이 실험 프로토콜, 세포막 (OP70 PH mCherry)를 시각화 할 수있는 마커를 발현하는 균주 수행하기 (HAM-1 : GFP를, OP102)를 생성 할 수 모두 coexpressing 변형.

배아 발달 동안 유전자 요구 사항을 연구하는 가장 좋은 방법은 유전자 산물이 뜨거나 변이 기능 실험의 손실을 수행하는 것입니다. 이 실험 프로토콜은 anillin (ANI-1) 모든 배아 조직에서 내인성 ANI-1 수준을 감소시키기에 대한 RNAi의를 수행에 대해 설명합니다. 더 잘 특징 hypomorphic 대립 유전자가 있습니다애니 1. 따라서, RNAi의 기능 표현형의 ANI-1의 손실을 검토하고 배아 발달 동안 그 기능을 확인하는 가장 좋은 방법입니다. 일반적으로, 그것은 최저의 효율이 가변 될 수있는 바와 같이, 대신의 RNAi 변이주를 사용하는 것이 좋다 드물게 NULL이다. RNAi의 프로토콜을 먹이로 발생하는 가장 일반적인 문제 중 하나는 RNAi의 효율성을 줄일 수있는 오염이다. 오염의 위험을 감소 무균 조건에서 RNAi의 접시와 음식을 준비합니다. 오염은 사용하기 전에 판의 몇 가지를 선별하여 검색 할 수 있으며, 우유 / 불투명 찾고 박테리아와 접시는 폐기해야합니다. RNAi의 효율을 감소시킬 수있는 또 다른 문제는 오른쪽 발달 단계에서 자웅 동체를 선택하지 않음으로써이다. 그것은 더 / 몇 가지 수정 된 배아가 없습니다 L4-단계적 또는 젊은 성인 웜 (개발 외음부 웜의 복부 측면에 흰 원 / 구멍으로 표시)를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 또한, RNAi의 조건과 치료 해요AY 다른 유전자 제품에 따라 다릅니다. RNAi의 강도를 증가 또는 감소하는 여러 가지 방법이 웜이에 유지됩니다 (1.2.2 절 참조) LB 앰프 매체의 서로 다른 양의 펠렛 HT115 박테리아를 재현 탁하고, RNAi의 치료 (시간의 길이의 기간을 변경하여입니다 RNAi의 플레이트;) 프로토콜 3을 참조하십시오. 이 프로토콜에 대한 최적의 ANI-1 RNAi의 표현형을 생성하는 박테리아를 LB 앰프 미디어 및 웜의 500 μL에 재현 탁은 (ANI-1 RNAi의 이전 매덕스 등. (23)에 의해 특징이었다) 2 일 동안 RNAi의 플레이트에 보관했다. RNAi에 내성 또는 민감한 균주 (예. RDE-1, SID-1 또는 RRF-3)는 RNAi의 강도를 변경하기 위해 사용될 수있다. 더 중요한 것은, 이들 균주는 티슈 민감한 균주를 생성하는 그들의 야생형 유전자의 조직 특이 적 발현과 결합 될 수있다. 예를 들어, 특정의 RNAi neuroblast을 수행하는, 하나의 중량을 나타내는 SID-1 돌연변이 배아 (RNAi의 저항)를 사용할 수도 UNC-119 프로모터 (CGC TU3401에서 변형 ID) 31에서.

이 프로토콜은 어떻게 이미지 neuroblast 세포 분열 중순 배 발생 과정에 대해 설명합니다. 적절한 Z-스택을 수집하고 이미지 품질을 손상시키지 않고 광독성을 최소화하는 촬상 조건의 최적화 등 배아의 발달 단계로서, 신중한 고려를 필요로하는 프로토콜의 몇 가지 측면이있다. 오른쪽 발달 단계 (예를 들면 복부 인클로저)에 시점을 캡처하려면, 배아는 (; 그림 1A6 태아의 등쪽에 표피의 단일 층을 형성하는 등의 표피 세포의 쌍 물리는 및 퓨즈) 등의 층간에서 촬영해야합니다. 이 때, neuroblasts 신속하게 분할됩니다. 배아를 준비하는 것은 (예를 해부 현미경을 사용하여) 낮은 배율하에 어려울 수 있기 때문에, 다양한 단계에서 배아의 많은 배아를 수집하는 데 도움오른쪽 단은 높은 배율을 사용하여 선택 될 수있다.

