Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisering neuroblast cytokinese Under Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan billedet dividere celler i et væv i Caenorhabditis elegans embryoner. Mens flere protokoller beskriver, hvordan du billedet celledeling i begyndelsen foster, denne protokol beskriver, hvordan billedet celledeling i et udviklingsland væv under midten sent embryogenese.

Abstract

Denne protokol beskriver anvendelsen af fluorescensmikroskopi billedet delende celler under udvikling af Caenorhabditis elegans embryoner. Især denne protokol fokuserer på, hvordan billedet dividere neuroblasts, som findes under de epidermale celler og kan være vigtige for epidermal morfogenese. Tissue dannelse er afgørende for metazoan udvikling og er afhængig af eksterne signaler fra omkringliggende væv. C. elegans er en fremragende model organisme for at studere vævsmorfogenese in vivo på grund af dets gennemsigtighed og enkel organisation gøre sine væv nemt at studere via mikroskopi. Ventral kabinettet er den proces, hvor den ventrale overflade af embryoet er dækket af et enkelt lag af epitelceller. Denne begivenhed menes at være lettet af de underliggende neuroblasts, som giver kemisk vejlednings stikord til at mægle migration af de overliggende epitelceller. Men neuroblaster er yderst proliferativ og kan også fungeresom en mekanisk substrat for ventrale epidermale celler. Undersøgelser ved hjælp af denne forsøgsplan kunne afdække betydningen af ​​intercellulær kommunikation under vævsdannelse og kunne anvendes til at afsløre de roller gener involveret i celledeling i udviklingslandene væv.

Introduction

Mens der er protokoller, der beskriver, hvordan billedet celledeling i begyndelsen C. elegans embryo, denne protokol beskriver, hvordan billedet celledeling i et væv under midten embryogenese. En af de store udfordringer i billeddannelse organismer under udvikling har været deres følsomhed over for fototoksicitet. Imidlertid har øget adgang til spinning disk konfokal mikroskoper eller fejes felt mikroskoper tilladt mere udbredte billedbehandlingsprogrammer. Begge systemer bruger solid state lasere og lysspredning, begrænse niveauerne af UV at organismerne udsættes for. Dog kan Widefield stande stadig bruges til billeddannelse in vivo, især hvis de er udstyret med kameraer med høj følsomhed (f.eks EMCCD), blænde kontrol og lysstyring (f.eks lysdioder eller justerbare kviksølv pærer). Denne protokol beskriver, hvordan man bruge enten en konfokal baseret system eller et vidvinkel-system til billede celledeling indenfor udviklingen af C. elegans </ Em> embryoner. Som et eksempel beskriver vi, hvordan billedet neuroblast celledeling. Neuroblasts kan lette epidermal morfogenese ved at give kemiske eller mekaniske signaler til de overliggende epidermale celler, og giver et glimrende eksempel på, hvor vigtigt det intercellulære kommunikation i dannelsen af ​​væv.

Caenorhabditis elegans er en ideel model organisme til mikroskopi baserede undersøgelser, på grund af sin åbenhed og enkle væv organisation 1. Endvidere C. elegans er modtagelig for genetiske metoder og RNAi, og da mange af dens gener har humane homologer, kan den anvendes til at identificere konserverede mekanismer til vævsdannelse 2-5. I C. elegans, dannelse af overhuden sker i midten embryogenese, når fosteret har> 300 celler. Epidermal morfogenese består af flere vigtige faser, hvorunder foster er indesluttet i et lag af epidermale celler, snøre og udvide til at omdanne embryo fra en ægformet form til den aflange form af en orm 6. Ventral kabinet beskriver en af disse morfogenetiske begivenheder, når ventrale epidermale celler migrere til den ventrale midterlinie til at dække den ventrale overflade af embryo (figur 1). Først to par forreste placeret forkant celler migrere til den ventrale midterlinjen hvor de klæber og sikring med deres kontralaterale 6 naboer. Dette efterfølges af migrationen af de posteriore placeret lomme celler, som danner kile lignende figurer skaber en ventral lomme 6-7. Den mekanisme, som lukker lommen er ikke godt forstået. En mulighed er, at en supracellular actin myosin kontraktile struktur binder pocket celler sammen i en pung streng som mode, svarende til sårheling 8. Interessant er migration af nogle af pocket-celler medieres af specifikke delmængder af underliggende neuroblaster 9 (neuronale prækursorer, der er fundet under epidermis; Figur 1B).

Tidligere undersøgelser viste, at de neuroblaster regulere ventrale epidermal cellemigration og ventrale kabinet. VAB-1 (Ephrin receptor) og VAB-2 (Ephrin ligand) er stærkt udtrykt i neuroblaster og lette sorteringen af forreste og bageste neuroblaster fra hinanden, og mutationer i VAB-1 eller VAB-2 årsag ventrale kabinet Fænotypers 10-13. Imidlertid viste promotor redning eksperimenter, VAB-1 også er påkrævet i de overliggende ventrale epidermale celler og receptorer for andre vejledende tidskoder udskilles af neuroblaster udtrykkes i ventrale epidermisceller 9. Selvom mutationer i nogen af disse receptorer forårsager ventrale kabinet fænotyper, er det ikke klart, om fejl opstår på grund af problemer i neuroblast positionering eller på grund af svigt af ventrale epidermale celler til at reagere på vejledning tidskoder 14. Ændring af opdelingen af ​​neuroblasts without påvirker deres evne til at udskille vejledning tidskoder kunne kaste lys over den rolle af neuroblasts og deres evne til at levere mekanisk input under epidermal morfogenese. For nylig blev det konstateret, at en celledeling gen, ani-1 (anillin) er overudtrykt i de neuroblasts (figur 2a) og udtynding forårsager neuroblast division defekter. Interessant, disse embryoner vise ventrale kabinet fænotyper (Fotopoulos, Wernike og Piekny, upublicerede observationer).

Anillin er nødvendig for celledeling, og især for cytokinese, der beskriver den proces, hvor en mor celle fysisk deler sig i to datterceller. Cytokinese er drevet af dannelsen af ​​et actomyosin kontraktile ring, som skal stramt kontrolleret i rum og tid til at sikre, at det er korrekt kombineret med søsterkromatid adskillelse. Føreren regulator af metazoan cytokinese er RhoA (RHO-1 i C. elegans), en lille GTPase, der er enctive i GTP-bundne form,. GEF Ect2/ECT-2 aktiverer RhoA, hvorefter RhoA-GTP interagerer med nedstrøms effektorer, der danner den kontraktile ringen og formidler sin indtrængen 15.. Anillin er et multi-domæne, der binder til RhoA via sin C-terminale ende og actin og myosin via sin N-terminus. Anillin er nødvendig for at stabilisere positionen af den kontraktile ringen i pattedyrs-eller Drosophila-S2-celler 16. Anillin udtømning forårsager kontraktile ringe til at gennemgå laterale svingninger, og cytokinese sidst fejler danner multinucleate celler 17-19. Interessant, selvom C. elegans ani-1 koordinater actomyosin kontraktilitet i det tidlige embryon, er det ikke afgørende for cytokinese. Men som beskrevet ovenfor, er ani-1 kræves for neuroblast cytokinese i midten af embryogenese (Fotopoulos, Wernike og Piekny, upublicerede observationer). Cytokinese fiasko ville ændre på antallet og placeringen af ​​neuroblasts og kan påvirke locning af kemiske vejledning tidskoder, eller det kan ændre de mekaniske egenskaber af vævet. Begge modeller fremhæve nonautonomous rolle neuroblasts for ventrale kabinet, og betydningen af ​​væv-væv kommunikation under fosterudviklingen.

Denne forsøgsprotokol beskriver, hvordan man billedet celledeling under C. elegans midten embryogenese ved hjælp af fluorescensmikroskopi. De fleste eksperimenter studere mekanismer celledeling blev udført i enkelte celler i dyrkningsskåle (f.eks. HeLa-eller S2-celler) eller tidlige embryoner med et begrænset antal celler (fx C. elegans en celle embryon Xenopus eller echinoderm embryoner). Men det er også vigtigt at undersøge celledeling i væv, som der er eksterne signaler, der kan påvirke timing og placering af divisionen flyet. Desuden kan celler giver kemiske eller mekaniske signaler at påvirke udviklingen af ​​tilstødende vævs, og det er vigtigt at forstå, hvordan intercellulær kommunikation hjælper væv dannes under udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Fremstilling af plader til Opretholdelse Worm Stammer og Performing RNAi

  1. Nematodevækst Media Plates
    1. Plader
      1. Forbered nematodevækst Media (NGM) plader for at opretholde ormen stammer og til at udføre genetiske kors. Kombiner 3 g NaCl, 17 g agar og 2,5 g bactopepton med 1 liter destilleret vand i en 2 liters kolbe og tilsættes et metal omrørerstav.
      2. Autoklaver kolben for at opløse agaren og at sterilisere mediet. Derefter anbringes kolben på en omrøringsplade og lade medierne til at køle af under omrøring.
      3. Når medierne er kølet ned og er stadig noget varmt at røre ved (45-50 ° C), tilsættes 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol-opløsning og 25 ml 1 M kaliumphosphatbuffer (PPB, opskrift i tabel af reagenser / materialer filter sterilisere stamopløsninger) og straks hælde medierne i små petriskåle (60 mm x 15 mm, fylde skålene ~ 3/4 til toppen eller 13 ml / plade USIng en automatiseret dispenser). Bemærk: Der kan tilføjes vedligeholdelse af nogle stammer tetracyclin lang sigt pladerne (12,5 ug / ml) for at give Tn10 transposon inaktivering af bakterielle RNAse III-gen.
      4. Lad medierne størkne natten over ved stuetemperatur. Bemærk: Plader bør holdes i en biologisk hætte eller i et område af lab, der er mindre udsat for forurening. Også fjerne enhver kondens, der har bygget op på låget (fx rene med silkepapir) at begrænse svampeangreb. Hvis Tetracycline også tilsættes til pladerne, og derefter dække dem med aluminiumsfolie, da dette antibiotikum er lysfølsomt.
      5. Den næste dag, frø de tørre NGM plader med en suspension af E. coli (OP50 stamme; se afsnit 1.1.2), som er blevet nænsomt vortexet. For at gøre plader til parring, tilsættes ~ 50 pi OP50 til midten af ​​hver plade (for at danne en lille cirkel). For at gøre plader for at opretholde ormen stammer, frø hver NGM plade med ~ 100-200 ml OP50 (tilsikre, at den dækker et større område af pladen).
      6. Lad podede plader tør O / N ved stuetemperatur.
      7. Den næste dag, drej de tørrede NGM plader på hovedet og stak dem i plast opbevaringsbeholdere ved 4 ° C. Bemærk: Plader er anvendelige op til ~ 3-4 uger. Plader indeholdende Tetracyklin bør holdes i mørke.
    2. Fødevarer
      1. Brug E. coli OP50 [fra Caenorhabditis Genetik Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] som en fødekilde for C. Bemærk elegans:. OP50 kan lagres som glycerolstamopløsninger ved -80 ° C (i forholdet 1:1 i 50% v / v glycerol).
      2. For at gøre OP50 for NGM plader, gør en stribe pladen ved hjælp af en lille portion af glycerol lager (<10 pi, brug en steril pipette tip). Spred bakterier på en LB-agar plade (opskrift i tabel af reagenser / materialer), og lade det blive ved 37 ° C i ~ 16 timer. Bemærk: Hvis der er problemer med forurening, kan streptomycinresistent OP50 anvendes ennd streptomycin kan tilsættes til LB agarplader (50 ug / ml).
      3. Den næste dag, plukke en enkelt koloni og pode 100 ml flydende LB medier (opskrift i tabel af reagenser / materialer) i en 500 ml kolbe.
      4. Lad kulturen vokse O / N ved 37 ° C med omrystning.
      5. Den næste dag, skal du bruge den bakterielle suspension til såning NGM plader. Bemærk: OP50 kan alikvoteret i 50 ml koniske rør og opbevaret ved 4 ° C i ~ 4-6 uger.
  2. RNAi
    Fodring er en af de vigtigste måder at udføre RNA medieret interferens (RNAi, at Knockdown et specifikt gen produkt) i C. elegans. C. elegans hermafroditter kan fodres E. coli-stamme HT115 transformeret med en fodring vektor, der udtrykker dsRNA efter induktion. Dette dsRNA (eller dets fragmenter) overføres til gonaden, hvilket sædvanligvis resulterer i væsentlig knockdown af den specifikke gen-mål.
    1. RNAi Plates
      1. Forbered NGM plader som beskrevet ovenfor (se afsnit 1.1.1), men også tilføje 1 ml 1 M IPTG (isopropylthio-beta-D-galactosid, at inducere ekspression af dsRNA) og 500 ml 50 mg / ml ampicillin (Amp, de vektorer, der udtrykker dsRNA er Amp -resistent) til varme medier (45-50 ° C).
      2. Efter at pladerne har tørret, frø dem med ~ 50-100 pi E. coli HT115 (se afsnit 1.2.2). Bemærk: unseeded plader kan opbevares ved 4 ° C i ~ 4-5 uger.
      3. Lad podede plader tørre natten over ved stuetemperatur.
      4. Den næste dag, drej de tørrede RNAi plader på hovedet og gemme dem i en plastik opbevaring beholder ved 15-20 ° C. Bemærk: Medfølgende plader bevarer RNAi effektivitet for op til ~ 2-3 uger.
    2. RNAi Food
      1. Brug E. coli HT115 (fra CGC, se afsnit 1.1.2) transformeret med fodring vektor L4440 eller L4440 indeholdende cDNA til et gen af interesse. Bemærk: Fodring biblioteker, der er målrettet de fleste af åbne læserammer i genometDer er allerede gjort, og er til rådighed (kloner i L4440 omdannet til HT115, fx indeholdende et fragment fra Y49E10.19 for ani -1 20-21. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / sider / rnai.html). Bemærk: HT115 kan holdes som glycerolstamopløsninger ved -80 ° C (i forholdet 1:1 i 50% v / v glycerol).
      2. For at generere en ny konstruktion rettet mod et gen af ​​interesse, se L4440 vektor kort og klon cDNA mellem de flankerende T7 promotere, som er inducerbare ved IPTG.
      3. Omdan HT115 med L4440 konstruktion ved hjælp af en standard-protokol til transformation (fx gøre kemisk kompetente bakterier og udføre varmechok transformation).
      4. Som beskrevet for OP50 (se afsnit 1.1.2), skal streak bakterier fra glycerolstamopløsning på en LB-agarplade, men pladen også indeholder 50 ug / ml ampicillin. Bemærk: Hvis du bruger en allerede eksisterende L4440 konstruktion springe afsnit 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Vælg en enkelt koloni og podes 5 mlLB medier indeholder 5 ul ampicillin fra en 50 mg / ml lager (LB Amp), og placer den ved 37 ° C under omrystning.
      6. Efter ~ 16 timer inokulere 5 ml frisk LB Amp medie med 50 pi O / N-kulturen og vokse kulturen i 7-8 timer med omrystning ved 37 ° C.
      7. Centrifuger bakterier i 1 min på 4.000-8.000 xg, supernatanten, og pellet resuspenderes i 500 pi frisk LB Amp medier.
      8. Brug denne bakteriel løsning til frø af RNAi plader som beskrevet ovenfor (se afsnit 1.2.1). Bemærk: HT115 bør anvendes straks og må ikke opbevares.

2. Dyrke Worm Stammer

Vedligehold C. elegans stammer bestilt fra CGC på NGM plader i henhold til standard-protokol 1. Stammer, der anvendes for denne protokol omfatter: C. elegans var Bristol, vildtype (stamme-ID på CGC N2), UNC-119 (tm4063) wgIs102 [skinke-1 UNC-119 (+)] (stamme-ID på CGC OP102), UNC-119 (ed3) ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (stamme-ID på CGC OD70), AJM-1 (OK-160), jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (stamme-ID på CGC SU159), UNC-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (stamme-ID på CGC FT250).

  1. Pick ~ 3 unge voksne hermafroditter, der viser den korrekte fænotype til en frisk NGM plade. Bemærk: N2 (var. Bristol, vildtype) kan holdes mellem 15-25 ° C, men de vil nå tæthed hurtigere ved højere temperaturer. Nye bestande bør foretages, når ormen tæthed er høj.
  2. Hold alle fluorescerende stammer (f.eks GFP og / eller mCherry-udtrykkende orme) ved 20-25 ° C for optimal ekspression af fluorescerende proteiner. Nye bestande bør foretages, når ormen tætheden er høj, og maden er lav.
  3. At vælge orme, bruge enplukke lavet af en trukket glas pipette med en platintråd fusioneret ved trukket ende (~ 3-5 cm i længden). Flatten wiren med en glat kant. Brug pick til 'scoop' op hermafroditter og overføre dem på nye plader. Flamme wire i mellem brug for at undgå krydskontaminering af stammer.

3. RNAi

  1. Udførelse af RNAi
    1. Først til sted ~ 8 L4 hermafroditter på en unseeded NGM plade til ~ 30-60 min fjerne OP50 bakterier fra orme.
    2. Derefter placeres de 8 hermafroditter på en NGM Amp IPTG plade tilsået med HT115, der bærer L4440 plasmid, der udtrykker dsRNA til et gen af interesse (f.eks ani-1;. Se 1.2) for ~ 24 timer. Bemærk: Afhængigt af genet af interesse, eller de ønskede fænotyper (som kan afhænge af styrken af ​​knockdown) kan orme efterladt på RNAi plader til kortere eller længere perioder (efter 24 timer, skal du placere hermafroditter på frisk RNAi plader).
    3. For en negtive kontrol, placere orme på en RNAi plade tilsået med HT115 bærer den tomme L4440 vektor. Bemærk: Disse embryoner skal have nogen fænotyper.
    4. For en positiv kontrol, placere orme på en RNAi plade udtrykker dsRNA der retter sig mod et gen med velkarakteriserede fænotyper. Bemærk: rho-1 (Y51H4A.3), embryoner er 100% dødelig efter 24 timer og hermafroditter er sterile efter 48 timer.
  2. RNAi Effektivitet
    Bør testes Niveauerne af knockdown af RNAi, især fordi nogle væv kan være mere modstandsdygtige end andre. I den tidlige midten embryogenese fleste væv er RNAi-følsomme, men i slutningen af ​​embryo eller larve, neuroner RNAi-resistente. Forskellige stammer kan anvendes til at forbedre RNAi følsomhed (f.eks rrf-3), eller til at generere vævsspecifik RNAi (f.eks sid-1 i kombination med et transgen udtrykt ved neurale promotor unc-119).
    1. Western Blotting
      Immunoblotting under anvendelse af C. elegans proteiner kan væreudføres i henhold til standard-protokol 22.
      1. Efter at have udført RNAi, indsamle ~ 10 gravide (fyldt med embryoner) hermafroditter i et mikrocentrifugerør, tilsættes 20-30 pi 1x SDS-PAGE prøvebuffer og lyseres ved kogning i ~ 2 min. Ligeledes indsamle N2 orme i et separat rør til kontrolprøven. Bemærk: Antallet af hermafroditter kan variere afhængigt af følsomheden af ​​de primære antistoffer.
      2. Opret fortyndinger af kontrolprøven (fx 3-100%) i prøve buffer. Load kontrol og RNAi prøver og køre ved SDS-PAGE som standardprotokol (for% gel vil variere afhængigt af størrelsen af ​​proteinet af interesse).
      3. Overfør gelen til en membran og udføre immunoblotting som pr standardprotokol. Bemærk: Brug forskellige primære og sekundære antistoffortyndinger som anbefales for hvert antistof.
      4. Udvikle (fx hvis du bruger kemoluminescens) eller scanne (fx hvis du bruger fluorescens) immunoblottet og sammenligne the tæthed af bånd i N2 baner vs RNAi lane, og bestemme niveauet af knockdown (fx tæthed RNAi lane matcher kontrol-banen 12%, antyder dette, at proteinet er reduceret med 88%). Bemærk: For at se effektiviteten af ANI-1 knockdown, se Maddox et al 23.
    2. Immunfarvning
      Immunfarvning i C. elegans kan udføres i henhold til standard-protokol 22.
      1. Efter at have udført RNAi, indsamle Gravid hermafroditter og høst embryoner ved hjælp af en af ​​to metoder. For en af ​​de metoder, sted hermafroditter i M9 buffer (opskrift i tabel af reagenser / materialer) i 1,5 ml siliconebehandlede mikrocentrifugerør og pellet ved centrifugering (1.000-4.000 xg). Bemærk: På samme måde indsamle N2 gravide hermafroditter.
      2. Fjern M9 løsning.
      3. Udvise embryoner ved at tilsætte 1 ml blegende opløsning (1 M NaOH, 5% blegemiddel) til mikrocentrifugerør i 3 minutter. Tilsvarende blegemiddel N2 hanrmaphrodites at gøre kontrol dias.
      4. Vortex forsigtigt, derefter straks pellet embryoner via centrifugering (4.000-8.000 xg) og fjern blegning løsning. Bemærk: Den samlede tid, som ormene inkuberes med blegemiddel må ikke overstige 5 min.
      5. Vask embryoner 3x med Tris pufret saltvand (TBS, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl) og overføre embryoner ved et glas Pasteur-pipette på en poly-L-lysin-coatede objektglas. Bemærk: For at belægge et objektglas med poly-L-lysin, først tørre det dias, hvorefter der tilsættes en dråbe (~ 20-30 ul) af poly-L-lysin og sprede det jævnt hen over overfladen og lad tørre. For at opnå optimale resultater, pels slides to gange mere. En alternativ metode til at indsamle embryoner (Kategori 3.2.2.1-3.2.2.5) er at placere en dråbe af M9 på en poly-L-lysin-coatede objektglas og pluk ~ 10 GRAVID hermafroditter i drop.
      6. Tilføj et dækglas på toppen af ​​hvert objektglas (til det område, der indeholder de fleste af de embryoner) og steddias i flydende kvælstof. Bemærk: hermafroditter placeres direkte i drop, lægge pres på dækglasset at bryde åbne hermafroditter og bortvise embryoner.
      7. Fryse-knække embryoner ved at svirpe off dækglas umiddelbart efter frysning dem i flydende nitrogen.
      8. Placer dias i iskold methanol i 20 min at fastsætte embryoner. Bemærk: På nogle antigener, kan en tværbindende fiksativ, såsom paraformaldehyd være at foretrække. Se protokollen fra Duerr 22.
      9. Rehydrere og permeabilisere embryoner ved vask af objektglassene 4x med Tris-bufret saltvand indeholdende Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,1% Tween-20) i 10 minutter hver.
      10. Tør hver slide omkring det område, der indeholder de fleste af embryonerne og tegne en cirkel omkring embryoner ved hjælp af en flydende blokering pen (f.eks PAP pennen).
      11. Tilføj ~ 100 ul af TBST med 5% normalt æsel serum (NDS, blok) til hvert dias (cirkel område) og inkuberes i20 min ved RT. Bemærk: Anbring dine dias i en 'våd kammer «(f.eks et fad med låg, der indeholder våde papirservietter).
      12. Fjern blokken tilsættes ~ 50-100 ul af primære antistoffer (fortyndet i TBST) til hvert objektglas (cirkel-området) og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Bemærk: Afhængigt af antistoffet, kan fortynding og inkubationstiden varierer. Til påvisning GFP, bruger vi et anti-muse-anti-GFP primære antistof i en 1/200 fortynding. For at detektere ANI-1, bruger vi en anti-kanin anti-ANI-1 primære antistof i en 1/1600 fortynding (venligst stillet til rådighed af Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). For længere inkubationstider placere dias ved 4 ° C.
      13. Fjern primære antistoffer (hvis det er muligt, holde til fremtidig brug) og vaskes slides 3x med TBS i 5 min hver.
      14. Fjern den sidste vask, og der tilsættes ~ 50-100 pi sekundære antistoffer (fortyndet i TBST) til hvert objektglas (cirkel-området) og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Bemærk: Afhængigt af antistoffet, kan fortynding variere. For at detektere GFP, bruger vi en aNTI-mus Alexa Fluor 488 sekundært antistof i en 1/250 fortynding. For at detektere ANI-1, bruger vi en anti-kanin Alexa Fluor 568 sekundært antistof i en 1/250 fortynding.
      15. Fjern sekundære antistoffer og vaske slides 3x med TBS i 5 min hver. Bemærk: For at plette DNA tilføje ~ 50-100 ul DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindol, 1 mg / ml) ved 1/500 fortynding i TBST i 5 min.
      16. Fjern DAPI og vask slides 2x med TBS i 5 min hver. Bemærk: Hvis DAPI farvning ikke er udført, skal du springe denne ekstra vask trin.
      17. Udføre en hurtig vask med 0,1 M Tris (pH 9), fjerne og tilføje ~ 15 pi monteringsmedie forvarmet til 37 ° C (4% n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoat (propylgallat), 50 mM Tris, pH 9 i 50% glycerol) til hvert objektglas (cirkel-området).
      18. Tilføj et dækglas til hver dias (på toppen af ​​montering medier i kredsede område), væge det overskydende væske og forsegle dias med neglelak. Bemærk: Slides kan opbevares ved -20 ° C.
      19. Overhold embryoner pådias ved hjælp af en vidvinkel fluorescensmikroskop eller laserscanning konfokal mikroskop. Vigtigere er det, at justere indstillingerne til at indsamle billeder af optimal pixelintensitet hjælp kontrol (N2 eller ikke-RNAi) embryoner. Derefter indsamle billeder fra RNAi embryoner ved hjælp af de samme indstillinger. Eksempler på billeder, der er indsamlet til kontrol vs ani-1 RNAi embryoner er vist i figur 2B.

4.. Udarbejdelse af Slides til Live Imaging og Høst Embryoner

  1. Udarbejdelse af agarose puder til direkte billedvisning
    1. Placer en ren, præ varmede objektglas mellem to andre dias, hver med 1-2 strimler af tape på dem.
    2. Ved hjælp af en glas Pasteur-pipette, tilsættes en dråbe 2% w / v agarose (opløst i opvarmet destilleret vand) til objektglasset.
    3. Hurtigt placere en anden, ren objektglas oven på det første dias i en vinkelret måde at flade agarose dråbe. Bemærk: Den tape på tilstødende gledes giver tykkelse for puden.
    4. Lad agarose pad tør for en 1-2 min, før du fjerner den øverste dias. Skub off toppen glide forsigtigt for at undgå at bryde agarose pad nedenunder. Bemærk: Nogle gange puden overføres til den øverste dias og er stadig brugbar, så længe det forbliver intakt.
    5. Overfør embryoner på agarose puden inden for et par minutter efter dens fremstilling som beskrevet nedenfor (se trin 4.2). Bemærk: Puden bør have et opakt udseende, når det er klart, det er for tør til at bruge.
  2. Høst embryoner
    1. Brug følgende protokol for indsamling af embryoner til billeddannelse, som er afledt af Sulston et al. 24.
    2. Pick ca 4-6 Gravid voksne (ikke sultet) fra NGM eller RNAi plader og placere dem i 20-30 pi M9 buffer i en brønd på en depression dias.
    3. Brug en steriliseret skalpel til at skære orme på hver side af spermatheca (eller alternativt i nærheden af ​​vulva) tilfrigive embryoner i opløsningen.
    4. Brug en gummislange med et mundstykke forbundet til en glaskapillar / pipetten trukket at have en lille boring og suge embryoner gennem munden pipettering. Alternativt indsamle embryoner med en kapillær glasrør, der er knyttet til en Pasteur-pipette gummibold.
    5. Overfør suctioned embryoner til en anden vel også indeholder M9 buffer, for at hjælpe adskille dem fra ormen vragrester.
    6. Derefter suge embryoner onto en frisklavet agarose pad (se trin 4.1).
    7. Klump embryoner sammen ved hjælp af en øjenvippe (limet til en tandstikker) for at øge antallet af embryoner, der kan blive filmet i en x, y-planet. Bemærk: For at undgå ilt afsavn, ikke klumper mere end 10 embryoner sammen.
    8. Dernæst dække slide med et dækglas og delvist forsegle det med pre opvarmet væske VALAP (vaseline, lanolin og paraffin, smeltet og kombineret 01:01:01) for at forhindre dehydrering af embryonerne under billedbehandling. Bemærk: Yderligere M9 buffer can hvormed puden for at sikre, at embryoer har tilstrækkelig væske til billeddannelse. I stedet for VALAP kan vaseline anvendes til delvis at forsegle dækglas, men det er mindre stift forårsager dækglassene til at glide og kunne få onto mikroskop mål.

