Summary
本协议描述了如何在图像秀丽隐杆线虫的胚胎组织中分裂的细胞。虽然一些协议描述了如何像细胞分裂在胚胎早期，这个协议描述了如何在图像中胚胎发育晚期一个发展中的组织内的细胞分裂。
Abstract
该协议描述了使用荧光显微镜的图像内开发秀丽隐杆线虫的胚胎分裂的细胞。特别是，这个协议的重点在于如何图像划分成神经细胞，这是发现了表皮细胞的下方和可以是用于表皮的形态很重要。组织的形成是后生动物发展是至关重要的，并依赖于外部线索来自邻近组织。C。线虫是一个很好的模式生物来研究组织形态发生在体内 ，由于其透明度和简单的组织，使得其组织容易通过显微镜来研究。腹侧外壳是其中胚胎的腹侧表面被上皮细胞单层的过程。此事件被认为是由底层的神经细胞，它提供化学品的指导线索进行调解覆上皮细胞的迁移提供便利。然而，成神经细胞是高度增殖和也可以充当作为机械基片的腹侧表皮细胞。使用此实验方案的研究可以在组织形成揭开间沟通的重要性，并且可以用来揭示发展组织中参与细胞分裂的基因的作用。
Introduction
虽然有说明如何像细胞分裂初期C.协议线虫的胚胎，这个协议描述了如何像细胞分裂中期胚胎发育过程中组织内。其中一个在开发过程中的生物成像的主要挑战一直是他们的光毒性的敏感性。然而，增加无障碍旋转盘共聚焦显微镜或扫描显微镜领域已经允许更广泛的成像应用。这两个系统使用固态激光器和散射光，限制紫外线的生物体暴露于的电平。但是，广角台灯仍然可以用于成像在体内 ，尤其是当它们配备相机具有高灵敏度（ 例如 EMCCD），光圈控制和调光（ 例如发光二极管或可调汞灯泡）。本协议描述了如何使用一个基于共聚焦系统或宽视场系统，以图像的细胞分裂中开发C。线虫</ em>的胚胎。作为一个例子，我们介绍了如何像神经细胞的细胞分裂。神经母细胞可以促进表皮细胞的形态通过提供化学或机械的线索来覆表皮细胞，并提供了细胞间通讯在组织中形成的重要性一个很好的例子。
秀丽隐杆线虫是一种理想的模式生物，由于其透明度和简单的组织机构1显微镜为基础的研究。此外，C。线虫是服从遗传方法和RNAi，并且由于它的许多基因具有人同系物，它可用于鉴定保守机制，组织形成2-5。在C线虫 ，形成表皮层的过程中胚发生时，当胚胎有> 300个细胞。表皮形态包括几个主要阶段，在此期间，胚胎被封闭在一层表皮细胞的收缩和延伸，改造EMBR的哟从一个卵形形状成蜗杆6的细长形状。腹侧外壳描述了这些形态发生的事件之一，当腹侧的表皮细胞向腹侧中线迁移以覆盖胚胎的腹侧表面（ 图1）。首先，两对位于前前缘细胞的迁移对腹中线，在那里他们坚持和保险丝与对侧邻居6。其次是由后部位于口袋的细胞，从而形成楔形形状像创建腹侧口袋6-7的迁移。关闭所述口袋的机制还不是很清楚。一种可能性是，一个supracellular肌动球蛋白收缩结构领带口袋细胞一起在一个荷包喜欢时尚，类似伤口愈合8。有趣的是，一些袖珍细胞的迁移是由相关的神经母细胞9（神经元前体被发现的epidermi下方的特定亚群介导的秒; 图1B）。
以前的研究表明，神经母细胞调节腹侧表皮细胞的迁移和腹侧外壳。VAB-1（肝配蛋白受体）和VAB-2（肝配蛋白配体）高度表达在神经母细胞并彼此促进前部和后部的成神经细胞的分选，并在VAB-1或VAB-2引起腹外壳突变表型10-13。然而，启动子拯救实验表明，VAB-1，也需要在上覆的腹面的表皮细胞和受体的神经细胞分泌其它的指导线索被表达在腹侧表皮细胞9。虽然在任何这些受体的突变可导致腹侧壳体的表型，这是不明确的，如果出现缺陷，由于在成神经细胞的定位或者由于腹侧表皮细胞未能对引导反应的杆14的问题。改变神经母细胞无线网络的划分thout影响其分泌的指导线索的能力可能揭示神经细胞的作用，使她们在表皮形态提供机械输入能力的光。最近，人们发现，一个细胞分裂基因，ANI-1（的Anillin）高度表达在神经母细胞（ 图2A）和其耗尽导致神经细胞分裂缺陷。有趣的是，这些胚胎腹侧显示表型机柜（Fotopoulos，Wernike和Piekny，未发表意见）。
的Anillin是必需的细胞分裂，特别是对于细胞分裂，它描述了该过程，其中一个母细胞物理地划分成两个子细胞。胞质分裂是由肌动球蛋白收缩环，这需要进行严格控制在空间和时间，以确保它是正确加上姐妹染色单体偏析的形成驱动。后生动物胞质分裂的主调节器是RhoA蛋白（ 线虫 RHO-1），小GTP酶是一在莫如其GTP结合形式。环境基金Ect2/ECT-2激活的RhoA，在这之后的RhoA-GTP与形成收缩环并介导其侵入15下游效应相互作用。的Anillin是，通过其C-末端并通过其N-末端肌动蛋白和肌球蛋白结合的RhoA的多结构域蛋白。的Anillin需要稳定在哺乳动物或果蝇S2细胞16的收缩环的位置。的Anillin枯竭导致收缩环经过横向振荡，和胞质最终失败形成多核细胞17-19。有趣的是，尽管C。线虫ANI-1坐标肌动球蛋白收缩在早期胚胎，它不是对胞质分裂至关重要。然而，如上所述，ANI-1是在中胚（Fotopoulos，Wernike和Piekny，未发表的观察结果）所需的成神经细胞的胞质。胞质分裂失败会改变神经细胞的数量和位置，并可能影响到禄化学指导线索振动性，或者它可能会改变组织的机械性能。这两款机型突出对神经母细胞腹侧外壳的非自治作用，组织 - 组织沟通的胚胎发育过程中的重要性。