Neuroblasts은 상대적으로 작고 얇은하고, 배아의 중간에 걸쳐 발견된다. 이는 전체 셀이 분열 동안 포착되도록하기 위해 Z-스택의 개수와 크기를 최적화하는 것이 필수적이다. 예를 들어, 너무 많은 이미지를 수집하는 것은 더 많은 빛에 배아를 노출하고 광독성하기가 쉬운 것입니다. 그러나 너무 적은 Z-스택을 수집 두꺼운 Z 섹션을 사용하여 어려운 전체 분할 neuroblast 셀 제대로 이미지에 만들 수 있습니다.
이 프로토콜은 이미지 neuroblast 세포 분열에 휩쓸 필드 공 초점 현미경 또는 위드 시스템의 사용에 대해 설명합니다. 전술 한 바와 같이, 위드의 epifluorescent 현미경을 사용하는 대부분의 한계 중 하나는 광독성 대한 전위이다. 그것은 매우 이미징 C.를위한 회전 디스크 공 촛점 또는 휩쓸 필드 공 촛점을 사용하는 것이 좋습니다 동안 엘레 배아, 일부 연구소는 이러한 시스템에 제한적으로 액세스 할 수 있습니다. 이 Protocol은 30 %로 개구를 폐쇄 수은 램프 (또는 바람직하게는 LED를 사용)으로부터의 광의 강도를 저하 EMCCD 카메라를 사용하고, 이득을 증가 시키거나 허용 비닝 같은 위드 시스템을 사용할 때 광독성을 제한하는 몇 가지 제안을 준다 노출 시간의 감소. Z-스택 및 시점의 개수는 위드 시스템을 사용하여 제한 될 것이다. 그것은이 프로토콜에 설명되지 않았지만 그것은 위드 현미경에 비해 낮은 광독성 발생의 원인이되므로, 회전 디스크 공 초점 현미경은 일반적으로 라이브 영상에 사용됩니다. 스위프 필드 시스템과 유사하게, 그것은 고체 레이저를 사용하고, 광을 산란 (비록 휩쓸 필드 대 다른 방식으로). CCD 또는 EMCCD 어느 카메라가 종종 이중 이미징을 허용하도록 다중 카메라 포트가 스피닝 디스크 시스템과 함께 사용될 수있다. 스위프 필드 현미경과 유사하게, 이미지는 위드 시스템 대 노출 시간 영문으로 아래로 캡처 할 수 있습니다.
이 protocOL은 조직 형성 동안 유사 분열을 조절 다양한 유전자의 기능을 연구하는데 사용될 수있다. 각 이미지 사이의 시간을 단축 할 수있다 (예 :.. 2 ~ 3 분 대마다 15 ~ 30 초)보다 분열 표현형을 시각화. 상이한 프로브가 사용될 수있다 (예를 들면 대신 HAM-1을 사용 :. GFP는 형광 표지 된 H2B는 DNA를 시각화하기 위해 사용될 수있는, 그리고 / 또는 형광은 튜 불린은 유사 분열 스핀들을 시각화하기 위해 사용될 수있는 태그). Z-스택 및 각 스택 두께의 숫자도 (더 작은 스텝 크기의 예보다 스택) 변경 될 수있다. 적절한 설정을 선택할 전술 한 바와 같이, 광독성을 제한하고 이미지 품질을 최적화하기 위해 결정적이다. 비록 mCherry : PH와 HAM-1 : GFP 프로브는 할 수없는 경우이 프로토콜에서 설명하는 것과 대 오랜 시간 동안 Z-스택 또는 영상의 수를 증가,보다 빠른 점을 수집, 상대적으로 높은 수준의 표현 위드 시스템.
자바 기반의 메신저나이 처리 프로그램 (ImageJ에, NIH)을 다른 현미경 및 화상에 의해 수집 된 영상을 가공하는 데 사용될 수는 TIFFs을으로 반출 할 수있다. 그러나, 획득을 위해 사용되는 소프트웨어에 따라, 파일은 이미 처리 소프트웨어와 호환 될 수있다. 메타 데이터는 원본 파일에 보관되어 있기 때문에 그것은, 원본 파일 대 내 보낸 이미지 (예 : TIFFs을)를 엽니 다하는 것이 좋습니다. 처리 소프트웨어는 인물이나 영화를 만들기위한 이미지를 조작하는 데 사용될 수있다. 또한, 정량적 인 분석은 또한 선택된 영역에서 픽셀 강도를 측정 같이 수행 될 수있다. 최적의 소프트웨어는 이미지 처리 도구 상자 (매스 웍스, Matlab을) 또는 3D 및 4D 실시간 인터랙티브 데이터 시각화 (Imaris, 비트 평면)으로, 분석에 따라 선택해야합니다.
이 프로토콜을 이용하여, ANI-1이 초기 배아에서 세포질 분열에 필요하지 않더라도 neuroblast의 세포질 분열에 필요한 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 뉴를 제어하여neuroblasts가 위에있는 상피 세포에 화학적 또는 기계적 신호를 제공하기 때문에 mber 및 neuroblasts의 위치는, ANI-1, 복부 인클로저 복부 표피 세포의 이동을 조절 할 수 있습니다. ANI-1 중간 늦은 배아 발생 동안 부서 또는 다른 세포 유형의 형상 변화에 필요한 경우 그러나, 알려져 있지 않다. 조직의 전체 구성은 주변 조직에 영향을 미치는 방법을 보여주는 것은 후생 동물 개발하는 동안 조직의 의사 소통의 중요성을 강조한다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는이 작품은 자연 과학 및 캐나다 (NSERC) 부여 공학 연구위원회에 의해 지원되었다 있음을 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

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References

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신경 과학 제 85, 형태 형성 세포질 분열 neuroblasts anillin 현미경 세포 분열
동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아
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Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

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