5.. Live-Imaging

  1. At visualisere neuroblasts, få en orm stamme, der udtrykker en neuroblast-specifikt protein bundet til et fluorescerende protein (f.eks HAM-1: GFP, stamme-ID på CGC OP102). For at detektere cellemembraner, bruge en orm stamme, der også udtrykker et protein domæne, der genkender lipider knyttet til et andet fluorescerende protein (f.eks mCherry:. PH, stamme-ID på CGC OD70).
  2. Harvest embryoner fra fluorescerende hermafroditter holdes på kontrol eller ani-1 RNAi plader (se protokol 3 og 4), og forberede slides som beskrevet ovenfor (se protokol nr. 4).
  3. Billede embryoner i 4D (x, y, z og time-lapse) af epifluorescens-mikroskopi. Brug enten en widefield systemet [automatiseret fluorescerende mikroskop med filtre for GFP og TexasRed, mål op til 60X eller 100X, en høj opløsning CCD (Charge Coupled Device) kamera, meget motoriseret scene (f.eks. Piezo Z) og specialiseret erhvervelse af software], eller en livescan fejet felt konfokal mikroskop [automatiseret fluorescerende scanning mikroskop med 488 nm og 561 nm lasere, mål op til 100X, en EMCCD (elektron multiplicere CCD) kamera, meget motoriseret scene (f.eks Piezo Z) og specialiseret erhvervelse af software]. Bemærk: For Widefield system, vil ved hjælp af lysdioder og en EMCCD kamera begrænse fototoksicitet. Desuden kan en roterende skive konfokalt mikroskop anvendes i stedet for det bestrøgne område systemet.
  4. Til billedet neuroblast celledeling på begge systemer, finde x, y rammer af embryoner ved hjælp af de 10X eller 20X mål og vælge en optimal x, y ramme hvor embryonerne undergår dorsal intercalation (skridt forud for ventrale kapsling; figur 1A) eller er i de tidlige faseraf ventrale kabinet (~ 350 min efter den første celledeling, figur 1A).
  5. På fejede felt mikroskop, skal du bruge 488 nm og 561 nm 100 mW lasere ved 40% effekt med en slids på 50. På Widefield systemet, skal du bruge GFP og TexasRed filtre med lav middel lysintensitet (hvis styret). Bemærk: For Widefield systemet, lysdioder har lav fototoksicitet og er at foretrække.
  6. På begge systemet, skal du bruge olie immersionsobjektiver 60X eller 100X og indsamle 20 Z-stakke af 0,2 um hver 2 min i alt 10 min. Bemærk: Selvom HAM-1: GFP og mCherry: PH sonder udtrykker på relativt høje niveauer, vil eksponering tider for hver probe skal være optimeret til forskellige mikroskoper. Bemærk: For Widefield systemet er færre Z-stacks anbefales at begrænse fototoksicitet og til billeddannelse over længere perioder, bruger færre tidspunkter.
  7. For at minimere fototoksicitet forårsaget af udsættelse af fostre for UV-lys på Widefield systemet (hvis du bruger en mercUry pære), luk blænden til 30% og sænke lysintensiteten (ved hjælp af en justerbar belysning system). Bemærk: Selvom gevinsten ikke er nødvendigt at bruge begge systemer, kan andre mikroskoper har lyskilder med lavere intensitet eller målsætninger med forskellige numeriske åbninger, hvilket kan kræve brug af gevinsten til at få billeder af optimal pixelintensitet. Test betingelserne ved at bruge en kontrol foster for at sikre, at eventuelle observerede fænotyper skyldes ikke kunstig fototoksicitet.

6.. Analyse af Microscopy data

  1. At analysere billeder, eksportere filer som TIFF og åbne TIFF som en stak hjælp af specialiseret software som et Java-baseret billedbehandling program (f.eks ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Bemærk: Afhængigt af købet software, der bruges til at indsamle billeder, kan filerne opbevares i deres oprindelige form og åbnede i ImageJ. Det er at foretrække, da metadata er holdt med filerne.
  2. Adskil stakkenind i "billeder" og vælge tidspunkter og Z-fly som ønsket. Bemærk: Selv om en stak på 20 Z-fly er taget mange af de neuroblasts er <1 um tyk under midten sen embryogenese og der er behov kun et par Z-fly.
  3. Omstakke de udvalgte Z planer for hvert tidspunkt og lave særskilte Z-stack fremskrivninger. Derefter stak fremskrivningerne for hvert tidspunkt sammen for at gøre en tid sekvens.
  4. Foretag justeringer af lysstyrke-og / eller kontrast for hver kanal.
  5. Vælg derefter et område af interesse, afgrøde (og rotere om nødvendigt) i regionen.
  6. Opret flettede billeder ved hjælp af 'flettede kanalernes funktion og vælge en anden farve for hver kanal. Konverter fusionerede billeder til RGB.
  7. Invert gråtonebilleder for hver kanal fra trin 6.3 eller 6.4 (brug "invert" funktion under 'rediger') mere klart at visualisere billeder.
  8. Gem alle endelige billeder som 8-bit TIFF til at gøre figurer i vektor baseret softwer programmer eller som Quicktime filer for at gøre film.
  9. Hvis der er behov for målinger af pixelstørrelse (fx til at omfatte en skala bar med billederne), brug ImageJ eller anden billedbehandling software til at måle størrelsen af embryoet. Bemærk: Billederne er indsamlet ved hjælp af forskellige mål vil have forskellige pixel størrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne forsøgsprotokol beskriver, hvordan man billedet celledeling i C. elegans embryoner under midten embryogenese. Især det beskriver, hvordan billed neuroblasts, der kan lette epidermal morfogenese. Epidermal morfogenese opstår på grund af en kombination af epidermal celle form ændringer, migration og adhæsion, men også er afhængig af kemiske eller mekaniske signaler fra de underliggende neuroblasts (figur 1b). De neuroblaster udskiller vejledning signaler, der modtages af receptorer på overfladen af ventrale epidermale celler, som regulerer deres vandring 10,14,25. Desuden neuroblasts er meget proliferativ, som kan give mekaniske kræfter, der bidrager til migreringen af ventrale epidermale celler 26. Denne protokol kan bruges til at studere neuroblast celledeling i midten embryogenese. Først embryoner coekspression markører til at visualisere neuroblasts (HAM-1: GFP) undergår cytokinese: er (mCherry PH), der genereres. HAM-1: GFP udtrykker GFP (grønt fluorescerende protein) mærkede protein, som lokaliseres neuroblast kerner 27, og det er nødvendigt at bruge, da der er mange andre celletyper stede under midten af embryogenese (> 300 celler, Figur 3). Det fungerer også som en god markør for delende celler, idet DNA kondenserer i kromosomer under mitose. mCherry: PH er en mCherry-mærket fluorescerende protein, der udtrykkes af en maternel promotor (cirkel-1), og indeholder lipid-bindende domæne fra PLC1 ∂ 1 28, der lokaliseres til cellemembraner. Dette protein er nødvendigt for at visualisere cytokinese, når membranen og cytosolen klemme i at adskille modercellen i to datterceller, figur 3; Video 1). Selv om denne protokol beskriver, hvordan billedet neuroblast division, (vist med HAM-1: GFP-ekspression), kan andre markører anvendes til at visualisere andre celletyper.

At visualisere dividere neuroblasts, embryoner coexpressing HAM-1: GFP og mCherry: PH afbildes hver 2 min (i alt 10 min.) Hver neuroblast er kun ~ 1-4 um i diameter og er <1 um tyk, og det er bedst at bruge et objektiv med høj forstørrelse (f.eks. 100X). Desuden talrige Z-stacks (~ 20) opsamles med en lille trinstørrelse (0,2 um) for at sikre, at de forskellige vinkler af hver celle (sfærisk form), er afbildet. At indsamle så mange billeder uden at gå på kompromis med tidspunkter, er en meget motoriseret scene (f.eks Piezo Z Stage) anbefales. Efter opsamling af en serie af billeder, er de analyseres for at finde celler inden for et par Z-stakke, der deler DNA kondenseres membranen ingressed og de nye datterceller danner (tidspunkterne for den forventede stak flettede kanaler er vist i figur 3A, og udvalgte stabler af flettede kanaler er vist i figur 3B, Video 1). For bedre at visualisere cellerne anbefales det atholde hver kanal i gråtoner og vend billederne (fx figur 4).

Billedopløsningen er anderledes for Widefield system ved hjælp af en høj opløsning CCD-kamera (1344 x 1024 pixel) vs. det fejede område system ved hjælp af en højhastigheds EMCCD kamera med høj følsomhed (~ 35 billeder / sek og 512 x 512 pixel). Inverted billeder af dividere neuroblasts fra kontrolforanstaltninger embryoner taget med begge systemer er præsenteret til sammenligning (Figur 4 vs. 5). Som vist i figur 4A (Widefield system Video 2), billederne er klarere vs figur 5A. (Fejet felt system Video 4). Men når du bruger Widefield systemet embryoner er modtagelige for fototoksicitet, og hurtigere tidspunkter er ikke muligt med den høje opløsning kamera. For eksempel for at undersøge ændringer i lokaliseringen af forskellige proteiner (f.eks. To undersøge ændringer i deres dynamik), måske tidspunkter, der skal indsamles oftere. Desuden kan det ikke være muligt at billedet i længere perioder uden at reducere antallet af Z-stakke og tidspunkter. Ved hjælp af en EMCCD kamera på Widefield systemet kan tillade en bredere vifte af programmer til billedbehandling. Kameraer, der har både høj opløsning og høj hastighed er blevet udviklet, men driverne er muligvis ikke tilgængelige, afhængigt af købet software, der anvendes, og de kan stadig ikke være så følsom som EMCCD kameraer. Et andet system, der er almindeligt anvendt til billeddannelse C. elegans er spinning disk konfokal, som også har lavere fototoksicitet og kan udstyres med enten EMCCD eller CCD-kameraer (se Diskussion).

At studere gener, der er nødvendige for celledeling, er hermafroditter behandlet med RNAi mod et gen af interesse (f.eks ani-1, se afsnit 1.2 og 3, i protokollen), og deres fostre afbildet på samme måde som control embryoner. At sammenligne celler fra RNAi embryoer til at kontrollere fostre, er det bedst at billedet på lignende stadier af fosterudviklingen (at hjælpe match celle former og positioner). For eksempel er der en større celle synlig i centrum af embryonet under ventrale kabinet, der kan fungere som et godt referencepunkt for imaging neuroblaster (figur 4 og 5). Genet studerede her, ani-1 (anillin), organiserer actomyosin kontraktilitet, men er ikke påkrævet for cytokinese i det tidlige foster 23,29-30. Anillin s homologer, er imidlertid nødvendige for cytokinese i højere eukaryoter 16, og ani-1 er nødvendig for neuroblast cytokinese (Fotopoulos, Wernike og Piekny, upublicerede observationer). Som vist i figur 4B (Video 3) og 5B (Video 5) flere neuroblaster indlede cytokinese og deres membraner klemme, men i stedet for at danne to separate datterceller, deres membraner tilbagegang og cellerne bliver multinucleate (> 1 kerne / celle). Det skal bemærkes, at ani-1 kan være påkrævet for divisionen eller form ændring af andre celletyper, som ikke er afsløret af denne protokol. Hertil kommer, at denne protokol ikke vise resultater fra vævsspecifik RNAi (se Diskussion).

Figur 1
Figur 1. Ventral kabinet under C. elegans epidermal morfogenese. A) Z-stack fremskrivninger (3 Z-Stakke af 0,5 um i tykkelsen) af en kontrol AJM-1: GFP (adherens krydset markør for at visualisere epidermale cellegrænserne, stamme-ID på CGC SU159) foster gennemgår dorsal intercalation (venstre, dorsal view ) og en kontrol AJM-1: GFP foster gennemgår ventrale kabinet (højre, ventral visning). Billeder inverteret til bedre forholdualize cellegrænserne. B) Tegnefilm viser ventrale synspunkter C. elegans embryoner gennemgår ventral kabinet. Først to par forkant celler (blå) bruger actin rig filopodia (sorte streger) for at vandre mod den ventrale midterlinjen (foster til venstre). Dernæst posteriore ventrale lomme celler (rød) vandre mod midterlinjen skabe et hul på den ventrale overflade, der kan lukkes med en pung snor lignende mekanisme (B 'sort stiplet linie / cirkel, der minder om sårheling) 25. Også vist er de underliggende neuroblasts (som grå cirkler). Den anden embryo (B ") viser, hvordan migrationen af specifikke delmængder af epidermale celler medieres af en» bro «dannet af omlægning af PLX-2/plexin og VAB-1/Ephrin receptorudtrykkende 'plexin band' celler (grønne cirkler). Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2.. ANI-1 lokalisering i C. elegans embryoner. A) en fast C. elegans embryo udtrykker HMR-1: GFP (E-cadherin; markør for epidermale cellegrænser) costained for GFP (grøn) og ANI-1 (rød). Konfokal billeder af de ydre cellelag (4 Z-Stakke af 0,2 um i tykkelse) viser de overliggende epidermale celler og underliggende neuroblasts, som er ANI-1 positiv B) Faste N2 og N2. Ani-1-RNAi embryoner co farvet for ANI-1. ANI-1 er stærkt reduceret i ani-1-udtømte foster. Skalapanelerne:. 10 um Klik her for at se større billede.


Figur 3.. Visualisering dividere neuroblast under C. elegans embryogenese. (A) Z-stack fremskrivninger (20 Z-Stakke af 0,2 um i tykkelse) er vist fra en kontrol embryo coekspression HAM-1: GFP (at visualisere neuroblast cellekerner; grøn) og mCherry: PH (at visualisere cellemembraner, rød) . Mange neuroblasts og andre celletyper er synlige i fremskrivningerne (B) Z-stack fremskrivninger anvender et mindre antal Z fly er vist fra en anden kontrol embryo coekspression HAM-1:. GFP (grøn) og mCherry: PH (rød). Et område er zoomet ind (hvid boks) til mere klart at vise en individuel skillelinje neuroblast. Hvide pilespidser peger på at trænge plasmamembran en skillelinje celle og grønne cirkler fremhæve kondenseret DNA under mitosen og nyligtdanner datter kerner i slutningen af ​​mitose. Den store celle fungerer som et referencepunkt (hvid stjerne) til at bestemme udviklingsstadiet og placering i embryoet. Skalapanelerne:. 10 um (hvid) og 3,5 m (gul) Klik her for at se større billede.

Figur 4
Figur 4.. Visualisere neuroblast cytokinese under C. elegans embryogenese ved hjælp af en vidvinkel-system. A) Inverted Z-stack fremskrivninger (2 Z-Stakke af 0,2 um i tykkelse) er vist fra en kontrol embryo coekspression HAM-1: GFP og mCherry: PH opsamlet fra Widefield systemet ved hjælp af en CCD-kamera med høj opløsning. Røde pilespidser peger på delende neuroblasts med ingressing cellemembraner. Grønne cirkler fremhæve kondenseret DNA under de tidlige faser af mitosen eller nyligt danner datter kerner i slutningen af ​​mitose / cytokinese. Den store celle fungerer som et referencepunkt (gul stjerne) til at bestemme udviklingsstadium. B) billeder vist svarer til A), men er fra et embryo behandlet med ani-1 RNAi. Cellemembran ingresses De i som cellen fortsætter gennem mitose, men slapper kort efter forlader en multinucleate celle. Skala bar:. 10 m (sort), 3,5 m (gul) Klik her for at se større billede.

Figur 5
Figur 5.. Visualisere neuroblast cytokinese under C. elegans embryogenese ved hjælp af en fejet felt system. A) Inverted Z-stack fremskrivninger af 2 Z-stakke af 0,2 um (i alt 0,4 um) er vist fra et embryo coekspression HAM-1: GFP og mCherry: PH opsamlet fra fejede felt-systemet ved hjælp af en EMCCD kamera med høj følsomhed, men lavere opløsning. De røde pilespids peger på en neuroblast undergår cytokinese. Grønne cirkler fremhæve kondenseret DNA under mitose og nydannede datter kerner efter cytokinese. Den store celle fungerer som et referencepunkt (gul stjerne) til at bestemme udviklingsstadium. B) Billederne ligner A), men er fra et embryo behandlet med ani-1 RNAi, og 3 Z-stakke er brugt (i alt 0,6 um ). Som beskrevet ovenfor membranen ingresses i de celle fortsætter gennem mitose, men så slapper forårsager cellen til at blive multinucleate. Målestok: 10 um (sort), 3,5 um (gul).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Video 1. Visualisering delende neuroblasts under C. elegans embryogenese. Z-stack fremskrivninger af to Z planer (0,4 mM / fly) fra en kontrol embryo coekspression HAM-1: GFP (grøn) og mCherry: PH (rød). Billeder indsamlet fra Widefield mikroskop er vist for begge kanaler. Videoen svarer til embryo vist i tredje panel i figur 3B. Klik her for at se video.

Video 2. Visualisering delende neuroblasts under C. elegans embryogenese. Z-stack fremskrivninger af to Z planer (0,4 mM / fly) fra en kontrol embryo coekspression HAM-1: GFP (grøn) og mCherry: PH (rød). Videoen svarer til spejlvendt billeder indsamlet fra Widefield mikroskop for mCherry: PH kanal only (embryo i figur 4A). Klik her for at se video.

Video 3. Visualisering delende neuroblasts under C. elegans embryogenese. Z-stack fremskrivninger af to Z planer (0,4 mM / fly) fra en ani-1 RNAi behandlet embryo coekspression HAM-1: GFP (grøn) og mCherry: PH (rød). Videoen svarer til spejlvendt billeder indsamlet fra Widefield mikroskop for mCherry:. Kun PH-kanal (foster i figur 4B) Klik her for at se video.

Video 4.. Visualisering dividere neuroblast under C. elegans embryogenese. Z-stack fremskrivninger af to Z planer (0,4 mM / fly) fra en kontrol embryo coekspression HAM-1: GFP (grøn) og mCherry: PH (rød). Videoen svarer til invertereed billeder indsamlet fra fejede felt konfokal mikroskop for mCherry:. kun PH-kanal (foster i figur 5A) Klik her for at se video.

Video 5.. Visualisering dividere neuroblast under C. elegans embryogenese. Z-stack fremskrivninger af tre Z planer (0,4 mM / fly) fra en ani-1 RNAi behandlet embryo coekspression HAM-1: GFP (grøn) og mCherry: PH (rød). Videoen svarer til spejlvendt billeder indsamlet fra fejede felt konfokal mikroskop for mCherry:. Kun PH-kanal (foster i figur 5B) Klik her for at se video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver brugen af ​​forskellige typer af mikroskopi til billede celledelinger under midten embryogenese. Især denne protokol fremhæver, hvordan billedet delingen af ​​neuroblasts, celler, der kan fremme epidermal morfogenese. Celle-celle-kommunikation er vigtig for vævsdannelse under metazo udvikling og C. elegans er en fremragende model til at studere vævsdannelse in vivo. En begivenhed, der pænt skildrer samspillet af væv er epidermal morfogenese, der dækker foster i et lag af epitelceller. Især ventral kabinettet er den proces, hvor de ventrale epidermale celler migrerer til omslutte den ventrale overflade af embryonet, og bygger på de underliggende neuroblasts. De neuroblasts giver kemiske eller mekaniske signaler, og ventral kabinettet er i fare, hvis position neuroblasts ændres. Nummeret (eller polaritet) af neuroblasts også kan være afgørende for ventral kabinet til at forekomme ordentligt,og det er vigtigt at forstå de mekanismer, der regulerer deres division. Denne protokol beskriver, hvordan billedet celledeling i et levende væv ved hjælp af C. elegans embryoner coekspression to fluorescerende prober (mCherry: PH at skitsere plasma membraner og HAM-1: GFP at mærke neuroblast kerner).
De mest væsentlige skridt til billedet levende C. elegans embryoner, der udtrykker fluorescerende prober er: i) at bruge sunde, unge voksne hermafroditter udtrykker det ønskede fluorescerende markører (opretholdt ved 20-25 ° C), ii) brug mutanter eller RNAi for at studere gen-kravene i løbet vævsdannelse, iii) indsamle embryoner på rigtige tidspunkt til mikroskopi (f.eks. midten embryogenese), og iv) udføre fluorescerende mikroskopi med indstillinger, der er optimeret til at holde fototoksicitet lavt, men at opretholde en høj billedkvalitet.

At identificere specifikke celler og / eller intracellulære rum inden et væv af interesse, skal du bruge orme udtrykker markører tagget med fluorescerende probes. Den Caenorhabditis Genetik Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) tilbyder en række stammer, der coudtrykke flere markører. Men to stammer (hver udtrykker en enkelt markør af interesse) måtte have, skal krydses og screenes med et fluorescerende mikroskop over flere generationer at generere en stamme stabilt udtrykker begge sonder. For eksempel til at udføre denne eksperimentelle protokol, en stamme, der udtrykker en markør for at visualisere cellemembraner (mCherry: PH; OP70) blev krydset med en stamme, der udtrykker en markør for at visualisere neuroblast kerner (HAM-1: GFP, OP102) til at generere en stamme coekspression begge.

Den bedste måde at studere gen krav under fosterudviklingen er at udføre tab af funktion eksperimenter, hvor genet produktet er slået ned eller muterede. Denne forsøgsprotokol beskriver udføre RNAi mod anillin (ani-1) for at reducere endogene ANI-1-niveauer i alle embryonale væv. Der er ingen velkarakteriserede hypomorphic alleleraf ani-1. Derfor RNAi er den bedste mulighed for at undersøge ani-1 's tab af funktion fænotyper og bestemme dens funktion under fosterudviklingen. Typisk er det bedre at anvende mutanter stedet for RNAi, da effektiviteten af ​​knockdown kan være variabel og er sjældent nul. Et af de mest almindelige problemer med fodring RNAi protokoller er forurening, hvilket vil reducere RNAi effektivitet. For at mindske risikoen for forurening, forberede RNAi plader og mad i aseptiske forhold. Forurening kan påvises ved screening af et par af pladerne før brug, og plader med mælkehvide / uigennemsigtige søger bakterier skal kasseres. Et andet problem, der kan reducere RNAi effektivitet er ved ikke at vælge hermafroditter på det rigtige udviklingsstadiet. Det er bedst at bruge L4-iscenesat eller unge voksne orme (udviklingslandene vulva vises som en hvidlig cirkel / hul på den ventrale side af ormen), som ikke har nogen / nogle befrugtede embryoner. Desuden RNAi vilkår og behandlinger may variere for forskellige genprodukter. Forskellige måder at øge eller mindske styrken af ​​RNAi er ved at resuspendere de pelleterede HT115 bakterier i forskellige mængder af LB Amp medie (se afsnit 1.2.2), og ved at ændre varigheden af ​​RNAi behandling (tid, orme holdes på RNAi plader, se protokol 3). For at opnå optimale ani-1 RNAi fænotyper til denne protokol, blev bakterierne resuspenderet i 500 ul LB Amp medier og orme blev holdt på RNAi plader i 2 dage (ani-1 RNAi har tidligere været præget af Maddox et al. 23). RNAi er resistente eller-følsomme stammer (f.eks. RDE-1, sid-1 eller rrf-3) kan også anvendes til at ændre styrken af RNAi. Endnu vigtigere er, kan disse stammer kobles med vævet specifikt udtryk for deres vildtype gener til at skabe væv følsomme stammer. For eksempel for at udføre neuroblast specifikke RNAi, kunne man bruge sid-1 mutant embryoner (RNAi-resistent) udtrykker vægt UNC-119 promotor (stamme-ID på CGC TU3401) 31.

Denne protokol beskriver, hvordan billedet neuroblast celledeling i midten embryogenese. Der er flere aspekter af den protokol, der kræver nøje overvejelse, såsom udviklingsstadiet af embryonerne, at indsamle de relevante Z-stakke og optimere de billeddannende betingelser for at minimere fototoksicitet uden at forringe billedkvaliteten. At fange tidspunkter på det rigtige udviklingsstadiet (f.eks ventral kabinet), bør embryoner blive filmet fra dorsal intercalation (par dorsale epidermale celler interdigitate og sikring for at danne et enkelt lag af epidermis på den dorsale side af foster; figur 1A6). På dette tidspunkt er de neuroblaster hurtigt delende. Siden iscenesættelse embryonerne kan være svært under lav forstørrelse (fx ved hjælp af et dissektionsmikroskop), hjælper det at samle mange embryoner af forskellige stadier og embryoner påhøjre stadie kan vælges med højere forstørrelse.

Neuroblasts er relativt små og tynde, og findes i hele midten af ​​embryoet. Det er vigtigt at optimere antallet og størrelsen af ​​Z-stacks at sikre, at hele cellen er fanget under deling. For eksempel vil opsamling for mange billeder udsætte embryoner mere lys og gør dem tilbøjelige til fototoksicitet. Men indsamling for få Z-stakke eller ved hjælp af tykke Z-profiler kan gøre det svært at billedet en hel skillelinje neuroblast celle.
Denne protokol beskriver anvendelsen af ​​en fejet felt konfokal mikroskop eller Widefield system billedet neuroblast celledeling. Som tidligere beskrevet, en af ​​de vigtigste begrænsninger ved brug af en vidvinkel epifluorescensmikroskop er potentialet for fototoksicitet. Selv om det stærkt anbefales at bruge en roterende disk konfokal eller fejet felt konfokal til billeddannelse C. elegans embryoner, kan nogle laboratorier har begrænset adgang til disse systemer. Denne protokol giver nogle forslag til at begrænse fototoksicitet ved brug Widefield systemer, såsom lukning af blænden til 30%, sænke intensiteten af ​​lyset fra kviksølv pære (eller helst ved hjælp af lysdioder), ved hjælp af en EMCCD kamera, og øge gevinsten eller udsmidningen at tillade et fald i eksponeringstid. Antallet af Z-stakke og tidspunkter vil også være begrænset ved hjælp af en vidvinkel-system. Selv om det ikke blev beskrevet i denne protokol, er spinning disk konfokal mikroskop almindeligt anvendt til billeddannelse, da det medfører en lavere fototoksicitet i forhold til en Widefield mikroskop. Svarende til fejede felt systemet, det bruger solid state lasere og spreder lys (selv på en anden måde vs fejet felt). Enten CCD eller EMCCD kameraer kan anvendes med roterende skive-system, som ofte har flere kamera porte til at tillade dobbelt billeddannelse. Svarende til fejede felt mikroskop, kan billeder taget med eksponeringstider 50-90% lavere vs Widefield system.
Denne protokolol kan anvendes til at studere funktionen af ​​forskellige gener, der regulerer mitose under vævsdannelse. Tiden mellem hvert billede kan afkortes (f.eks. Hver 15-30 sek vs. 2-3 min) til bedre at visualisere mitose fænotyper. Kan anvendes forskellige prober (fx i stedet for at bruge HAM-1:. GFP kan fluorescerende mærkede H2B anvendes til at visualisere DNA og / eller fluorescerende mærkede tubulin kunne anvendes til at visualisere mitotiske spindler). Antallet af Z-stacks og tykkelse for hver stabel kan også ændres (f.eks flere stabler af en mindre trinstørrelse). Som beskrevet ovenfor, er at vælge de korrekte indstillinger er afgørende for at begrænse fototoksicitet og optimere billedkvaliteten. Selvom mCherry: PH og HAM-1: GFP sonder udtrykker på relativt høje niveauer, indsamling hurtigere tidspunkter, øge antallet af Z-stakke eller billeddannelse til længere perioder vs hvad der er beskrevet i denne protokol, kan ikke være muligt på en vidvinkel-system.
En Java-baserede imalder behandlingsprogram (ImageJ, NIH), kan bruges til at behandle billeder indsamlet af forskellige mikroskoper og billeder kan eksporteres som TIFF. Men afhængigt af den software, der anvendes til erhvervelse, filerne allerede kunne være forenelig med den behandling software. Det er bedre at åbne originale filer vs eksporterede billeder (f.eks TIFF-format), da metadata er holdt med de originale filer. Forarbejdning software kan bruges til at manipulere billeder for at gøre figurer eller film. Desuden også kvantitative analyser kan udføres, såsom måling af pixel intensitet i udvalgte regioner. Optimal software bør vælges afhængigt af den analyse, såsom Image Processing Toolbox (MathWorks, Matlab) eller 3D-og 4D Real-Time Interactive Data Visualization (Imaris, bitplane).
Ved hjælp af denne protokol blev ani-1 vist sig at være nødvendig for neuroblast cytokinese, selvom det ikke er nødvendigt for cytokinese i det tidlige foster. Interessant, ved at styre number og placering af neuroblasts, ani-1 kan regulere migrationen af ventrale epidermale celler til ventrale kabinet, fordi neuroblasts levere kemiske eller mekaniske signaler til de overliggende epitelceller. Dog vides det ikke, om ani-1 er nødvendig for divisionen eller form ændring i andre celletyper under midten sent embryogenese. Viser, hvordan den overordnede sammensætning af et væv påvirker omkringliggende væv understreger vigtigheden af ​​væv kommunikation under metazoan udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende, at dette arbejde blev støttet af naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC) tilskud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

Tags

Neuroscience , Morfogenese cytokinese neuroblasts anillin mikroskopi celledeling
Visualisering neuroblast cytokinese Under<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenesen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wernike, D., van Oostende, C.,… More

Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter