Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Abstract

Dit protocol beschrijft het gebruik van fluorescentie microscopie afbeelding delende cellen in ontwikkelingslanden Caenorhabditis elegans embryo. Vooral dit protocol gericht op het afbeelden verdelen neuroblasts, die zich bevinden onder de epidermale cellen en kan belangrijk zijn voor epidermale morfogenese zijn. Weefsel vorming is cruciaal voor metazoan ontwikkeling en vertrouwt op externe stimuli uit naburige weefsels. C. elegans is een uitstekend model organisme om weefsel morfogenese bestuderen in vivo vanwege de transparantie en eenvoudige organisatie, waardoor de weefsels gemakkelijk om te studeren via microscopie. Ventrale behuizing is het proces waarbij het ventrale oppervlak van het embryo is bedekt met een enkele laag van epitheelcellen. Deze gebeurtenis wordt gedacht te worden vergemakkelijkt door de onderliggende neuroblasts, die chemische begeleiding cues migratie van de bovenliggende epitheliale cellen mediëren. De neuroblasts zeer proliferatieve en ook kunnen fungerenals mechanische substraat voor de ventrale epidermale cellen. Studies met dit experimentele protocol kan het belang van intercellulaire communicatie ontdekken tijdens weefselvorming en kunnen worden gebruikt om de rol van genen betrokken bij celdeling in ontwikkelende weefsels te onthullen.

Introduction

Terwijl er protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege C. elegans embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een weefsel tijdens mid embryogenese. Een van de belangrijkste uitdagingen in de beeldvorming van organismen in ontwikkeling is hun gevoeligheid voor fototoxiciteit geweest. Echter, is toegenomen toegankelijkheid van draaiende schijf confocale microscopen of geveegd veld microscopen meer wijdverspreide beeldvorming toepassingen toegestaan. Beide systemen maken gebruik van solid state lasers en verstrooid licht, waardoor het niveau van UV die de organismen aan. Toch kan groothoek stands nog steeds worden gebruikt voor beeldvorming in vivo, vooral als ze zijn uitgerust met camera's met een hoge gevoeligheid (bijv. EMCCD), diafragma controle en lichtregeling (bijv. LED's of verstelbare kwik lampen). Dit protocol beschrijft hoe u ofwel een confocale gebaseerd systeem of een groothoek-systeem op de foto om de celdeling te gebruiken in ontwikkelingslanden C. elegans </ Em> embryo's. Als voorbeeld beschrijven we hoe u het neuroblast celdeling. Neuroblasts kan epidermale morfogenese vergemakkelijken door chemische of mechanische signalen naar de bovenliggende epidermale cellen en verschaffen een uitstekend voorbeeld van het belang van intercellulaire communicatie in de vorming van weefsels.

Caenorhabditis elegans is een ideaal modelorganisme voor microscopie op basis van studies door zijn transparantie en eenvoudige weefsel organisatie 1. Bovendien C. elegans vatbaar is voor genetische methoden en RNAi en omdat veel van de genen humane homologen, kan het gebruikt worden om geconserveerde moeten mechanismen voor weefselvorming 2-5. In C. elegans, vorming van de epidermis optreedt tijdens embryogenese midden, wanneer de embryo> 300 cellen. Epidermale morfogenese bestaat uit verschillende hoofdfasen, waarbij het embryo is ingesloten in een laag epidermale cellen die vernauwen verlenen tot de embr transformerenyo uit een eivormige vorm in de langwerpige vorm van een worm 6. Ventraal behuizing beschrijft een van deze morfogenetische gebeurtenissen, wanneer de ventrale epidermale cellen migreren naar de ventrale middellijn aan het ventrale oppervlak van de embryo (figuur 1) omvat. Ten eerste, twee paar voorste gelegen voorrand cellen migreren naar de ventrale middellijn, waar zij zich en zekering met de contralaterale 6 buren. Dit wordt gevolgd door de migratie van de achterste gelegen pocket cellen, die wig vormen achtige vormen creëren van een ventrale pocket 6-7. Het mechanisme dat de zak gesloten is niet goed begrepen. Een mogelijkheid is dat een supracellular actine myosine contractiele structuur bindt de zak cellen samen in een tas string als mode, vergelijkbaar met wondgenezing 8. Interessant is migratie van enkele pocket cellen gemedieerd door specifieke subsets onderliggende neuroblasts 9 (neuronale precursors die worden gevonden onder de epidermis: Figuur 1B).

Eerdere studies toonden aan dat de neuroblasts regelen ventrale epidermale celmigratie en ventrale behuizing. VAB-1 (Efrine receptor) en VAB-2 (Efrine ligand) zijn sterk uitgedrukt in de neuroblasts en sorteren van anterieure en posterieure neuroblasts vergemakkelijken van elkaar, en mutaties in VAB-1 of VAB-2 oorzaak ventrale behuizing fenotypen 10-13. Echter, promotor rescue experimenten toonden aan dat VAB-1 ook vereist in de bovenliggende ventrale epidermale cellen en receptoren voor andere begeleiding signalen afgescheiden door de neuroblasts zijn uitgedrukt in de ventrale epidermale cellen 9. Hoewel mutaties in een van deze receptoren leiden ventrale behuizing fenotypen, is het niet duidelijk of defecten ontstaan ​​door problemen neuroblast positioneren of door uitval van de ventrale epidermale cellen te reageren op leiding keuen 14. Het veranderen van de verdeling van neuroblasts without waardoor hun vermogen om leiding signalen te scheiden zou licht werpen op de rol van neuroblasts en hun vermogen om mechanische input te geven tijdens epidermale morfogenese. Onlangs bleek dat een celdeling gen, ani-1 (anillin) sterk uitgedrukt in neuroblasts (figuur 2A) en de uitputting veroorzaakt neuroblast divisie defecten. Interessant is dat deze embryo's tonen ventrale behuizing fenotypes (Fotopoulos, Wernike en Piekny, ongepubliceerde waarnemingen).

Anillin nodig is voor celdeling, en met name voor cytokinese, waarbij het proces waarbij een moedercel fysiek verdeeld in twee dochtercellen beschreven. Cytokinesis wordt gedreven door de vorming van een actomyosine contractiele ring, die moet goed worden gecontroleerd in de ruimte en tijd om ervoor te zorgen dat deze goed is gekoppeld aan zusterchromatide segregatie. De meester regulator van metazoan cytokinesis is RhoA (RHO-1 in C. elegans), een klein GTPase dat is eenctive in zijn GTP-gebonden vorm. De GEF Ect2/ECT-2 activeert RhoA, waarna RhoA-GTP interageert met downstream effectoren dat de contractiele ring te vormen en te bemiddelen zijn binnentreden 15. Anillin is een multi-domein eiwit dat bindt aan RhoA via zijn C-terminus en actine en myosine via zijn N-terminus. Anillin nodig om de positie van de contractiele ring in zoogdier-of Drosophila S2 cellen 16 te stabiliseren. Anillin uitputting veroorzaakt contractie ringen om zijwaartse schommelingen die te ondergaan, en cytokinesis uiteindelijk faalt vormen meerkernige cellen 17-19. Interessant, hoewel C. elegans ani-1 coördinaten actomyosine contractiliteit in het vroege embryo, is het niet essentieel voor cytokinese. Zoals hierboven beschreven, ani-1 vereist voor neuroblast cytokinese in mid-embryogenese (Fotopoulos, Wernike en Piekny, ongepubliceerde waarnemingen). Cytokinesis mislukking zou het aantal en de positie van neuroblasts veranderen en kan invloed hebben op de locatie chemische begeleiding signalen, of het kan de mechanische eigenschappen van het weefsel te veranderen. Beide modellen benadrukken de nonautonomous rol van neuroblasts voor ventrale behuizing, en het belang van weefsel-weefsel communicatie tijdens de embryonale ontwikkeling.