该实验方案介绍了如何像细胞分裂过程中C.线虫用荧光显微镜中胚。多数实验研究细胞分裂的机制是在内部培养皿（ 例如 ，海拉或S2细胞）的单细胞或早期胚胎细胞与数量有限的（ 如线虫的单细胞胚胎， 非洲爪蟾 ，或棘皮动物进行胚胎）。然而，重要的是要同时组织中研究细胞分裂，因为有外部线索可以影响分割平面的时机和位置。此外，细胞可以提供化学或机械线索来影响邻近组织的发展s，而它，了解细胞间的沟通有助于组织发展过程中，形成很重要。
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Protocol
1。为维护虫株及表演RNAi技术制备板的
- 线虫生长培养基平板
- 板
- 准备线虫生长培养基（NGM）板保持蠕虫病毒株，并进行遗传杂交。的合成将3克氯化钠，17克琼脂和2.5克细菌蛋白胨，用1升的蒸馏水在一个2升的烧瓶，并添加金属搅拌棒。
- 高压灭菌的烧瓶中溶解的琼脂和灭菌介质。然后将烧瓶在搅拌盘，并允许媒体，边搅拌边冷却。
- 一旦媒体已经冷却下来，还是有点温暖的触碰（45-50℃），加入1 ml 1米氯化钙 1毫升1米硫酸镁4，1毫升5毫克/毫升溶液中的胆固醇和25ml 1米磷酸钾缓冲液（PPB，配方表中试剂/材料;过滤消毒原液），并立即传媒倒入小培养皿（60毫米×15毫米，填补了菜〜3/4的顶端或13毫升/板USI纳克自动点胶机）。注意：对于长期维护的某些菌株四环素可被添加到板（12.5微克/毫升），使细菌的RNA酶III基因的Tn10转座子灭活。
- 让媒体固化在室温下过夜。注：钢板应保持在生物罩或在实验室中是不容易污染的区域。此外，删除已建立的盖子（ 如清洁用纸巾）来限制真菌污染的任何凝结。如四环素也被添加到板，然后盖上他们用铝箔作为这种抗生素是光敏感。
- 第二天，种子干燥NGM板与大肠杆菌中的悬浮液大肠杆菌 （OP50应变，见1.1.2节）已经轻轻涡旋。为了使板进行交配，增加约50μlOP50，以每块板的中心（形成一个小圆圈）。为了使板维护虫株，种子每NGM板〜100-200微升OP50的（以确保它覆盖所述板的一个更大的区域）。
- 让种子板干燥的O / N在室温下。
- 第二天，打开干燥NGM板倒置并在4℃下将它们堆叠在塑料储存容器注：板材的使用，最高约3-4周。含四环素板应保持在黑暗中。
- 食物
- E.使用大肠杆菌 OP50 [从线虫遗传学中心（CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc）]作为食物来源为C。 。线虫注：OP50可以在-80℃（在50％的v / v甘油比1:1）被存储为甘油原液。
- 为了使OP50的NGM板，采用小等分甘油股票进行划线平板（<10微升，用无菌枪头）。传播细菌在LB琼脂平板（配方表中的试剂/材料），并把它在37℃〜16小时。注意：如果有问题，污染，耐链霉素OP50可以使用，一第二链霉素可被添加到LB琼脂平板上（50微克/毫升）。
- 第二天，挑取单个菌落，并在500ml烧瓶中接种100ml毫升药液LB培养基（配方表中的试剂/物料）。
- 让文化发展O / N在37℃振荡。
- 第二天，使用细菌悬浮液用于接种NGM板。注意：OP50可以等分在50ml锥形管中并储存于4℃〜4-6周。
- 板
- RNA干扰
喂食是履行介导的RNA干扰的主要方式之一（RNA干扰，拦截特定基因产物）在C线虫。C.雌雄同体线虫可以喂E。大肠杆菌菌株HT115转化有表达的dsRNA诱导时的馈电矢量。这个双链RNA（或其片段）被发送到生殖腺，通常导致特定基因靶的大量击倒。- RNA干扰板
- 如上所述准备NGM板（见1.1.1节），但也加入1毫升1M的IPTG（异丙基-β-D-半乳糖苷;诱导双链RNA的表达）和500微升的50毫克/毫升氨苄青霉素（安培;表达dsRNA的载体是放大器性），以预热介质（45-50℃）。
- 后平板干燥后，种子他们〜50-100微升大肠杆菌的大肠杆菌 HT115（参见1.2.2节）。注意：未播种板可被储存在4℃下〜4-5周。
- 让种子板干燥在室温下过夜。
- 第二天，把干燥的RNAi板倒置，并将它们在一个塑料存储容器存储在15-20℃。注：直播板块保留的RNAi效率高达约2-3周。
- RNAi的食物
- E.使用大肠杆菌 HT115（从CGC，见第1.1.2）转化的进料载体L4440，L4440或含有基因对感兴趣的基因。注：进纸面向广大的开放阅读框的基因组文库已经生产的，可（在L4440克隆转化为HT115， 如含Y49E10.19一个片段ANI -1 20-21;。http://www.gurdon.cam.ac.uk/〜ahringerlab /页/ rnai.html）。注意：HT115可以保存于甘油在-80℃（在50％的v / v甘油比为1:1）。
- 来生成针对目标基因的新构建体，参见L4440矢量地图和侧翼的T7启动子，它们是被IPTG诱导的克隆的cDNA。
- 使用标准协议进行转换（ 例如将化学感受态细菌，并执行热休克变换）变换HT115与L4440结构。
- 如对于OP50（见第1.1.2节），从甘油贮存在LB琼脂平板上，但在板的条纹细菌也应包含氨苄青霉素的50微克/毫升。注意：如果使用的是预先存在的L4440结构，跳过第1.2.2.2-1.2.2.3。
- 挑取单个菌落，接种5毫升含有5微升氨苄青霉素从50毫克/毫升的股票（LB安培），并将其放置在37℃振荡LB培养基。
- 后〜16小时，接种将5ml新鲜LB安培媒体50微升的O / N培养和7-8小时振荡在37℃生长培养
- 在4,000-8,000 XG离心细菌1分钟，弃上清，重悬沉淀于500μl新鲜LB安培媒体。
- 使用该细菌溶液如上所述的种子所述RNAi板（见第1.2.1节）。注意：HT115应立即使用，不应该被存储。
- RNA干扰板
2。培养菌虫
C.维护线虫菌株按照标准协议1从CGC下令NGM板。用于本协议的菌株包括：C。线虫布里斯托尔变种，野生型（在政府总部大楼N2应变ID）; UNC-119（tm4063）; wgIs102 [ 火腿-1 UNC-119（+）]（应变CGC OP102 ID）; UNC-119（ED3）; ltIs44pAA173 [ 馅饼-1P-的mCherry :: PH值（PLC1delta1）+ UNC-11 9（+）]（在政府总部大楼OD70应变ID）; AJM-1（ok160）; jcEx44 [AJM-1 :: GFP + ROL-6（su1006）]（在政府总部大楼SU159株ID）; UNC-119（ED3） ; xnIs96 [pJN455（HMR-1P :: HMR-1 :: GFP :: UNC-54 3'UTR + UNC-119（+）]（在政府总部大楼FT250应变的ID）。
- 挑〜3中显示了正确的表型到一个新的NGM板年轻成人雌雄同体。注：N 2（品种布里斯托尔;野生型）可以被保持在15-25℃，但他们会更快地达到密度在较高的温度。当蠕虫密度高新股应作出。
- 保留所有荧光的菌株（ 例如 GFP和/或的mCherry-表达蠕虫）在20-25℃下进行荧光蛋白的最佳表达。当蠕虫密度高，食物是低新股应作出。
- 挑虫，可使用挑选与铂丝融合在拉末（〜3-5厘米长）从拉玻璃吸管制成。压平线与边缘光滑。使用pick为'瓢'了雌雄同体，并将它们转移到新的板块。火焰在电线之间使用，以避免株交叉污染。
3。 RNA干扰
- RNAi的表演
- 首先，在一个非种子选手NGM板〜30-60分钟的地方〜8 L4雌雄同体从蠕虫移除OP50细菌。
- 然后将8雌雄同体到一个NGM放大器IPTG的平板接种HT115携带双链RNA表达对感兴趣的基因的L4440质粒（ 如ANI-1，见1.2）〜24小时。注意：根据目的基因，或所希望的表型（其可以依赖于敲低的强度）上，蠕虫可以留在所述RNAi板的时间更短或更长的时间（24小时后，放置雌雄同体上新鲜的RNAi板）。
- 对于一个负ative控制，地方上的蠕虫病毒的RNAi板接种HT115携带空L4440载体。注：这些胚胎应该没有表型。
- 对于阳性对照，放置在蠕虫的RNAi板表达的dsRNA靶向与充分表征的表型的基因。注：对于ρ-1（Y51H4A.3），胚胎是100％致死后24小时，雌雄同体是无菌的48小时后。
- RNAi的功效
击倒通过RNAi的水平应进行测试，特别是由于某些组织可能比其他更耐。在早期胚胎发育中，大多数组织中的RNAi是敏感的，但在后期胚胎或幼虫，神经元是RNAi-抗性。不同菌株可用于提高灵敏度的RNAi（ 例如RRF-3），或以产生组织特异性的RNAi（ 例如SID-1与由神经子UNC-119表达转基因的组合）。- 蛋白质印迹
C.使用免疫印迹线虫的蛋白质可根据标准协议22进行。- 进行RNA干扰后，收集〜10妊娠在微量离心管（填充有胚胎）雌雄同体，添加20-30微升1X SDS-PAGE样品缓冲液和裂解由为〜2分钟煮沸。同样，收集N2蠕虫的控制样品的单独管。注意：取决于初级抗体的灵敏度雌雄同体的数量可能会有所不同。
- 在样品缓冲创建控制样品（ 如 3-100％）的稀释液。加载控制和RNAi的样品和通过SDS-PAGE根据标准协议（在％凝胶将取决于所感兴趣的蛋白的大小而变化）运行。
- 将凝胶转移到膜上并进行免疫印迹按照标准协议。注意：使用不同的一级和二级抗体稀释作为建议每个抗体的。
- 制定（ 例如 ，如果使用化学发光）或扫描（ 例如 ，如果使用荧光）的免疫印迹和比较次在N2通道与RNA干扰车道带电子密度，并确定击倒的水平（ 如 RNA干扰车道的密度的12％，控制车道相匹配，这表明，该蛋白减少了88％）。注意：要查看ANI-1敲除的效率，看到马多克斯等[23]。
- 免疫组化
免疫组化在C线虫可以根据标准协议22来执行。- 进行RNA干扰后，收集使用以下两种方法之一妊娠雌雄同体和收获的胚胎。对于方法，雌雄同体的地方在M9缓冲液（配方表中的试剂/材料）于1.5ml通过离心（1,000-4,000 XG）硅化离心管和球团之一。注：同样收集N2妊娠雌雄同体。
- 卸下M9的解决方案。
- 通过加入1ml的漂白溶液（1M的NaOH，5％漂白剂）到微量离心管中3分钟，排出胚胎。同样，漂白剂N2他rmaphrodites使控制幻灯片。
- 涡轻轻地，然后立即通过离心（4000-8000 XG）沉淀的胚胎并取出漂白液。注意：该蠕虫孵育漂白剂的总时间不应超过5分钟。
- 洗涤胚胎3倍，用Tris缓冲盐水（TBS;的50mM Tris pH值7.5，150mM的NaCl）中，并用玻璃巴氏吸管上的聚-L-赖氨酸包被的载玻片转移的胚胎。注意：要涂有聚-L-赖氨酸显微镜载玻片上，先擦滑，再加入聚L-赖氨酸的下降（〜20〜30微升），并均匀地涂抹它在表面上并让其干燥。为获得最佳结果，涂层的载玻片2次以上。一种替代的方法收集的胚胎（第3.2.2.1-3.2.2.5）是一滴的M9放置到一个聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，并挑选〜10妊娠雌雄同体成的下降。
- 加在每个显微镜载片的顶部上的盖玻片（到包含大多数胚胎的面积），并置于载玻片在液氮中。注意：对于直接放入滴雌雄同体，把压力转嫁给盖玻片破开的雌雄同体和排出胚胎。
- 通过液氮冷冻后立即弹离盖玻片冷冻破解胚胎。
- 放置在冰冷的甲醇中的幻灯片20分钟来固定细胞胚。注：对于某些抗原，交联固定剂如多聚甲醛可能是可取的。从迪埃尔22的协议。
- 再水化和通过洗涤载玻片通透胚胎4倍与含有Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST;的50mM Tris pH值7.5，150 mM氯化钠，0.1％Tween-20中），每次10分钟。
- 干燥每个幻灯片周围包含大部分胚胎的面积和用液体阻挡笔（ 例如 PAP笔）绘制围绕胚胎的圆。
- 添加〜100微升TBST用5％正常驴血清（NDS，块），以每张幻灯片（圆圈区域），并孵育20分钟，在室温。注：将幻灯片在“湿室”（ 如含湿纸巾盖菜）。
- 取出块，加入约50-100微升一抗（稀释在TBST），以每张幻灯片（圆圈区域）孵育2小时在室温。注：根据不同的抗体，稀释和孵育时间可能会有所不同。以检测GFP，我们用抗小鼠抗GFP一抗的1/200稀释。为了检测ANI-1，我们使用的抗兔抗ANI-1初级抗体在1/1600稀释液（由Amy Shaub马多克斯，UNC Chapel Hill的友情提供）。对于较长的温育时间，将载玻片在4℃下
- 除去一抗（如果可能的话，留着以后用）洗净幻灯片3X用TBS，每次5分钟。
- 除去最后一次洗涤和补充〜50-100微升二抗（稀释在TBST），以每张幻灯片（圆圈区域）孵育2小时在室温。注：根据不同的抗体，稀释可能会有所不同。为了检测GFP，我们使用一个在1/250稀释NTI鼠的Alexa Fluor 488的二级抗体。以检测ANI-1中，我们使用的抗兔的Alexa Fluor 568的二级抗体在1/250稀释。
- 去除第二抗体，洗涤载玻片3倍，用TBS，每次5分钟。注意：要染色的DNA，加入约50-100微升的DAPI（4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚，1毫克/毫升）在1/500稀释于TBST中5分钟。
- 除去DAPI和洗涤载玻片2倍，用TBS，每次5分钟。注意：如果不进行DAPI染色，跳过这额外的洗涤步骤。
- 执行一个快洗，用0.1M的Tris（pH值9），删除和添加〜15微升安装媒体预热至37℃（4％正丙基3.4.5-三羟基（没食子酸丙酯），50毫米的Tris，pH值在9 50％甘油），以每张幻灯片（圆圈区域）。
- 加盖玻片，以每张幻灯片（在圆圈区域的安装介质的顶部），灯芯多余液体和密封用指甲油的幻灯片。注：幻灯片可以储存在-20℃。
- 观察胚胎的采用宽视场荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜幻灯片。重要的是，调整设置使用控制（N2或不RNAi）的胚胎收集最佳的像素强度的图像。然后，收集使用相同的设置从RNA干扰胚胎的图像。收集用于控制对图像的例子ANI-1的RNAi胚如图2B所示。
- 蛋白质印迹
4。实时成像和收获胚胎准备的幻灯片
- 对于实时成像制备琼脂糖垫
- 将干净，预加热显微镜其他两个幻灯片，每个幻灯片之间用1-2条带在他们身上。
- 使用玻璃巴斯德吸管，加一滴2％w / v琼脂糖（溶于热蒸馏水）的幻灯片。
- 快速放置第二，清洁显微镜载玻片上的第一张幻灯片的顶部以垂直方式，以扁平化的琼脂糖下降。注：在邻近的胶带下滑ES提供用于垫的厚度。
- 让琼脂糖垫干燥1-2分钟取出顶部滑动之前。滑开滑盖上方小心，以避免破坏琼脂糖垫下方。注意：有时垫传送到顶部滑动，仍可以使用，只要它保持不变。
- 在几分钟之内传送的胚胎到琼脂糖垫及其制备后，如下所述（参见步骤4.2）。注：垫应该有一个不透明的外观，一旦它是明确的，实在是太干燥使用。
- 收获的胚胎
- 使用下面的协议，用于收集胚胎实时成像，这是从苏尔斯顿等 24衍生
- 从NGM或RNAi板挑约4-6妊娠成人（非饿死），并放置在20-30微升M9的缓冲区在一个良好的抑郁症幻灯片。
- 使用无菌解剖刀切开蠕虫对精囊的任一侧（或外阴备选附近），以释放胚胎成溶液。
- 使用橡胶软管与一个口形件连接到玻璃毛细管/吸管拉到有一个小的孔和由口移液吸胚胎。或者，收集胚胎是连接到巴斯德吸管橡胶管的毛细管的玻璃管。
- 转让抽吸胚胎还含有M9的缓冲区第二个好，帮助他们从虫碎片分离。
- 然后，吸胚胎到新鲜制备的琼脂糖凝胶垫（见步骤4.1）。
- 一起使用的睫毛（粘在牙签），以增加可以在一个X，Y平面内拍摄胚胎数丛胚胎。注：为避免缺氧，不聚集超过10胚胎在一起。
- 接着，盖上盖玻片，在滑动部分和与预先加热的液体VALAP密封（凡士林，羊毛脂和石蜡;熔化并结合1:1:1），以防止在成像期间的胚胎的脱水。注：其他M9的缓冲区CAn为加入到垫，以确保胚胎有足够的液体以进行成像。在这里VALAP的，凡士林可以用来部分地密封盖玻片，但它是刚性不足引起的盖玻片滑落，并可能获得到显微镜的物镜。
5。实时成像
- 为了形象化神经母细胞，获得一个蠕虫病毒菌株，表达连接到荧光蛋白的成神经细胞特异性蛋白（ 如 HAM-1：绿色荧光蛋白，在政府总部大楼OP102应变的ID）。检测细胞的膜，使用蠕虫菌株也表达，识别连接到一个不同的荧光蛋白脂质蛋白质结构域（ 例如，的mCherry：PH，在CGC OD70应变ID）。
- 从荧光雌雄同体收获的胚胎保存在控制或ANI-1的RNAi板（见协议3和4），并准备上述幻灯片（见协议4）。
- 在4D图像胚胎（X，Y，Z和时间推移）通过荧光显微镜。使用一个无线defield系统[自动荧光显微镜，过滤器GFP和TexasRed，目标可达60X或100X，高分辨率的CCD（电荷耦合器件）摄像机，高机动化阶段（ 如 。压电Z）和专门的采集软件]或livescan扫场共聚焦显微镜[自动荧光扫描显微镜与488 nm和561 nm的激光器，目标可达100X，一个EMCCD（电子倍增CCD）摄像机，高机动化阶段（ 如压电Z）和专门的采集软件。注意：对于广角系统，采用LED和EMCCD相机会限制光毒性。另外，旋转盘共聚焦显微镜来代替扫过场系统的使用。
- 要么系统映像成神经细胞的细胞分裂，求x，使用10X或20X的目标胚胎y帧，然后选择一个最佳的x，其中胚胎正处于背插Y框架（步骤前腹外壳; 图1A）或有在早期阶段腹外壳（〜第一次细胞分裂后350分钟; 图1A）。
- 在扫场显微镜，使用488 nm和561 nm的100毫瓦的激光，在40％的功率为50的缝隙。在宽视场系统，使用GFP和TexasRed滤波器中低光强（如果可控）。注意：对于广角系统，LED具有低光毒性和是可取的。
- 对任一系统中，使用60X或100X油浸目标，并收集20 Z-堆栈为0.2微米，每2分钟，共10分钟。注意：虽然HAM-1：GFP和的mCherry：PH探针表示在比较高的水平时，曝光时间为每个探针将具有不同的显微镜来进行优化。注意：对于宽视场系统，更少的Z-堆栈，建议限制光毒性和对成像在较长的时间周期，则使用较少的时间点。
- 如果要使用一个佣兵减少因胚胎暴露于紫外线光的广角系统上的光毒性（URY灯泡），关闭光圈至30％，（使用一个可调节的照明系统），降低光的强度。注意：虽然收益不使用任何系统所需要，其他显微镜可有光源强度较低或与目标数值孔径不同，这可能需要使用增益以获得最佳的像素强度的图像。使用控制胚胎，以确保任何观察到的表型不是由于伪迹的光毒性测试的条件。
6。显微镜数据分析
- 分析图像，导出文件为TIFF格式，并打开TIFF格式作为使用专门的软件，如基于Java的图像处理程序（ 如 ImageJ的，美国国立卫生研究院，http://rsbweb.nih.gov/ij/）堆栈。注：根据用于收集图像的采集软件，可以将文件保存在其原来的形式和ImageJ的打开。这是最好的元数据保持与文件。
- 堆栈分开进入“图像”，然后选择时间点和理想的Z平面。注意：尽管一叠20的Z-平面取，许多神经母细胞是<1μm厚的中间期间胚胎发育晚期和只需要几Z-平面。
- 重新堆叠所选择的Z平面，每个时间点，并分别作出Z堆栈的预测。然后，堆叠凸起的每个时间点在一起，使时间序列。
- 作出调整，亮度/和或对比度为每个通道。
- 然后，选择感兴趣，作物区域（如有必要，旋转）的区域。
- 创建使用“合并通道”功能合并后的图像，并选择不同的颜色为每个通道。转换合并后的图像为RGB。
- 反转灰度图像的每个通道从步骤6.3或6.4（使用'倒置'编辑'功能下），以更清楚地看到图像。
- 保存所有最终图像存储为8位TIFF格式，使数据在基于矢量的软体是程序或为QuickTime文件，使电影。
- 如果需要的像素大小的测量（ 例如 ，以包括与图像的比例尺）时，使用ImageJ的，或其它的图像处理软件来测量胚胎的大小。注意：使用不同的目标所收集的图像将具有不同的像素大小。
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Representative Results
该实验方案描述了C。如何像细胞分裂线虫在胚胎发育中的胚胎。特别地，它描述了如何图象的成神经细胞，其可以促进表皮细胞的形态发生。表皮形态发生是由于表皮细胞形状的变化，迁移和黏附，而且还依赖于化学或机械线索来自相关神经母细胞（ 图1B）的组合。在神经母细胞分泌接收由受体腹表皮细胞，从而调节他们的迁移10,14,25的表面上的指导线索。此外，成神经细胞是高度增殖性，其可提供有助于腹面表皮细胞26的迁移的机械力。此协议可用于在胚胎发育中期，研究神经细胞的细胞分裂。首先，胚胎共表达标记，以可视化的神经母细胞生成：（PH值的mCherry）（HAM-1 GFP）进行胞质分裂。 HAM-1：GFP表达GFP（绿色荧光蛋白）标记的蛋白质，定位于神经母细胞的核27，并且有必要使用，因为有存在于中胚许多其他类型的细胞（> 300个细胞; 图3）。这也可以作为一个很好的标记分裂细胞中，由于DNA的有丝分裂过程中凝结成染色体。的mCherry：PH是受母体子（ 馅饼-1）表示的的mCherry-标记的荧光蛋白，并含有从PLC1∂1 28中的脂质结合结构域，其定位于细胞膜。这种蛋白质是需要可视化的胞质中，当膜和细胞质捏在给母细胞分成两个子细胞， 图3;视频1）。虽然这个协议描述了如何像神经母细胞分裂，（由HAM-1所示：GFP表达），其他标志物可以用于可视化其他类型的细胞。
为了形象地划分成神经细胞，胚胎coexpressing HAM-1：GFP和的mCherry：PH进行成像，每2分钟（总共10分钟）。每个神经细胞是唯一〜1-4微米的直径，并且是<1μm厚，并且它最好是使用一个客观的高倍率（ 例如 ，100X）。此外，无数的Z-堆栈（〜20），收集用小的步长（0.2微米），以确保每个细胞（球形）的不同的角度进行成像。要收集这么多的影像，而无需牺牲时间点，一个高度机动化阶段（ 如压电Z台）的建议。采集一系列图像后，对其进行分析，以找到被分割，该DNA被冷凝，膜被侵入的和新的子细胞形成（合并通道的投影堆栈的时间点是在数的Z-堆栈细胞在图3A中所示，并且合并信道中选择栈示于图3B，视频1）。以更好地可视化的细胞，它是建议保持每个通道的灰度和反转图像（ 如图4）。
图像分辨率是不同的，使用高分辨率CCD摄像头（1344 x 1024像素）， 相较于宽视场系统。使用高速EMCCD相机具有高灵敏度（〜35帧/秒和512×512像素）的扫场系统。从划分与两个系统采取控制胚胎神经母细胞的倒置图像，提出了比较（ 图4与5）。如图4A（广角制度; 视频2），图像更清晰与图5A。（扫场系统， 视频4）。然而，使用广角系统时，胚胎易受光毒性和更快的时间点是不可能的高分辨率摄像机。例如，如果要检查的变化在各种蛋白质的定位（ 例如 ，吨o学习改变自己的动力），时间点可能需要更频繁地收集。此外，它可能不能对图像进行较长时间而不降低的Z-堆栈和时间点的数量。在宽视场系统上使用EMCCD相机可以允许更宽范围的成像应用。同时具有高分辨率和高速摄影机已经制定，但具体取决于正在使用的采集软件驱动程序可能无法使用，他们仍然可能不如EMCCD相机一样敏感。这是常用的成像C.另一个系统线虫是旋转盘共聚焦，其中也有较低的光毒性，可与EMCCD或CCD相机可以装配（见讨论）。
学习所需要的细胞分裂基因，雌雄同体与RNAi的治疗对感兴趣的基因（ 例如，ANI-1，见第1.2和3的协议）和它们的胚胎进行成像以同样的方式作为控器升胚胎。从RNA干扰胚胎细胞进行比较，以控制胚胎，最好是像在胚胎发育阶段相似（帮助匹配的细胞形状和位置）。例如，有一个较大的细胞在胚胎的中心可见腹侧外壳中，以（5图4和图）作为用于成像的成神经细胞的良好的参考点。该基因在此研究，ANI-1（的Anillin），组织肌动球蛋白收缩力，但不要求在胞质分裂早期胚胎23,29-30。的Anillin的同源物，但是，在高等真核生物16所需的胞质和ANI-1需要神经母细胞胞质分裂（Fotopoulos，Wernike和Piekny，未发表意见）。 如图4B（视频3）和图5B（视频5），数个神经母细胞胞质分裂开始和它们的膜夹在，但不是形成两个独立的子细胞，它们的膜倒退和细胞变得多核（> 1核/细胞）。但必须指出的是ANI-1可能需要的其它类型的细胞分裂或形状变化，这是不通过该协议揭示。此外，该协议不显示来自组织特异性RNA干扰（见讨论）的结果。
图1。 C.在腹外壳线虫表皮形态。 A）Z堆栈控制AJM-1的预测（3 Z-叠在0.5微米厚）：绿色荧光蛋白（粘着连接标记可视化表皮细胞界限;在政府总部大楼SU159株ID）的胚胎进行背插（左，背视图例）和对照AJM-1：GFP的胚胎进行腹外壳（右，腹面观）。图像反转，以便更好地相ualize细胞界限B）漫画描述了C的腹意见线虫的胚胎进行腹外壳。首先，两对前沿细胞（蓝色）的使用肌动蛋白丰富的丝状伪足（黑线）迁移向腹中线（胚胎在左侧）。接着，对后部腹侧口袋细胞（红色）迁移朝向中线创建于腹侧表面上的孔，可能会关闭由荷包像机构（B';黑色虚线/圈;让人想起伤口愈合）25。还示出了相关的神经母细胞（灰色圆圈）。第二个胚胎（B“）显示了如何表皮细胞的特定子集的迁移是由PLX-2/plexin和VAB-1/Ephrin受体表达'丛蛋白带的细胞（绿色的重排形成的”桥梁“介圆圈）。 点击这里查看大图。
图2：ANI-1定位在C线虫的胚胎。A）固定C。线虫胚胎表达HMR-1：绿色荧光蛋白（E-cadherin蛋白，表皮细胞界线标志物）costained的GFP（绿色）和ANI-1（红色）。外细胞层（0.2微米厚4 Z-堆栈）的共聚焦图像显示固定N2和N2上覆表皮细胞及相关神经母细胞，这是ANI-1阳性B）; ANI-1 RNA干扰胚胎共同染色ANI-1。 ANI-1是在ANI-1-耗尽胚胎大大降低。比例尺：10微米点击这里查看大图。
图3形象化分割成神经细胞C.期间线虫胚胎发育。 （A）Z堆栈预测（20 Z-堆栈的厚度为0.2μm）显示从控制胚胎共表达HAM-1：GFP（可视化神经细胞的细胞核，绿色）和mCherry的：PH值（可视化细胞膜;红） 。许多神经母细胞和其他细胞类型是可见的突起用Z平面的数量较少（B）Z堆叠突起从另一个控制胚胎共表达所示HAM-1：GFP（绿色）和的mCherry：PH（红色）。一个区域被放大（白盒），以更清楚地显示一个人分割成神经细胞。白箭头指向一个分裂细胞和绿色圆圈的ingressing质膜有丝分裂过程中突出简明DNA和新形成子细胞核向有丝分裂的末端。大细胞作为基准点（白星号）的胚胎内确定的发育阶段和位置。比例尺：10微米（白色）和3.5微米（黄色） 点击此处查看大图。
图4。C.在可视化的成神经细胞的胞质线虫胚胎发育采用宽视场系统。 A）倒Z堆栈预测（2 Z-叠厚0.2微米）从控制胚胎共表达示HAM-1：GFP和的mCherry：PH值使用CCD摄像头，高分辨率的广角系统收集。红色箭头指向神经母细胞分裂与我ngressing细胞膜。绿色圆圈突出显示简明的DNA中有丝分裂的早期阶段或新形成的子细胞核向有丝分裂/细胞分裂的末端。所示的大细胞作为基准点（黄色星号）来确定的发育阶段B）的图像类似A），但都是从与ANI-1的RNAi治疗的胚胎。细胞膜入节点中作为细胞进入有丝分裂，而是放松后不久，留下一个多核细胞。比例尺：10微米（黑色），3.5微米（黄色） 点击此处查看大图。
图5。C.在可视化的成神经细胞的胞质线虫胚胎发育用扫频场系统。 2 Z-堆栈为0.2μm（总0.4微米）甲）倒Z堆叠突起从胚胎共表达HAM-1所示：GFP和的mCherry：PH从使用EMCCD相机具有高灵敏度的扫频场系统收集，但较低的分辨率。红色箭头指向一个神经母细胞胞质正在接受。绿色的圆圈有丝分裂和胞质分裂后新形成的子核中突出简明的DNA。大细胞作为基准点（黄色星号）来确定的发育阶段B）所示的图像类似A），但都是从与ANI-1的RNAi治疗的胚胎和3的Z-堆栈用于（总共0.6微米）。如上所述，该膜在入节点通过有丝分裂的细胞进行，但随后放松使细胞成为多核。比例尺：10微米（黑色），3.5微米（黄色）。188/51188fig5highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
视频1。C.在可视化神经母细胞分裂线虫胚胎发育。从控制胚胎两个Z平面（0.4微米/平面）共表达HAM-1 Z堆栈的预测：GFP（绿色）和mCherry的：PH值（红色）。从广角显微镜采集到的图像显示两个通道。视频对应于图3B的第三个面板中显示的胚胎。 点击这里观看视频。
视频2。C.在可视化神经母细胞分裂线虫胚胎发育。从控制胚胎两个Z平面（0.4微米/平面）共表达HAM-1 Z堆栈的预测：GFP（绿色）和mCherry的：PH值（红色）。视频对应的宽视场显微镜的的mCherry收集颠倒的影像：PH通道ONLY（胚胎在图4A）。 点击这里观看视频。
视频3。C.在可视化神经母细胞分裂线虫胚胎发育。两个Z平面（0.4微米/飞机）从ANI-1 RNA干扰治疗的胚胎Z堆栈预测共表达HAM-1：GFP（绿色）和mCherry的：PH值（红色）。视频对应的宽视场显微镜的的mCherry收集颠倒的影像：仅PH值通道（胚胎在图4B） 点击这里观看视频。
视频4。可视化C.在成神经细胞分裂线虫胚胎发育。从控制胚胎两个Z平面（0.4微米/平面）共表达HAM-1 Z堆栈的预测：GFP（绿色）和mCherry的：PH值（红色）。视频对应反转编自扫场共聚焦显微镜对的mCherry采集到的图像：仅PH值通道（胚胎在图5A） 点击这里观看视频。
视频5。可视化C.在成神经细胞分裂线虫胚胎发育。三Z平面（0.4微米/飞机）从ANI-1 RNA干扰治疗的胚胎Z堆栈预测共表达HAM-1：GFP（绿色）和mCherry的：PH值（红色）。视频对应于从外地席卷共聚焦显微镜对的mCherry收集颠倒的影像：仅PH值通道（胚胎图5B） 点击这里观看视频。
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Discussion
本协议描述在胚胎发育中的使用各类显微镜的图像细胞分裂。特别是，该协议强调了如何将图像的神经母细胞的分裂，细胞，可促进表皮形态。后生动物的开发和C在细胞间的沟通对组织形成重要线虫是研究在体内组织形成一个很好的模型。一个事件，很好地描绘组织的相互作用是表皮形态，它涵盖了胚胎一层上皮细胞。特别是，腹侧外壳是其中腹侧表皮细胞迁移到包围胚胎的腹侧表面上的过程中，并且依赖于相关的神经母细胞。在神经母细胞提供化学或机械提示，和腹侧外壳被破坏，如果成神经细胞的位置被改变。成神经细胞的数目（或极性）也可以是必不可少的发生腹外壳正确，并且要明白，规范他们的分裂机制是很重要的。本协议描述了如何像细胞分裂中使用C的活组织线虫胚胎同时表达两种荧光探针（的mCherry：PH值勾勒质膜和HAM-1：GFP标记神经细胞的细胞核）。
最重要的步骤，以图像C.生活线虫胚胎表达的荧光探针是：i）使用表达所需的荧光标记物的健康，年轻，成人雌雄同体（保持在20-25℃），ⅱ）使用突变体或RNAi过程中组织的形成来研究基因的要求，ⅲ）收集胚胎在舞台右侧显微镜（ 如 。胚胎发育中期），以及iv）进行荧光显微镜使用设置进行优化，以保持光毒性低，但要保持高图像质量。
要确定具体的细胞和/或感兴趣的组织内细胞内隔层，使用蠕虫表达标记标记荧光亲BES。在秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc）提供了多种的共表达多个标记菌株。然而，两种菌株（每个表达感兴趣的单一标志物）可能不得不被划线，并筛选与荧光显微镜历经数代而产生的应变稳定表达两种探针。例如，为了进行这项实验方案，表达一个标记，以可视化细胞膜（的mCherry：PH值，OP70）一个菌株越过了应变表达一个标记，以可视化的成神经细胞的细胞核（HAM-1：GFP，OP102）生成一个株共表达两种。
胚胎发育过程中，研究基因的要求的最好办法是要执行的函数的实验中，其中该基因产物被撞倒或突变的损失。该实验方案进行描述的RNAi对的Anillin（ANI-1），以减少内源性ANI-1水平在所有的胚胎组织。有没有很好地表征减效等位基因的ANI-1。因此，RNAi是研究ANI-1的功能丧失表型和胚胎发育过程中确定其功能的最佳选择。通常，最好使用突变体而不是RNA干扰，如敲除的效率可以是可变的，而且很少空。其中喂养的RNAi协议中遇到的最常见的问题就是污染，这将减少RNA干扰效率。以降低污染的风险，制备所述RNAi板和食品在无菌条件下。污染可以通过筛选使用前几个板块进行检测，并与板乳白/不透明寻找细菌应该被丢弃。另一个问题是可以减少的RNAi效率是不是在正确的发展阶段选择雌雄同体。最好是使用L4上演或年轻的成虫（发展外阴显示为白色圆/孔对蠕虫的腹侧），它们没有什么可/几个受精胚胎。此外，RNA干扰条件和处理米唉各有不同，不同的基因产物。不同的方法来增加或减少的RNA干扰的强度是通过再悬浮于不同量的LB放大器介质的沉淀HT115菌（见第1.2.2节），并通过改变RNAi的治疗（时间长度的持续时间，蠕虫病毒被保存在RNAi技术板块;见协议3）。以产生最佳的ANI-1表型的RNAi此协议，细菌重悬于500微升的LB放大器的媒体和蠕虫被保存在RNA干扰板2天（ANI-1 RNA干扰先前特点是Maddox 等人。23）。 RNAi的抗性或敏感性的菌株（ 例如，RDE-1，SID-1或RRF-3）也可用于改变RNA干扰的强度。更重要的是，这些菌株可以与它们的野生型基因，以创建组织敏感菌株的组织特异性表达。例如，要执行的成神经细胞特异性RNAi，人们可以使用SID-1突变体胚胎（RNAi-抗性）表示重量
本协议描述了如何像神经细胞的细胞分裂过程中胚胎发育中期。有协议的一些方面，需要慎重的考虑，如胚胎的发育阶段，收集适当的Z-堆栈和优化的成像条件，以减少光毒性不影响图像质量。捕捉到的时间点在合适的发育阶段（ 例如腹侧外壳），胚胎应该从背侧嵌入拍摄（对背表皮细胞的相互交叉和融合形成表皮对胚胎的背侧的单层; 图1A6）。此时，在成神经细胞分裂速度非常快。由于分期的胚胎可以（ 例如，使用解剖显微镜）在低倍率是困难的，它有助于收集不同的阶段，胚胎的胚胎多在右阶段可以使用更高的放大倍率来选择。
神经母细胞都比较小而薄，并发现整个胚胎的中间。关键是要优化的Z-堆栈的数量和尺寸，以确保在整个细胞分裂过程中捕获。例如，收集太多的图像将暴露的胚胎，以更多的光线，使他们容易产生光毒性。然而，收集太少Z-堆栈或使用厚的Z部分可以使它很难正确图像的整个分割成神经细胞。
该协议描述了使用后掠场共聚焦显微镜或广角系统映像神经细胞的细胞分裂。正如前面所描述的，使用广角啶显微镜的主要限制之一是光毒性的潜力。虽然强烈建议使用旋转盘共聚焦或扫描共聚焦场成像C。线虫的胚胎，一些实验室可能有限访问这些系统。这个Protocol给出了一些建议使用广角系统，如关闭光圈至30％，从水银灯泡（或最好使用LED）降低光的强度，使用EMCCD相机，并增加收益或分级，允许时限制光毒性减少曝光时间。的Z-堆栈和时间点的数量也将采用宽视场系统的限制。虽然在这个协议中没有描述，该旋转盘共聚焦显微镜通常用于实时成像，因为它会导致低的光毒性相比，一个宽视场显微镜。类似风靡场系统，它使用固态激光器和光散射（尽管以不同的方式与后掠场）。无论是CCD或EMCCD相机可用于与旋转盘系统，该系统通常具有多个摄像机的端口，以允许双重成像。类似风靡场显微镜，图像可以被捕获曝光时间降低50-90％比的宽视场系统。
此协议传输醇可以被用来研究期间组织的形成，调节有丝分裂的各种基因的功能。每幅图像之间的时间可以缩短（ 比如 ，每隔15-30秒比 。2-3分钟），以更好地可视化有丝分裂的表型。不同的探针可用于（ 例如 ，而不是使用HAM-1：绿色荧光蛋白，荧光标记H2B可以用来使DNA可视化，和/或荧光标记的微管蛋白可用于可视化有丝分裂纺锤体）。的Z-堆栈，并为每个堆叠的厚度的数量也可以改变的（一个较小的步长大小的例如更栈）。如上所述，选择适当的设置是为了限制光毒性和优化图象质量的关键。即使的mCherry：PH和HAM-1：绿色荧光蛋白表达的探针在相对 较高的水平，收集更快的时间点，增加的Z-堆栈或成像的数目为较长的时间与什么在这个协议描述，可能无法在宽视场系统。
基于Java的IM年龄处理程序（ImageJ的，美国国立卫生研究院）可以用来处理由不同的显微镜和图像采集到的图像可以导出为TIFF格式。然而，取决于用于采集软件，该文件可能已经是与处理的软件兼容。这是更好地打开原始文件与导出的图像（ 如 TIFF格式），因为元数据保持与原始文件。处理软件可以用来操作图像用于使人物或电影。此外，定量分析也可以被执行，如测量像素强度中选择的区域。优化软件应该根据分析来选择，如图像处理工具箱（MathWorks公司的Matlab）或3D和4D实时交互式数据可视化（Imaris里，位平面）。
使用该协议，ANI-1被证明是所需的成神经细胞的胞质，即使它是不需要的胞质中的早期胚胎。有趣的是，通过控制NUMBER和成神经细胞的位置，ANI-1可调节腹侧表皮细胞为腹侧壳体的迁移，因为在神经母细胞提供化学或机械的线索来覆上皮细胞。然而，它不知道，如果ANI-1所需的期间中胚胎发育晚期的划分或其他细胞类型的形状变化。示出了组织的整体组成如何影响邻近组织强调组织通信的后生动物发育过程中的重要性。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
笔者想承认，这项工作是由加拿大自然科学和（NSERC）授予工程研究理事会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
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