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Neuroscience

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188

Summary

Ce protocole décrit comment l'image des cellules en division dans un tissu en Caenorhabditis elegans embryons. Bien que de nombreux protocoles décrivent comment la division cellulaire de l'image dans l'embryon précoce, ce protocole décrit comment l'image de la division cellulaire dans un tissu en développement au cours de l'embryogenèse tardive milieu.

Abstract

Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie de fluorescence à l'image à l'intérieur de la division des cellules en développement Caenorhabditis elegans embryons. En particulier, ce protocole met l'accent sur la façon de l'image divisant neuroblastes, qui se trouvent sous les cellules de l'épiderme et peuvent être importants pour la morphogenèse épidermique. formation de tissus est cruciale pour le développement de métazoaires et s'appuie sur des indices externes de tissus voisins. C. elegans est un excellent organisme modèle pour étudier la morphogenèse des tissus in vivo en raison de sa transparence et de l'organisation simple, faire ses tissus faciles à étudier par microscopie. Enceinte ventrale est le processus où la surface ventrale de l'embryon est recouvert d'une seule couche de cellules épithéliales. Cet événement est pensé pour être facilitée par les neuroblastes sous-jacents, qui fournissent orientation chimique indices de médiation migration des cellules épithéliales recouvrant. Toutefois, les neuroblastes sont très proliférante et peuvent également agircomme substrat mécanique pour les cellules épidermiques ventrales. Les études utilisant ce protocole expérimental pourraient découvrir l'importance de la communication intercellulaire pendant la formation du tissu, et pourraient être utilisées pour révéler les rôles des gènes impliqués dans la division cellulaire dans les tissus en développement.

Introduction

Bien qu'il existe des protocoles décrivant la manière de la division cellulaire de l'image au début C. elegans embryon, ce protocole décrit comment la division cellulaire de l'image dans un tissu à la mi embryogenèse. L'un des principaux défis dans les organismes d'imagerie au cours du développement a été leur sensibilité à la phototoxicité. Cependant, l'augmentation de l'accessibilité à la filature microscopes confocaux disque ou microscopes champ balayé a permis des applications d'imagerie les plus répandues. Les deux systèmes utilisent des lasers à l'état solide et la lumière diffusée, ce qui limite les niveaux de rayons UV que les organismes sont exposés. Toutefois, les peuplements Widefield peuvent encore être utilisés pour l'imagerie in vivo, en particulier s'ils sont équipés de caméras à haute sensibilité (par exemple EMCCD), le contrôle de l'ouverture et contrôle de la lumière (par exemple des LED ou des ampoules de mercure réglables). Ce protocole décrit comment utiliser soit un système confocal base ou un système à grand champ de la division cellulaire de l'image dans le développement C. elegans </ Em> embryons. A titre d'exemple, nous décrivons comment l'image de la division cellulaire des neuroblastes. Neuroblastes peuvent faciliter la morphogenèse épidermique en fournissant des signaux chimiques ou mécaniques pour les cellules de l'épiderme sus-jacentes, et de fournir un excellent exemple de l'importance de la communication intercellulaire dans la formation des tissus.

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle idéal pour les études fondées microscopie en raison de sa transparence et de l'organisation simple tissu 1. Par ailleurs, C. elegans se prête à des méthodes génétiques et RNAi, et puisque plusieurs de ses gènes ont des homologues humains, il peut être utilisé pour identifier les mécanismes conservées pour la formation de tissu 2-5. Dans C. elegans, la formation de l'épiderme survient pendant l'embryogenèse milieu, quand l'embryon a> 300 cellules. Morphogenèse épidermique se compose de plusieurs phases principales, au cours de laquelle l'embryon est enfermé dans une couche de cellules épidermiques qui compriment et s'étendent à transformer le embryo d'une forme ovoïde dans la forme allongée d'un ver 6. Décrit une enceinte ventrale de ces événements morphogénétiques, lorsque les cellules épidermiques ventrales migrent vers la ligne médiane ventrale à couvrir la surface ventrale de l'embryon (figure 1). Tout d'abord, deux paires de cellules de premier plan de bord antérieure située migrent vers la ligne médiane ventrale, où elles adhèrent et fusionnent avec leurs voisins controlatérales 6. Elle est suivie par la migration des cellules de poche postérieure situé, qui forment coin comme des formes en créant une poche ventrale 6-7. Le mécanisme qui ferme la poche n'est pas bien comprise. Une possibilité est que la structure de la myosine contractile actine supracellular lie les cellules de poche ensemble dans une chaîne de sac à main comme la mode, semblable à la cicatrisation des plaies 8. Fait intéressant, la migration d'une partie des cellules de la poche est médiée par des sous-ensembles spécifiques de sous-jacents 9 neuroblastes (précurseurs neuronaux qui se trouvent en dessous de la epidermis, figure 1B).

Des études antérieures ont montré que les neuroblastes régulent la migration ventrale des cellules épidermiques et de l'enceinte ventral. VAB-1 (récepteur Ephrin) et (ligand Ephrin) VAB-2 est fortement exprimé dans les neuroblastes et faciliter le tri des antérieur et neuroblastes postérieures les unes des autres, et mutations dans VAB-1 ou VAB-2 provoquent enceinte ventrale phénotypes 10-13. Cependant, les expériences de sauvetage de promoteurs ont montré que VAB-1 est également nécessaire dans les cellules épidermiques ventrales jacentes et des récepteurs pour d'autres signaux de guidage sécrétées par les neuroblastes sont exprimés dans les cellules de l'épiderme ventral 9. Bien que des mutations dans l'un de ces récepteurs provoquent phénotypes de l'enceinte ventrales, il n'est pas clair si les défauts se produisent en raison de problèmes de positionnement des neuroblastes ou en raison de l'échec des cellules épidermiques ventrales pour répondre aux signaux de guidage 14. Modification de la répartition des neuroblastes wiThoout affectant leur capacité à sécréter des signaux de guidage pourrait faire la lumière sur le rôle des neuroblastes et leur capacité à apporter une contribution mécanique au cours de la morphogenèse épidermique. Récemment, il a été constaté qu'un gène de la division cellulaire, ani-1 (anillin) est fortement exprimé dans les neuroblastes (figure 2A) et son appauvrissement provoque neuroblastes défauts de division. Fait intéressant, ces embryons présentent ventrales phénotypes de l'enceinte (Fotopoulos, Wernike et Piekny, observations non publiées).

Anillin est requis pour la division cellulaire, et en particulier pour la cytokinèse, qui décrit le processus par lequel une cellule mère sépare physiquement en deux cellules filles. Cytocinèse est entraîné par la formation d'un anneau contractile actomyosine, qui doit être étroitement contrôlée dans l'espace et le temps pour s'assurer qu'il est correctement couplée avec la sœur de chromatides ségrégation. Le régulateur principal de la cytokinèse métazoaires est RhoA (RHO-1 chez C. elegans), une petite GTPase qui est unctive dans sa forme liée au GTP. La FEM Ect2/ECT-2 RhoA active, après quoi interagit RhoA-GTP avec des effecteurs en aval, qui forment l'anneau contractile et la médiation de son l'admission 15. Anillin est une protéine de domaine qui se lie à plusieurs RhoA via son extrémité C-terminale et à l'actine et de la myosine par l'intermédiaire de son extrémité N-terminale. Anillin est nécessaire pour stabiliser la position de l'anneau contractile dans des cellules de mammifères ou de Drosophila S2 16. Anillin épuisement provoque des anneaux contractiles à des oscillations latérales, et la cytokinèse échoue finalement former des cellules multinucléées 17-19. Fait intéressant, bien que C. elegans ani-1 coordonne actomyosin contractilité dans l'embryon précoce, il n'est pas essentiel pour la cytokinèse. Cependant, comme décrit ci-dessus, ani-1 est requise pour la cytokinèse neuroblastes durant l'embryogenèse (mi-Fotopoulos, Wernike et Piekny, observations non publiées). l'échec de la cytokinèse modifierait le nombre et la position des neuroblastes et pourrait affecter la loction de signaux de guidage chimiques, ou il peut modifier les propriétés mécaniques du tissu. Les deux modèles mettent en évidence le rôle non autonome de neuroblastes pour enceinte ventrale, et l'importance de la communication tissus tissus au cours du développement embryonnaire.

Ce protocole expérimental décrit comment la division cellulaire de l'image pendant C. elegans mi embryogenèse en utilisant la microscopie de fluorescence. La majorité des expériences qui étudient les mécanismes de la division cellulaire ont été réalisées dans des cellules individuelles dans des boîtes de culture (par exemple. Des cellules HeLa ou S2) ou dans les embryons précoces avec un nombre limité de cellules (par exemple C. elegans embryon d'une cellule, Xenopus, ou échinoderme embryons). Cependant, il est également important d'étudier la division cellulaire dans les tissus, car il existe des indices externes qui peuvent influer sur la synchronisation et la mise en place du plan de division. En outre, les cellules peuvent fournir des indices chimiques ou mécaniques d'influencer le développement du tissu voisins, et il est important de comprendre comment la communication intercellulaire aide tissus pour former au cours du développement.

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Protocol

Une. Préparation des plaques pour le maintien des souches de vers et de la réalisation de RNAi

  1. Plaques nématode croissance médias
    1. Plaques
      1. Préparer le nématode croissance médias (NGM) plaques pour maintenir les souches de vers et de réaliser des croisements génétiques. Moissonneuse 3 g de NaCl, 17 g de gélose et de 2,5 g de bactopeptone avec 1 L d'eau distillée dans un flacon de 2 litres et ajoutez un barreau d'agitation de métal.
      2. Autoclave le ballon pour dissoudre l'agar-agar et de stériliser les médias. Ensuite, placer le ballon sur une plaque d'agitation et de permettre aux médias de se refroidir en remuant.
      3. Une fois le support refroidi et est encore un peu chaud au toucher (45-50 ° C), ajouter 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml de solution à 5 mg / ml de cholestérol et 25 ml 1 M tampon phosphate de potassium (PPB; recette dans le tableau de réactifs / matériel; filtre stériliser solutions mères) et verser immédiatement les médias en petites boîtes de Pétri (60 mm x 15 mm; remplir les plats ~ 3/4 vers le haut ou 13 ml / plaque USIng un distributeur automatique). Remarque: Pour le maintien à long terme de certains souches tetracycline peut être ajouté aux plaques (12,5 pg / ml) pour permettre transposon Tn10 inactivation du gène de la RNase III bactérienne.
      4. Que les médias se solidifient pendant une nuit à température ambiante. Remarque: Les plaques doivent être conservés dans une hotte biologique ou dans une zone du laboratoire qui est moins sujette à contamination. En outre, supprimer toute condensation qui s'est accumulée sur les couvercles (par exemple, nettoyer avec du papier de soie) pour limiter la contamination fongique. Si la tétracycline est également ajouté aux plaques, puis les couvrir de papier d'aluminium que cet antibiotique est sensible à la lumière.
      5. Le lendemain, ensemencer les plaques NGM secs avec une suspension de E. coli (souche OP50, voir la section 1.1.2) qui a été doucement au vortex. Pour fabriquer des plaques pour l'accouplement, ajouter ~ 50 pi de OP50 au centre de chaque assiette (pour former un petit cercle). Pour fabriquer des plaques pour maintenir les souches de vers, de semences chaque plaque NGM avec ~ 100-200 pi de OP50 (àveiller à ce qu'elle couvre une plus grande surface de la plaque).
      6. Laissez les plaques ensemencées O sec / N à la température ambiante.
      7. Le lendemain, tourner les plaques NGM séchées à l'envers et les empiler dans des contenants de rangement en plastique à 4 ° C. Remarque: Les plaques sont utilisables jusqu'à ~ 3-4 semaines. Les plaques contenant la tétracycline doivent être maintenus dans l'obscurité.
    2. Nourriture
      1. Utilisez E. coli OP50 [du Caenorhabditis Centre de Génétique (CCG; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] comme une source de nourriture pour C. . elegans Remarque: OP50 peut être stocké sous forme de solutions mères de glycerol à -80 ° C (rapport 1:1 dans 50% v / v de glycerol).
      2. Pour faire OP50 pour les plaques NGM, faire une plaque de série en utilisant une petite aliquote de la stock de glycérol (<10 pi; utiliser une pipette stérile). Répartir les bactéries sur une plaque de gélose LB (recette dans le tableau de réactifs / matériaux) et laissez-le à 37 ° C pendant environ 16 heures. Remarque: S'il ya des problèmes de contamination, la streptomycine OP50 résistant peut être utilisé, unnd streptomycine peuvent être ajoutés à des plaques de gélose LB (50 pg / ml).
      3. Le lendemain, choisir une seule colonie et inoculer 100 ml de milieu liquide LB (recette dans le tableau de réactifs / matériaux) dans un flacon de 500 ml.
      4. Que la culture croître O / N à 37 ° C avec agitation.
      5. Le lendemain, utilisez la suspension bactérienne pour l'ensemencement des plaques NGM. Remarque: OP50 peut être réparti en portions aliquotes dans 50 ml tubes coniques et stocké à 4 ° C pendant ~ 4-6 semaines.
  2. ARNi
    L'alimentation est l'un des principaux moyens pour effectuer l'interférence ARN médiée (ARNi; knockdown à un produit de gène spécifique) en C. elegans. C. hermaphrodites elegans peuvent être alimentés E. coli souche HT115 transformée avec un vecteur d'avance qui exprime l'ARN double brin lors de l'induction. Cet ARN double brin (ou ses fragments) sont transmises à la gonade, qui entraîne en général knockdown substantielle du gène cible spécifique.
    1. ARNi plaques
      1. Préparer des plaques NGM comme décrit ci-dessus (voir la section 1.1.1), mais aussi ajouter 1 ml de 1 M IPTG (isopropyl-beta-D-galactoside, pour induire l'expression de l'ARN double brin) et 500 ul de 50 mg / ml d'ampicilline (Amp; vecteurs exprimant l'ARN double brin sont Amp résistant) à la presse à chaud (45-50 ° C).
      2. Après que les plaques ont séché, les épépiner avec ~ 50-100 ul de E. coli HT115 (voir section 1.2.2). Remarque: les plaques non ensemencés peuvent être stockés à 4 ° C pendant ~ 4-5 semaines.
      3. Laissez les plaques ensemencées sécher toute la nuit à température ambiante.
      4. Le lendemain, tourner les plaques ARNi séchées à l'envers et les stocker dans un conteneur de stockage en plastique à 15-20 ° C. Note: les plaques ensemencées conservent l'efficacité de l'ARNi pour jusqu'à ~ 2-3 semaines.
    2. ARNi alimentaire
      1. Utilisez E. coli HT115 (de la CCG, voir la section 1.1.2) transformée avec le vecteur L4440 d'alimentation, ou L4440 contenant de l'ADNc à un gène d'intérêt. Remarque: L'alimentation de bibliothèques qui ciblent la plupart des cadres de lecture ouverts dans le génomeont déjà été faites et sont disponibles (clones L4440 transformés en HT115, par exemple contenant un fragment de Y49E10.19 pour ani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / pages / rnai.html). Remarque: HT115 peut être maintenu en stock de glycérol à -80 ° C (rapport 1:1 dans 50% v / v de glycérol).
      2. Pour générer une nouvelle construction ciblant un gène d'intérêt, voir la carte vectorielle L4440 et clone ADNc entre les promoteurs T7 accompagnement, qui sont inductible par l'IPTG.
      3. Transformer HT115 avec la construction d'L4440 utilisant un protocole standard pour la transformation (par exemple faire bactéries chimiquement compétentes et effectuer la transformation de choc thermique).
      4. Comme décrit pour OP50 (voir section 1.1.2), les bactéries à balayage du stock de glycérol sur une plaque de gélose LB, mais la plaque doivent également contenir 50 pg / ml d'ampicilline. Remarque: Si vous utilisez une construction pré L4440 existant, passez articles 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Choisissez une seule colonie et inoculer 5 mlde milieu LB contenant 5 ul d'ampicilline de 50 mg / stock ml (LB Amp), et placez-le à 37 ° C avec agitation.
      6. Après ~ 16 heures, inoculer 5 ml de milieu LB frais Amp avec 50 ul de la culture O / N et développer la culture de 7-8 heures avec agitation à 37 ° C.
      7. Centrifuger les bactéries pendant 1 min à 4,000-8,000 xg, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul de milieu LB frais Amp.
      8. Utilisez cette solution bactérienne pour ensemencer les plaques ARNi comme décrit ci-dessus (voir section 1.2.1). Remarque: HT115 doit être utilisé immédiatement et ne doit pas être stockée.

2. Culture de souches de vers

Maintenir C. souches elegans commandés de la CCG sur des plaques NGM selon le protocole standard 1. Souches utilisées pour ce protocole sont: C. elegans var Bristol, de type sauvage (souche ID au CCG N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [jambon-1 unc-119 (+)] (souche ID au CCG OP102); unc-119 (ed3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (souche ID au CCG OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (souche ID au CCG SU159); unc-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (souche ID au CCG FT250).

  1. Choisissez ~ 3 jeunes hermaphrodites adultes qui affichent le phénotype correct pour une plaque NGM frais. Note: N2 (var. Bristol; type sauvage) peut être maintenue entre 15-25 ° C, mais ils atteindra densité plus rapidement à des températures plus élevées. Nouvelles actions doivent être effectuées lorsque la densité de ver est élevé.
  2. Gardez toutes les souches fluorescentes (par exemple GFP et / ou les vers mCherry exprimant) à 20-25 ° C pour une expression optimale des protéines fluorescentes. Nouvelles actions doivent être effectuées lorsque la densité de ver est élevé et la nourriture est faible.
  3. Pour reprendre les vers, utiliser unchoisir fabriqué à partir d'une pipette de verre tiré avec un fil de platine fusionné à l'extrémité tirée (~ 3-5 cm de longueur). Aplatir le fil avec un bord lisse. Utilisez la pioche de scoop 'jusqu'à hermaphrodites et les transférer sur de nouvelles plaques. Flamber le fil entre chaque utilisation pour éviter la contamination croisée des souches.

3. ARNi

  1. Exécution d'ARNi
    1. Tout d'abord, lieu ~ 8 hermaphrodites L4 sur une plaque non ensemencée NGM pour ~ 30-60 min pour éliminer les bactéries OP50 des vers.
    2. Ensuite, placez les 8 hermaphrodites sur une plaque NGM Amp IPTG ensemencé avec HT115 qui porte le plasmide L4440 exprimant l'ARN double brin à un gène d'intérêt (par exemple, de l'anus-1;. Voir 1.2) pour ~ 24 h. Remarque: Selon le gène d'intérêt, ou les phénotypes souhaités (qui peut dépendre de la force du knockdown), les vers peuvent être laissés sur les plaques d'ARNi pour des périodes plus ou moins longues (après 24 h, placer les hermaphrodites sur ARNi frais plaques).
    3. Pour un negcontrôle ative, place des vers sur une plaque ARNi ensemencées avec HT115 portant le L4440 vecteur vide. Remarque: Ces embryons ne devraient pas avoir phénotypes.
    4. Pour un contrôle positif, placer vers sur une plaque ARNi exprimant l'ARN double brin qui cible un gène à des phénotypes bien caractérisés. Remarque: Pour rho-1 (Y51H4A.3), les embryons sont 100% mortelle après 24 h et les hermaphrodites sont stériles après 48 heures.
  2. ARNi efficacité
    Les niveaux de knockdown par ARNi doivent être testés, en particulier depuis certains tissus peuvent être plus résistantes que d'autres. Au cours de l'embryogenèse précoce milieu, la plupart des tissus sont sensibles à l'ARNi, mais à la fin de l'embryon ou de larve, les neurones sont des RNAi-résistant. Différentes souches peuvent être utilisées pour améliorer la sensibilité de l'ARNi (par exemple, far-3), ou pour produire de l'ARNi spécifique à un tissu (par exemple sid-1 en combinaison avec un transgène exprimé par le promoteur neuronal unc-119).
    1. Western Blot
      Immunoblot en utilisant C. elegans protéines peuvent êtreeffectuée selon le protocole standard 22.
      1. Après avoir effectué l'ARNi, collecter ~ 10 gravide (rempli d'embryons) hermaphrodites dans un tube à centrifuger, ajouter 20-30 ul 1x tampon d'échantillon SDS-PAGE et lyse par ébullition pendant ~ 2 min. De même, ramasser les vers N2 dans un tube séparé de l'échantillon de contrôle. Note: Le nombre de hermaphrodites variable en fonction de la sensibilité des anticorps primaires.
      2. Créer des dilutions de l'échantillon de contrôle (par exemple de 3 à 100%) dans du tampon d'échantillon. Chargez le contrôle et les échantillons de RNAi et géré par SDS-PAGE selon le protocole standard (le% de gel varie en fonction de la taille de la protéine d'intérêt).
      3. Transférer le gel à une membrane et effectuer immuno selon le protocole standard. Remarque: Utilisez différentes dilutions d'anticorps primaires et secondaires comme l'a recommandé pour chaque anticorps.
      4. Développer (par exemple si vous utilisez chimiluminescence) ou scanner (par exemple si vous utilisez fluorescence) l'immunoblot et comparer èmedensité de e de bandes dans les voies N2 vs la voie ARNi, et déterminer le niveau d'effet de choc (par exemple, la densité de la voie de l'ARNi correspondant à la voie de contrôle de 12%, ce qui suggère que la protéine est réduite de 88%). Remarque: Pour voir l'efficacité de l'ANI-1 knockdown, voir Maddox et al 23.
    2. Immunocoloration
      Immunocoloration en C. elegans peuvent être effectuées selon le protocole standard 22.
      1. Après avoir effectué l'ARNi, recueillir des hermaphrodites gravides et les embryons de récolte à l'aide de l'une des deux méthodes. Pour l'une des méthodes, place des hermaphrodites dans un tampon M9 (recette dans le tableau de réactifs / matériaux) dans 1,5 ml siliconées microtubes et culot par centrifugation (1,000-4,000 xg). Remarque: même collecter N2 hermaphrodites gravides.
      2. Retirer la solution M9.
      3. Expulser les embryons en ajoutant 1 ml de solution de blanchiment (NaOH 1 M, 5% de l'eau de Javel) dans le tube à centrifuger pendant 3 min. De même, l'eau de Javel N2 ilrmaphrodites à faire des diapositives de contrôle.
      4. Vortex doucement, puis culot immédiatement les embryons par centrifugation (4,000-8,000 xg) et retirer la solution de blanchiment. Remarque: Le temps total que les vers sont incubées avec l'eau de Javel ne doit pas dépasser 5 minutes.
      5. Lavez les embryons 3x avec du Tris Buffered Saline (SCT; 50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM) et d'embryons de transfert à l'aide d'une pipette Pasteur en verre sur un L-lysine poly lame de microscope. Remarque: Pour revêtir une lame de microscope en verre avec de la poly-L-lysine, essuyez d'abord la diapositive, puis ajouter une goutte (~ 20-30 pi) de poly-L-lysine et l'étaler uniformément sur toute la surface et laisser sécher. Pour des résultats optimaux, enduire les lames deux fois plus. Une autre méthode pour recueillir des embryons (Sections 3.2.2.1-3.2.2.5) consiste à placer une goutte de M9 sur un L-lysine poly lame de microscope et prendre ~ 10 hermaphrodites gravides dans la goutte.
      6. Ajouter une lamelle sur le dessus de chaque lame de microscope (à la zone qui contient la plupart des embryons) et le lieules lames dans de l'azote liquide. Remarque: Pour hermaphrodites placés directement dans la chute, mettre la pression sur la lamelle à casser les hermaphrodites et expulser les embryons.
      7. Congelez-fendre les embryons par effleurant les lamelles immédiatement après leur congélation dans l'azote liquide.
      8. Placer les lames dans la glace méthanol froid pendant 20 min pour fixer les embryons. Remarque: Pour certains antigènes, un fixateur comme le paraformaldéhyde réticulation peut être préférable. Voir le protocole de Duerr 22.
      9. Réhydrater et perméabiliser les embryons par lavage des lames 4x avec du Tris Buffered Saline contenant du Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween-20) pendant 10 minutes chacun.
      10. Sécher chaque diapositive autour de la zone qui contient la plupart des embryons et dessiner un cercle autour des embryons en utilisant un stylo de blocage de liquide (par exemple PAP stylo).
      11. Ajouter ~ 100 ul de TBST avec 5% de sérum d'âne normal (NDS; bloc) à chaque diapositive (zone cerclée) et incuber20 min à température ambiante. Remarque: Placez les diapositives dans une «chambre humide» (par exemple, un plat avec un couvercle contenant des serviettes en papier humide).
      12. Supprimer le blocage, ajouter ~ 50-100 ul d'anticorps primaire (dilué dans du TBST) à chaque coulisseau (zone cerclée) et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Remarque: En fonction de l'anticorps, le temps d'incubation et la dilution variable. Pour détecter la GFP, on utilise un anticorps primaire anti-GFP anti-souris à une dilution de 1/200. Pour détecter ANI-1, nous utilisons un anti-ANI-1 anticorps primaire anti-lapin dans une dilution au 1/1600 (aimablement fourni par Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Pour de plus longues durées d'incubation, placer les lames à 4 ° C.
      13. Éliminer les anticorps primaires (si possible, conserver pour une utilisation future) et laver les lames 3x avec le SCT pour 5 min chacun.
      14. Retirer le dernier lavage et ajouter de 50 à 100 pl ~ des anticorps secondaires (dilué dans du TBST) à chaque coulisseau (zone cerclée) et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Remarque: Selon l'anticorps, la dilution peut varier. Pour détecter la GFP, nous utilisons un unnti-souris Alexa Fluor 488 anticorps secondaire à une dilution de 1/250. Pour détecter ANI-1, on utilise un Alexa Fluor 568 anticorps secondaire anti-lapin à une dilution au 1/250.
      15. Suppression des anticorps secondaires et laver les lames 3x avec le SCT pour 5 min chacun. Remarque: Pour colorer l'ADN, ajouter ~ 50-100 ul de DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole; 1 mg / ml) à 1/500 dans du TBST dilution pendant 5 min.
      16. Retirer DAPI et laver les lames 2x avec le SCT pour 5 min chacun. Remarque: Si la coloration DAPI n'est pas effectuée, ignorez cette étape de lavage supplémentaire.
      17. Effectuer un lavage rapide avec 0,1 M Tris (pH 9), supprimer et ajouter environ 15 pi de milieu de montage préchauffé à 37 ° C (4% de n-propyle 3.4.5-trihydroxybenzoate (gallate de propyle), Tris 50 mM, pH 9 50% de glycérol) à chaque diapositive (zone cerclée).
      18. Ajouter une lamelle de chaque diapositive (au-dessus du support de montage dans la zone encerclée), évacuer l'excès de liquide et sceller les diapositives avec du vernis à ongles. Remarque: Les diapositives peuvent être stockés à -20 ° C.
      19. Respecter les embryons surles lames en utilisant un microscope à fluorescence à grand champ ou de microscope à balayage laser confocal. Surtout, ajuster les paramètres pour recueillir des images d'intensité de pixel optimale en utilisant le contrôle (N2 ou non ARNi) embryons. Ensuite, recueillir des images à partir d'embryons ARNi utilisant les mêmes paramètres. Exemples d'images recueillies pour le contrôle vs ani-1 embryons d'ARNi sont présentés dans la figure 2B.

4. Préparation des lames pour l'imagerie en direct et récolte des embryons

  1. Préparation des plaquettes d'agarose pour l'imagerie en direct
    1. Placez une lame propre pré réchauffé de microscope entre deux autres diapositives, chacune avec 1-2 bandes de ruban adhésif sur eux.
    2. En utilisant une pipette Pasteur en verre, ajouter une goutte de 2% en poids / volume d'agarose (en solution dans l'eau distillée chauffée) de la glissière.
    3. Placer rapidement d'une seconde, lame de microscope propre au-dessus de la première diapositive d'une manière perpendiculaire à aplatir la goutte d'agarose. Remarque: La bande sur le voisin a glissées fournit l'épaisseur de la garniture.
    4. Laissez le agarose sec pad pour un 1-2 min avant de retirer la lame supérieure. Faites glisser le chariot supérieur attentivement pour éviter de casser le tampon d'agarose dessous. Remarque: Parfois, le tampon est transféré à la glissière en haut et est encore utilisable, tant qu'il reste intact.
    5. Transférer les embryons sur le bloc d'agarose en quelques minutes après sa préparation comme décrit ci-dessous (voir l'étape 4.2). Remarque: Le tampon doit avoir un aspect opaque, une fois il est clair, il est trop sec à utiliser.
  2. embryons de récolte
    1. Utiliser le protocole suivant pour la collecte d'embryons pour l'imagerie en temps réel, qui est dérivé de Sulston et al. 24
    2. Choisissez environ 4-6 adultes gravides (pas affamés) à partir de plaques NGM ou ARNi et les placer dans 20-30 pi de tampon M9 dans un puits sur une lame de dépression.
    3. Utiliser un scalpel stérilisé pour couper les vers de chaque côté de la spermathèque (ou encore près de la vulve) àlibérer les embryons dans la solution.
    4. Utiliser un tuyau en caoutchouc avec un embout buccal relié à un capillaire de verre / pipette tiré d'avoir un petit trou et aspirer les embryons par pipetage à la bouche. En variante, recueillir des embryons avec un tube de verre capillaire qui est attaché à une poire en caoutchouc de pipette Pasteur.
    5. Transférer les embryons aspirées à un second puits contenant également tampon M9, pour les aider à séparer des débris de ver.
    6. Ensuite, aspiration des embryons sur un bloc d'agarose fraîchement préparé (voir étape 4.1).
    7. embryons de s'agglutiner en utilisant un cil (collé à une sélection de dent) d'augmenter le nombre d'embryons qui peuvent être filmées dans un plan x, y. Remarque: Pour éviter la privation d'oxygène, ne pas s'agglutiner plus de 10 embryons ensemble.
    8. Ensuite, recouvrir la lame avec une lamelle couvre-objet et sceller partiellement avec pré valap de liquide chauffé (la vaseline, de la lanoline et de la paraffine; fondu et combiné 01:01:01) pour éviter la déshydratation des embryons au cours de l'imagerie. Remarque: supplémentaires M9 tampon can être ajouté au tampon pour faire en sorte que les embryons ont suffisamment de liquide pour l'imagerie. Au lieu de valap, la gelée de pétrole peut être utilisé pour sceller partiellement lamelles, mais il est moins rigide provoquant les lamelles de glisser et pourrait obtenir sur les objectifs de microscope.

5. Imagerie en direct

  1. Pour visualiser les neuroblastes, obtenir une souche de ver qui exprime une protéine spécifique neuroblastes attaché à une protéine fluorescente (par exemple HAM-1: GFP, souche ID au CCG OP102). Pour détecter les membranes cellulaires, utiliser une souche de ver qui exprime aussi un domaine protéique qui reconnaît lipides attachés à une protéine fluorescente différente (par exemple mCherry:. PH, souche ID au CCG OD70).
  2. embryons de récolte de hermaphrodites fluorescentes conservés sur le contrôle ou ani-1 plaques d'ARNi (voir Protocoles 3 et 4), et de préparer les lames comme décrit ci-dessus (voir le protocole no 4).
  3. embryons de l'image en 4D (x, y, z et time-lapse) par microscopie à épifluorescence. Utilisez un wisystème defield [microscope à fluorescence automatisé avec des filtres pour la GFP et TexasRed, objectifs jusqu'à 60X ou 100X, un CCD haute résolution (dispositif à couplage de charge) appareil photo, très platine motorisée (par exemple. Piezo Z) et le logiciel d'acquisition spécialisé] ou un livescan balayé champ microscope confocal [automatisé fluorescent microscope à balayage à 488 nm et 561 nm lasers, les objectifs à 100X, un EMCCD (électrons CCD multipliant) appareil photo, très platine motorisée (par exemple piézo Z) et le logiciel d'acquisition spécialisée]. Remarque: Pour le système à grand champ, utilisant des LED et une caméra EMCCD limitera phototoxicité. En outre, un microscope confocal à disque rotatif peut être utilisé à la place du système de champ balayé.
  4. Pour la division cellulaire image neuroblastes de chaque système, trouver x, cadres y d'embryons en utilisant les 10X ou 20X objectifs, et choisir une optimales x, y cadre où les embryons sont en cours dorsale intercalation (étape préalable à l'enceinte ventrale; figure 1A) ou sont à un stade précocede l'enceinte ventrale (~ 350 min après la première division cellulaire; figure 1A).
  5. Sur le microscope de champ balayé, utilisez le 488 nm et 561 nm lasers 100 mW à 40% de la puissance d'une fente de 50. Sur le système de grand champ, utiliser les filtres GFP et TexasRed avec une intensité de lumière faible à moyenne (si commandé). Remarque: Pour le système à grand champ, les LED ont une faible phototoxicité et sont préférables.
  6. Sur l'autre système, utiliser les objectifs à immersion d'huile 60X ou 100X et collecter 20 Z-piles de 0,2 um toutes les 2 minutes pour un total de 10 min. Remarque: Bien que la HAM-1: GFP et mCherry: sondes PH expriment à des niveaux relativement élevés, les temps d'exposition pour chaque sonde devront être optimisés pour différents microscopes. Remarque: Pour le système de champ large, moins de Z-piles est recommandé de limiter la phototoxicité et de l'imagerie sur des périodes de temps plus longues, utilisent moins de points dans le temps.
  7. Pour minimiser la phototoxicité causée par l'exposition des embryons à la lumière UV sur le système à grand champ (si vous utilisez un mercenaireampoule ury), fermer l'ouverture à 30% et de diminuer l'intensité lumineuse (en utilisant un système d'éclairage réglable). Remarque: Bien que le gain n'est pas nécessaire en utilisant soit le système, d'autres microscopes peuvent avoir des sources de lumière avec des intensités plus faibles ou des objectifs avec des ouvertures numériques différentes, ce qui pourrait nécessiter l'utilisation d'un gain pour obtenir des images d'intensité de pixel optimale. Testez les conditions en utilisant un embryon de contrôle pour s'assurer que les phénotypes observés ne sont pas dus à un artefact phototoxicité.

6. Analyse des données de microscopie

  1. Pour analyser les images, les fichiers d'exportation que TIFF et ouvrir les fichiers TIFF comme une pile en utilisant un logiciel spécialisé comme un programme de traitement d'image basé sur Java (par exemple ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Remarque: Selon le logiciel d'acquisition utilisé pour recueillir les images, les fichiers peuvent être conservés dans leur forme originale et ouverts dans ImageJ. Ceci est préférable que les métadonnées sont conservées avec les fichiers.
  2. Séparer la pileen «images» et choisir les points de temps et Z-plans comme vous le souhaitez. Remarque: Même si une pile de 20 Z-avions est prise, la plupart des neuroblastes sont <1 um d'épaisseur en moyenne embryogenèse tardive et seulement quelques Z-plans sont nécessaires.
  3. Réempilez les plans de Z sélectionnés pour chaque point de temps et de faire des projections Z-stack distincts. Ensuite, pile des projections pour chaque point de temps ensemble pour faire une séquence de temps.
  4. Faire des ajustements à la luminosité / contraste et ou pour chaque canal.
  5. Ensuite, sélectionnez une région d'intérêt, la culture (et tourner si nécessaire) de la région.
  6. Créez des images fusionnées en utilisant la fonction 'chaînes fusionnées de et choisir une couleur différente pour chaque canal. Autre images fusionnées en RVB.
  7. Inversez les images en niveaux de gris pour chaque canal à partir des étapes 6.3 ou 6.4 (utiliser la fonction 'inverti' sous 'edit') pour visualiser des images plus clairement.
  8. Enregistrer toutes les images finales que TIFF 8 bits pour faire des figures dans le vecteur basé softwsont des programmes ou que des fichiers Quicktime pour faire des films.
  9. Si les mesures de la taille de pixel sont nécessaires (par exemple pour inclure une barre d'échelle avec les images), utiliser ImageJ, ou un autre logiciel de traitement d'image pour mesurer la taille de l'embryon. Remarque: Les images recueillies à l'aide des objectifs différents auront différentes tailles de pixels.

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Representative Results

Ce protocole expérimental décrit la façon de la division cellulaire de l'image en C. elegans embryons en moyenne embryogenèse. En particulier, il décrit comment les neuroblastes de l'image, ce qui peut faciliter la morphogenèse épidermique. Épidermique morphogenèse est due à une combinaison de changements de forme des cellules épidermiques, la migration et l'adhérence, mais aussi s'appuie sur des indices chimiques ou mécaniques des neuroblastes sous-jacents (figure 1B). Les neuroblastes sécrètent des signaux de guidage qui sont reçus par des récepteurs à la surface des cellules épidermiques ventrales, qui régule leur 10,14,25 de migration. En outre, les neuroblastes sont hautement proliférative, qui peut fournir des forces mécaniques qui contribuent à la migration des cellules épidermiques ventrales 26. Ce protocole peut être utilisé pour étudier la division des cellules au cours de la mi neuroblastes embryogenèse. Tout d'abord, les embryons co-exprimant les marqueurs de visualiser neuroblastes (HAM-1: GFP) subissant la cytocinèse (mCherry: PH) sont générés. HAM-1: GFP exprime la GFP (green fluorescent protein) étiqueté protéine qui se localise dans neuroblastes noyaux 27, et est nécessaire pour utiliser car il ya beaucoup d'autres types de cellules présentes en moyenne embryogenèse (> 300 cellules; figure 3). Cela agit également comme un bon marqueur pour les cellules en division, étant donné que l'ADN se condense dans des chromosomes lors de la mitose. mCherry: PH est une protéine fluorescente mCherry-marqué qui est exprimé par un promoteur de la mère (pie-1), et contient le domaine de liaison des lipides de PLC1 ∂ 1 28, qui se localise aux membranes cellulaires. Cette protéine est nécessaire pour visualiser la cytokinèse, lorsque la membrane et le cytosol pincent pour séparer la cellule mère en deux cellules filles; la figure 3; vidéo 1). Bien que ce protocole décrit comment des neuroblastes division d'image, (représentée par HAM-1: expression GFP), d'autres marqueurs peuvent être utilisés pour visualiser d'autres types de cellules.

Pour visualiser la division des neuroblastes, les embryons coexpression HAM-1: GFP et mCherry: PH sont imagée à toutes les 2 min (pour un total de 10 min). Chaque neuroblastes n'est ~ 1-4 m de diamètre, et est <1 um d'épaisseur, et il est préférable d'utiliser un objectif à fort grossissement (par exemple. 100X). En outre, de nombreuses Z-piles (~ 20) sont recueillies avec une petite taille de l'étape (0,2 um) à veiller à ce que les différents angles de chaque cellule (forme sphérique) sont imagés. Pour recueillir ces nombreuses images sans compromettre points dans le temps, une étape très motorisés (par exemple piézo Z scène) est recommandé. Après avoir recueilli une série d'images, elles sont analysées pour trouver des cellules en quelques Z-piles qui se divisent, l'ADN est condensé, la membrane est infiltrée et les nouvelles cellules filles se forment (points de temps de la pile projeté de canaux fusionnés sont présentés sur la figure 3A, et des piles sélectionnées de canaux fusionnés sont présentés sur la figure 3B; vidéo 1). Pour mieux visualiser les cellules, il est recommandé d'garder chaque canal en niveaux de gris et inverser les images (par exemple, la figure 4).

La résolution de l'image est différente pour le système de grand champ à l'aide d'une caméra CCD haute résolution (1344 x 1024 pixels) vs. le système de champ balayé en utilisant une caméra EMCCD à grande vitesse avec une grande sensibilité (~ 35 images / sec et 512 x 512 pixels). Images inversées de diviser neuroblastes à partir d'embryons de contrôle prises avec les deux systèmes sont présentés à titre de comparaison (figure 4 vs. 5). Comme le montre la figure 4A (système à champ large; Vidéo 2), les images sont plus claires vs figure 5A. (Système de champ balayé; vidéo 4). Cependant, lors de l'utilisation du système de champ large, les embryons sont sensibles à la phototoxicité et points de temps plus rapide ne sont pas possibles avec la caméra à haute résolution. Par exemple, pour examiner les changements dans la localisation de différentes protéines (p. ex. To étudier les changements dans la dynamique), des points de temps peuvent être collectées le plus souvent. En outre, il peut ne pas être possible de l'image pendant des périodes de temps plus longues, sans réduire le nombre de piles et Z-points dans le temps. L'utilisation d'une caméra EMCCD sur le système de champ large peut autoriser une plus large gamme d'applications d'imagerie. Les caméras qui ont à la fois une haute résolution et haute vitesse ont été développés, mais les pilotes ne soient pas disponibles en fonction du logiciel d'acquisition utilisé, et ils peuvent toujours pas être aussi sensibles que les caméras EMCCD. Un autre système qui est couramment utilisé pour l'imagerie C. elegans est le disque confocale de filage, qui a également phototoxicité inférieure et peut être équipé soit EMCCD ou caméras CCD (voir Discussion).

Pour étudier les gènes qui sont nécessaires à la division cellulaire, les hermaphrodites sont traités avec l'ARNi contre un gène d'intérêt (par exemple, ani-1, voir sections 1.2 et 3 du protocole) et de leurs embryons sont imagés de la même manière que control embryons. Pour comparer les cellules à partir d'embryons de RNAi pour contrôler les embryons, il est préférable d'image au même stade de développement embryonnaire (pour aider les formes et les positions de cellules d'allumette). Par exemple, il ya une plus grande cellule visible au centre de l'embryon au cours de clôture ventrale qui peut agir comme un bon point pour les neuroblastes d'imagerie de référence (figures 4 et 5). Le gène étudié ici, ani-1 (anillin), organise actomyosin contractilité, mais n'est pas nécessaire pour la cytokinèse dans l'embryon précoce 23,29-30. Des homologues de Anillin, cependant, sont nécessaires à la cytocinèse chez les eucaryotes supérieurs 16, et ani-1 est nécessaire pour neuroblastes cytokinèse (Fotopoulos, Wernike et Piekny, observations non publiées). Comme le montrent les figures 4B (vidéo 3) et 5B (vidéo 5), plusieurs neuroblastes lancer cytokinèse et leurs membranes pincer dans, mais au lieu de former deux fille séparéecellules, leurs membranes régressent et les cellules deviennent multinucléées (> 1 noyau / cellule). Il faut noter que ani-1 peut être nécessaire pour la division ou de la forme de changement d'autres types de cellules, qui ne sont pas révélées par ce protocole. En outre, ce protocole ne montre pas les résultats de l'ARNi spécifique du tissu (voir Discussion).

Figure 1
Figure 1. Enceinte ventrale pendant C. elegans épidermique morphogenèse. A) les projections Z-stack (3 Z-piles de 0,5 um d'épaisseur) d'un contrôle AJM-1: GFP (jonctions adhérentes marqueur pour visualiser les limites des cellules épidermiques; souche ID au CCG SU159) embryon subir dorsale intercalation (à gauche, vue dorsale ) et un AJM-1 contrôle: embryon GFP subir enceinte ventrale (à droite, vue ventrale). Les images sont inversées pour mieux visualize limites de la cellule. B) Bandes montrent des vues ventrales de C. embryons elegans subissant enceinte ventrale. Tout d'abord, deux paires de grandes cellules de bord (en bleu) utilisent actine riche filopodes (lignes noires) à migrer vers la ligne médiane ventrale (embryon sur la gauche). Ensuite, les cellules de poche ventrale postérieure (rouge) migrent vers la ligne médiane créant un trou sur la face ventrale pouvant fermer par une chaîne de sac à main comme mécanisme (B '; noir pointillé ligne / cercle; rappelle la cicatrisation des plaies) 25. On trouvera également les neuroblastes sous-jacent (cercles gris). La deuxième embryon (B ") montre comment la migration des sous-ensembles spécifiques de cellules épidermiques sont médiés par un« pont »formé à partir du réarrangement des cellules PLX-2/plexin et VAB-1/Ephrin exprimant le récepteur« bande de plexin »(verts cercles). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. ANI-1 localisation en C. elegans embryons. A) C. fixe elegans embryon exprimant HMR-1: GFP (E-cadhérine, marqueur de limites des cellules de l'épiderme) costained pour la GFP (vert) et ANI-1 (rouge). Les images confocales des couches cellulaires externes (4 Z-piles de 0,2 um d'épaisseur) montrent les cellules de l'épiderme sus-jacentes et les neuroblastes sous-jacents, qui sont ANI-1 positif B) fixe N2 et N2;. Ani-1 embryons ARNi sont co colorées pour ANI-1. ANI-1 est fortement réduite dans l'embryon d'ani-1-appauvri. Barres d'échelle: 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.


Figure 3. Visualisation divisant neuroblastes pendant C. embryogenèse elegans. (A) les projections Z-stack (20 Z-piles de 0,2 um d'épaisseur) sont présentés à partir d'un embryon de contrôle coexprimant HAM-1: GFP (pour visualiser les noyaux de neuroblastes, vert) et mCherry: PH (pour visualiser les membranes cellulaires, rouge) . Beaucoup de neuroblastes et d'autres types de cellules sont visibles dans les projections (B) des projections Z-stack l'aide d'un petit nombre d'avions de Z sont présentés à partir d'un autre embryon de contrôle coexprimant HAM-1:. GFP (vert) et mCherry: PH (rouge). Une zone est agrandie (boîte blanche) pour montrer plus clairement un neuroblastes de séparation individuelle. Blanc têtes de flèches indiquent la membrane plasmique ingressing d'une cellule en division et les cercles verts mettre en évidence l'ADN condensé pendant la mitose et nouvellementformant noyaux fils vers la fin de la mitose. La grande cellule sert de point de référence (astérisque blanc) pour déterminer le stade de développement et la localisation dans l'embryon. Barres d'échelle: 10 um. (blanc) et 3,5 um (jaune) Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4
Figure 4. Visualisation neuroblastes cytokinèse pendant C. elegans embryogenèse utilisant un système de champ large. Projections Z de la pile A) inversés (2 Z-piles de 0,2 um d'épaisseur) sont présentés à partir d'un embryon de contrôle coexprimant HAM-1: GFP et mCherry: PH recueillies par le système de grand champ à l'aide d'une caméra CCD à haute résolution. Flèches rouges indiquent les neuroblastes division avec ingressing membranes cellulaires. Les cercles verts soulignent ADN condensé au cours des premières phases de la mitose ou nouvellement formant noyaux filles vers la fin de la mitose / cytokinèse. La grande cellule sert de point de référence (astérisque jaune) pour déterminer le stade de développement. B) Les images présentées sont semblables à A), mais sont d'un embryon traité avec ani-1 ARNi. Les migre de la membrane cellulaire en tant que la cellule passe à travers la mitose, mais se détend peu de temps après, ce qui laisse une cellule multinucléées. Barre d'échelle: 10. Pm (noir), 3,5 um (jaune) Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 5
Figure 5. Visualisation neuroblastes cytokinèse pendant C. elegans embryogenèse utilisant un système de champ balayé. A) inversés projections Z-stack des deux Z-piles de 0,2 um (total de 0,4 um) sont présentés à partir d'un embryon coexprimant HAM-1: GFP et mCherry: PH recueillies par le système de champ balayé aide d'une caméra EMCCD avec une grande sensibilité, mais résolution inférieure. La flèche pointe rouge à une cytokinèse neuroblastes subissant. Les cercles verts soulignent ADN condensé pendant la mitose et la fille noyaux nouvellement formé après la cytokinèse. La grande cellule sert de point de référence (astérisque jaune) pour déterminer le stade de développement. B) Les images présentées sont semblables à A), mais sont d'un embryon traité avec ani-1 ARNi, et 3 Z-piles sont utilisées (total de 0,6 um ). Comme décrit ci-dessus, les migre de la membrane en tant que produit de cellules par mitose, mais détend provoquant la cellule à devenir multinucléé. Barre d'échelle: 10 pm (noir), 3,5 um (jaune).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Vidéo 1. Visualisation neuroblastes division pendant C. embryogenèse elegans. Projections Z-stack des deux plans Z (0,4 um / avion) ​​à partir d'un embryon de contrôle co-exprimant HAM-1: GFP (vert) et mCherry: PH (rouge). Images recueillies du microscope à grand champ sont présentés pour les deux canaux. La vidéo correspond à l'embryon le montre la troisième partie de la figure 3B. Cliquez ici pour regarder la vidéo.

Vidéo 2. Visualisation neuroblastes division pendant C. embryogenèse elegans. Projections Z-stack des deux plans Z (0,4 um / avion) ​​à partir d'un embryon de contrôle co-exprimant HAM-1: GFP (vert) et mCherry: PH (rouge). La vidéo correspond à des images inversées recueillies du microscope à grand champ pour le mCherry: canal de PH ONLy (embryon de la figure 4A). Cliquez ici pour regarder la vidéo.

Vidéo 3. Visualisation neuroblastes division pendant C. embryogenèse elegans. Projections Z-stack des deux plans Z (0,4 um / avion) ​​à partir d'un embryon traité ani-1 ARNi coexprimant HAM-1: GFP (vert) et mCherry: PH (rouge). La vidéo correspond à des images inversées recueillies du microscope à grand champ pour le mCherry:. Chaîne de PH seulement (embryon de la figure 4B) Cliquez ici pour regarder la vidéo.

Vidéo 4. Visualisation divisant neuroblastes pendant C. embryogenèse elegans. Projections Z-stack des deux plans Z (0,4 um / avion) ​​à partir d'un embryon de contrôle co-exprimant HAM-1: GFP (vert) et mCherry: PH (rouge). La vidéo correspond à inversered images recueillies sur le terrain balayé microscope confocal pour la mCherry:. chaîne de PH seulement (embryon de la figure 5A) Cliquez ici pour regarder la vidéo.

Vidéo 5. Visualisation divisant neuroblastes pendant C. embryogenèse elegans. Projections Z-stack de trois plans Z (0,4 um / avion) ​​à partir d'un embryon traité ani-1 ARNi coexprimant HAM-1: GFP (vert) et mCherry: PH (rouge). La vidéo correspond à des images inversées recueillies sur le terrain microscope confocal balayé pour la mCherry:. Chaîne de PH seulement (embryon de la figure 5B) Cliquez ici pour regarder la vidéo.

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Discussion

Ce protocole décrit l'utilisation de divers types de microscopie à des divisions cellulaires de l'image au cours de l'embryogenèse milieu. En particulier, ce protocole met en évidence comment l'image de la division des neuroblastes, des cellules qui peuvent faciliter la morphogenèse épidermique. La communication cellulaire est important pour la formation des tissus au cours du développement de métazoaires et C. elegans est un excellent modèle pour étudier la formation du tissu in vivo. Un événement qui dépeint bien l'interaction des tissus est épidermique morphogenèse, qui couvre l'embryon dans une couche de cellules épithéliales. En particulier, l'enceinte ventral est le processus par lequel les cellules de l'épiderme ventral migrent pour enfermer la surface ventrale de l'embryon, et s'appuie sur les neuroblastes sous-jacents. Les neuroblastes fournissent des signaux chimiques ou mécaniques, et enceinte ventrale est compromise si la position de neuroblastes est modifiée. Le nombre (ou polarité) de neuroblastes peuvent aussi être essentiel pour enceinte ventrale se produise correctement,et il est important de comprendre les mécanismes qui régissent leur division. Ce protocole décrit la façon de la division cellulaire de l'image de l'intérieur d'un tissu vivant en utilisant C. elegans embryons co-exprimant deux sondes fluorescentes (mCherry: PH afin de décrire les membranes plasmiques et HAM-1: GFP pour marquer les noyaux neuroblastes).
Les étapes les plus essentielles à l'image vivant C. elegans embryons exprimant sondes fluorescentes sont: i) utiliser en bonne santé, les jeunes hermaphrodites adultes exprimant les marqueurs fluorescents souhaités (maintenu à 20-25 ° C), ii) utiliser des mutants ou ARNi pour étudier les besoins de gènes lors de la formation de tissu, iii) la collecte des embryons à la stade droite pour la microscopie (p. ex. milieu de l'embryogenèse), et iv) effectuer la microscopie à fluorescence avec les paramètres optimisés pour garder phototoxicité bas, mais à maintenir une haute qualité d'image.

Pour identifier les cellules spécifiques et / ou des compartiments intracellulaires au sein d'un tissu d'intérêt, utilisez vers exprimant des marqueurs marqués avec pro fluorescentbes. Le Centre de Génétique Caenorhabditis (CCG; http://www.cbs.umn.edu/cgc) offre une variété de souches coexprimer plusieurs marqueurs. Cependant, deux souches (exprimant chacun un seul marqueur d'intérêt) peuvent être croisées et projeté avec un microscope à fluorescence sur plusieurs générations afin de générer une souche exprimant de façon stable les deux sondes. Par exemple, pour réaliser ce protocole expérimental, une souche exprimant un marqueur pour visualiser les membranes cellulaires (mCherry: PH; OP70) a été croisée avec une souche exprimant un marqueur pour visualiser les noyaux des neuroblastes (HAM-1: GFP; OP102) afin de générer un souche co-exprimant à la fois.

La meilleure façon d'étudier les besoins de gènes au cours du développement embryonnaire est de réaliser la perte d'expériences de fonction, où le produit du gène est renversé ou muté. Ce protocole expérimental décrit effectuer ARNi contre anillin (ani-1) pour réduire endogènes ANI-1 chez tous les tissus embryonnaires. Il ya allèles hypomorphic pas bien caractérisésdes ani-1. Par conséquent, l'ARNi est la meilleure option pour examiner la perte de phénotypes de fonction de l 'ani-1 et déterminer sa fonction au cours du développement embryonnaire. En règle générale, il est préférable d'utiliser des mutants à la place de l'ARNi, que l'efficacité de knockdown peut être variable et est rarement nulle. L'un des problèmes les plus fréquemment rencontrés avec alimentation protocoles ARNi est la contamination, ce qui réduira l'efficacité de l'ARNi. Pour diminuer le risque de contamination, préparer les plaques de RNAi et de la nourriture dans des conditions aseptiques. La contamination peut être détecté par le dépistage quelques-unes des plaques avant l'utilisation, et les plaques à base de bactéries lactées / opaques à la recherche doit être jeté. Un autre problème qui peut réduire l'efficacité de l'ARNi est de ne pas choisir hermaphrodites au stade du développement droite. Il est préférable d'utiliser des vers adultes L4-étagées ou jeunes (la vulve en développement apparaît comme un cercle / trou blanchâtre sur la face ventrale du ver), qui n'ont pas / peu d'embryons fécondés. En outre, les conditions de RNAi et traitements may varier selon les différents produits de gènes. Différentes manières pour augmenter ou diminuer la force de l'ARNi est en remettant en suspension les bactéries HT115 granulés dans des quantités différentes de LB Amp support (voir Section 1.2.2), et en modifiant la durée du traitement ARNi (longueur de temps pendant laquelle les vers sont maintenus sur plaques d'ARNi; voir Protocol 3). Pour un rendement optimal ani-1 phénotypes ARNi de ce protocole, les bactéries ont été remises en suspension dans 500 ul de milieu et vers LB Amp ont été maintenues sur des plaques ARNi pendant 2 jours (ani-1 ARNi a été précédemment caractérisée par Maddox et al. 23). Souches résistantes ou sensibles (par exemple, ARNi. Rde-1, 1-sid ou far-3) peuvent également être utilisés pour modifier la résistance de l'ARNi. Plus important encore, ces souches peuvent être couplés avec l'expression spécifique d'un tissu de leurs gènes de type sauvage pour créer des souches sensibles des tissus. Par exemple, pour effectuer neuroblastes ARNi spécifique, on peut utiliser sid-1 embryons mutants (ARNi résistant) exprimant poids unc-119 (souche ID au CCG TU3401) 31.

Ce protocole décrit comment la division image de cellule de neuroblastes la mi embryogenèse. Il ya plusieurs aspects du protocole qui nécessitent un examen attentif, comme le stade de développement des embryons, la collecte des Z-piles appropriées et d'optimiser les conditions d'imagerie pour réduire la phototoxicité sans compromettre la qualité d'image. Pour capturer des points de temps à la phase de développement à droite (par exemple de l'enceinte ventrale), les embryons doivent être filmés de dorsale intercalation (paires de cellules épidermiques dorsales s'entrecroisent et fusionnent pour former une seule couche de l'épiderme sur la face dorsale de l'embryon; figure 1A6). A cette époque, les neuroblastes se divisent rapidement. Depuis la tenue des embryons peut être difficile à faible grossissement (par exemple en utilisant un microscope à dissection), il permet de recueillir beaucoup d'embryons de différentes étapes et les embryons à laétape droit peut être sélectionné en utilisant un grossissement supérieur.

Neuroblastes sont relativement petits et minces, et sont présents dans le milieu de l'embryon. Il est essentiel pour optimiser le nombre et la taille des piles Z pour garantir que la totalité de la cellule est capturée au cours de division. Par exemple, la collecte de trop d'images exposera embryons de plus de lumière et de les rendre sujettes à phototoxicité. Toutefois, la collecte de trop peu de Z-piles ou en utilisant des sections de Z épais pourrait rendre difficile de bien l'image entière d'une cellule de division des neuroblastes.
Ce protocole décrit l'utilisation d'un champ balayé microscope confocal ou d'un système à champ large de division d'image de cellule de neuroblastes. Comme décrit plus haut, l'une des principales limites de l'aide d'un microscope à fluorescence à champ large est le potentiel de phototoxicité. Alors qu'il est fortement recommandé d'utiliser un microscope confocal à disque rotatif ou balayé confocale de champ pour l'imagerie C. elegans embryons, certains laboratoires peuvent avoir un accès limité à ces systèmes. Ce protocol donne quelques suggestions visant à limiter la phototoxicité pour l'utilisation de systèmes de champ large, telles que la fermeture de l'ouverture à 30%, en abaissant l'intensité de la lumière provenant de l'ampoule de mercure (ou de préférence en utilisant des LED), à l'aide d'une caméra EMCCD, et l'augmentation du gain ou de binning pour permettre une diminution de la durée d'exposition. Le nombre de Z-piles et des points de temps sera également limitée en utilisant un système à grand champ. Bien qu'il n'a pas été décrite dans ce protocole, le disque rotatif microscope confocal est couramment utilisé pour l'imagerie en direct car il provoque la phototoxicité inférieure par rapport à un microscope à champ large. Similaire au système de champ balayé, il utilise des lasers à l'état solide et diffuse la lumière (bien que d'une manière différente par rapport au champ balayé). Soit CCD ou EMCCD caméras peuvent être utilisées avec le système de disque de filage, ce qui a souvent des ports multiples de la caméra pour permettre la formation d'image double. Semblable à la microscopie champ balayé, les images peuvent être capturées avec des temps d'exposition 50-90% inférieure par rapport au système à grand champ.
Cette protocol peut être utilisé pour étudier la fonction des divers gènes qui régulent la mitose pendant la formation du tissu. Le temps entre chaque image peut être réduite (par exemple. Tous les 15-30 sec vs. 2-3 min) pour mieux visualiser phénotypes mitotiques. Différentes sondes pourraient être utilisés (par exemple, au lieu d'utiliser HAM-1:. GFP, H2B fluorescent marqué pourrait être utilisée pour visualiser l'ADN, et / ou fluorescent marqué tubuline pourrait être utilisé pour visualiser fuseau mitotique). Le nombre de Z-piles et l'épaisseur de chaque pile peut également être modifiée (par exemple, plusieurs piles d'une taille de pas plus petit). Comme décrit ci-dessus, en choisissant les paramètres appropriés est cruciale pour limiter la phototoxicité et l'optimisation de la qualité de l'image. Même si la mCherry: PH et HAM-1: sondes GFP expriment à des niveaux relativement élevés, la collecte de points dans le temps plus vite, d'augmenter le nombre de Z-piles ou d'imagerie pour de longues périodes de temps par rapport à ce qui est décrit dans ce protocole peut ne pas être possible sur un système à grand champ.
Une im Javaprogramme de traitement de l'âge (ImageJ, NIH) peut être utilisé pour traiter des images recueillies par les différents microscopes et des images peut être exporté sous forme de fichiers TIFF. Toutefois, selon le logiciel utilisé pour l'acquisition, les fichiers pourraient déjà être compatible avec le logiciel de traitement. Il est préférable d'ouvrir les fichiers originaux par rapport aux images exportées (par exemple TIFF), car les métadonnées sont conservées avec les fichiers originaux. Logiciel de traitement peut être utilisé pour manipuler des images pour faire des figures ou des films. En outre, des analyses quantitatives peuvent être effectuées également, tels que la mesure des intensités de pixels dans des régions sélectionnées. Logiciel optimal doit être choisie en fonction de l'analyse, comme l'image Processing Toolbox (MathWorks, Matlab) ou 3D et 4D en temps réel Interactive Data Visualization (Imaris, Bitplane).
En utilisant ce protocole, a été montré ani-1 à être nécessaire pour neuroblastes cytokinèse, même si elle n'est pas nécessaire pour la cytokinèse dans l'embryon précoce. Fait intéressant, en contrôlant le numbre et la position des neuroblastes, ani-1 peut réguler la migration des cellules épidermiques ventrales pour enceinte ventral, parce que les neuroblastes chimiques ou mécaniques fournissent des signaux aux cellules épithéliales sus-jacentes. Cependant, on ne sait pas si ani-1 est nécessaire pour la division ou le changement de forme d'autres types de cellules pendant la mi embryogenèse tardive. Montrer comment la composition globale d'un tissu affecte les tissus voisins souligne l'importance de la communication des tissus au cours du développement des métazoaires.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à reconnaître que ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en génie du Canada de subvention (CRSNG) en sciences naturelles et.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

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Neuroscience Numéro 85, La morphogenèse la cytokinèse neuroblastes anillin la microscopie la division cellulaire
Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse
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Wernike, D., van Oostende, C.,More

Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

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