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Neuroscience

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.

Abstract

Este protocolo describe el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen dentro de la división de células en desarrollo Caenorhabditis elegans embriones. En particular, este protocolo se centra en la forma de imagen dividiendo neuroblastos, que se encuentran por debajo de las células de la epidermis y puede ser importante para la morfogénesis epidérmica. La formación de tejidos es crucial para el desarrollo de los metazoos y se basa en las señales externas de los tejidos vecinos. C. elegans es un organismo modelo excelente para estudiar la morfogénesis de tejidos in vivo debido a su transparencia y organización sencilla, haciendo que sus tejidos fácil de estudiar a través de microscopía. Recinto ventral es el proceso donde la superficie ventral del embrión está cubierto por una capa única de células epiteliales. Este evento se piensa que es facilitado por los neuroblastos subyacentes, que proporcionan señales de orientación química para mediar en la migración de las células epiteliales suprayacentes. Sin embargo, los neuroblastos son altamente proliferativa y también pueden actuarcomo un sustrato mecánico para las células epidérmicas ventrales. Los estudios que utilizan este protocolo experimental podrían descubrir la importancia de la comunicación intercelular durante la formación de tejido, y podrían utilizarse para revelar las funciones de los genes implicados en la división celular dentro de los tejidos en desarrollo.

Introduction

Aunque existen protocolos que describen cómo la división celular la imagen a principios del C. elegans embrión, este protocolo se describe cómo la división celular la imagen dentro de un tejido a mediados embriogénesis. Uno de los principales retos en la formación de imágenes organismos durante el desarrollo ha sido su sensibilidad a la fototoxicidad. Sin embargo, el aumento de la accesibilidad a hilar microscopios confocal de disco o microscopios de campo de barrido ha permitido aplicaciones de imagen más extendidos. Ambos sistemas utilizan láseres de estado sólido y la luz difusa, lo que limita los niveles de radiación UV que los organismos están expuestos. Sin embargo, puestos de campo amplio todavía se puede utilizar para obtener imágenes in vivo, sobre todo si están equipados con cámaras con alta sensibilidad (por ejemplo EMCCD), control de apertura y control de luz (por ejemplo, LEDs o bombillas de mercurio ajustables). Este protocolo describe cómo utilizar bien un sistema confocal o basado en un sistema de campo amplio para la división celular en el desarrollo de la imagen C. elegans </ Em> embriones. A modo de ejemplo, se describe cómo reproducir la división celular neuroblastos. Los neuroblastos pueden facilitar la morfogénesis epidérmica proporcionando señales químicas o mecánicas a las células de la epidermis suprayacente, y proporcionar un excelente ejemplo de la importancia de la comunicación intercelular en la formación de tejidos.

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo ideal para estudios basados ​​en la microscopía, debido a su transparencia y simple organización del tejido 1. Además, C. elegans es susceptible de métodos genéticos y de ARNi, y dado que muchos de sus genes tienen homólogos humanos, puede ser utilizado para identificar los mecanismos conservadas para la formación de tejido 2-5. En C. elegans, la formación de la epidermis ocurre durante la mitad la embriogénesis, cuando el embrión tiene> 300 células. Morfogénesis epidérmico se compone de varias fases principales, durante el cual el embrión está encerrado en una capa de células epidérmicas que constriñen y se extienden para transformar la EMBRyo desde una forma ovoide en la forma alargada de un tornillo sin fin 6. Recinto ventral describe uno de estos eventos morfogenéticos, cuando las células epidérmicas ventrales migran hacia la línea media ventral para cubrir la superficie ventral del embrión (Figura 1). En primer lugar, dos pares de anteriores situada células principales del borde migran hacia la línea media ventral, donde se adhieren y se fusionan con sus vecinos contralaterales 6. Esto es seguido por la migración de las células de bolsillo posterior situado, que forman cuña formas creando un bolsillo ventral 6-7. El mecanismo que cierra el bolsillo no se entiende bien. Una posibilidad es que una estructura contráctil miosina actina supracellular ata las células de bolsillo juntos en un cordón de bolsa como la moda, similar a la cicatrización de la herida 8. Curiosamente, la migración de algunas de las células de bolsillo está mediada por subconjuntos específicos de neuroblastos subyacentes 9 (precursores neuronales que se encuentran debajo de la epidermis; Figura 1B).

Estudios anteriores mostraron que los neuroblastos regulan la migración de las células epidérmicas ventrales y recinto ventral. VAB-1 (receptor de Efrina) y VAB-2 (Efrina ligando) son altamente expresado en los neuroblastos y facilitar la clasificación de los neuroblastos anterior y posterior entre sí, y mutaciones en VAB-1 o VAB-2 causa recinto ventral fenotipos 10-13. Sin embargo, experimentos de rescate promotoras mostraron que también se requiere VAB-1 en las células epidérmicas ventrales suprayacentes y receptores para otras señales de orientación secretadas por los neuroblastos se expresan en las células epidérmicas ventrales 9. Aunque las mutaciones en cualquiera de estos receptores causan fenotipos recinto ventrales, no está claro si surgen defectos debido a problemas en el posicionamiento de los neuroblastos o por insuficiencia de las células epidérmicas ventrales para responder a la orientación Tacos de 14. La alteración de la división de wi neuroblastosthout que afecta su capacidad para secretar señales de orientación podría arrojar luz sobre el papel de los neuroblastos y su capacidad para proporcionar energía mecánica durante la morfogénesis epidérmica. Recientemente, se encontró que un gen de la división celular, ani-1 (anillin) es altamente expresado en los neuroblastos (figura 2A) y su agotamiento causa defectos de división de neuroblastos. Curiosamente, estos embriones exhiben fenotipos recinto ventrales (Fotopoulos, Wernike y Piękny, observaciones no publicadas).

Anillin se requiere para la división celular, y en particular para la citocinesis, que describe el proceso en el que una célula madre divide físicamente en dos células hijas. La citocinesis es impulsado por la formación de un anillo contráctil actomiosina, que debe ser estrechamente controlada en el espacio y el tiempo para asegurarse de que está acoplado correctamente con la segregación de cromátidas hermanas. El regulador maestro de la citocinesis metazoos es RhoA (RHO-1 en C. elegans), una pequeña GTPasa que es unctive en su forma unida a GTP. El FMAM Ect2/ECT-2 activa RhoA, después de lo cual RhoA-GTP interactúa con los efectores que forman el anillo contráctil y median su ingresión 15. Anillin es una proteína de dominio múltiple que se une a RhoA a través de su C-terminal y a la actina y la miosina a través de su extremo N-terminal. Anillin se requiere para estabilizar la posición del anillo contráctil en células de mamífero o de Drosophila S2 16. Agotamiento Anillin causa anillos contráctiles a someterse a oscilaciones laterales, y la citocinesis finalmente falla la formación de células multinucleadas 17-19. Curiosamente, a pesar C. elegans ani-1 coordina la contractilidad actomiosina en el embrión temprano, no es esencial para la citocinesis. Sin embargo, como se describió anteriormente, se requiere ani-1 para la citocinesis neuroblastos durante la mitad de la embriogénesis (Fotopoulos, Wernike y Piękny, observaciones no publicadas). Fracaso Citocinesis alteraría el número y posición de los neuroblastos y podría afectar a la locción de señales de orientación químicos, o podría alterar las propiedades mecánicas del tejido. Ambos modelos destacan el papel no autónoma de neuroblastos de cerramiento ventral, y la importancia de la comunicación de tejidos tejidos durante el desarrollo embrionario.

Este protocolo experimental se describe cómo la división celular imagen durante la C. elegans mediados embriogénesis mediante microscopía de fluorescencia. La mayoría de los experimentos que estudian los mecanismos de la división celular se realizaron en células individuales dentro de placas de cultivo (por ejemplo. HeLa o células S2) o en embriones tempranos con un número limitado de células (por ejemplo, C. elegans embrión de una célula, de Xenopus, o equinodermo embriones). Sin embargo, es importante para estudiar la división celular también dentro de los tejidos, ya que hay señales externas que pueden influir en el tiempo y la colocación del plano de división. Además, las células pueden proporcionar señales químicas o mecánicas para influir en el desarrollo de los tejidos vecinoss, y es importante entender cómo la comunicación intercelular ayuda a los tejidos para formar durante el desarrollo.

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Protocol

1. Preparación de las placas para el mantenimiento de cepas de gusanos y escénicas RNAi

  1. Placas Nematodo Crecimiento Medios
    1. Placas
      1. Preparar platos Nematodo Crecimiento Medios (NGM) para mantener cepas de gusanos y realizar cruces genéticos. Combinar 3 g de NaCl, 17 g de agar y 2.5 g de bactopeptona con 1 L de agua destilada en un matraz de 2 L y añadir una barra de agitación de metal.
      2. Autoclave el matraz para disolver el agar y para esterilizar los medios de comunicación. A continuación, coloque el frasco en una placa de agitación y deje que el material se enfríe mientras se agita.
      3. Una vez que los medios de comunicación se ha enfriado y es todavía algo caliente al tacto (45-50 ° C), añadir 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml de solución de 5 mg / ml de colesterol y 25 ml 1 M tampón de fosfato potásico (PPB; receta en la tabla de reactivos / materiales; filtro esterilizar soluciones madre) y verter de inmediato los medios de comunicación en pequeñas cajas de Petri (60 mm x 15 mm; llenar los platos de ~ 4.3 a la parte superior o 13 ml / placa using de un dispensador automatizado). Nota: Para el mantenimiento a largo plazo de algunas cepas de tetraciclina puede ser añadido a las placas (12.5 g / ml) para permitir Tn10 transposón inactivación del gen de la RNasa III bacteriana.
      4. Deje que los medios de comunicación se solidifican durante la noche a temperatura ambiente. Nota: Las placas se deben mantener en una campana biológica o en un área del laboratorio que es menos propenso a la contaminación. También, quite cualquier condensación que se ha acumulado en los párpados (por ejemplo, limpieza con papel de seda) para limitar la contaminación por hongos. Si tetraciclina también se añade a las placas, luego cubrir con papel de aluminio como este antibiótico es sensible a la luz.
      5. Al día siguiente, las semillas NGM placas secas con una suspensión de E. coli (cepa OP50, véase la sección 1.1.2) que ha sido agitaron suavemente. Para hacer placas para el apareamiento, añadir ~ 50 l de OP50 al centro de cada placa (para formar un pequeño círculo). Para hacer placas para mantener cepas de gusano, sembrar cada placa NGM con ~ 100-200 l de OP50 (aasegúrese de que cubre una mayor área de la placa).
      6. Que las placas sembradas O seco / N a temperatura ambiente.
      7. Al día siguiente, vuelta a las placas de NGM secos boca abajo y apilarlos en contenedores de plástico de almacenamiento a 4 ° C. Nota: Las placas son utilizables hasta ~ 3-4 semanas. Las placas que contienen tetraciclina se deben mantener en la oscuridad.
    2. Comida
      1. Utilice E. OP50 coli [Del Caenorhabditis Centro de Genética (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] como fuente de alimento para la C. . elegans Nota: OP50 se puede almacenar como stocks de glicerol a -80 ° C (relación 1:1 en 50% v / v de glicerol).
      2. Para hacer OP50 para las placas de NGM, hacer un plato consecutivas con una pequeña alícuota de la solución madre en glicerol (<10 l, el uso de una punta de pipeta estéril). Separe las bacterias en una placa de agar LB (receta en la tabla de reactivos / materiales) y dejarlo en 37 ° C durante aproximadamente 16 horas. Nota: Si hay problemas con la contaminación, OP50 resistente estreptomicina se puede utilizar, unaND estreptomicina se puede añadir a las placas de agar LB (50 g / ml).
      3. Al día siguiente, elegir una sola colonia e inocular 100 ml de medio LB líquido (receta en la tabla de reactivos / materiales) en un matraz de 500 ml.
      4. Deje que la cultura crezca O / N a 37 ° C con agitación.
      5. Al día siguiente, utilice la suspensión bacteriana para la siembra de NGM placas. Nota: OP50 se puede dividió en alícuotas en tubos de 50 ml cónicos y se almacenó a 4 ° C durante ~ 4-6 semanas.
  2. RNAi
    La alimentación es una de las principales formas de realizar el ARN de interferencia mediada (RNAi; para derribar un producto génico específico) en C. elegans. C. hermafroditas elegans pueden ser alimentados E. coli cepa HT115 transformada con un vector que expresa ARNds de alimentación después de la inducción. Este dsARN (o sus fragmentos) se transmite a la gónada, por lo general resulta en la precipitación sustancial del objetivo gen específico.
    1. Placas de RNAi
      1. Preparar NGM placas como se describió anteriormente (véase la Sección 1.1.1), sino también añadir 1 ml de 1 M de IPTG (isopropiltio-beta-D-galactósido; para inducir la expresión de ARN de doble cadena) y 500 l de 50 mg / ml de ampicilina (Amp; los vectores que expresan dsRNA son Amp -resistente) a los medios de comunicación caliente (45-50 ° C).
      2. Después las placas se han secado, las semillas con ~ 50-100 l de E. coli HT115 (véase la Sección 1.2.2). Nota: las placas no cabeza de serie se pueden almacenar a 4 ° C durante ~ 4-5 semanas.
      3. Deje que las placas sembradas se secan durante la noche a temperatura ambiente.
      4. Al día siguiente, vuelta a las placas de RNAi secos boca abajo y guárdelos en un envase de plástico a 15-20 º C. Nota: placas sembradas conservan eficacia RNAi para un máximo de ~ 2-3 semanas.
    2. RNAi Alimentos
      1. Utilice E. coli HT115 (a partir de la CGC; véase la Sección 1.1.2) transformada con el vector de alimentación L4440, L4440 o que contiene ADNc para un gen de interés. Nota: La alimentación de las bibliotecas que se dirigen a la mayoría de los marcos de lectura abierta en el genomaya se han realizado y se encuentran disponibles (clones en L4440 transformadas en HT115, por ejemplo, que contiene un fragmento de Y49E10.19 para ani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / páginas / rnai.html). Nota: HT115 se puede mantener como stocks de glicerol a -80 ° C (relación 1:1 en 50% v / v de glicerol).
      2. Para generar una nueva construcción dirigidas a un gen de interés, ver el mapa vectorial L4440 y cDNA clon entre los promotores T7 que flanquean, que son inducible por IPTG.
      3. Transformar HT115 con el constructo L4440 usando un protocolo estándar para la transformación (por ejemplo, hacer que las bacterias químicamente competentes y realizar la transformación de choque térmico).
      4. Como se describe para OP50 (ver Sección 1.1.2), las bacterias del rayado de la madre de glicerol en una placa de agar LB, pero el plato también debe contener 50 mg / ml de ampicilina. Nota: Si utiliza un pre construcción L4440 existente, omita Secciones 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Elija una sola colonia e inocular 5 mlde medio LB que contiene 5 l de ampicilina de un / ml 50 mg (LB Amp) y colocarlo a 37 ° C con agitación.
      6. Después de aproximadamente 16 horas, inocular 5 ml de medio fresco LB Amp con 50 l de la cultura de O / N y hacer crecer el cultivo durante 7-8 horas con agitación a 37 º C.
      7. Centrifugar las bacterias durante 1 min a 4.000-8.000 x g, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 l de medio fresco LB Amp.
      8. Utilice esta solución bacteriana a sembrar las placas de RNAi como se describe anteriormente (véase el apartado 1.2.1). Nota: HT115 debe utilizarse inmediatamente y no se debe almacenar.

2. El cultivo de cepas de gusano

Mantener C. cepas elegans pedidas a la CGC en placas NGM acuerdo con el protocolo estándar de 1. Las cepas utilizadas para este protocolo son: C. elegans var Bristol, de tipo salvaje (ID deformación a la CGC N2); UNC-119 (tm4063); wgIs102 [ham-1 UNC-119 (+)] (ID deformación a la CGC OP102); UNC-119 (ed3); ltIs44pAA173 [pastel-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (ID deformación a la CGC OD70); AJM-1 (OK160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (ID deformación a la CGC SU159); UNC-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: UNC-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (ID deformación a la CGC FT250).

  1. Elija ~ 3 adultos hermafroditas jóvenes que muestran el fenotipo correcto a una placa de NGM fresco. Nota: N2 (var. Bristol; de tipo salvaje) se puede mantener entre 15-25 ° C, pero llegará a la densidad más rápido a temperaturas más altas. Se deben hacer nuevas acciones cuando la densidad de gusano es alto.
  2. Mantener todas las cepas fluorescentes (por ejemplo GFP y / o gusanos mCherry-que expresan) a 20-25 ° C para la expresión óptima de proteínas fluorescentes. Se deben hacer nuevas acciones cuando la densidad de gusano es alta y la comida es baja.
  3. Para recoger gusanos, utilice unrecoger a partir de una pipeta de vidrio desmenuzado con un alambre de platino fusionado en el extremo tirado (~ 3-5 cm de longitud). Acoplar el cable con un borde liso. Usar la selección para 'scoop' hasta hermafroditas y transferirlos a nuevas placas. Flamear el cable entre su uso para evitar la contaminación cruzada de las cepas.

3. RNAi

  1. Realización de RNAi
    1. En primer lugar, el lugar ~ 8 hermafroditas L4 en una placa de NGM cabeza de serie para el ~ 30 a 60 min para eliminar las bacterias OP50 de los gusanos.
    2. A continuación, coloque los 8 hermafroditas sobre una placa de NGM Amp IPTG se sembró con HT115 que lleva el plásmido L4440 que expresa ARNds a un gen de interés (por ejemplo, ani-1;. Ver 1.2) durante ~ 24 horas. Nota: En función del gen de interés, o de los fenotipos deseados (que puede depender de la fuerza de la caída), los gusanos se pueden dejar en las placas de RNAi para períodos más cortos o más largos de tiempo (después de las 24 horas, colocar los hermafroditas en RNAi fresca placas).
    3. Para un negControl ativa, colocar gusanos en una placa de RNAi sembraron con HT115 lleva el vector L4440 vacía. Nota: Estos embriones no deben tener fenotipos.
    4. Para un control positivo, colocar gusanos en una placa de ARNi expresar dsRNA que se dirige a un gen con fenotipos bien caracterizados. Nota: Para rho-1 (Y51H4A.3), los embriones son 100% letal después de 24 horas y hermafroditas son estériles después de 48 hr.
  2. Eficacia RNAi
    Los niveles de caída de RNAi se deben probar, sobre todo porque algunos tejidos pueden ser más resistentes que otros. Durante principios de mediados embriogénesis, la mayoría de los tejidos son RNAi y minúsculas, pero a finales del embrión o larva, las neuronas son RNAi resistentes. Las diferentes cepas se pueden utilizar para mejorar la sensibilidad de RNAi (por ejemplo, FRR-3), o para generar ARNi específico de tejido (por ejemplo, SID-1 en combinación con un transgén expresado por el promotor neuronal unc-119).
    1. Western Blotting
      Inmunotransferencia utilizando C. elegans proteínas pueden serrealizado de acuerdo con el protocolo estándar 22.
      1. Después de realizar ARNi, recoger ~ 10 grávido (lleno de embriones) hermafroditas en un tubo de microcentrífuga, añadir 20-30 l 1x tampón de muestra SDS-PAGE y se lisan por ebullición durante ~ 2 min. Del mismo modo, recoger gusanos N2 en un tubo separado para la muestra de control. Nota: El número de hermafroditas puede variar dependiendo de la sensibilidad de los anticuerpos primarios.
      2. Crear diluciones de la muestra de control (por ejemplo, 3-100%) en tampón de muestra. Cargar el control y las muestras de RNAi y ejecutar por SDS-PAGE según el protocolo estándar (el gel% variará dependiendo del tamaño de la proteína de interés).
      3. Transferir el gel a una membrana y realizar inmunotransferencia según el protocolo estándar. Nota: Utilice diferentes diluciones de anticuerpos primarios y secundarios como se recomienda para cada anticuerpo.
      4. Desarrollar (por ejemplo, si se utiliza la quimioluminiscencia) o escanear (por ejemplo, si se utiliza la fluorescencia) el inmunoblot y compara ªe densidad de las bandas en los carriles N2 vs el carril de ARNi, y determinar el nivel de caída (por ejemplo, la densidad de la vía de RNAi coincide con el carril de control de 12%, esto sugiere que la proteína se reduce en un 88%). Nota: Para ver la eficiencia de ANI-1 desmontables, ver Maddox et al 23.
    2. La inmunotinción
      La inmunotinción en C. elegans pueden ser realizados de acuerdo con el protocolo estándar 22.
      1. Después de realizar RNAi, recoger hermafroditas grávidas y embriones de la cosecha utilizando uno de dos métodos. Para uno de los métodos, lugar hermafroditas en tampón M9 (receta en la tabla de reactivos / materiales) en 1,5 ml siliconado tubos de microcentrífuga y pellet por centrifugación (1.000-4.000 xg). Nota: De manera similar recoger N2 hermafroditas grávidas.
      2. Eliminar la solución M9.
      3. Expulsar embriones mediante la adición de 1 ml de solución de blanqueo (1 M de NaOH, 5% de blanqueo) para el tubo de microcentrífuga durante 3 min. Del mismo modo, N2 blanqueador élrmaphrodites hacer diapositivas de control.
      4. Vortex suavemente, luego sedimentar inmediatamente los embriones a través de centrifugación (4.000-8.000 xg) y retire la solución de blanqueo. Nota: El tiempo total que los gusanos se incuban con blanqueador no debe superar los 5 minutos.
      5. Lavar los embriones 3 veces con solución salina amortiguadora Tris (TBS; Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM) y de transferencia de embriones utilizando una pipeta Pasteur de vidrio en una poli-L-lisina-revestido portaobjetos de microscopio. Nota: Para recubrir un portaobjetos de vidrio con poli-L-lisina, primero limpie la diapositiva, a continuación, agregar una gota (~ 20 a 30 l) de poli-L-lisina y se extendió uniformemente por toda la superficie y dejar secar. Para obtener resultados óptimos, capa de las diapositivas dos veces más. Un método alternativo para recoger embriones (Secciones 3.2.2.1-3.2.2.5) es colocar una gota de M9 en un poli-L-lisina-revestido portaobjetos de microscopio y recoger ~ 10 hermafroditas grávidas en la gota.
      6. Añadir un cubreobjetos en la parte superior de cada portaobjetos de microscopio (a la zona que contiene la mayoría de los embriones) y lugarlas diapositivas de nitrógeno líquido. Nota: Para los hermafroditas colocados directamente en la gota, ejercer presión sobre el cubreobjetos para romper los hermafroditas y expulsar los embriones.
      7. Freeze-romper los embriones con un movimiento rápido de los cubreobjetos inmediatamente después de la congelación en nitrógeno líquido.
      8. Colocar los portaobjetos en metanol enfriado con hielo durante 20 minutos para fijar los embriones. Nota: Para algunos antígenos, un fijador de reticulación tales como paraformaldehído puede ser preferible. Ver el protocolo de Duerr 22.
      9. Se rehidrata y permeabilizar las embriones por lavado de las diapositivas 4x con solución salina tamponada con Tris que contiene Tween-20 (TBST; Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween-20) durante 10 min cada uno.
      10. Seque cada diapositiva alrededor del área que contiene la mayoría de los embriones y dibujar un círculo alrededor de los embriones con un bolígrafo bloqueo líquido (por ejemplo PAP pluma).
      11. Añadir ~ 100 l de TBST con 5% de suero normal de burro (NDS; bloque) a cada diapositiva (zonas marcadas con círculos) y se incuba durante20 min a temperatura ambiente. Nota: Coloque los portaobjetos en una "cámara húmeda" (por ejemplo, un plato con una tapa que contiene toallas de papel húmedo).
      12. Retire el bloque, agregue ~ 50-100 l de anticuerpos primarios (diluido en TBST) a cada diapositiva (área de un círculo) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Nota: En función del anticuerpo, la dilución y tiempo de incubación puede variar. Para detectar GFP, utilizamos un anti-ratón anti-GFP anticuerpo primario en una dilución de 1/200. Para detectar ANI-1, se utiliza un anti-conejo anti-ANI-1 anticuerpo primario en una dilución 1/1600 (amablemente proporcionados por Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Para tiempos de incubación más largos, coloque las diapositivas a 4 ° C.
      13. Retire anticuerpos primarios (si es posible, mantener para uso futuro) y lavar los portaobjetos 3x con TBS durante 5 minutos cada uno.
      14. Retire el último lavado y añadir ~ 50-100 l de anticuerpos secundarios (diluido en TBST) a cada diapositiva (zonas marcadas con círculos) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Nota: En función del anticuerpo, la dilución puede variar. Para detectar GFP, utilizamos un unanti-ratón Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario en una dilución de 1/250. Para detectar ANI-1, se utiliza un anti-conejo Alexa Fluor 568 anticuerpo secundario en una dilución de 1/250.
      15. Eliminar anticuerpos secundarios y lavar 3 veces con TBS diapositivas durante 5 min cada uno. Nota: Para la tinción de ADN, añadir ~ 50-100 l de DAPI (4 ',6-diamino-2-fenilindol; 1 mg / ml) a 1/500 de dilución en TBST durante 5 min.
      16. Retire DAPI y lavar los portaobjetos 2 veces con TBS durante 5 minutos cada uno. Nota: Si no se realiza la tinción DAPI, omita este paso de lavado extra.
      17. Realice un lavado rápido con 0,1 M Tris (pH 9), quitar y añadir ~ 15 l de medio de montaje precalentado a 37 º C (4% de n-propilo 3.4.5-trihydroxybenzoate (galato de propilo), 50 mM Tris, pH 9 en 50% de glicerol) para cada diapositiva (área de un círculo).
      18. Añadir un cubre a cada diapositiva (en la parte superior de los medios de montaje en el área de un círculo), absorber el exceso de líquido y sellar las diapositivas con esmalte de uñas. Nota: Las diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C.
      19. Observe los embriones enlas diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio o escaneo láser confocal microscopio. Es importante destacar que ajustar la configuración para recoger imágenes de la intensidad óptima de píxeles con el control de los embriones (N2 o no RNAi). Luego, recoger imágenes a partir de embriones de RNAi con los mismos valores. Los ejemplos de las imágenes recogidas por el control vs ani-1 RNAi embriones se muestran en la Figura 2B.

4. Preparación de las diapositivas de imágenes en vivo y Cosecha embriones

  1. Preparación de pastillas de agarosa para formación de imágenes en vivo
    1. Coloque un recipiente limpio, pre portaobjetos calentado entre dos diapositivas, cada una con 1-2 tiras de cinta sobre ellos.
    2. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, añadir una gota de 2% w / v de agarosa (disuelto en agua destilada calentada) a la diapositiva.
    3. Coloque rápidamente una segunda, portaobjetos limpio en la parte superior de la primera diapositiva de una manera perpendicular a aplanar la gota de agarosa. Nota: La cinta en la vecina deslizóes proporciona el espesor de la almohadilla.
    4. Deje que la agarosa seca pad para un 1-2 minutos antes de retirar el carro superior. Deslice el carro superior con cuidado para evitar romper la almohadilla de agarosa debajo. Nota: A veces la almohadilla se transfiere a la corredera superior y es aún utilizable, siempre y cuando se mantenga intacta.
    5. La transferencia de los embriones en la almohadilla de agarosa dentro de unos pocos minutos después de su preparación como se describe a continuación (véase el paso 4.2). Nota: La plataforma debe tener un aspecto opaco, una vez que está claro, es demasiado seco para su uso.
  2. Embriones de cosecha
    1. Utilice el siguiente protocolo para la recogida de embriones de imágenes en vivo, que se deriva de Sulston et al. 24
    2. Elige aproximadamente 4-6 adultos grávidas (no hambre) a partir de placas de NGM o RNAi y colocarlos en 20-30 l de tampón M9 en un pozo en un portaobjetos de la depresión.
    3. Utilice un bisturí esterilizado para cortar los gusanos a cada lado de la espermateca (o, alternativamente, cerca de la vulva) aliberar los embriones en la solución.
    4. Utilice una manguera de goma con una boquilla conectada a un capilar de vidrio / pipeta tirado a tener un pequeño agujero y succionar los embriones por pipetear con la boca. Alternativamente, recoger los embriones con un tubo de vidrio capilar que está conectado a una pera de goma pipeta Pasteur.
    5. La transferencia de los embriones succionadas a un segundo pozo también contiene tampón M9, para ayudar a separarlos de los escombros gusano.
    6. Entonces, la succión de los embriones en una almohadilla de agarosa recién preparado (véase el paso 4.1).
    7. Los embriones se agrupan utilizando una pestaña (pegado a un palillo de dientes) para aumentar el número de embriones que pueden ser filmados en uno plano x, y. Nota: Para evitar la falta de oxígeno, no agrupan más de 10 embriones juntos.
    8. A continuación, cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos y parcialmente sellarlo con pre valap líquido calentado (vaselina, lanolina y parafina; derretido y 01:01:01 combinado) para prevenir la deshidratación de los embriones durante la exploración. Nota: Adicional M9 buffer can ser añadido a la almohadilla para asegurar que los embriones tienen suficiente líquido para formación de imágenes. En lugar de valap, vaselina se puede utilizar para sellar parcialmente cubreobjetos, pero es menos rígido que causan los cubreobjetos se deslicen y se podrían obtener en los objetivos de microscopio.

5. Imágenes en vivo

  1. Para visualizar los neuroblastos, obtener una cepa gusano que expresa una proteína-neuroblast específica unida a una proteína fluorescente (por ejemplo, HAM-1: GFP, ID deformación a la CGC OP102). Para detectar las membranas celulares, utilizar una cepa de gusano que también expresa un dominio de proteína que reconoce lípidos unidos a una proteína fluorescente diferente (por ejemplo, mCherry:. PH, Identificación deformación a CGC OD70).
  2. Embriones Cosecha de hermafroditas fluorescentes mantienen en control o ani-1 RNAi placas (ver Protocolos 3 y 4), y preparar las diapositivas como se describió anteriormente (véase el Protocolo 4).
  3. Embriones de la imagen en 4D (x, y, z y time-lapse) por microscopía de epifluorescencia. Utilice una wisistema defield [microscopio de fluorescencia automatizado con filtros para GFP y TexasRed, objetivos de hasta 60X o 100X, una alta resolución CCD (dispositivo de carga acoplada) de la cámara, altamente motorizados etapa (por ejemplo. Piezo Z) y un software especializado adquisición] campo o una livescan barrieron microscopio confocal [automatizado de barrido microscopio fluorescente con 488 nm y 561 nm láseres, los objetivos hasta 100X, un EMCCD (electrones multiplicando CCD) de la cámara, altamente motorizado etapa (por ejemplo Piezo Z) y un software especializado adquisición]. Nota: Para que el sistema de campo amplio, utilizando los LED y una cámara EMCCD limitará fototoxicidad. También, un microscopio confocal de disco giratorio se puede utilizar en lugar del sistema de campo de barrido.
  4. Para la división celular imagen neuroblastos en uno u otro sistema, encontrar x, marcos xey de embriones utilizando los 10X o 20X objetivos y elija una x óptimas, marco y donde los embriones están experimentando intercalación dorsal (paso antes de su cierre ventral; Figura 1A) o son en las primeras etapasde recinto ventral (~ 350 min después de la primera división celular; Figura 1A).
  5. En el microscopio de campo barrido, utilizar el 488 nm y 561 nm lasers 100 MW a la potencia del 40%, con una hendidura de 50. En el sistema de campo amplio, utilice los filtros de las buenas prácticas agrarias y TexasRed con intensidad de la luz de baja-media (si es regulable). Nota: Para que el sistema de campo amplio, los LED tienen una baja fototoxicidad y son preferibles.
  6. En cualquiera de los sistemas, utilizar los objetivos de inmersión en aceite 60X o 100X y recoger 20 Z-pilas de 0,2 m cada 2 min durante un total de 10 min. Nota: Aunque la HAM-1: GFP y mCherry: sondas de pH expresan en niveles relativamente altos, los tiempos de exposición para cada sonda tendrá que ser optimizado para diferentes microscopios. Nota: Para que el sistema de campo amplio, se recomiendan menos Z-pilas para limitar la fototoxicidad y para obtener imágenes durante períodos más largos de tiempo, utilizan menos los puntos de tiempo.
  7. Para reducir al mínimo la fototoxicidad causada por la exposición de los embriones a la luz UV en el sistema de campo amplio (si se utiliza un mercbombilla ury), cerrar la abertura y el 30% y disminuir la intensidad de la luz (utilizando un sistema de iluminación ajustable). Nota: Aunque el aumento no es necesario el uso de uno u otro sistema, otros microscopios pueden tener fuentes de luz con menor intensidad u objetivos con diferentes aperturas numéricas, lo que podría requerir el uso de ganancia para obtener imágenes de una intensidad óptima de píxeles. Prueba de las condiciones utilizando un embrión de control para asegurarse de que cualquier fenotipos observados no se deben a la fototoxicidad artefactos.

6. Análisis de Microscopía de datos

  1. Para el análisis de las imágenes, archivos de exportación como archivos TIFF y abrir los archivos TIFF como una pila utilizando software especializado, como un programa de procesamiento de imágenes basado en Java (por ejemplo, ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Nota: Dependiendo del software de adquisición utilizado para recoger las imágenes, los archivos se pueden guardar en su forma original y se abrieron en ImageJ. Esto es preferible como los metadatos se mantiene con los archivos.
  2. Separe la pilaen "imágenes" y los puntos de selección de tiempo y Z-planos si lo deseas. Nota: A pesar de que se adopte una pila de 20 Z-planos, muchos de los neuroblastos son <1 m de espesor durante la mitad de la embriogénesis tardía y sólo se necesitan unos pocos Z-planos.
  3. Vuelva a apilar los planos Z seleccionados para cada momento y hacer proyecciones Z-stack separadas. A continuación, se apilan las proyecciones para cada punto juntos para hacer una secuencia de tiempo.
  4. Realizar ajustes en el brillo / contraste y o para cada canal.
  5. A continuación, seleccione una región de interés, los cultivos (y girar si es necesario) de la región.
  6. Crear imágenes fusionadas mediante la función de los "canales fusionadas y elegir un color diferente para cada canal. Convertir imágenes fusionadas a RGB.
  7. Invierta las imágenes en escala de grises para cada canal de los pasos 6.3 o 6.4 (uso de la función 'invertido' en 'edit') para visualizar las imágenes con mayor claridad.
  8. Guarde todas las imágenes finales como archivos TIFF de 8 bits para hacer figuras en el vector basado softwson programas o como archivos de QuickTime para hacer películas.
  9. Si se necesitan mediciones de tamaño de píxel (por ejemplo, para incluir una barra de escala con las imágenes), utilizar ImageJ, u otro software de procesamiento de imagen para medir el tamaño del embrión. Nota: Las imágenes recogidas utilizando diferentes objetivos tienen diferentes tamaños de píxeles.

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Representative Results

Este protocolo experimental se describe cómo la división celular en la imagen C. elegans embriones durante mediados de la embriogénesis. En particular, se describe cómo los neuroblastos de la imagen, lo que puede facilitar la morfogénesis epidérmica. Morfogénesis epidérmico se produce debido a una combinación de cambios en la forma de células epidérmicas, la migración y la adhesión, pero también se basa en señales químicas o mecánicas de los neuroblastos subyacentes (Figura 1B). Los neuroblastos secretan las señales de orientación que son recibidas por los receptores en la superficie de las células epidérmicas ventrales, que regula su 10,14,25 migración. Además, los neuroblastos son altamente proliferativa, que puede proporcionar las fuerzas mecánicas que contribuyen a la migración de las células epidérmicas ventrales 26. Este protocolo se puede utilizar para estudiar la división celular neuroblastos durante mediados embriogénesis. En primer lugar, los embriones coexpressing marcadores para visualizar neuroblastos se generan:: (PH mCherry) (HAM-1 GFP) de someterse a la citocinesis. HAM-1: GFP expresa GFP (proteína verde fluorescente) etiquetados proteína que se localiza en neuroblast núcleos 27, y es necesario el uso, ya que hay muchos otros tipos de células presentes durante mediados de la embriogénesis (> 300 células; Figura 3). Esto también actúa como un buen marcador para la división de las células, ya que el ADN se condensa en los cromosomas durante la mitosis. mCherry: PH es una proteína fluorescente de etiquetado mCherry que se expresa por un promotor materna (PIE-1), y contiene el dominio de unión de lípidos de PLC1 ∂ 1 28, que se localiza en las membranas celulares. Esta proteína se necesita para visualizar la citocinesis, cuando la membrana y el citosol pellizco en separar la célula madre en dos células hijas; Figura 3; vídeo 1). Aunque este protocolo se describe cómo la imagen división neuroblastos, (mostrado por HAM-1: la expresión de GFP), otros marcadores podrían usarse para visualizar otros tipos de células.

Para visualizar la división de los neuroblastos, embriones coexpressing HAM-1: GFP y mCherry: PH son expuestas cada 2 minutos (para un total de 10 min). Cada neuroblast es sólo ~ 1.4 m de diámetro, y es <1 m de espesor, y lo mejor es utilizar un objetivo con gran aumento (por ejemplo. 100X). Por otra parte, numerosos Z-pilas (~ 20) se recogen con un tamaño de paso pequeño (0,2 m) para asegurar que los diferentes ángulos de cada célula (de forma esférica) se crean imágenes. Para recoger esta cantidad de imágenes sin comprometer los puntos de tiempo, se recomienda una etapa altamente motorizados (por ejemplo Piezo Z Stage). Después de recoger una serie de imágenes, que se analizan para detectar células dentro de unos Z-pilas que se están dividiendo, el ADN se condensa, la membrana se ingressed y las nuevas células hijas están formando (puntos de tiempo de la pila proyectada de los canales combinados están muestran en la Figura 3A, y las pilas seleccionadas de canales fusionadas se muestran en la Figura 3B; vídeo 1). Para visualizar mejor las células, se recomiendamantener a cada canal en escala de grises e invertir las imágenes (por ejemplo, la figura 4).

La resolución de la imagen es diferente para el sistema de campo amplio con una cámara CCD de alta resolución (1344 x 1024 píxeles) vs. el sistema de barrido de campo utilizando una cámara EMCCD alta velocidad con alta sensibilidad (~ 35 cuadros / seg y 512 x 512 píxeles). Imágenes invertidas de dividir los neuroblastos a partir de embriones de control adoptadas con ambos sistemas se presentan para la comparación (Figura 4 vs. 5). Como se muestra en la Figura 4A (sistema de campo amplio; vídeo 2), las imágenes son más claras frente a la Figura 5A. (Sistema de campo de barrido; vídeo 4). Sin embargo, cuando se utiliza el sistema de campo amplio, los embriones son susceptibles a la fototoxicidad y los puntos de tiempo más rápidos no son posibles con la cámara de alta resolución. Por ejemplo, para examinar los cambios en la localización de varias proteínas (por ejemplo. To estudiar los cambios en su dinámica), podría ser necesario recopilar más a menudo puntos de tiempo. También, puede que no sea posible la imagen por períodos más largos de tiempo sin reducir el número de Z-pilas y los puntos de tiempo. Utilizando una cámara EMCCD en el sistema de campo amplio puede permitir una gama más amplia de aplicaciones de imagen. Las cámaras que tienen alta resolución y alta velocidad se han desarrollado, pero los conductores pueden no estar disponibles dependiendo del software de adquisición que se utilice, y que todavía pueden no ser tan sensibles como cámaras EMCCD. Otro sistema que se usa comúnmente para la formación de imágenes C. elegans es el confocal de disco giratorio, que también tiene un menor fototoxicidad y se puede equipar con cualquiera EMCCD o cámaras CCD (ver Discusión).

Para estudiar los genes que se requieren para la división celular, hermafroditas se tratan con ARNi contra un gen de interés (por ejemplo, ani-1; véanse las Secciones 1.2 y 3 del protocolo) y sus embriones se crean imágenes de la misma manera como control embriones. Para comparar las células a partir de embriones de RNAi para controlar los embriones, lo mejor para la imagen es en etapas similares de desarrollo embrionario (para ayudar a las formas celulares de los partidos y posiciones). Por ejemplo, hay una célula más grande visible en el centro del embrión durante recinto ventral que puede actuar como un buen punto de referencia para los neuroblastos de formación de imágenes (Figuras 4 y 5). El gen estudiado aquí, los ani-1 (anillin), organiza la contractilidad actomiosina, pero no se requiere para la citocinesis en el embrión temprano 23,29-30. Homólogos de anillin, sin embargo, son necesarios para la citocinesis en eucariotas superiores 16 y ani-1 se requiere para la citocinesis neuroblastos (Fotopoulos, Wernike y Piekny, observaciones no publicadas). Como se muestra en las Figuras 4B (vídeo 3) y 5B (vídeo 5), varios neuroblastos iniciar la citocinesis y sus membranas pellizco en, pero en lugar de formar dos hija separadacélulas, sus membranas regresión y las células se vuelven multinucleadas (> 1 núcleo / célula). Debe tenerse en cuenta que ani-1 puede ser necesaria para la división o la forma de cambio de otros tipos de células, que no se revela en este protocolo. Además, este protocolo no muestra resultados de ARNi específico de tejido (ver Discusión).

Figura 1
Figura 1. Recinto ventral durante C. elegans morfogénesis epidérmica. A) Proyecciones Z-stack (3 Z-pilas de 0,5 m de espesor) de un AJM-1 de control: las buenas prácticas agrarias (marcador de unión adherente de visualizar los límites celulares epidérmicas; ID deformación a la CGC SU159) embriones sometidos intercalación dorsal (izquierda, vista dorsal ) y un control AJM-1: Embrión GFP someterse recinto ventral (a la derecha, vista ventral). Las imágenes son invertidos para una mejor relaciónualize límites de las celdas. B) Dibujos animados muestran vistas ventrales de C. embriones elegans sometidos recinto ventral. En primer lugar, dos pares de células de borde de ataque (azul) utilizan actina rica filopodios (líneas negras) a migrar hacia la línea media ventral (embrión de la izquierda). A continuación, las células de bolsillo ventral posterior (rojo) migran hacia la línea media la creación de un agujero en la superficie ventral que puede cerrar por una bolsa de tabaco como mecanismo (B '; negro punteada línea / círculo, que recuerda a la cicatrización de heridas) 25. También se muestran los neuroblastos subyacentes (como círculos grises). El segundo embrión (B ") muestra cómo la migración de subconjuntos específicos de células epidérmicas están mediadas por un" puente "formado a partir de la reorganización de las células PLX-2/plexin y VAB-1/Ephrin que expresan el receptor 'de la banda plexin' (verde círculos). Haz click aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. ANI-1 localización en C. elegans embriones. Una) C. Una fijo elegans embrión expresar HMR-1: GFP (E-cadherina, marcador de límites celulares epidérmicas) costained para GFP (verde) y ANI-1 (rojo). Confocal de imágenes de las capas de células exteriores (4 Z-pilas de 0,2 micras de espesor) muestran que las células de la epidermis suprayacente y neuroblastos subyacentes, que son ANI-1 B positivo) fija N2 y N2;. Ani-1 RNAi embriones se tiñeron para co ANI-1. ANI-1 se reduce en gran medida en el embrión ani-1-empobrecido. Las barras de escala: 10 micras. Haz click aquí para ver la imagen más grande.


Figura 3. Visualización dividiendo neuroblast durante C. embriogénesis elegans. proyecciones pila Z (A) (20 Z-pilas de 0,2 m de espesor) se muestran a partir de un embrión de control de la coexpresión de HAM-1: GFP (para visualizar los núcleos neuroblast; verde) y mCherry: PH (para visualizar las membranas celulares; rojo) . Muchos neuroblastos y otros tipos de células son visibles en las proyecciones (b) proyecciones de Z-pila utilizando un número menor de aviones Z se muestran de otro embrión de control de la coexpresión de HAM-1:. GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). Un área está ampliada (caja blanca) para mostrar más claramente un neuroblast divisoria individual. Las flechas blancas indican la membrana plasmática ingressing de una célula en división como círculos verdes resaltar el ADN condensado durante la mitosis y recientementeformación de núcleos hijos hacia el final de la mitosis. La célula grande sirve como un punto de referencia (asterisco blanco) para determinar la etapa de desarrollo y la ubicación dentro del embrión. Las barras de escala:. 10 micras (blancos) y 3,5 m (amarillo) Haz click aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4
Figura 4. Visualización citocinesis neuroblast durante C. elegans embriogénesis utilizando un sistema de campo amplio. Proyecciones Z-stack A) invertidos (2 Z-pilas de 0,2 m de espesor) se muestran a partir de un embrión de control coexpressing HAM-1: GFP y mCherry: PH recogido desde el sistema de campo amplio utilizando una cámara CCD de alta resolución. Puntas de flechas rojas apuntan a neuroblastos divisorias con ingressing las membranas celulares. Los círculos verdes destacan ADN condensado durante las primeras fases de la mitosis o de nueva formación de núcleos hijos hacia el final de la mitosis / citocinesis. La célula grande sirve como un punto de referencia (asterisco amarillo) para determinar la etapa de desarrollo. B) Las imágenes mostradas son similares a A), pero son de un embrión tratado con ani-1 RNAi. Los ingresses de la membrana celular en que la célula procede a través de la mitosis, pero relaja poco después, dejando una célula multinucleadas. Barra de escala:. 10 m (negro), 3,5 m (amarillo) Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

La figura 5
Figura 5. Visualización citocinesis neuroblast durante C. elegans embriogénesis utilizando un sistema de barrido de campo. Proyecciones Z-stack A) invertidos de 2 Z-pilas de 0,2 micras (total 0,4 micras) se muestran a partir de un embrión coexpressing HAM-1: GFP y mCherry: PH recogido del sistema de campo de barrido utilizando una cámara EMCCD con alta sensibilidad, pero resolución más baja. La punta de flecha roja apunta a una citocinesis sometido neuroblastos. Los círculos verdes destacan ADN condensado durante la mitosis y la hija núcleos de nueva formación después de la citocinesis. La célula grande sirve como punto de referencia (asterisco amarillo) para determinar el grado de desarrollo. B) Las imágenes que se muestran son similares a A), pero son de un embrión tratado con ani-1 RNAi, y 3 Z-pilas se utilizan (total 0,6 micras ). Como se describió anteriormente, los ingresses de membrana en células a medida que avanza a través de la mitosis, pero luego se relaja haciendo que la célula se convierta en multinucleadas. Barra de escala: 10 m (negro), 3,5 m (amarillo).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Video 1. Visualizar neuroblastos dividen en C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-stack de dos planos Z (0,4 m / avión) de un embrión de control coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). Imágenes recogidas desde el microscopio de campo amplio se muestran para ambos canales. El vídeo se corresponde con el embrión se muestra en el tercer panel de la Figura 3B. Haga clic aquí para ver el vídeo.

Video 2. Visualizar neuroblastos dividen en C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-stack de dos planos Z (0,4 m / avión) de un embrión de control coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). El video corresponde a imágenes invertidas recogidas del microscopio de campo amplio para la mCherry: onl canal PHy (embrión en la figura 4A). Haga clic aquí para ver el vídeo.

Video 3. Visualización de los neuroblastos dividen en C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-stack de dos planos Z (0,4 m / plano) de un embrión tratado ani-1 RNAi coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). El video corresponde a imágenes invertidas recogidas del microscopio de campo amplio para la mCherry:. Único canal PH (embrión en la figura 4B) Haga clic aquí para ver el vídeo.

Video 4. Visualización dividiendo neuroblast durante C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-stack de dos planos Z (0,4 m / avión) de un embrión de control coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). El vídeo corresponde a invertirimágenes recogidas desde el microscopio confocal de barrido de campo para el mCherry ed:. único canal PH (embrión en la figura 5A) Haga clic aquí para ver el vídeo.

Video 5. Visualización dividiendo neuroblast durante C. embriogénesis elegans. Proyecciones Z-pila de tres planos Z (0,4 m / plano) de un embrión tratado ani-1 RNAi coexpressing HAM-1: GFP (verde) y mCherry: PH (rojo). El video corresponde a imágenes invertidas recogidas del microscopio confocal de barrido de campo para el mCherry:. Único canal PH (embrión en la Figura 5B) Haga clic aquí para ver el vídeo.

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Discussion

Este protocolo describe el uso de diversos tipos de microscopía de divisiones celulares imagen durante mediados embriogénesis. En particular, este protocolo pone de relieve cómo la imagen de la división de los neuroblastos, células que pueden facilitar la morfogénesis epidérmica. La comunicación de célula de la célula es importante para la formación de tejido durante el desarrollo de los metazoos y C. elegans es un modelo excelente para estudiar la formación de tejido in vivo. Un evento que representa muy bien la interacción de los tejidos es la morfogénesis epidérmica, que cubre el embrión en una capa de células epiteliales. En particular, el recinto ventral es el proceso en el que las células epidérmicas ventrales migran para encerrar la superficie ventral del embrión, y se basa en los neuroblastos subyacentes. Los neuroblastos proporcionan señales químicas o mecánicas, y el recinto ventral se ve comprometida si se altera la posición de los neuroblastos. El número (o polaridad) de neuroblastos también pueden ser esenciales para el recinto ventral que se produzca adecuadamente,y es importante para entender los mecanismos que regulan su división. Este protocolo se describe cómo la división celular imagen dentro de un tejido vivo usando C. elegans embriones coexpressing dos sondas fluorescentes (mCherry: PH para delinear las membranas plasmáticas y HAM-1: las buenas prácticas agrarias para etiquetar los núcleos neuroblastos).
Los pasos más esenciales para la imagen C. viven elegans embriones que expresan sondas fluorescentes son: i) utilizar, hermafroditas sanos jóvenes adultos que expresan los marcadores fluorescentes deseados (mantenidas a 20-25 ° C), ii) utilizar mutantes o RNAi para estudiar los requisitos de genes durante la formación de los tejidos, iii) recoger los embriones en el la derecha del escenario para microscopía (por ejemplo. mediados embriogénesis), y iv) realizar microscopía de fluorescencia con los ajustes optimizados para mantener fototoxicidad bajo, pero para mantener una alta calidad de imagen.

Para identificar las células específicas y / o compartimentos intracelulares dentro de un tejido de interés, utilice gusanos expresan marcadores etiquetados con pro fluorescentebes. El Centro de Genética Caenorhabditis (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) ofrece una variedad de cepas que coexpresan marcadores múltiples. Sin embargo, dos cepas (cada una expresando un único marcador de interés) pueden tener que ser cruzado y examinados con un microscopio de fluorescencia durante varias generaciones para generar una cepa que expresa de forma estable ambas sondas. Por ejemplo, para llevar a cabo este protocolo experimental, una cepa que expresa un marcador para visualizar las membranas celulares (mCherry: Ph; OP70) se cruzó con una cepa que expresa un marcador para visualizar los núcleos de neuroblastos (HAM-1: GFP; OP102) para generar una cepa coexpressing ambos.

La mejor manera de estudiar los requisitos de genes durante el desarrollo embrionario es llevar a cabo experimentos de pérdida de función, donde el producto génico es derribado o mutado. Este protocolo experimental se describe la realización de RNAi contra anillin (ani-1) para reducir endógenos ANI-1 los niveles en todos los tejidos embrionarios. Hay alelos hypomorphic no bien caracterizadosde ani-1. Por lo tanto, el ARNi es la mejor opción para examinar la pérdida de ani-1 's de fenotipos funcionales y determinar su función durante el desarrollo embrionario. Típicamente, es mejor utilizar mutantes en lugar de ARNi, como la eficiencia de la precipitación puede ser variable y rara vez es nulo. Uno de los problemas más comunes con la alimentación de los protocolos de ARNi es la contaminación, lo que reducirá la eficiencia de RNAi. Para disminuir el riesgo de contaminación, preparar las placas y el alimento de RNAi en condiciones asépticas. La contaminación puede ser detectada mediante el cribado de algunas de las placas antes de su uso, y placas con bacterias lechosas / opacas que buscan debe ser desechada. Otro problema que puede reducir la eficiencia de RNAi es por no elegir hermafroditas en la etapa de desarrollo derecho. Lo mejor es usar gusanos adultos L4 escenificados o jóvenes (la vulva desarrollo aparece como un círculo / agujero blanquecino en la parte ventral del gusano), que no tienen / pocos embriones fertilizados. Además, las condiciones y tratamientos de RNAi may variar para los diferentes productos génicos. Diferentes maneras para aumentar o disminuir la fuerza de la RNAi es resuspendiendo las bacterias HT115 sedimentadas en diferentes cantidades de medio LB Amp (ver Sección 1.2.2), y mediante la alteración de la duración del tratamiento de RNAi (longitud de tiempo que los gusanos se mantienen en placas de RNAi, véase el Protocolo no 3). Para obtener óptimos ani-1 RNAi fenotipos para este protocolo, las bacterias se resuspendieron en 500 l de medio LB Amp y gusanos se mantuvieron en placas de RNAi durante 2 días (ani-1 RNAi se caracterizó previamente por Maddox et al. 23). Cepas resistentes o sensibles RNAi (por ejemplo. Rde-1, SID-1 o RRF-3) también se pueden usar para alterar la fuerza de ARNi. Más importante, estas cepas se pueden acoplar con la expresión específica de tejido de sus genes tipo salvaje para crear cepas sensibles de tejidos. Por ejemplo, para llevar a cabo los neuroblastos específica de RNAi, se podría utilizar SID-1 embriones mutantes (RNAi-resistente) que expresan en peso UNC-119 (ID deformación a la CGC TU3401) 31.

Este protocolo se describe cómo la división de imagen de la célula neuroblast mediados embriogénesis. Hay varios aspectos del protocolo que requieren una cuidadosa consideración, tales como el estado de desarrollo de los embriones, la recogida de los Z-pilas adecuadas y la optimización de las condiciones de formación de imágenes para minimizar fototoxicidad sin comprometer la calidad de imagen. Para capturar momentos de la hora a la fase de desarrollo a la derecha (por ejemplo recinto ventral), los embriones deben ser filmados de intercalación dorsal (pares de células de la epidermis dorsal se entrecruzan y se fusionan para formar una sola capa de la epidermis en el lado dorsal del embrión; Figura 1A6). En este momento, los neuroblastos están dividiendo rápidamente. Desde la organización de los embriones puede ser difícil bajo bajo aumento (por ejemplo, usando un microscopio de disección), que ayuda a recolectar muchos embriones de diferentes etapas y embriones en ella derecha del escenario se puede seleccionar con mayor aumento.

Los neuroblastos son relativamente pequeñas y delgadas, y se encuentran en todo el centro del embrión. Es esencial para optimizar el número y el tamaño de Z-pilas para asegurar que se captura toda la célula durante la división. Por ejemplo, la recogida de demasiadas imágenes expondrá embriones a más luz y hacerlos propensos a la fototoxicidad. Sin embargo, la recogida de muy pocos Z-pilas o utilizando secciones Z gruesos podría hacer más difícil la imagen correctamente una célula entera neuroblast divisoria.
Este protocolo describe el uso de un microscopio confocal de barrido de campo o un sistema de división de imagen de campo amplio de células de neuroblastos. Como se describió anteriormente, una de las principales limitaciones del uso de un microscopio de epifluorescencia de campo amplio es el potencial de fototoxicidad. Si bien es muy recomendable utilizar un disco giratorio confocal o confocal de barrido de campo para la imagen C. elegans embriones, algunos laboratorios pueden tener acceso limitado a estos sistemas. Esta pROTOCOLO da algunas sugerencias para limitar fototoxicidad cuando se utilizan sistemas de campo amplio, tales como el cierre de la abertura a 30%, la reducción de la intensidad de luz de la bombilla de mercurio (o preferiblemente el uso de LEDs), usando una cámara EMCCD, y el aumento de la ganancia o binning para permitir una disminución en el tiempo de exposición. El número de Z-pilas y puntos temporales también se limitará el uso de un sistema de campo amplio. Aunque no se describe en este protocolo, el disco giratorio microscopio confocal se utiliza comúnmente para la formación de imágenes en vivo, ya que causa baja fototoxicidad en comparación con un microscopio de campo amplio. Similar al sistema de campo de barrido, que utiliza láseres de estado sólido y dispersa la luz (aunque en una forma diferente respecto al campo de barrido). Cualquiera de las cámaras CCD o EMCCD se pueden utilizar con el sistema de disco giratorio, que a menudo tiene múltiples puertos de la cámara para permitir la formación de imágenes doble. Al igual que en el microscopio de campo barrido, las imágenes se pueden capturar con tiempos de exposición de 50-90% más baja respecto al sistema de campo amplio.
Esta protocol se puede utilizar para estudiar la función de varios genes que regulan la mitosis durante la formación de tejido. El tiempo entre cada imagen podría reducirse (por ej. Cada 15 a 30 segundos vs. 2-3 min) para visualizar mejor los fenotipos mitótico. Diferentes sondas podrían ser utilizados (por ejemplo, en lugar de utilizar la HAM-1: GFP, H2B-etiquetado fluorescente podría ser utilizado para visualizar el ADN, y / o fluorescente marcado tubulina se podría utilizar para visualizar husos mitóticos.). El número de Z-pilas y el espesor de cada pila también podría ser alterado (por ejemplo, más pilas de un tamaño de paso más pequeño). Como se describió anteriormente, la elección de la configuración apropiada es crucial para limitar la fototoxicidad y la optimización de la calidad de imagen. A pesar de que la mCherry: PH y HAM-1: sondas GFP expresan en niveles relativamente altos, la recogida de los puntos de tiempo más rápidos, lo que aumenta el número de Z-pilas o imágenes durante períodos más largos de tiempo frente a lo que se describe en este protocolo no puede ser posible en un sistema de campo amplio.
Un im basada en Javaprograma de procesamiento de edad (ImageJ, NIH) se puede utilizar para procesar las imágenes recogidas por los diferentes microscopios y las imágenes se pueden exportar como archivos TIFF. Sin embargo, dependiendo del software utilizado para la adquisición, los archivos podrían ya ser compatible con el software de procesamiento. Es mejor abrir archivos originales vs imágenes exportadas (por ejemplo, TIFF), ya que los metadatos se mantiene con los archivos originales. Software de procesamiento puede ser usado para manipular las imágenes para la fabricación de figuras o películas. Además, los análisis cuantitativos también se pueden realizar, como la medición de intensidades de los píxeles en las regiones seleccionadas. Software óptimo debe seleccionarse en función del análisis, tales como procesamiento de imágenes Toolbox (MathWorks, Matlab) o 3D y 4D en tiempo real Interactive Data Visualization (Imaris, Bitplane).
Usando este protocolo, se mostró ani-1 que se requiere para la citocinesis neuroblastos, a pesar de que no se requiere para la citocinesis en el embrión temprano. Curiosamente, mediante el control de la numbre y la posición de los neuroblastos, ani-1 pueden regular la migración de las células epidérmicas ventrales para recinto ventral, ya que los neuroblastos proporcionan señales químicas o mecánicas a las células epiteliales suprayacentes. Sin embargo, no se sabe si se requiere ani-1 para la división o cambio de forma de otros tipos de células durante la embriogénesis tardía mediados. Mostrando cómo la composición total de un tejido afecta a los tejidos vecinos hace hincapié en la importancia de la comunicación tejidos durante el desarrollo de los metazoos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer que este trabajo recibió el apoyo de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) subvención.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

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References

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Neurociencia Número 85, La morfogénesis la citocinesis neuroblastos anillin la microscopía la división celular
Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis
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Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

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