Deze experimentele protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling tijdens C. elegans medio embryogenese met behulp van fluorescentie microscopie. De meeste experimenten bestuderen de mechanismen van celdeling werden in enkele cellen in kweekplaten (bijv.. HeLa of S2-cellen) of vroege embryo's met een beperkt aantal cellen (bijv. C. elegans eencellige embryo Xenopus of echinoderm embryo's). Het is echter belangrijk om tevens na celdeling in weefsels, er externe stimuli die de timing en plaatsing van het schot vliegtuig kan beïnvloeden. Verder kunnen cellen chemisch of mechanisch cues beïnvloeden de ontwikkeling van aangrenzende weefselss, en het is belangrijk te begrijpen hoe intercellulaire communicatie helpt weefsel te vormen tijdens de ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de platen voor het behoud van Worm Stammen en uitvoeren van RNAi

  1. Nematode Groei Media Plates
    1. Plates
      1. Bereid Nematoden Groei Media (NGM) platen worm stammen te handhaven en genetische kruisingen uit te voeren. Combineer 3 g NaCl, 17 g Agar en 2,5 g bactopepton met 1 liter gedestilleerd water in een 2 L kolf en voeg een metalen roerstaaf.
      2. Autoclaaf de kolf aan de agar te ontbinden en de media steriliseren. Zet de kolf op een roer plaat en laat de media afkoelen onder roeren.
      3. Zodra het materiaal is afgekoeld en nog enigszins warm aan te raken (45-50 ° C), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml cholesterol-oplossing en 25 ml 1 M kaliumfosfaatbuffer (PPB; recept in tabel van de reagentia / materialen; filter steriliseren voorraad oplossingen) en giet onmiddellijk de media in kleine petrischalen (60 mm x 15 mm, vul de gerechten ~ 3/4 om de boven-of 13 ml / plaat using een automatische dispenser). Opmerking: Voor behoud van sommige stammen tetracycline op lange termijn kunnen worden toegevoegd aan de platen (12,5 ug / ml) aan Tn10 transposon inactivering van de bacteriële RNase III-gen mogelijk.
      4. Laat het materiaal stollen nacht bij kamertemperatuur geroerd. Opmerking: De platen moeten in een biologisch kap of in een gebied van het lab dat minder gevoelig is voor vervuiling gehouden. Verwijder bovendien alle condens die is opgebouwd op de deksels (bijvoorbeeld schoon met papieren zakdoekje) om schimmel besmetting te beperken. Als Tetracycline wordt ook toegevoegd aan de platen vervolgens bedekken met aluminiumfolie als dit antibioticum is lichtgevoelig.
      5. De volgende dag, het zaad van de droge NGM platen met een suspensie van E. coli (OP50 stam, zie paragraaf 1.1.2) dat is zachtjes gewerveld. Om platen te paren, voeg ~ 50 ul van OP50 het midden van elke plaat (een klein rondje). Om platen te maken voor het behoud van worm stammen, zaad elk NGM plaat met ~ 100-200 pi OP50 (totervoor te zorgen dat het bestrijkt een groter gebied van de plaat).
      6. Laat de geplaatste borden droge O / N bij kamertemperatuur.
      7. De volgende dag, zet de gedroogde NGM platen ondersteboven en stapel ze in plastic opslag containers bij 4 ° C. Opmerking: Platen zijn bruikbaar tot ~ 3-4 weken. Platen met Tetracycline moeten in het donker bewaard.
    2. Voedsel
      1. Gebruik E. coli OP50 [van de Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] als een bron van voedsel voor C. . elegans Opmerking: OP50 kan worden opgeslagen glycerol voorraad bij -80 ° C (verhouding 1:01 in 50% v / v glycerol).
      2. Om OP50 te maken voor de NGM platen, maken een streep plaat met behulp van een kleine hoeveelheid van de glycerol voorraad (<10 pi, een steriele pipet tip). Spreid de bacteriën op een LB agar plaat (recept in tabel reagentia / materialen) en verlaat deze bij 37 ° C voor ~ 16 uur. Opmerking: Als er problemen zijn met vervuiling, kan streptomycineresistente OP50 worden gebruikt, eennd streptomycine kan worden toegevoegd aan de LB-agarplaten (50 ug / ml).
      3. De volgende dag, kies een enkele kolonie en te enten 100 ml vloeibaar LB-medium (recept in tabel van de reagentia / materialen) in een kolf van 500 ml.
      4. Laat de cultuur groeien O / N bij 37 ° C met schudden.
      5. De volgende dag, gebruik maken van de bacteriële suspensie voor zaaien NGM platen. Opmerking: OP50 kunnen hoeveelheden verdeeld in 50 ml conische buizen en bewaard bij 4 ° C voor ~ 4-6 weken.
  2. RNAi
    Feeding is een van de manieren om RNA-gemedieerde interferentie voeren (RNAi, een specifiek genproduct knockdown) in C. elegans. C. elegans hermafrodieten kan worden gevoed E. coli stam HT115 getransformeerd met een voeding vector die dsRNA uitdrukt na inductie. Deze dsRNA (of fragmenten) is aan de gonaden overgebracht, gewoonlijk tot aanzienlijke knockdown van het specifieke gen doelwit.
    1. RNAi Plates
      1. Bereid NGM platen zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 1.1.1), maar ook toevoegen 1 ml van 1 M IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside, om de expressie van dsRNA te wekken) en 500 pl van 50 mg / ml ampicilline (Amp, de vectoren die dsRNA zijn Amp -bestendig) het warme medium (45-50 ° C).
      2. Nadat de platen gedroogd zaad hen ~ 50-100 pi E. coli HT115 (zie paragraaf 1.2.2). Opmerking: ongeplaatste platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C voor ~ 4-5 weken.
      3. Laat de geplaatste borden nacht drogen bij kamertemperatuur.
      4. De volgende dag, zet de gedroogde RNAi platen ondersteboven en bewaar ze in een plastic opslagcontainer bij 15-20 ° C. Opmerking: Gezaaid platen behouden RNAi-efficiëntie tot ~ 2-3 weken.
    2. RNAi Eten
      1. Gebruik E. coli HT115 (van de CGC, zie paragraaf 1.1.2) getransformeerd met het voederen vector L4440 of L4440 die cDNA om een gen van belang. Opmerking: Feeding bibliotheken die de meeste open reading frames in het genoom richtenzijn al gemaakt en zijn verkrijgbaar (klonen in L4440 omgezet in HT115, bv. met een fragment uit Y49E10.19 voor ani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / pages / rnai.html). Opmerking: HT115 kan glycerol voorraden worden bewaard bij -80 ° C (verhouding 1:01 in 50% v / v glycerol).
      2. Om een ​​nieuwe constructie gericht op een gen van belang te genereren, zie de L4440 vector kaart en kloon cDNA tussen de flankerende T7 promoters die induceerbare door IPTG zijn.
      3. Transformeer HT115 met de L4440 construct met behulp van een standaard protocol voor transformatie (bijv. merk chemisch competente bacteriën en uitvoeren heat shock transformatie).
      4. Zoals beschreven voor OP50 (zie paragraaf 1.1.2), moeten streak bacteriën uit de glycerol voorraad op een LB-agar plaat, maar de plaat bevatten ook 50 ug / ml ampicilline. Opmerking: Als u een reeds bestaande L4440 construct, overslaan secties 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Kies een enkele kolonie en te enten 5 mlLB-medium dat 5 ul ampicilline van een 50 mg / ml voorraad (LB Amp) en plaats het op 37 ° C onder schudden.
      6. Na ~ 16 uur Inoculeer 5 ml vers LB-Amp medium met 50 ul van de O / N kweek en groei van de cultuur voor 7-8 uur onder schudden bij 37 ° C.
      7. Centrifugeer de bacteriën gedurende 1 min bij 4000-8000 xg, gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ui vers LB-Amp medium.
      8. Gebruik deze bacteriële oplossing voor de RNAi platen zaad zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 1.2.1). Opmerking: HT115 moet onmiddellijk worden gebruikt en mag niet worden opgeslagen.

2. Het cultiveren van Worm Stammen

Handhaven C. elegans stammen besteld bij de CGC op NGM platen volgens standaard protocol 1. Stammen die voor dit protocol zijn: C. elegans var Bristol, wild-type (stam ID bij CGC N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [ham-1 unc-119 (+)] (stam ID bij CGC OP102); unc-119 (ED3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (stam ID bij CGC OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (stam ID bij CGC SU159); unc-119 (ED3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (stam ID bij CGC FT250).

  1. Pick ~ 3 jonge volwassen hermafrodieten dat de juiste fenotype weer een verse NGM plaat. Opmerking: N2 (var. Bristol, wild-type) kan worden gehouden tussen 15-25 ° C, maar ze zullen bereiken dichtheid sneller bij hogere temperaturen. Nieuwe voorraden moet worden gemaakt wanneer de worm dichtheid hoog.
  2. Houd alle tl-stammen (bijv. GFP en / of mCherry expressie wormen) bij 20-25 ° C voor een optimale expressie van fluorescerende eiwitten. Nieuwe voorraden moet worden gemaakt wanneer de worm is hoog en het eten is laag.
  3. Om wormen halen, gebruikt u eenpick gemaakt van een getrokken glazen pipet met een platina draad gefuseerd aan het eind trok (~ 3-5 cm lang). Vlak de draad met een gladde rand. Gebruik de pick om 'scoop' up hermafrodieten en over te brengen op nieuwe platen. Vlam de draad tussen het gebruik om kruisbesmetting van spanning te voorkomen.

3. RNAi

  1. Het uitvoeren van RNAi
    1. Eerste, plaats ~ 8 L4 hermafrodieten op een ongeplaatste NGM plaat voor ~ 30-60 minuten naar het OP50 bacteriën uit de wormen te verwijderen.
    2. Plaats dan de 8 hermafrodieten op een NGM Amp EPTG plaat bezaaid met HT115 dat de L4440 plasmide dat dsRNA om een gen van belang draagt ​​(bijv. ani-1;. Zie 1.2) voor ~ 24 uur. Opmerking: Afhankelijk van het gen van belang, of de gewenste fenotypes (die kan afhangen van de sterkte van de knock-down), kunnen wormen worden overgelaten aan de RNAi platen voor kortere of langere tijd (na 24 uur, plaats de hermafrodieten op verse RNAi platen).
    3. Voor een negtieve controle, plaats wormen op een RNAi plaat bezaaid met HT115 die de lege L4440 vector. Opmerking: Deze embryo's geen fenotypen hebben.
    4. Voor een positieve controle, plaatst wormen op RNAi plaat expressie dsRNA dat een gen met goed gekarakteriseerde fenotypes gericht. Opmerking: Voor rho-1 (Y51H4A.3), embryo's zijn 100% dodelijk na 24 uur en hermafrodieten zijn steriel na 48 uur.
  2. RNAi Werkzaamheid
    De niveaus van knockdown van RNAi te testen, vooral omdat sommige weefsels resistenter dan anderen zijn. Tijdens de vroege embryogenese midden meeste weefsels RNAi-gevoelig, maar in de late embryo of larve neuronen RNAi-bestendig. Verschillende stammen kunnen worden gebruikt voor het verbeteren RNAi gevoeligheid (bijv. RRF-3), of weefselspecifieke RNAi genereren (bijv. sid-1 in combinatie met een transgen van de neurale promoter unc-119 expressie).
    1. Western Blotting
      Immunoblotting behulp C. elegans eiwitten kunnenuitgevoerd volgens standaard protocol 22.
      1. Na het uitvoeren van RNAi, verzamelen ~ 10 gravid (gevuld met embryo's) hermafrodieten in een microcentrifugebuis, voeg 20-30 ul 1x SDS-PAGE sample buffer en lyseren door koken gedurende ca. 2 min.. Ook verzamel N2 wormen in een afzonderlijke buis voor het controlemonster. Opmerking: Het aantal hermafrodieten kan variëren afhankelijk van de gevoeligheid van de primaire antilichamen.
      2. Maak verdunningen van de te controleren steekproef (bijv. 3-100%) in de steekproef buffer. Laad de controle en RNAi monsters en geleid door SDS-PAGE volgens standaardprotocol (het% gel is afhankelijk van de grootte van het eiwit van belang).
      3. Breng de gel aan een membraan en het uitvoeren van immunoblotting volgens standaardprotocol. Opmerking: Gebruik verschillende primaire en secundaire antilichaam verdunningen zoals aanbevolen voor elk antilichaam.
      4. Ontwikkelen (bijvoorbeeld bij gebruik van chemiluminescentie) of scannen (bijv. bij gebruik van fluorescentie) de immunoblot en vergelijk the dichtheid van banden in de lanen N2 versus RNAi baan en zij bepalen de knockdown (bijvoorbeeld de dichtheid van de RNAi laan overeenkomt met de 12% controlelaan, suggereert dit dat het eiwit wordt verminderd met 88%). Opmerking: Om de efficiëntie van ANI-1 knock-down te zien, zie Maddox et al. 23.
    2. Immunostaining
      Immunokleuring in C. elegans kan worden uitgevoerd volgens standaard protocol 22.
      1. Na het uitvoeren van RNAi, verzamelen gravid hermafrodieten en oogst embryo's met behulp van een van de twee methoden. Voor een van de methoden, plaats hermafrodieten in M9 buffer (recept in tabel van de reagentia / materialen) in 1,5 ml gesiliconiseerd microcentrifugebuizen en pellet via centrifugeren (1,000-4,000 xg). Opmerking: Ook verzamel N2 zwangere hermafrodieten.
      2. Verwijder de M9 oplossing.
      3. Verdrijven embryo door 1 ml bleken oplossing (1 M NaOH, 5% bleekmiddel) aan de microcentrifugebuis gedurende 3 minuten. Ook bleek hij N2rmaphrodites controle dia's te maken.
      4. Vortex zachtjes, dan meteen pellet de embryo's via centrifugeren (4000-8000 xg) en verwijder het bleken oplossing. Opmerking: De totale tijd dat de wormen worden geïncubeerd met bleekwater mag niet meer dan 5 minuten.
      5. Was de embryo 3x met Tris gebufferde zoutoplossing (TBS, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl) en overdracht embryo met een glazen Pasteur pipet op een poly-L-lysine-gecoate objectglaasje. Opmerking: Om jas een glazen objectglaasje met poly-L-lysine, eerste veeg de dia, voeg dan een druppel (~ 20-30 pl) van poly-L-lysine en verdeel het gelijkmatig over het oppervlak en laat drogen. Voor een optimaal resultaat, de vacht van de dia's twee keer. Een alternatieve methode om embryo's (secties 3.2.2.1-3.2.2.5) verzamelen is om een ​​druppel M9 plaatsen op een poly-L-lysine-gecoate microscoop glijbaan en pick ~ 10 gravid hermafrodieten in de drop.
      6. Voeg een dekglaasje bovenop elkaar objectglaasje (het gebied dat de meeste embryo's bevat) en plaatsde dia's in vloeibare stikstof. Opmerking: Voor hermafrodieten direct in de drop geplaatst, zette druk op het dekglaasje open te breken de hermafrodieten en verdrijven de embryo's.
      7. Freeze-kraken van de embryo's door de knop van de dekglaasjes direct na ze te bevriezen in vloeibare stikstof.
      8. Plaats de dia's in ijskoude methanol gedurende 20 minuten om de embryo's te repareren. Opmerking: Voor sommige antigenen kan een verknopende fixeermiddel zoals paraformaldehyde voorkeur. Zie het protocol van Duerr 22.
      9. Hydrateren en permeabel de embryo door wassen van de glaasjes 4x met Tris gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) gedurende 10 min. elk.
      10. Droog elke dia rond het gebied dat de meeste van de embryo's bevat en trek een cirkel rond de embryo's met behulp van een pen vloeistof blokkerende (bijv. PAP pen).
      11. Voeg ~ 100 ul van TBST met 5% normaal ezel serum (NDS; blok) aan elke dia (omcirkeld gebied) en incubeer20 minuten bij kamertemperatuur. Let op: Plaats de dia's in een 'natte ruimte' (bijvoorbeeld een gerecht met een deksel met natte papieren handdoeken).
      12. Verwijder het blok, voeg ~ 50-100 ul van de primaire antilichamen (verdund in TBST) per glaasje (omcirkeld gebied) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Opmerking: Afhankelijk van het antilichaam, kan de verdunning en incubatietijd variëren. Om GFP detecteren, gebruiken we een anti-muis-anti-GFP primair antilichaam in een 1/200 verdunning. Om ANI-1 te detecteren, gebruiken we een anti-konijn anti-ANI-1 primair antilichaam in een 1/1600 verdunning (vriendelijk verschaft door Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Voor langere incubatietijden, plaatst dia bij 4 ° C.
      13. Verwijder de primaire antilichamen (indien mogelijk, te houden voor toekomstig gebruik) en was slides 3x met TBS gedurende 5 minuten elk.
      14. Verwijder de laatste wassing en voeg ~ 50-100 ul van secundaire antilichamen (verdund in TBST) per glaasje (omcirkeld gebied) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Opmerking: Afhankelijk van het antilichaam, kan verdunning variëren. Om GFP te detecteren, gebruiken we een eennti-muis Alexa Fluor 488 secundair antilichaam in een 1/250 verdunning. Om ANI-1 te detecteren, gebruiken we een anti-konijn Alexa Fluor 568 secundair antilichaam in een 1/250 verdunning.
      15. Verwijder secundaire antilichamen en was dia 3x met TBS gedurende 5 minuten elk. Opmerking: DNA vlek, voeg ~ 50-100 ul van DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenylindool, 1 mg / ml) en 1/500 verdunning in TBST gedurende 5 minuten.
      16. Verwijder DAPI en was 2x dia met TBS gedurende 5 minuten elk. Opmerking: Als DAPI kleuring niet wordt uitgevoerd, slaat u deze extra wasstap.
      17. Voer een snelle wassing met 0,1 M Tris (pH 9), verwijderen en ~ 15 ul van fixeermiddelen voorverwarmd tot 37 ° C (4% n-propyl-3.4.5 trihydroxybenzoaat (propylgallaat), 50 mM Tris, pH 9 in 50% glycerol) aan elke dia (omcirkeld gebied).
      18. Voeg een dekglaasje aan elke dia (bovenop de montage media in het omcirkelde gebied), lont uit de overtollige vloeistof en sluit de dia's met nagellak. Opmerking: Dia's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
      19. Let op de embryo's opde dia's met behulp van een groothoek fluorescentiemicroscoop of laser scanning confocale microscoop. Belangrijk, de instellingen aanpassen om beelden van optimale pixelintensiteit verzamelen met behulp van controle (N2 of niet-RNAi) embryo's. Verzamel dan beelden van RNAi embryo's met dezelfde instellingen. Voorbeelden van beelden verzameld controle versus ani-1 RNAi embryo's worden getoond in Figuur 2B.

4. Voorbereiding van de dia's voor Live Imaging en Oogsten Embryo

  1. Voorbereiding van de agarose pads voor live-imaging
    1. Plaats een schone, vooraf verwarmd microscoopglaasje tussen twee dia's, elk met 1-2 afplakband op hen.
    2. Met behulp van een glazen Pasteur pipet een druppel 2% w / v agarose (opgelost in gedestilleerd water verwarmd) aan de dia.
    3. Plaats snel een tweede, schone microscoopglaasje op de top van de eerste dia in een loodrechte wijze de agarose druppel plat. Opmerking: De tape op de naburige geschovenes geeft de dikte van de pad.
    4. Laat de agarose pad droog voor een 1-2 minuten voordat u de bovenste schuif. Schuif het bovenste slede voorzichtig om te voorkomen dat onder het breken van de agarose pad. Opmerking: soms is het pad naar de bovenste slede en is nog bruikbaar, zolang het intact blijft.
    5. Breng de embryo's op de agarose pad binnen een paar minuten na de bereiding zoals hieronder beschreven (zie stap 4.2). Opmerking: Het pad moet een ondoorzichtige uiterlijk hebben, zodra duidelijk is, is het te droog om te gebruiken.
  2. Oogsten embryo
    1. Gebruik het volgende protocol voor het verzamelen van levende embryo beeldvorming, dat is afgeleid van Sulston et al.. 24
    2. Pick ongeveer 4-6 gravid volwassenen (niet uitgehongerd) van NGM of RNAi borden en plaats ze in 20-30 pi M9 buffer in een goed op een depressie glijbaan.
    3. Gebruik een gesteriliseerde scalpel de wormen snijden aan weerszijden van de spermatheca (dan wel bij de vulva) telaat embryo in de oplossing.
    4. Gebruik een rubberen slang met een mondstuk verbonden met een glazen capillair / pipet getrokken om een ​​kleine boring hebben en zuig de embryo's via de mond pipetteren. Als alternatief, verzamel embryo's met een capillaire glazen buis die aan een Pasteur pipet rubberen bol is bevestigd.
    5. Breng de afgezogen embryo's om een ​​tweede put ook M9 buffer die, om hen te helpen scheiden van de worm puin.
    6. Dan zuig de embryo's op een vers bereide agarose pad (zie stap 4.1).
    7. Massa embryo tezamen met een wimper (verlijmd op een tandenstoker) om het aantal embryo's dat kan worden gefilmd in een x, y-vlak te vergroten. Opmerking: Om zuurstoftekort te voorkomen, klonteren niet meer dan 10 embryo's.
    8. Vervolgens bekeken de dia met een dekglaasje en gedeeltelijk af te dichten met reeds verwarmde vloeistof valap (vaseline, lanoline en paraffine, gesmolten en gecombineerd 01:01:01) om uitdroging van de embryo's tijdens de beeldvorming te voorkomen. Let op: Extra M9 buffer can worden toegevoegd aan de pad zodat embryo voldoende vloeistof beeldvorming. In plaats van valap kunnen vaseline worden gebruikt om gedeeltelijk afdichten dekglaasjes, maar minder stijf waardoor de dekglaasjes te glijden en kan op de microscoop doelstellingen krijgen.

5. Live-Imaging

  1. Om neuroblasts visualiseren, het verkrijgen van een worm stam die een neuroblast-specifiek eiwit verbonden aan een fluorescerend eiwit uitdrukt (bijv. HAM-1: GFP, stam ID bij CGC OP102). Om celmembranen te detecteren, een worm stam die ook drukt een eiwit domein dat lipiden die op een ander fluorescerend eiwit herkent (bijv. mCherry:. PH, stam ID bij CGC OD70).
  2. Harvest embryo's van TL hermafrodieten gehouden op controle of ani-1 RNAi platen (zie Protocollen 3 en 4), en dia's zoals hierboven beschreven te bereiden (zie Protocol nr. 4).
  3. Afbeelding embryo 4D (x, y, z en time-lapse) door epifluorescentie microscopie. Gebruik of een widefield systeem [geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop met filters voor GFP en TexasRed, doelstellingen tot 60X of 100X, een hoge resolutie CCD (Charge Coupled Device) camera, zeer gemotoriseerde stadium (bv.. Piezo Z) en gespecialiseerde acquisitie software] of een livescan geveegd veld confocale microscoop [geautomatiseerde fluorescerende scanning microscoop met 488 nm en 561 nm lasers, doelstellingen tot 100X, een EMCCD (elektron te vermenigvuldigen CCD) camera, zeer gemotoriseerde stadium (bv. piëzo-Z) en gespecialiseerde acquisitie software]. Opmerking: Voor de groothoek-systeem, met behulp van LED's en een EMCCD camera zal fototoxiciteit beperken. Ook kan een draaiende schijf confocale microscoop gebruikt in plaats van het veld geveegd systeem.
  4. Om het beeld neuroblast celdeling op beide systemen, vinden x, y frames van embryo's met behulp van de 10X of 20X doelstellingen, en kiezen voor een optimale x, y frame waarin de embryo's ondergaan dorsale intercalation (stap voorafgaand aan de ventrale behuizing; Figuur 1A) of zijn in vroege stadiavan ventrale behuizing (~ 350 minuten na de eerste celdeling; Figuur 1A).
  5. Op het veld geveegd microscoop, gebruik maken van de 488 nm en 561 nm 100 mW lasers bij 40% vermogen met een spleet van 50. Op de groothoek-systeem, gebruik de filters GFP en TexasRed met lage-medium lichtintensiteit (indien regelbaar). Opmerking: Voor de groothoek-systeem, LED's hebben een lage fototoxiciteit en voorkeur.
  6. Op beide systemen, gebruik dan de 60X of 100X olie immersie doelstellingen en verzamel 20 Z-stacks van 0,2 micrometer om de 2 min voor een totaal van 10 minuten. Opmerking: Hoewel de HAM-1: GFP en mCherry: PH probes express relatief hoog, de belichtingstijden voor elke probe moet geoptimaliseerd voor verschillende microscopen. Opmerking: Voor de groothoek-systeem, zijn er minder Z-stacks aan te raden om fototoxiciteit te beperken en voor de beeldvorming over een langere periode van tijd, gebruik minder tijd punten.
  7. Tot fototoxiciteit veroorzaakt door de blootstelling van embryo's aan UV-licht op de groothoek te minimaliseren (bij gebruik van een mercury bol), sluit de opening tot 30% en de lichtintensiteit te verlagen (met behulp van een verstelbare verlichtingssysteem). Opmerking: Hoewel versterking niet nodig beide systemen gebruikt, kunnen andere microscopen lichtbronnen met lagere intensiteit of doelstellingen verschillende numerieke openingen, die het gebruik van baat kunnen vereisen om optimale beelden te verkrijgen pixel intensiteit hebben. Test de omstandigheden met behulp van een controle-embryo om ervoor te zorgen dat alle waargenomen fenotypes zijn niet te wijten aan artefactuele fototoxiciteit.

6. Analyse van Microscopie gegevens

  1. Om de beelden, export-bestanden als TIFF analyseren en open de TIFF als een stapel met behulp van gespecialiseerde software, zoals een op Java gebaseerde beeldverwerking programma (bijvoorbeeld ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Opmerking: Afhankelijk van de acquisitie software waarmee de beelden te verzamelen, kan de bestanden in hun oorspronkelijke vorm bewaard en geopend in ImageJ. Dit heeft de voorkeur als de metadata wordt gehouden met de bestanden.
  2. Scheid de stapelin 'beelden' en selecteer tijdstippen en Z-vliegtuigen zoals gewenst. Opmerking: Hoewel een stapel van 20 Z-vliegtuigen wordt genomen, veel van de neuroblasts zijn <1 micrometer dik tijdens de mid late embryogenese en slechts een paar Z-vliegtuigen nodig zijn.
  3. Restack de geselecteerde Z vliegtuigen voor elk tijdstip en maak aparte Z-stack projecties. Vervolgens stapel de projecties voor elk tijdstip samen om een ​​tijdreeks maken.
  4. Aanpassingen doen aan de helderheid en / of contrast voor elk kanaal.
  5. Vervolgens selecteert u een regio van belang, bijsnijden (en draai indien nodig) de regio.
  6. Samengevoegde beelden met behulp van de functie 'samengevoegd kanalen' en kies een andere kleur voor elk kanaal. Samengevoegde afbeeldingen te converteren naar RGB.
  7. Omkeren grijsschaalbeelden voor elk kanaal van stap 6.3 of 6.4 (gebruik 'omkeren' functie onder 'bewerken') om beelden duidelijker te visualiseren.
  8. Sla alle uiteindelijke beelden als 8-bits TIFF's om cijfers te maken in vector-gebaseerde softwzijn programma's of als Quicktime-bestanden om films te maken.
  9. Bij metingen van pixelgrootte zijn (bijvoorbeeld om een schaalbalk met de beelden omvatten), gebruikt ImageJ of andere beeldverwerkingssoftware de grootte van de embryo meten. Opmerking: Afbeeldingen verzameld met behulp van verschillende doelstellingen verschillende pixel maten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze experimentele protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling in C. elegans embryo's tijdens de mid embryogenese. In het bijzonder wordt beschreven hoe u foto neuroblasts, die epidermale morfogenese kan vergemakkelijken. Epidermale morfogenese optreedt als gevolg van een combinatie van epidermale celvorm veranderingen, migratie en adhesie, maar ook afhankelijk van chemische of mechanische signalen van de onderliggende neuroblasts (Figuur 1B). De neuroblasts scheiden Praktische signalen die worden ontvangen door receptoren op het oppervlak van ventrale epidermale cellen, die de trek 10,14,25 regelt. Bovendien zijn de neuroblasts zeer proliferatieve, die mechanische krachten die bijdragen aan de migratie van epidermale cellen ventrale 26 kunnen bepalen. Dit protocol kan worden gebruikt om neuroblast celdeling bestuderen middenseizoen embryogenese. Eerste, embryo's co-expressie markers om neuroblasts visualiseren (HAM-1: GFP) ondergaat cytokinesis (mCherry: PH) worden gegenereerd. HAM-1: GFP expressie GFP (green fluorescent protein) gelabeld eiwit dat lokaliseert kernen 27 neuroblast en moeten gebruiken omdat er vele andere celtypen aanwezig tijdens mid embryogenese (> 300 cellen, figuur 3). Dit werkt ook als een goede marker voor delende cellen, aangezien DNA condenseert in chromosomen tijdens de mitose. mCherry: PH is een mCherry-gelabeld fluorescerende eiwit dat wordt uitgedrukt door een maternale promotor (pie-1) en bevat de lipide bindende domein van PLC1 ∂ 1 28, die lokaliseert aan celmembranen. Dit eiwit is nodig om cytokinesis visualiseren, wanneer het membraan en cytosol knijpen in om de moeder cel scheiden in twee dochtercellen, figuur 3; Video 1). Hoewel dit protocol beschrijft het afbeelden neuroblast splitsing (getoond door HAM-1: GFP expressie) kunnen andere merkers worden gebruikt om andere celtypen te visualiseren.

Te visualiseren verdelen neuroblasts, embryo coexpRessing HAM-1: GFP en mCherry: PH worden afgebeeld om de 2 min (in totaal 10 min). Elke neuroblast slechts ~ 1-4 micrometer in diameter, en is <1 urn dik, en is het het beste om een objectief te gebruiken met hoge vergroting (bijv.. 100X). Bovendien werden vele Z-stacks (~ 20) worden verkregen, een kleine stapgrootte (0,2 um) zodat de verschillende hoeken van elke cel (bolvormig) worden afgebeeld. Om dit te veel afbeeldingen te verzamelen, zonder afbreuk te doen tijdstippen, wordt een sterk gemotoriseerde stadium (bv. Piezo Z Stage) aanbevolen. Na verzamelen van een reeks beelden, worden ze geanalyseerd om cellen binnen enkele Z-stacks die verdelen, het DNA wordt gecondenseerd, het membraan ingressed en nieuwe dochtercellen worden gevormd (tijdstippen van de verwachte stapel samengevoegde kanalen voorbeeld figuur 3A en geselecteerde stapels samengevoegd kanalen zijn weergegeven in figuur 3B, Video 1). Om de cellen beter zichtbaar te maken, is het raadzaam omhouden elk kanaal in grijstinten en keren de beelden (bijvoorbeeld figuur 4).

De beeldresolutie is verschillend voor de groothoek-systeem met behulp van een hoge resolutie CCD-camera (1344 x 1024 pixels) vs. het veld geveegd systeem met behulp van een high speed EMCCD camera met hoge gevoeligheid (~ 35 frames / sec en 512 x 512 pixels). Omgekeerde beelden van het verdelen neuroblasts van controle embryo's die met beide systemen worden gepresenteerd ter vergelijking (Figuur 4 vs. 5). Zoals weergegeven in figuur 4A (groothoek systeem; Video 2), zijn de beelden duidelijker vs figuur 5A. (Geveegd veld systeem; Video 4). Echter, bij gebruik van de groothoek-systeem, embryo's zijn gevoelig voor fototoxiciteit en een snellere time punten niet mogelijk met de hoge resolutie camera. Bijvoorbeeld veranderingen in de lokalisatie van diverse eiwitten (bijv.. T onderzoekeno bestuderen veranderingen in hun dynamiek), misschien tijd punten moeten vaker worden verzameld. Ook kan het niet mogelijk zijn om voor langere tijd zonder vermindering van het aantal Z-stacks en tijdstippen. Met een EMCCD camera op de groothoek systeem een ​​breder imaging toepassingen mogelijk. Camera's die zowel een hoge resolutie en hoge snelheid hebben ontwikkeld, maar de drivers zijn mogelijk niet beschikbaar, afhankelijk van de acquisitie software wordt gebruikt, en ze kunnen nog niet zo gevoelig als EMCCD camera's. Een ander systeem dat gewoonlijk wordt gebruikt voor beeldvorming C. elegans is de draaiende schijf confocale, die ook lager fototoxiciteit en kan worden uitgerust met ofwel EMCCD of CCD-camera's (zie Discussie).

Genen die nodig zijn voor celdeling te bestuderen, worden hermafrodieten behandeld met RNAi tegen een gen van belang (bijvoorbeeld ani-1, zie paragraaf 1.2 en 3 van het protocol) en de embryo's worden afgebeeld op dezelfde wijze als control embryo's. Om cellen te vergelijken van RNAi embryo tot embryo's te beheersen, is het het beste om het op een vergelijkbaar stadium van de embryonale ontwikkeling (naar wedstrijd cel vormen en posities te helpen). Zo is er een grotere cel zichtbaar in het midden van het embryo tijdens ventrale behuizing die kan fungeren als een goede referentie voor beeldvorming neuroblasts (figuren 4 en 5). Het gen hier onderzochte ani-1 (anillin) organiseert actomyosine contractiliteit, maar is niet vereist voor cytokinese in het vroege embryo 23,29-30. Anillin's homologen zijn echter nodig voor cytokinese in hogere eukaryoten 16 en ani-1 is vereist voor neuroblast cytokinesis (Fotopoulos, Wernike en Piekny, ongepubliceerde waarnemingen). Zoals getoond in figuren 4B (Video 3) en 5B (Video 5), verscheidene neuroblasts initiëren cytokinese en hun membranen knijpen, maar in plaats van het vormen van twee afzonderlijke dochtercellen, hun membranen achteruit en de cellen meerkernige (> 1 kern / cel). Opgemerkt moet worden dat de ani-1 kan worden geëist voor de divisie of vormverandering van andere celtypes, die niet zijn geopenbaard door dit protocol. Bovendien is dit protocol niet het gevolg van weefsel-specifieke RNAi (zie Overleg) tonen.

Figuur 1
Figuur 1. Ventrale behuizing tijdens C. elegans epidermale morfogenese. A) Z-stack projecties (3 Z-stacks van 0,5 micrometer dik) van een controle AJM-1: GFP (adherens knooppunt marker om epidermale cel grenzen te visualiseren; stam ID bij CGC SU159) embryo ondergaat dorsale intercalatie (links-, rug-view ) en een controle AJM-1: GFP embryo ondergaat ventrale behuizing (rechts, ventrale view). Beelden worden omgekeerd om beter visualize cel grenzen. B) Cartoons tonen ventrale uitzicht op C. elegans embryo ondergaat ventrale behuizing. Eerste, twee paar toonaangevende cellen (blauw) gebruiken actine rijk filopodia (zwarte lijnen) te migreren naar de ventrale middellijn (embryo aan de linkerkant). Vervolgens de achterste ventrale zak cellen (rood) migreren naar de middellijn het creëren van een gat op het ventrale oppervlak dat kan sluiten door een portemonnee string als mechanisme (B '; zwarte gestippelde lijn / cirkel, die doet denken aan wondgenezing) 25. Ook getoond worden de onderliggende neuroblasts (als grijze cirkels). De tweede embryo (B ') laat zien hoe de migratie van specifieke subsets van epidermale cellen worden bemiddeld door een' brug 'gevormd uit de herschikking van PLX-2/plexin en VAB-1/Ephrin-receptor uitdrukken' plexin band 'cellen (groen cirkels). Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2. ANI-1 lokalisatie in C. elegans embryo's. a) een vaste C. elegans embryo uitdrukken HMR-1: GFP (E-cadherine; marker van epidermale cel grenzen) costained voor GFP (groen) en ANI-1 (rood). Confocale beelden van de buitenste cellagen (4 Z-stacks van 0,2 micrometer dikte) tonen de bovenliggende epidermale cellen en onderliggende neuroblasts, die ANI-1-positieve B zijn) Vaste N2 en N2;. Ani-1 RNAi embryo's worden mede gekleurd voor ANI-1. ANI-1 is zeer gering bij de ani-1-verarmd embryo. Schaal bars:. 10 pm Klik hier voor grotere afbeelding.


Figuur 3. Visualiseren verdelen neuroblast tijdens C. elegans embryogenese. (A) Z-stack projecties (20 Z-stacks van 0,2 micrometer dik) worden getoond vanuit een controlekamer embryo co-expressie HAM-1: GFP (tot neuroblast kernen te visualiseren, groen) en mCherry: PH (om celmembranen te visualiseren; red) . Vele neuroblasts en andere celtypes zijn zichtbaar in de uitsteeksels (B) Z-stack uitsteeksels met een kleiner aantal Z vlakken getoond van een andere co-expressie controle embryo HAM-1. GFP (groen) en mCherry: PH (rood). Een gebied wordt ingezoomd (witte doos) om duidelijker een individuele scheidslijn neuroblast. Witte pijlpunten wijzen op de ingressing plasmamembraan van een delende cel en groene cirkels markeren de gecondenseerde DNA tijdens mitose en nieuwvormen dochter kernen tegen het einde van de mitose. De grote cel dient als referentiepunt (witte asterisk) om te bepalen ontwikkelingsstadium en locatie binnen het embryo. Schaal bars:. 10 micrometer (wit) en 3,5 micrometer (geel) Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4
Figuur 4. Visualiseren neuroblast cytokinesis tijdens C. elegans embryogenese met een groothoek-systeem. A) Omgekeerde Z-stack uitsteeksels (2 Z-stacks van 0,2 pm dik) zijn vertegenwoordigd door een controle-embryo co-expressie HAM-1: GFP en mCherry: PH vanuit het groothoek systeem met een CCD-camera met een hoge resolutie. Rode pijlpunten wijzen op delen neuroblasts met ingressing celmembranen. Groene cirkels markeren gecondenseerd DNA tijdens vroege fasen van mitose of nieuw gevormde dochterkernen eind mitose / cytokinese. De grote cel dient als referentiepunt (geel sterretje) om ontwikkelingsstadium bepalen. B) De getoonde afbeeldingen zijn vergelijkbaar met A), maar zijn uit een embryo behandeld met ani-1 RNAi. Het celmembraan ingresses in de cel gaat door mitose, maar ontspant kort na het verlaten van een meerkernige cel. Schaal bar:. 10 micrometer (zwart), 3,5 micrometer (geel) Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 5
Figuur 5. Visualiseren neuroblast cytokinesis tijdens C. elegans embryogenese gebruik van een veld geveegd systeem. A) Omgekeerde Z-stack projecties van 2 Z-stacks van 0,2 micrometer (totaal 0,4 micrometer) getoond van een embryo co-expressie HAM-1: GFP en mCherry: PH verzameld van het veld geveegd systeem met behulp van een EMCCD camera met hoge gevoeligheid, maar lagere resolutie. De rode pijl wijst naar een neuroblast ondergaan cytokinese. Groene cirkels markeren gecondenseerde DNA tijdens mitose en de nieuw gevormde dochter kernen na cytokinesis. De grote cel dient als referentiepunt (geel sterretje) om ontwikkelingsstadium bepalen. B) De getoonde afbeeldingen zijn vergelijkbaar met A), maar zijn uit een embryo behandeld met ani-1 RNAi, en 3 Z-stacks worden gebruikt (in totaal 0,6 pm ). Zoals hierboven beschreven, het membraan ingresses in de cel verloopt via mitose, maar ontspant waardoor de cel meerkernige worden. Schaal bar: 10 micrometer (zwart), 3,5 micrometer (geel).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Video 1. Visualiseren verdelen neuroblasts tijdens C. elegans embryogenese. Z-stack projecties van twee Z vlakken (0,4 micrometer / vliegtuig) vanuit een controlekamer embryo co-expressie HAM-1: GFP (groen) en mCherry: PH (rood). Beelden verzameld van de groothoek microscoop worden getoond voor beide kanalen. De video komt overeen met de in het derde deel van fig. 3B embryo. Klik hier om video.

Video 2. Visualiseren verdelen neuroblasts tijdens C. elegans embryogenese. Z-stack projecties van twee Z vlakken (0,4 micrometer / vliegtuig) vanuit een controlekamer embryo co-expressie HAM-1: GFP (groen) en mCherry: PH (rood). De video komt overeen met omgekeerde beelden verzameld van de groothoek microscoop voor de mCherry: PH kanaal only (embryo in figuur 4A). Klik hier om de video te bekijken.

Video 3. Visualiseren verdelen neuroblasts tijdens C. elegans embryogenese. Z-stack projecties van twee Z vlakken (0,4 micrometer / vliegtuig) van een ani-1 RNAi behandelde embryo co-expressie HAM-1: GFP (groen) en mCherry: PH (rood). De video komt overeen met omgekeerde beelden verzameld van de groothoek microscoop voor de mCherry:. Alleen PH kanaal (embryo in figuur 4B) Klik hier om de video te bekijken.

Video 4. Visualiseren verdelen neuroblast tijdens C. elegans embryogenese. Z-stack projecties van twee Z vlakken (0,4 micrometer / vliegtuig) vanuit een controlekamer embryo co-expressie HAM-1: GFP (groen) en mCherry: PH (rood). De video komt te inverterened beelden verzameld van het veld geveegd confocale microscoop voor de mCherry:. alleen PH kanaal (embryo in figuur 5A) Klik hier om de video te bekijken.

Video 5. Visualiseren verdelen neuroblast tijdens C. elegans embryogenese. Z-stack projecties van drie Z vlakken (0,4 micrometer / vliegtuig) van een ani-1 RNAi behandelde embryo co-expressie HAM-1: GFP (groen) en mCherry: PH (rood). De video komt overeen met omgekeerde beelden verzameld van het veld geveegd confocale microscoop voor de mCherry:. Alleen PH kanaal (embryo in figuur 5B) Klik hier om de video te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft het gebruik van verschillende soorten microscopie beeld celdelingen tijdens mid embryogenese. In het bijzonder, dit protocol benadrukt hoe het imago van de afdeling van neuroblasts, cellen die epidermale morfogenese kan vergemakkelijken. Cel-cel communicatie is belangrijk voor de vorming van weefsel tijdens metazoan ontwikkeling en C. elegans is een uitstekend model voor de vorming van weefsel te bestuderen in vivo. Een gebeurtenis die mooi beeldt het samenspel van weefsels epidermale morfogenese, waarbij het embryo in een laag van epitheelcellen omvat. Vooral ventrale behuizing is het proces waarbij de ventrale epidermale cellen naar het ventrale oppervlak van de embryo omsluiten, en vertrouwt op de onderliggende neuroblasts. De neuroblasts bieden chemische of mechanische signalen, en ventrale behuizing in het gedrang komt als de positie van neuroblasts wordt gewijzigd. Het nummer (of polariteit) van neuroblasts kan ook van essentieel belang voor het ventrale behuizing goed te voorkomen,en het is belangrijk om de mechanismen die hun divisie reguleren begrijpen. Dit protocol beschrijft hoe het de celdeling in een levend weefsel met behulp van C. elegans embryo's co-expressie van twee fluorescerende probes (mCherry: PH aan plasma membranen en HAM-1 schetsen: GFP tot neuroblast kernen label).
De meest essentiële stappen om het leven C. elegans embryo uitdrukken fluorescerende probes zijn: i) te gebruiken gezonde, jonge volwassen hermafrodieten uiting van de gewenste fluorescente markers (gehandhaafd op 20-25 ° C), ii) gebruik mutanten of RNAi om gen eisen te bestuderen tijdens de vorming van weefsel, iii) het verzamelen van embryo's in de juiste podium voor microscopie (bijv.. medio embryogenese), en iv) het uitvoeren fluorescentie microscopie met optimale instellingen te fototoxiciteit laag te houden, maar om een hoge beeldkwaliteit te behouden.

Aan specifieke cellen en / of intracellulaire compartimenten binnen een weefsel van belang te identificeren, gebruiken wormen uiten markers gelabeld met fluorescerende probes. De Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) biedt een verscheidenheid aan stammen die meerdere markers coexpress. Kunnen echter twee stammen (elke expressie een merker van belang) worden gekruist en onderzocht met een fluorescentiemicroscoop over meerdere generaties een stam die stabiel beide probes. Bijvoorbeeld, voor het uitvoeren van deze experimentele protocol, een stam die een marker om celmembranen (mCherry: PH; OP70) visualiseren werd gekruist met een stam die een marker om neuroblast kernen te visualiseren (HAM-1: GFP; OP102) voor het genereren van een stam co-expressie beide.

De beste manier om genen te bestuderen eisen tijdens de embryonale ontwikkeling verlies-experimenten, waarbij het genproduct wordt neergeslagen of gemuteerde voeren. Deze experimentele protocol beschrijft het uitvoeren van RNAi tegen anillin (ani-1) endogene ANI-1 niveaus in alle embryonale weefsels verminderen. Er zijn geen goed gekarakteriseerd hypomorphic allelenvan ani-1. Daarom RNAi is de beste optie om verlies van functie fenotypes ani-1 's te onderzoeken en vast te stellen zijn functie tijdens de embryonale ontwikkeling. Gewoonlijk is het beter om mutanten plaats van RNAi gebruik, de efficiëntie van knockdown variabel kan zijn en is zelden nul. Een van de meest voorkomende problemen met invoeren RNAi protocollen besmetting die RNAi efficiëntie verminderen. Om het risico van besmetting te verminderen, de voorbereiding van de RNAi borden en eten in aseptische omstandigheden. Verontreiniging kan worden gedetecteerd door het screenen van een paar van de platen voor gebruik, en platen met melkachtig / ondoorzichtige zoek bacteriën moet worden weggegooid. Een ander probleem dat RNAi-efficiëntie kan verminderen is door niet te kiezen voor hermafrodieten op het juiste ontwikkelingsstadium. Het beste is om L4-gefaseerde of jong volwassen wormen (het ontwikkelen van vulva verschijnt als een witachtig cirkel / gat aan de buikzijde van de worm), die geen / weinig bevruchte embryo's te gebruiken. Bovendien is de RNAi voorwaarden en behandelingen benay variëren voor verschillende genproducten. Verschillende manieren om te verhogen of verlagen van de sterkte van de RNAi is door resuspenderen het ingehulde HT115 bacteriën in verschillende hoeveelheden LB Amp media (zie paragraaf 1.2.2), en door het veranderen van de duur van RNAi behandeling (tijdsduur dat wormen worden gehouden op RNAi platen, zie Protocol nr. 3). Om optimale ani-1 RNAi fenotypes voor dit protocol verkregen, werden bacteriën geresuspendeerd in 500 pi LB Amp media en wormen RNAi platen werden gedurende 2 dagen (ani-1 RNAi is eerder gekenmerkt door Maddox et al.. 23). RNAi resistente en gevoelige stammen (bijv.. Rde-1, sid-1 of RRF-3) kan ook worden gebruikt om de sterkte van RNAi veranderen. Wat nog belangrijker is, kunnen deze stammen worden gekoppeld met het weefsel specifieke uitdrukking van hun wild-type genen om weefsel gevoelige stammen creëren. Om bijvoorbeeld neuroblast specifieke RNAi uitgevoerd dan kan men sid-1 mutant embryo (RNAi-resistente) gebruiken expressie wt unc-119 promotor (stam ID bij CGC TU3401) 31.

Dit protocol beschrijft hoe u het neuroblast celdeling tijdens de mid embryogenese. Er zijn verschillende aspecten van het protocol dat een zorgvuldige afweging vereisen, zoals het ontwikkelingsstadium van het embryo, het verzamelen van de juiste Z-stacks en het optimaliseren van de beeldvorming voorwaarden fototoxiciteit een minimum te beperken zonder afbreuk te doen aan de beeldkwaliteit. Om tijdstippen vastleggen rechts ontwikkelingsstadium (bijv. ventrale behuizing), moet het embryo worden gefilmd dorsale intercalatie (paren dorsale epidermiscellen interdigitate en zekering met een enkele laag van de epidermis aan de rugzijde van het embryo te vormen, figuur 1A6). Op dit moment worden de neuroblasts snel delende. Sinds de enscenering van de embryo's kan moeilijk zijn onder lage vergroting (bijv. met behulp van een dissectie microscoop), helpt het om veel embryo's van verschillende stadia en embryo's te verzamelen bij dejuiste stadium kunnen worden geselecteerd met een hogere vergroting.

Neuroblasts zijn relatief klein en dun, en zijn te vinden in het midden van het embryo. Het is essentieel om het aantal en de grootte van Z-stacks optimaliseren zodat de hele cel wordt gevangen tijdens scheiding. Bijvoorbeeld, het verzamelen van teveel beelden zullen embryo's bloot aan meer licht en maken ze vatbaar voor fototoxiciteit. Echter, het verzamelen van te weinig Z-stacks of met behulp van dikke Z-profielen kan het moeilijk maken om goed imago een hele scheidslijn neuroblast cel.
Dit protocol beschrijft het gebruik van een sweep veld confocale microscoop of groothoek systeem beeld neuroblast celdeling. Zoals eerder beschreven, een van de belangrijkste beperkingen van het gebruik van een groothoek epifluorescerende microscoop is de mogelijke fototoxiciteit. Hoewel het sterk aanbevolen om een draaiende schijf confocale of geveegd veld confocale voor imaging C. gebruiken elegans embryo's, kunnen sommige laboratoria beperkte toegang tot deze systemen. Dit pROTOCOL geeft enkele suggesties om fototoxiciteit beperken bij het gebruik van groothoek-systemen, zoals het sluiten van de opening tot 30%, het verlagen van de intensiteit van het licht van de kwik lamp (of bij voorkeur met behulp van LED's), met behulp van een EMCCD camera, en het verhogen van de winst of binning toestaan een afname van de belichtingstijd. Het aantal Z-stacks en tijdstippen ook zal worden beperkt met behulp van een groothoek-systeem. Hoewel niet in dit protocol werd beschreven, wordt de draaiende schijf confocale microscoop gebruikt voor levende beeldvorming als het veroorzaakt minder fototoxiciteit in vergelijking met een groothoek microscoop. Net als het veld geveegd systeem gebruikt solid state lasers en verstrooit licht (hoewel op een andere wijze tegen het geveegd veld). Ofwel CCD of EMCCD camera's kunnen worden gebruikt met draaiende schijf systeem, dat vaak meerdere camera poorten voor dubbele beeldvorming mogelijk te maken. Net als bij het ​​geveegd veld microscoop kunnen beelden worden vastgelegd met belichtingstijden 50-90% lager ten opzichte van de groothoek-systeem.
Dit protocolol kan worden gebruikt om de functie van verschillende genen die mitose reguleren tijdens weefselvorming bestuderen. De tijd tussen elke foto kan worden verkort (bv. Elke 15-30 sec vs. 2-3 min) tot mitotische fenotypes beter te visualiseren. Verschillende probes kunnen worden gebruikt (bijv. in plaats van HAM-1. GFP, fluorescent-gelabelde H2B kunnen worden gebruikt om DNA te visualiseren en / of fluorescerend gelabeld tubuline kan worden om mitotische spoelen te visualiseren). Het aantal Z-stacks en de dikte van elke stapel kan worden gewijzigd (bijv. meer stapels van een kleinere stapgrootte). Zoals hierboven beschreven, het kiezen van de juiste instellingen is cruciaal voor het beperken fototoxiciteit en optimaliseren beeldkwaliteit. Hoewel de mCherry: PH en HAM-1: GFP sondes te uiten op een relatief hoog niveau, het verzamelen van een snellere time punten, het verhogen van het aantal Z-stacks of beeldvorming voor langere tijd tegen wat wordt beschreven in dit protocol niet mogelijk zijn op een groothoek systeem.
Een Java-gebaseerde imleeftijd verwerkingsprogramma (ImageJ, NIH) kan worden gebruikt om beelden van de verschillende microscopen en beelden verzameld proces kan worden geëxporteerd als TIFF. Echter, afhankelijk van de gebruikte software voor de verwerving, de bestanden konden al compatibel met de verwerking software. Het is beter om originele bestanden vs geëxporteerde afbeeldingen (bijv. TIFF's) te openen, omdat de metagegevens wordt gehouden met de originele bestanden. Processing software kan worden gebruikt om beelden te manipuleren voor het maken van figuren of films. Daarnaast kwantitatieve analyses ook worden uitgevoerd, zoals het meten pixelintensiteiten in geselecteerde gebieden. Optimale software moet worden geselecteerd afhankelijk van de analyse, zoals beeldverwerking Toolbox (MathWorks, Matlab) of 3D-en 4D-Real-Time Interactive Data Visualization (Imaris, Bitplane).
Met dit protocol ani-1 werd aangetoond dat nodig neuroblast cytokinese, hoewel het niet nodig is voor cytokinese in het vroege embryo. Interessant is dat door het beheersen van de number en de positie van neuroblasts, ani-1 kan de migratie van ventrale epidermale cellen voor ventrale behuizing te reguleren, omdat de neuroblasts verstrekken van de chemische of mechanische signalen naar de bovenliggende epitheelcellen. Het is echter niet bekend of ani-1 vereist is voor de splitsing of vormverandering van andere celtypes middenseizoen late embryogenese. Laat zien hoe de totale samenstelling van een weefsel beïnvloedt omringende weefsels benadrukt het belang van weefsel communicatie tijdens metazoan ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag erkennen dat dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) subsidie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

Tags

Neurowetenschappen , Morfogenese cytokinese neuroblasts anillin microscopie celdeling
Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wernike, D., van Oostende, C.,… More

Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter