Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך Published: March 12, 2014 doi: 10.3791/51188
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Concordia University

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונת חלוקת תאים בתוך פיתוח עוברי elegans Caenorhabditis. בפרט, פרוטוקול זה מתמקד איך תמונת חלוקת neuroblasts, אשר נמצאים מתחת לתאי האפידרמיס ועשוי להיות חשוב עבור המורפוגנזה אפידרמיס. היווצרות רקמה חיונית לפיתוח מטזואניים ומסתמכת על רמזים חיצוניים מרקמות שכנות. ג elegans הוא אורגניזם מודל מצוין ללמוד המורפוגנזה רקמות in vivo בשל השקיפות שלה וארגון פשוט, מה שהופך את הרקמות שלה קלים ללמוד באמצעות מיקרוסקופ. מתחם הגחון הוא התהליך שבו פני השטח הגחון של העובר הוא מכוסה על ידי שכבה אחת של תאי האפיתל. הוא חשב את האירוע הזה כדי להיות בהנחייתם של neuroblasts הבסיסית, המספק רמזי הדרכה כימית לתווך הגירה של תאי האפיתל שמעליה. עם זאת, neuroblasts הן שגשוג מאוד וגם עשויה לפעולכמצע מכאני לתאי האפידרמיס הגחון. מחקרים באמצעות פרוטוקול ניסוי זה יכול לחשוף את חשיבותה של תקשורת בין תאית במהלך היווצרות רקמות, ויכולים לשמש כדי לחשוף את תפקידם של גנים הקשורים בחלוקת תאים בתוך רקמות מתפתחות.

Introduction

אמנם יש פרוטוקולים המתארים כיצד לחלוקת תא תמונה בתחילת ג עובר elegans, פרוטוקול זה מתאר כיצד חלוקת תא תמונה בתוך רקמות במהלך אמצע העובר. אחד האתגרים הגדולים בתחום ההדמיה אורגניזמים במהלך הפיתוח היה רגישותם לphototoxicity. עם זאת, נגישות מוגברת למיקרוסקופי confocal הדיסק מסתובב או מיקרוסקופים שדה סחפו התירה יישומי הדמיה נפוצים יותר. שני מערכות משתמשות בלייזרים של מצב מוצקים ואור מפוזר, המגבילים את הרמות של UV שאורגניזמים נחשפים אליהן. עם זאת, דוכני Widefield עדיין יכולים לשמש הדמיה in vivo, במיוחד אם הם לבוש עם מצלמות עם רגישות גבוהה (למשל EMCCD), בקרת צמצם ושליטה אור (למשל נוריות או נורות כספית להתאמה). פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש באחת מערכת confocal מבוסס או מערכת widefield לחלוקת תא תמונה בתוך פיתוח ג elegans </ Em> עוברים. כדוגמא, נתאר כיצד תמונת חלוקת תא neuroblast. Neuroblasts עשויה להקל המורפוגנזה אפידרמיס על ידי מתן אותות כימיים או מכאניים לתאי האפידרמיס שמעליה, ומספקת דוגמא מצוינת לחשיבות של תקשורת בין תאית ביצירת רקמות.

elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם מודל אידיאלי למחקרים מבוססי מיקרוסקופיה בשל השקיפות שלה וארגון של רקמות פשוטות 1. יתר על כן, ג elegans ניתן לשיטות גנטיות וRNAi, ומאז יש לי רבים מהגנים שלו homologues האנושי, זה יכול לשמש כדי לזהות מנגנוני שימור להיווצרות רקמת 2-5. בג elegans, היווצרות של האפידרמיס מתרחש במהלך אמצע העובר, כאשר לעובר> 300 תאים. המורפוגנזה עוריות מורכבת מכמה שלבים עיקריים, שבמהלכו העובר מוקף בשכבה של תאי האפידרמיס שלהצר ולהרחיב להפוך embrיו מצורת ביצה לצורה המוארכת של תולעת 6. מתחם הגחון מתאר את אחד אירועי morphogenetic אלה, כאשר תאי האפידרמיס הגחון נודדים לכיוון קו האמצע הגחון כדי לכסות את פני השטח הגחון של העובר (איור 1). ראשית, שני זוגות של תאים החדשניים קדמי ממוקם נודדים לכיוון קו אמצע הגחון, שבו הם דבקים והפתיל עם שכניהם נגדי 6. זה ואחריו הגירה של תאי כיס האחוריים ממוקם, המהווים טריז כמו צורות יצירת כיס הגחון 6-7. המנגנון שסוגר את הכיס אינו מובן היטב. אפשרות אחת היא שמבנה התכווצות שרירן אקטין supracellular קושר את תאי הכיס יחד במחרוזת ארנק כמו אופנה, בדומה לריפוי פצעים 8. מעניין לציין, כי הגירתם של חלק מתאי הכיס מתווכת על ידי תת ספציפי של neuroblasts בסיס 9 (מבשרי נוירונים שנמצאים מתחת לepidermis; איור 1).

מחקרים קודמים הראו כי neuroblasts לווסת את הגירת הגחון אפידרמיס תא ומתחם הגחון. VAB-1 (קולט ephrin) ו( יגנד ephrin) VAB-2 באים לידי ביטוי מאוד בneuroblasts ולהקל על מיון הקדמי והאחורית neuroblasts אחד מהשני, ו מוטציות במתחם הגחון סיבת VAB-1 או VAB-2 פנוטיפים 10-13. עם זאת, ניסויי הצלת אמרגן הראו כי VAB-1 נדרש גם בתאים שמעל הגחון אפידרמיס וקולטנים לאותות הנחיה אחרים מופרשים על ידי neuroblasts באים לידי ביטוי בתאי האפידרמיס הגחון 9. למרות שמוטציות בכל של קולטנים אלה גורמים לפנוטיפים מתחם הגחון, שלא ברור אם פגמים להתעורר עקב בעיות במיקום neuroblast או עקב כישלון של תאי האפידרמיס הגחון להגיב להדרכת רמזי 14. לשנות את חלוקת wi neuroblastsגם בלי להשפיע על היכולת שלהם להפריש רמזי הדרכה יכול לשפוך אור על התפקיד של neuroblasts והיכולת שלהם לספק קלט מכאני במהלך המורפוגנזה אפידרמיס. לאחרונה, נמצא כי גן חלוקת תא, ani-1 (anillin) מתבטא מאוד בneuroblasts (איור 2 א) ודלדולה גורם למומי חלוקת neuroblast. מעניין לציין, כי העוברים האלה להציג פנוטיפים מתחם הגחון (Fotopoulos, Wernike וPiekny, תצפיות לא פורסמו).

Anillin נדרש לחלוקת תאים, ובמיוחד עבור cytokinesis, המתאר את התהליך שבו תא האם מחלק פיזי לשני תאים בת. Cytokinesis הוא מונע על ידי היווצרות של טבעת התכווצות actomyosin, אשר צריך להיות מבוקר היטב בחלל ובזמן כדי לוודא שהוא מצמידים כראוי עם הפרדה chromatid האחות. הרגולטור הראשי של cytokinesis מטזואניים הוא RhoA (RHO-1 ב C. elegans), GTPase קטן שהואctive בצורה מאוגד GTP. GEF Ect2/ECT-2 מפעיל RhoA, לאחר שRhoA-GTP אינטראקציה עם effectors מורד הזרם היוצרות את טבעת ההתכווצות ולתווך ingression 15. Anillin הוא חלבון תחום רב שנקשר לRhoA באמצעות C-הסופית שלה ויקטין ומיוזין באמצעות N-הסופית שלה. Anillin נדרש כדי לייצב את עמדתה של טבעת ההתכווצות בתאי יונקים או דרוזופילה S2 16. דלדול Anillin גורם טבעות התכווצות לעבור תנודות לרוחב, וסופו של דבר נכשל cytokinesis יוצר תאים multinucleate 17-19. מעניין לציין, כי למרות שג elegans ani-1 מתאם את התכווצות actomyosin בעובר המוקדם, זה לא חיוני לcytokinesis. עם זאת, כפי שתואר לעיל, נדרש ani-1 לcytokinesis neuroblast במהלך אמצע העובר (Fotopoulos, Wernike וPiekny, תצפיות לא פורסמו). כישלון cytokinesis ישנה את המספר והמיקום של neuroblasts ועלול להשפיע על locע אותות הנחיה כימיים, או שזה יכול לשנות את התכונות מכאניות של הרקמות. שני הדגמים להדגיש את תפקיד nonautonomous של neuroblasts למתחם הגחון, ואת החשיבות של תקשורת רקמות רקמות במהלך התפתחות עוברית.

פרוטוקול ניסוי זה מתאר כיצד חלוקת תא תמונה במהלך ג elegans אמצע עובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. רוב ניסויי חקר המנגנונים של חלוקת תא בוצעו בתאים בודדים בתוך מנות תרבות (למשל. הלה או תאי S2) או בעוברים מוקדמים עם מספר מוגבל של תאים (לדוגמא C. elegans עובר אחד תאים, Xenopus, או echinoderm עוברים). עם זאת, חשוב גם ללמוד חלוקת תאים בתוך רקמות, שכן יש רמזים חיצוניים שיכול להשפיע על העיתוי ומיקום של מטוס החטיבה. יתר על כן, תאים עשויים לספק רמזים כימיים או מכאניים כדי להשפיע על ההתפתחות של רקמה השכנהים, וזה חשוב להבין כיצד תקשורת בין תאית מסייעת רקמות כדי ליצור במהלך פיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת צלחות לשמירה על זני תולעת וביצוע RNAi

  1. צלחות צמיחה נמטודות מדיה
    1. צלחות
      1. הכן את צלחות צמיחה נמטודות מדיה (NGM) כדי לשמור על זני תולעת ולבצע צלבים גנטיים. שלב 3 גרם NaCl, 17 גרם אגר ו2.5 BactoPeptone גרם עם 1 ליטר של מים מזוקקים בבקבוק 2 ליטר ולהוסיף סרגל ערבוב מתכת.
      2. החיטוי הבקבוק כדי לפזר את אגר ולעקר את התקשורת. לאחר מכן הנח את הבקבוק על צלחת ומערבבים ולאפשר התקשורת כדי לקרר תוך כדי ערבוב.
      3. ברגע שהתקשורת התקררה, והוא עדיין מעט חם למגע (45-50 ° C), להוסיף 1 מיליליטר 1 M CaCl 2, 1 מיליליטר 1 M MgSO 4, פתרון 1 מיליליטר של 5 כולסטרול מ"ג / מיליליטר ו25 מיליליטר 1 M חיץ פוספט אשלגן (PPB; מתכון בטבלה של חומרים כימיים / חומרים; מסנן לעקר פתרונות מניות) ויוצקים מייד את התקשורת לתוך צלחות פטרי קטנות (60 מ"מ x 15 מ"מ; למלא את הצלחות ~ 3/4 לחלק העליון או 13 מיליליטר / צלחת USIng מתקן אוטומטי). הערה: לתחזוקה ארוכת טווח של כמה טטרציקלין זנים ניתן להוסיף לצלחות (12.5 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי לאפשר איון transposon Tn10 של גן RNAse III חיידקים.
      4. בואו לחזק את התקשורת בין לילה בטמפרטורת חדר. הערה: יש לשמור צלחות במנדף ביולוגי או באזור של המעבדה כי הוא נוטה פחות לזיהום. כמו כן, להסיר כל עיבוי שבנה על העפעפיים (למשל נקיים עם נייר טישו) להגביל פטרייתי זיהום. אם טטרציקלין יתווסף גם לצלחות, ואז לכסות אותם עם נייר אלומיניום כאנטיביוטיקה זו היא רגישה לאור.
      5. למחרת, זרע צלחות NGM היבשה עם השעיה של א ' coli (זן OP50, ראה סעיף 1.1.2), כי כבר vortexed בעדינות. כדי להפוך את הצלחות להזדווגות, להוסיף ~ 50 μl של OP50 למרכז כל צלחת (כדי ליצור עיגול קטן). כדי להפוך את הצלחות לשמירה על זני תולעת, זרע כל צלחת NGM עם ~ 100-200 μl של OP50 (ללהבטיח שהוא מכסה שטח גדול יותר של הצלחת).
      6. בואו צלחות זרע O היבש / N בטמפרטורת חדר.
      7. למחרת, לפנות צלחות NGM המיובשים במהופך ולערום אותם במיכלי אחסון מפלסטיק ב 4 ° C. הערה: לוחות שמישים עד ~ 3-4 שבועות. צלחות המכילות טטרציקלין צריכים להיות כל הזמן בחושך.
    2. מזון
      1. השתמש E. coli OP50 [מהמרכז לגנטיקת Caenorhabditis (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] כמקור מזון לג . Elegans הערה: OP50 ניתן לאחסן כמו מניות גליצרול ב-80 ° C (1:1 ב50% גליצרול V / V).
      2. כדי להפוך OP50 לצלחות NGM, להפוך את צלחת פס באמצעות aliquot קטן של מניית גליצרול (<10 μl; להשתמש קצה פיפטה סטרילית). מורחים את החיידקים על צלחת LB אגר (מתכון בטבלה של חומרים כימיים / חומרים) ולהשאיר אותו ב37 מעלות צלזיוס במשך שעה ~ 16. הערה: אם יש בעיות עם זיהום, ניתן להשתמש OP50 עמיד סטרפטומיצין,nd סטרפטומיצין ניתן להוסיף לצלחות LB אגר (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
      3. למחרת, פיק מושבה אחת ולחסן של תקשורת LB נוזלית (מתכון בטבלה של חומרים כימיים / חומרים) 100 מיליליטר בבקבוק 500 מיליליטר.
      4. בואו התרבות לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
      5. למחרת, השתמש בהשעית החיידקים לזריעת צלחות NGM. הערה: ניתן aliquoted OP50 ב50 צינורות חרוטי מ"ל ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס ל~ 4-6 שבועות.
  2. RNAi
    האכלה היא אחת הדרכים העיקריות לבצע התערבות בתיווך RNA (RNAi; למציאת מוצר גן ספציפי) בג elegans. ג יכולים להיות מוזנים הרמפרודיטים elegans E. זן חיידק HT115 הפך עם וקטור האכלה המבטא dsRNA על אינדוקציה. dsRNA זה (או שברים שלו) מועבר לבלוטת המין, בדרך כלל כתוצאה מכך מציאה משמעותית של יעד הגן הספציפי.
    1. צלחות RNAi
      1. הכן את צלחות NGM כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 1.1.1), אלא גם להוסיף 1 מיליליטר של 1 M IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside; כדי לגרום לביטוי של dsRNA) ו500 μl של 50 מ"ג / מיליליטר אמפיצילין (Amp; הווקטורים להביע dsRNA הם Amp עמיד) לתקשורת החמה (45-50 ° C).
      2. לאחר הצלחות התייבשו, זרעם עם ~ 50-100 μl של E. coli HT115 (ראה סעיף 1.2.2). הערה: ניתן לאחסן צלחות unseeded על 4 מעלות צלזיוס במשך ~ 4-5 שבועות.
      3. בואו צלחות זרע הייבוש למשך הלילה בטמפרטורת חדר.
      4. למחרת, לפנות את צלחות RNAi המיובשים במהופך ולאחסן אותם במכל אחסון מפלסטיק ב15-20 ° C. הערה: צלחות זורעים לשמור על יעילות RNAi לעד ~ 2-3 שבועות.
    2. RNAi מזון
      1. השתמש E. coli HT115 (מCGC, ראה סעיף 1.1.2) הפך עם L4440 האכלת הווקטור, או L4440 המכיל cDNA לגן של עניין. הערה: האכלת ספריות המתמקדות ברוב מסגרות קריאה פתוחות בגנוםכבר עשה והם זמינים (שיבוטים בL4440 הפכו לHT115; למשל מכיל בר מY49E10.19 לani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / דפים / Rnai.html). הערה: אפשר לשמור HT115 כמו מניות גליצרול ב-80 ° C (1:1 ב50% גליצרול V / V).
      2. כדי ליצור מבנה חדש מיקוד גן של עניין, ראה את מפת L4440 הווקטור וcDNA שיבוט בין היזמים T7 איגוף, שהם מתנהלת על ידי IPTG.
      3. להפוך HT115 עם מבנה L4440 באמצעות פרוטוקול סטנדרטי לשינוי (למשל להפוך את החיידקים כימיים המוסמכים ולבצע שינוי הלם חום).
      4. כפי שתואר לOP50 (ראה סעיף 1.1.2), חיידקי פס ממניות גליצרול על צלחת אגר LB, אבל את הצלחת צריכים להכיל גם 50 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין. הערה: אם אתם משתמשים במבנה L4440 קיים מראש, דלגו סעיפים 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. פיק מושבה אחת ולחסן 5 מיליליטרשל תקשורת LB המכילה 5 μl של אמפיצילין מ50 מ"ג / מיליליטר מניות (LB Amp), ולמקם אותו על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
      6. לאחר ~ 16 שעות, לחסן 5 מיליליטר של תקשורת LB Amp הטרי עם 50 μl של התרבות O / N ולצמוח התרבות ל7-8 שעות עם רעד ב37 ° C.
      7. צנטריפוגה החיידקים 1 דקות ב4,000-8,000 XG, לבטל את supernatant ו resuspend את הכדור ב 500 μl של תקשורת LB Amp הטרי.
      8. השתמש פתרון חיידקים זה זרע צלחות RNAi כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 1.2.1). הערה: יש להשתמש HT115 באופן מיידי ולא צריך להיות מאוחסן.

2. טיפוח זני תולעת

לשמור על ג זני elegans הזמינו מCGC על צלחות NGM על פי פרוטוקול סטנדרטי 1. זנים המשמשים לפרוטוקול זו כוללים: ג elegans var בריסטול, wild-type (מזהה מתח בCGC N2); UNC-119 (tm4063); wgIs102 [חזיר-1 UNC-119 (+)] (זיהוי מתח בCGC OP102); UNC-119 (ed3); ltIs44pAA173 [עוגה-1P-mCherry :: PH (PLC1delta1) + UNC-11 9 (+)] (זיהוי מתח בCGC OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [GFP AJM-1 :: + רול -6 (su1006)] (זיהוי מתח בCGC SU159); UNC-119 (ed3) ; XnIs96 [pJN455 (HMR-1 :: ה-GFP HMR-1P :: :: UNC-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (זיהוי מתח בCGC FT250).

  1. פיק ~ 3 הרמפרודיטים מבוגרים צעירים המציגים את הפנוטיפ הנכון לצלחת NGM טרי. הערה: N2 (var. בריסטול; wild-type) יכול להישמר בין 15-25 ° C, אבל הם יגיעו לצפיפות מהר יותר בטמפרטורות גבוהות יותר. מניות חדשות צריכה להתבצע כאשר צפיפות התולעת היא גבוהה.
  2. שמור את כל זני הניאון (למשל ה-GFP ו / או תולעי mCherry-להביע) ב-C ° 20-25 לביטוי אופטימלי של חלבוני ניאון. מניות חדשות צריכה להתבצע כאשר צפיפות התולעת היא גבוהה ואוכל הוא נמוך.
  3. לאסוף תולעים, להשתמשלקחת עשויה מזכוכית פיפטה משכה עם חוט פלטינה התמזגו בסוף משך (~ 3-5 סנטימטר באורך). שטח את החוט עם קצה חלק. השתמש בבחירה ל'סקופ 'עד הרמפרודיטים ולהעביר אותם לצלחות חדשות. להבת החוט בין השימוש כדי למנוע זיהום צולב של זנים.

3. RNAi

  1. ביצוע RNAi
    1. ראשית, מקום ~ 8 הרמפרודיטים L4 על צלחת NGM unseeded ל~ 30-60 דקות כדי להסיר את חיידקי OP50 מהתולעים.
    2. לאחר מכן למקם את הרמפרודיטים 8 על גבי צלחת NGM Amp IPTG זרע עם HT115 שנושאת את הפלסמיד L4440 להביע dsRNA לגן של עניין (למשל ani-1;. לראות 1.2) ל~ שעה 24. הערה: בהתאם לגן של עניין, או פנוטיפים הרצויים (שעשוי להיות תלוי בכוחו של מציאה), ניתן להשאיר תולעים על צלחות RNAi לתקופות קצרות או ארוכות יותר של זמן (לאחר 24 שעות, הניחו את הרמפרודיטים על RNAi הטרי צלחות).
    3. לנגשליטת ative, תולעי מקום על צלחת RNAi זרע עם HT115 נושא את וקטור L4440 הריק. הערה: עוברים אלה צריכים שום פנוטיפים.
    4. לביקורת חיובית, למקם את התולעים על צלחת RNAi להביע dsRNA כי מטרות גן עם פנוטיפים מאופיינים היטב. הערה: לקבלת Rho-1 (Y51H4A.3), עוברים הם 100% קטלניים לאחר 24 שעות והרמפרודיטים הם סטרילי לאחר 48 שעה.
  2. יעילות RNAi
    הרמות של מציאה ידי RNAi צריכים להיבדק, במיוחד מאז כמה רקמות עשויות להיות עמידות יותר מאחרים. במהלך בתחילת אמצע העובר, רוב הרקמות הן RNAi רגישות, אבל בעובר מאוחר או הזחל, הנוירונים הם RNAi עמידים. זנים שונים יכולים לשמש כדי לשפר את רגישות RNAi (למשל rrf-3), או כדי ליצור רקמות ספציפיות RNAi (למשל sid-1 בשילוב עם transgene הביע על ידי האמרגן UNC-119 העצביים).
    1. סופג מערבי
      Immunoblotting באמצעות ג elegans חלבונים יכולים להיותמבוצע על פי פרוטוקול סטנדרטי 22.
      1. לאחר ביצוע RNAi, לאסוף ~ 10 הרה להולדת (מלאים בעוברים) הרמפרודיטים בצינור microcentrifuge, להוסיף 20-30 חיץ μl 1x-SDS מדגם וlyse על ידי רתחה במשך 2 דקות ~. באופן דומה, לאסוף תולעי N2 בצינור נפרד למדגם השליטה. שים לב: מספר הרמפרודיטים עשוי להשתנות תלוי ברגישות של הנוגדנים הראשוניים.
      2. צור דילולים של מדגם השליטה (למשל 3-100%) במאגר מדגם. טען את השליטה ודגימות RNAi ומנוהל על ידי SDS-PAGE לפי פרוטוקול סטנדרטי (ג'ל% ישתנה בהתאם לגודל של החלבון של עניין).
      3. העבר את הג'ל לממברנה ולבצע immunoblotting לפי פרוטוקול סטנדרטי. הערה: דילולים ראשוניים ומשניים שונים השתמש בנוגדן כמומלץ לכל נוגדן.
      4. לפתח (למשל, אם באמצעות chemiluminescence) או לסרוק (למשל, אם באמצעות הקרינה) immunoblot ולהשוות הצפיפות דואר של להקות בנתיבי N2 לעומת מסלול RNAi, ולקבוע את רמת מציאה (למשל הצפיפות של מסלול RNAi תואמת את נתיב שליטת 12%, זה מצביע על כך שהחלבון הוא מופחת על ידי 88%). הערה: כדי לראות את היעילות של מציאה ANI-1, ראה מדוקס ואח' 23.
    2. Immunostaining
      Immunostaining בג ניתן לבצע elegans על פי פרוטוקול סטנדרטי 22.
      1. לאחר ביצוע RNAi, לאסוף הרמפרודיטים הרה להולדת עוברים וקציר באמצעות אחת משתי שיטות. לאחת מהשיטות, הרמפרודיטים המקום בחיץ M9 (מתכון בטבלה של חומרים כימיים / חומרים) ב1.5 מיליליטר siliconized microcentrifuge צינורות וגלולים באמצעות צנטריפוגה (1,000-4,000 XG). הערה: באופן דומה לאסוף N2 הרמפרודיטים הרה.
      2. הסר את פתרון M9.
      3. לגרש את העוברים על ידי הוספת 1 מיליליטר של תמיסת הלבנת (1 M NaOH, אקונומיקה 5%) ​​לצינור microcentrifuge במשך 3 דקות. באופן דומה, N2 אקונומיקה הואrmaphrodites לעשות שקופיות שליטה.
      4. מערבולת בעדינות, ולאחר מכן גלולה באופן מיידי את העוברים באמצעות צנטריפוגה (4,000-8,000 XG) ולהסיר את פתרון הלבנת. הערה: הזמן הכולל שהתולעים מודגרת עם אקונומיקה לא יעלה על 5 דקות.
      5. לשטוף את העוברים 3x עם טריס שנאגרו מלוח (TBS; 50 מ"מ טריס pH 7.5, 150 mM NaCl) ועוברי העברה באמצעות פיפטה פסטר זכוכית על פולי-L-ליזין מצופה שקופיות מיקרוסקופ. הערה: כדי מעיל שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם פולי-L-ליזין, לנגב את השקופית ראשונה, ולאחר מכן להוסיף טיפה (~ 20-30 μl) של פולי-L-ליזין ולהפיץ אותה באופן שווה על פני השטח ולתת להתייבש. לקבלת תוצאות אופטימליות, מעיל השקופיות שתי פעמים נוספות. שיטה חלופית כדי לאסוף עוברים (סעיפים 3.2.2.1-3.2.2.5) היא להציב ירידה של M9 על פולי-L-ליזין מצופה שקופיות מיקרוסקופ ולהרים ~ 10 הרמפרודיטים הרה להולדת לירידה.
      6. הוספת coverslip על גבי כל שקופית מיקרוסקופ (לאזור שמכיל את רוב העוברים) ומקוםהשקופיות בחנקן נוזלי. הערה: להרמפרודיטים ממוקמים ישירות לתוך הטיפה, להפעיל לחץ על coverslip לפרוץ את הרמפרודיטים ולגרש את העוברים.
      7. הקפאה לפצח את העוברים על ידי מצליף את coverslips מייד לאחר הקפאתן בחנקן נוזלי.
      8. מניחים את השקופיות במתנול הקרח קר עבור 20 דקות כדי לתקן את העוברים. הערה: לכמה אנטיגנים, מקבע crosslinking כגון paraformaldehyde עשוי להיות עדיף. ראה פרוטוקול מ22 Duerr.
      9. רעננות וpermeabilize את העוברים על ידי שטיפת השקופיות 4x עם טריס שנאגרו מלוח מכיל 20-Tween (TBST; 50 מ"מ טריס pH 7.5, 150 mM NaCl, Tween-20 0.1%) 10 דקות כל אחד.
      10. ייבש כל שקופית מסביב לאזור שמכיל את רוב העוברים וצייר עיגול סביב את העוברים באמצעות עט נוזל חסימה (למשל PAP עט).
      11. הוספה של TBST ~ 100 μl עם 5% בסרום חמור נורמלי (NDS; בלוק) לכל שקופית (אזור מוקף בעיגול) ודגירה20 דקות ב RT. הערה: מניחים את השקופיות ב'חדר רטוב "(למשל צלחת עם מכסה המכיל מגבות נייר רטובות).
      12. להסיר את החסימה, להוסיף ~ 50-100 μl של נוגדנים ראשוניים (בדילול מלא ב TBST) לכל שקופית (אזור מוקף בעיגול) ו דגירה עבור שעה 2 ב RT. הערה: בהתאם לנוגדן, זמן הדילול ודגירה עשוי להשתנות. כדי לזהות GFP, אנו משתמשים בנוגדן ראשוני אנטי-GFP אנטי עכבר בדילול 1/200. כדי לזהות ANI-1, אנו משתמשים באנטי ANI-1 נוגדן ראשוני נגד ארנב בדילול 1/1600 (הניתן באדיבות על ידי איימי Shaub מדוקס, UNC Chapel Hill). לפעמי דגירה ארוכות יותר, למקם שקופיות ב 4 ° C.
      13. הסר את הנוגדנים ראשוניים (במידת האפשר, לשמור לשימוש עתידי) ולשטוף שקופיות 3x עם כפות במשך 5 דקות כל אחד.
      14. הסר את השטיפה האחרונה ולהוסיף ~ 50-100 μl של נוגדנים משני (בדילול מלא ב TBST) לכל שקופית (אזור מוקף בעיגול) ו דגירה עבור שעה 2 ב RT. הערה: בהתאם לנוגדן, דילול עשוי להשתנות. כדי לזהות GFP, אנו משתמשיםאלקסה פלואוריד 488 נוגדנים משני NTI עכבר בדילול 1/250. כדי לזהות ANI-1, אנו משתמשים בפלואוריד אלקסה 568 שני נוגדנים נגד ארנב בדילול 1/250.
      15. שקופיות הסירו נוגדנים משני ולשטוף 3x עם כפות במשך 5 דקות כל אחד. הערה: כדי להכתים DNA, להוסיף ~ 50-100 μl של DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole; 1 מ"ג / מיליליטר) בשעה 1/500 דילול ב TBST למשך 5 דקות.
      16. הסר DAPI ולשטוף שקופיות 2x עם כפות במשך 5 דקות כל אחד. הערה: אם מכתים DAPI לא מבוצע, דלג על שלב שטיפה נוסף זו.
      17. לבצע שטיפה מהירה אחד עם 0.1M טריס (pH 9), להסיר ולהוסיף ~ 15 μl של תקשורת ההרכבה prewarmed 37 ° C (4% n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (gallate propyl), 50 מ"מ טריס, pH 9 ב 50% גליצרול) לכל שקופית (אזור מוקף בעיגול).
      18. הוספת coverslip לכל שקופית (על גבי תקשורת ההרכבה באזור המוקף בעיגול), פתיל את הנוזל העודף ולאטום את השקופיות עם לק. הערה: שקופיות ניתן לאחסן ב -20 ° C.
      19. שימו לב לעוברים עלהשקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield או לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal. חשוב מכך, להתאים את ההגדרות כדי לאסוף תמונות של עוצמת פיקסל אופטימלית באמצעות שליטת עוברים (N2 או אי RNAi). לאחר מכן, לאסוף תמונות מעוברי RNAi באמצעות אותן ההגדרות. דוגמאות לתמונות שנאספו ללעומת שליטה ani-1 עוברי RNAi מוצגים באיור 2.

4. הכנת השקופיות עבור הדמית חיה וקציר עוברים

  1. הכנה של רפידות agarose הדמיה חיה
    1. מקום שקופית נקי, טרום חימם מיקרוסקופ בין שתי שקופיות אחרות, כל אחד עם 1-2 רצועות של סרט עליהם.
    2. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, להוסיף טיפה אחת של 2% w / agarose v (מומס במים מזוקקים מחוממים) לשקופית.
    3. במהירות למקום שקופיות מיקרוסקופ שנייה, נקיות על גבי השקופית הראשונה באופן בניצב לשטח את ירידת agarose. הערה: הקלטת על השכנות החליקהes מספק עובי למשטח.
    4. בואו יבש כרית agarose לדקות 1-2 לפני הסרת השקופית העליונה. להחליק את השקופית העליונה בזהירות כדי למנוע שבירת כרית agarose מתחת. הערה: לפעמים הכרית מועברת לשקופית העליונה והיא עדיין אפשריים, כל עוד הוא נשאר בשלמותה.
    5. מעביר את העוברים על כרית agarose תוך מספר דקות לאחר הכנתו כמפורט להלן (ראה שלב 4.2). הערה: הכרית צריכה להיות מראה אטום, ברגע שזה ברור, הוא יבש מדי לשימוש.
  2. עוברי קצירה
    1. השתמש בפרוטוקול הבא לאיסוף עובר להדמית חיה, הנגזרת מSulston et al. 24
    2. פיק כ 4-6 מבוגרים הרה להולדת (לא רעבים) מצלחות NGM או RNAi ולמקם אותם ב20-30 μl של חיץ M9 בגם בשקופית דיכאון.
    3. השתמש באזמל מעוקר לחתוך את התולעים בכל צד של spermatheca (או לחלופין ליד הפות) ללשחרר את העוברים לתוך התמיסה.
    4. השתמש בצינור גומי עם חתיכה מחוברת לנימי זכוכית / פיפטה בפה משך לי שעמם קטן ולשאוב את העוברים על ידי הפה pipetting. לחלופין, לאסוף עובר עם צינור זכוכית נימים המחובר לנורת גומי פיפטה פסטר.
    5. מעביר את העוברים נשאבים לגם שני גם המכיל חיץ M9, כדי לעזור להפריד אותם מפסולת התולעת.
    6. לאחר מכן, שאיבת העוברים על כרית agarose מוכנה טרי (ראו שלב 4.1).
    7. עוברי גוש ביחד באמצעות עפעף (דבוק לאיסוף שן) כדי להגדיל את מספר העוברים שיכולים להיות מצולם באחד x, y מטוס. שים לב: כדי להימנע ממחסור בחמצן, לא גוש יותר מ -10 עוברים ביחד.
    8. בשלב הבא, לכסות את השקופית עם coverslip ולאטום אותו באופן חלקי עם VALAP נוזל המחומם מראש (וזלין, לנולין ופרפין; נמס ושילוב 01:01:01) על מנת למנוע התייבשות של העוברים במהלך הדמיה. הערה: ca חיץ נוסף M9n יתווסף לכרית, כדי להבטיח שיש לי עוברים נזילים מספיקים להדמיה. במקום VALAP, וזלין ניתן להשתמש כדי לאטום באופן חלקי coverslips, אבל זה פחות נוקשה גורם coverslips להחליק ויכול לעלות על מטרות מיקרוסקופ.

5. הדמיה חיה

  1. כדי להמחיש neuroblasts, להשיג מתח תולעת שמבטא חלבון neuroblast הספציפית המצורף לחלבון פלואורסצנטי (למשל HAM-1: ה-GFP, מזהה מתח בCGC OP102). כדי לזהות קרום תא, להשתמש בזן תולעת שמבטא גם תחום חלבון שמכיר שומנים מצורפים לחלבון פלואורסצנטי שונה (למשל mCherry:. PH, מזהה מתח בCGC OD70).
  2. עוברי קציר מהרמפרודיטים ניאון שמרו על שליטה או צלחות RNAi ani-1 (ראו פרוטוקולים 3 ו -4), ולהכין שקופיות כפי שתואר לעיל (ראה 4 לפרוטוקול).
  3. עוברי תמונה ב4D (x, y, z וזמן לשגות) על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. השתמש באחת wiמערכת defield [מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי עם מסננים עבור ה-GFP וTexasRed, מטרות עד 60x או 100x, CCD ברזולוציה גבוהה מצלמה (התקן צמוד מטענים), ממונע שלב מאוד (למשל. Piezo Z) ורכישת תוכנה מיוחדת] או livescan סחפו שדה מיקרוסקופ confocal [אוטומטי סריקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 488 ננומטר ו561 לייזרי ננומטר, מטרות עד 100X, EMCCD מצלמה (CCD הכפלת אלקטרונים), ממונע ביותר במה (למשל Piezo Z) ורכישת תוכנה מיוחדת]. הערה: למערכת widefield, באמצעות נוריות ומצלמה EMCCD יגביל phototoxicity. כמו כן, מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב יכול לשמש במקום של מערכת השדה נסחפה.
  4. לחלוקת תא neuroblast תמונה משני המערכת, למצוא x, y מסגרות של עוברים באמצעות 10X או 20X המטרות, ולבחור x אופטימלי, מסגרת y בי העוברים עוברים עיבור הגבי (שלב קודם למתחם הגחון; איור 1 א) או בשלבים מוקדמיםשל מתחם הגחון (~ 350 דקות לאחר חלוקת התא הראשונה; איור 1 א).
  5. במיקרוסקופ השדה נסחף, השתמש ננומטר 488 ו561 לייזרי 100 mW ננומטר ב40% כוח עם שסע 50. על מערכת widefield, השתמש במסנני ה-GFP וTexasRed עם נמוכה בינוני עוצמת אור (אם לשליטה). הערה: למערכת widefield, יש נוריות phototoxicity הנמוך ועדיפות.
  6. שתי המערכת, השתמש במטרות שמן טבילת 60x או 100X ולאסוף 20 Z-ערימות של 0.2 מיקרומטר כל 2 דקות עבור סכום כולל של 10 דקות. הערה: למרות שHAM-1: ה-GFP וmCherry: בדיקות PH להביע ברמות גבוהות יחסית, זמני חשיפה לכל חללית יצטרכו להיות מותאמים למיקרוסקופים שונים. הערה: למערכת widefield, Z-ערימות פחות מומלצות להגביל phototoxicity והדמיה על פני תקופות זמן ארוכות יותר, השתמשו בנקודתי זמן פחות.
  7. כדי למזער phototoxicity הנגרם על ידי החשיפה של עוברים לאור UV על מערכת widefield (אם משתמש במרצדסאורי הנורה), לסגור את הצמצם ל30% ולהקטין את עוצמת האור (באמצעות מערכת תאורה מתכווננת). הערה: למרות שהרווח אינו נחוץ או באמצעות מערכת, ייתכן שיש לי מיקרוסקופים אחרים מקורות אור בעוצמות נמוכות יותר או מטרות עם פתחים מספריים שונים, שעשוי לחייב שימוש ברווח כדי להשיג תמונות של עוצמת פיקסל אופטימלית. בדוק את תנאי שימוש בעובר שליטה כדי להבטיח כי כל פנוטיפים שנצפו אינם בשל phototoxicity artifactual.

6. ניתוח מיקרוסקופית נתונים

  1. כדי לנתח את התמונות, קבצי יצוא כמו בפורמט TIFF ולפתוח את הפורמט TIFF כמחסנית תוך שימוש בתוכנה מיוחדת, כגון תכנית עיבוד תמונה מבוססת ג'אווה (למשל ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). הערה: בהתאם לתוכנת הרכישה משמשת כדי לאסוף את התמונות, אפשר לשמור את הקבצים בצורתם המקורית ונפתחו בImageJ. זה עדיף כמטה נשמר עם הקבצים.
  2. הפרד את המחסניתל" תמונות "ובחר נקודות זמן ו-Z-מטוסים בהתאם לצורך. הערה: למרות ערימת 20 Z-המטוסים נלקחת, רבים של neuroblasts הם <1 מיקרומטר עבה בעובר מאוחר האמצע ויש צורך רק כמה Z-מטוסים.
  3. לסדר מחדש את מטוסי Z שנבחרו עבור כל נקודת זמן ולבצע את התחזיות נפרדות Z-מחסנית. לאחר מכן, מחסנית התחזיות עבור כל נקודת זמן יחד כדי להפוך את רצף זמן.
  4. לבצע התאמות לבהירות / או והניגוד לכל ערוץ.
  5. לאחר מכן, בחר אזור של עניין, לחתוך (ולסובב במידת צורך) באזור.
  6. ליצור תמונות הממוזגות באמצעות הפונקציה 'הערוצים התמזגו' ולבחור בצבע שונה עבור כל ערוץ. המרת תמונות הממוזגת ל RGB.
  7. הפוך תמונות בגווני אפור לכל ערוץ מהצעדים 6.3 או 6.4 (פונקצית שימוש 'הפוך' תחת 'עריכה') כדי להמחיש תמונות בצורה ברורה יותר.
  8. לשמור את כל תמונות הסופיות כפורמט TIFF 8 ביט כדי להפוך דמויות בsoftw וקטור מבוססתוכניות או כקבצי Quicktime לעשות סרטים.
  9. אם מדידות של גודל פיקסל יש צורך (למשל לכלול סרגל קנה מידה עם התמונות), השתמש ImageJ, או תוכנות עיבוד תמונה אחרות כדי למדוד את גודלו של העובר. הערה: תמונות שנאספו באמצעות יעדים שונים יהיו גדלי פיקסל שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול ניסוי זה מתאר כיצד חלוקת תאי תמונה בג elegans עוברים במהלך אמצע העובר. בפרט, היא מתארת ​​כיצד neuroblasts תמונה, אשר עשוי להקל המורפוגנזה אפידרמיס. המורפוגנזה עוריות מתרחשת עקב שילוב של שינויי צורת תא אפידרמיס, הגירה והידבקות, אלא גם מסתמך על אותות כימיים או מכאניים מneuroblasts הבסיס (איור 1). Neuroblasts מפרישות רמזי הדרכה שקבלו על ידי קולטנים על פני השטח של תאי האפידרמיס הגחון, המסדיר 10,14,25 ההגירה שלהם. יתר על כן, neuroblasts הן שגשוג מאוד, אשר עשוי לספק כוחות מכאניים התורמים להגירה של תאי האפידרמיס הגחון 26. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את חלוקת תא neuroblast במהלך אמצע העובר. ראשית, עוברי coexpressing סמנים לדמיין neuroblasts (HAM-1: GFP) עובר cytokinesis (mCherry: PH) נוצרים. HAM-1: ה-GFP מבטא GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) מתויג חלבון שמתאים לneuroblast גרעינים 27, ויש צורך להשתמש מכיוון שיש סוגים רבים אחרים של תאים נוכחים במהלך אמצע העובר (> 300 תאים; איור 3). זה משמש גם כסמן טוב לחלוקת תאים, שכן ה-DNA מתעבה לכרומוזומים במהלך מיטוזה. mCherry: PH הוא חלבון פלואורסצנטי מתויג-mCherry שבא לידי ביטוי על ידי אמרגן אימהי (פאי-1), והוא מכיל שומנים תחום המחייב מPLC1 ∂ 28 1, אשר localizes לממברנות תא. יש צורך בחלבון זה כדי להמחיש cytokinesis, כאשר הקרום וcytosol לצבוט בלהפריד בין התא האם לשני תאים בת; 3 איור; 1 וידאו). למרות שפרוטוקול זה מתאר כיצד חלוקת תמונת neuroblast, (שמוצגת על ידי HAM-1: ביטוי של GFP), יכולים לשמש סמנים אחרים כדי להמחיש סוגי תאים אחרים.

כדי להמחיש את חלוקת neuroblasts, עוברי coexpressing HAM-1: ה-GFP וmCherry: PH הם צילמו כל 2 דקות (עבור סכום כולל של 10 דקות). כל neuroblast היא ~ מיקרומטר 1-4 רק בקוטרו, והוא <1 מיקרומטר עבה, והדרך טובה ביותר היא להשתמש במטרה עם ההגדלה גבוהה (למשל. 100X). יתר על כן, Z-ערימות רבות (~ 20) נאספים עם גודל קטן צעד (0.2 מיקרומטר) כדי להבטיח שהזוויות השונות של כל תא (צורה כדורית) הם צילמו. כדי לאסוף תמונות רבות זה מבלי להתפשר על נקודות זמן, בשלב ממונע מאוד (למשל Piezo Z Stage) מומלץ. לאחר איסוף סדרה של תמונות, הם ניתחו למצוא תאים בתוך כמה Z-ערימות שחילוק, ה-DNA הוא תמצית, הממברנה היא חלחלה ותאי הבת החדשים יוצרים (נקודות של המחסנית הצפויה של ערוצים התמזגו זמן הן שמוצג באיור 3 א, וערימות נבחרות של ערוצים התמזגו מוצגות באיור 3: 1 וידאו). כדי להמחיש טוב יותר את התאים, מומלץלשמור על כל ערוץ בגוונים אפור ולהפוך את התמונות (למשל איור 4).

רזולוציית התמונה היא שונה עבור מערכת widefield משתמשת במצלמה ברזולוציה גבוהה CCD (1344 x 1024 פיקסלים) לעומת. מערכת השדה נסחפה באמצעות מצלמה EMCCD מהירות גבוהה עם רגישות גבוהה (~ 35 מסגרות / sec ו512 x 512 פיקסלים). תמונות הפוכות של חלוקת neuroblasts מעוברי שליטה נלקחו עם שני המערכות מוצגות להשוואה (איור 4 vs. 5). כפי שניתן לראות באיור 4 א (מערכת Widefield; וידאו 2), התמונות ברורות יותר לעומת איור 5A. (מערכת שדה נסחף; 4 וידאו). עם זאת, בעת השימוש במערכת widefield, עוברים רגישים לphototoxicity ונקודות זמן מהירים יותר אינן אפשריות עם המצלמה ברזולוציה הגבוהה. לדוגמה, כדי לבחון את השינויים בלוקליזציה של חלבונים שונים (לדוגמא:. To ללמוד שינויים בדינמיקה שלהם), נקודות זמן ייתכן שיהיה צורך שנאספו לעתים קרובות יותר. כמו כן, זה עשוי להיות בלתי אפשרי לתמונה לתקופות זמן ארוכות יותר, מבלי להקטין את מספר Z-ערימות ונקודות זמן. באמצעות מצלמה EMCCD על מערכת widefield רשאי להתיר מגוון רחב יותר של יישומי הדמיה. מצלמות שיש להם גם ברזולוציה גבוהה ומהירות גבוהה פותחו, אבל הנהגים לא יהיו זמינים בהתאם לתוכנת הרכישה בשימוש, והם עדיין לא יכולים להיות רגישים כמו מצלמות EMCCD. מערכת נוספת שמשמשת בדרך כלל לג הדמיה elegans הוא confocal הדיסק מסתובב, שגם לי phototoxicity נמוך יותר ויכול להיות לבוש עם מצלמות או EMCCD או CCD (ראה דיון).

ללמוד גנים הנדרשים לחלוקת תא, מטופלים הרמפרודיטים עם RNAi נגד גן של עניין (למשל ani-1; ראה סעיפים 1.2 ו3 לפרוטוקול) והעוברים שלהם הם צילמו באותו אופן כמו controעוברי ליטר. כדי להשוות תאי מעוברים RNAi לשלוט עוברים, עדיף לתמונה בשלבים דומים של התפתחות עוברית (כדי לעזור לצורות תא משחק ועמדות). לדוגמא, יש תא גלוי במרכזו של העובר גדול יותר במתחם הגחון שיכול לשמש כנקודת התייחסות טובה לneuroblasts הדמיה (איורים 4 ו -5). הגן למד כאן, ani-1 (anillin), מארגן התכווצות actomyosin, אך אינו נדרש לcytokinesis בעובר המוקדם 23,29-30. Homologues של Anillin, לעומת זאת, נדרשים לcytokinesis אאוקריוטים גבוהים 16, וani-1 נדרש לcytokinesis neuroblast (Fotopoulos, Wernike וPiekny, תצפיות לא פורסמו). כפי שניתן לראות ב4B דמויות (וידאו) 3 ו5B (וידאו 5), כמה neuroblasts ליזום cytokinesis והקרומים שלהם צובטים ב, אבל במקום להרכיב שתי בת נפרדתתאים, הקרומים שלהם לסגת והתאים הופכים multinucleate (גרעין / תא> 1). יש לציין כי ani-1 עשוי להידרש לשינוי החלוקה או צורה של סוגי תאים אחרים, שאינם מתגלה על ידי פרוטוקול זה. יתר על כן, בפרוטוקול זה לא מראה תוצאות מRNAi הרקמות ספציפיים (ראה דיון).

איור 1
איור 1. מתחם הגחון בג המורפוגנזה אפידרמיס elegans. א) תחזיות Z-מחסנית (3 Z-ערימות של 0.5 מיקרומטר בעובי) של AJM-1 שליטה: ה-GFP (סמן צומת adherens לדמיין גבולות תא אפידרמיס; עיבור גב עובר עובר מזהה מתח בCGC SU159) (משמאל, תצוגה הגבי ) וAJM-1 שליטה: מתחם עובר GFP עובר הגחון (מימין, נוף הגחון). תמונות הפוכות למול טוב יותרקריקטורות ualize גבולות תא. B) מראות נוף הגחון של ג עוברי elegans עוברים מתחם הגחון. ראשית, שני זוגות של תאים חדשניות (כחול) להשתמש filopodia אקטין העשיר (קווים שחורים) להגר לכיוון קו אמצע הגחון (עובר בצד השמאל). לאחר מכן, התאים האחוריים הגחון הכיס (אדום) לנדוד לעבר קו האמצע יצירת חור על פני השטח הגחון שעשויה לסגור על ידי מחרוזת ארנק כמו מנגנון (ב '; קו / עיגול מקווקו שחור; מזכיר ריפוי פצעים) 25. מוצגת גם הם neuroblasts משמשת כבסיס (עיגולים אפורים). העובר השני (B ") מראה כיצד ההגירה של תת קבוצות מסוימות של תאי אפידרמיס מתווכת על ידי 'גשר' שנוצר מהסידור מחדש של תאי PLX-2/plexin וVAB-1/Ephrin קולטן להביע 'להקת plexin' (ירוק עיגולים). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר .

איור 2
איור 2. לוקליזציה ANI-1 בג elegans עוברים.) ג קבוע עובר elegans להביע HMR-1: ה-GFP (E-cadherin; סמן של גבולות תא אפידרמיס) costained לGFP (ירוק) וANI-1 (אדום). תמונות confocal של השכבות החיצוניות של תאים (4 Z-הערימות של 0.2 מיקרומטר בעובי) שמעליה מראות תאי האפידרמיס וneuroblasts בסיסיים, שהם ANI-1 B החיובי) קבוע N2 וN2;. עוברי RNAi ani-1 הם שיתוף מוכתמים עבור ANI-1. ANI-1 מצטמצם מאוד בעובר מדולדל ani-1-. ברים סולם:. 10 מיקרומטר לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 3
איור 3. חזותי חלוקת neuroblast במהלך ג עובר elegans. תחזיות () Z-מחסנית (20 Z-ערימות של 0.2 מיקרומטר עובי) מוצגות מעובר שליטת coexpressing HAM-1: ה-GFP (כדי להמחיש גרעיני neuroblast; ירוק) וmCherry: PH (כדי להמחיש קרום תא; אדום) . רבים neuroblasts וסוגי תאים אחרים נראית בתחזיות תחזיות Z-מחסנית (ב) שימוש במספר קטן יותר של מטוסי Z מוצגות מעובר פקד אחר coexpressing HAM-1:. GFP (ירוק) ו mCherry: PH (אדום). אזור מוגדל ב( קופסא לבנה) כדי להראות neuroblast המפרידה פרט בצורה ברורה יותר. ראשי חץ לבנים מצביעים על קרום הפלזמה ingressing של תא מפריד ועיגולים ירוקים להדגיש את ה-DNA המרוכז במהלך מיטוזה וחדשהיצירת גרעיני בת לקראת סוף מיטוזה. התא הגדול משמש כנקודת התייחסות (כוכבית לבן) כדי לקבוע שלב ומיקום התפתחותיות בתוך העובר. ברים סולם:. 10 מיקרומטר (לבן) ו3.5 מיקרומטר (צהוב) לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. חזותי cytokinesis neuroblast במהלך ג elegans עובר באמצעות מערכת widefield. תחזיות) הפוכה Z-מחסנית (2 Z-ערימות של 0.2 מיקרומטר עובי) מוצגות מעובר שליטת coexpressing HAM-1: ה-GFP וmCherry: PH שנאסף ממערכת widefield באמצעות מצלמת CCD עם רזולוציה גבוהה. ראשי חץ אדומים מצביעים על neuroblasts החלוקה עם ingressing קרום תא. עיגולים ירוקים להדגיש DNA המרוכז במהלך שלבים מוקדמים של מיטוזה או שזה עתה יצרו גרעיני בת לקראת סוף מיטוזה / cytokinesis. תמונות של התאים הגדולים משמש כנקודת התייחסות (כוכבית צהוב) כדי לקבוע שלב התפתחותי. ב ') הראו דומות ל), אבל הם מעובר שטופלו בani-1 RNAi. Ingresses קרום תא כבתא ממשיך דרך מיטוזה, אבל מרגיע את זמן קצר אחרי, משאיר תא multinucleate. בר סולם:. 10 מיקרומטר (שחור), 3.5 מיקרומטר (צהוב) לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5
איור 5. חזותי cytokinesis neuroblast במהלך ג elegans עובר באמצעות מערכת שדה נסחפה. תחזיות Z-מחסנית) הפוכה של 2 Z-ערימות של 0.2 מיקרומטר (סה"כ 0.4 מיקרומטר) מוצגות מעובר coexpressing HAM-1: ה-GFP וmCherry: PH שנאסף ממערכת השדה נסחפה באמצעות מצלמה EMCCD עם רגישות גבוהה, אבל ברזולוציה נמוכה יותר. נקודות חץ האדומות לcytokinesis עובר אותה neuroblast. עיגולים ירוקים להדגיש DNA המרוכז במהלך מיטוזה וגרעיני בת יוצרים החדש לאחר cytokinesis. התא הגדול משמש כנקודת התייחסות (כוכבית צהוב) כדי לקבוע שלב התפתחותי. תמונות B) הראו דומות ל), אבל הם מעובר שטופלו בani-1 RNAi, ו3 Z-ערימות משמשות (סה"כ 0.6 מיקרומטר ). כפי שתואר לעיל, ingresses הקרום כבתמורת התא דרך מיטוזה, אבל אז מרגיע גורם לתאים להפוך לmultinucleate. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר (שחור), 3.5 מיקרומטר (צהוב).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

וידאו 1. חזותי neuroblasts החלוקה בג עובר elegans. תחזיות Z-ערימה של שני מטוסי Z (0.4 מיקרומטר / מטוס) מעובר שליטת coexpressing HAM-1: ה-GFP (ירוק) וmCherry: PH (אדום). תמונות שנאספו ממיקרוסקופ widefield מוצגים עבור שני הערוצים. הווידאו מתאים לעובר שמוצג בפנל השלישי של איור 3. לחץ כאן כדי לצפות בוידאו.

וידאו 2. חזותי neuroblasts החלוקה בג עובר elegans. תחזיות Z-ערימה של שני מטוסי Z (0.4 מיקרומטר / מטוס) מעובר שליטת coexpressing HAM-1: ה-GFP (ירוק) וmCherry: PH (אדום). הווידאו מתאים לתמונות הפוכות שנאספו ממיקרוסקופ widefield לmCherry: onl ערוץ PHy (עובר באיור 4 א). לחץ כאן כדי לצפות בוידאו.

וידאו 3. חזותי neuroblasts החלוקה בג עובר elegans. תחזיות Z-ערימה של שני מטוסי Z (0.4 מיקרומטר / מטוס) מעובר טופל ani-1 RNAi coexpressing HAM-1: ה-GFP (ירוק) וmCherry: PH (אדום). הווידאו מתאים לתמונות הפוכות שנאספו ממיקרוסקופ widefield לmCherry:. ערוץ PH (עובר באיור 4 ב) רק לחץ כאן כדי לצפות בוידאו.

וידאו 4. לדמיין חלוקת neuroblast במהלך ג עובר elegans. תחזיות Z-ערימה של שני מטוסי Z (0.4 מיקרומטר / מטוס) מעובר שליטת coexpressing HAM-1: ה-GFP (ירוק) וmCherry: PH (אדום). הווידאו מתאים להיפוך צבעיםעורך תמונות שנאספו ממיקרוסקופ confocal השדה נסחף לmCherry:. ערוץ PH (עובר באיור 5 א) רק לחץ כאן כדי לצפות בוידאו.

וידאו 5. לדמיין חלוקת neuroblast במהלך ג עובר elegans. תחזיות Z-ערימה של שלושה מטוסי Z (0.4 מיקרומטר / מטוס) מעובר טופל ani-1 RNAi coexpressing HAM-1: ה-GFP (ירוק) וmCherry: PH (אדום). הווידאו מתאים לתמונות הפוכות שנאספו ממיקרוסקופ confocal השדה נסחף לmCherry:. ערוץ PH (עובר באיור 5 ב) רק לחץ כאן כדי לצפות בוידאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בסוגים שונים של מיקרוסקופ לחלוקות תא תמונה במהלך אמצע העובר. בפרט, פרוטוקול זה מדגיש עד כמה לתמונת חלוקת neuroblasts, תאים שעשויים להקל המורפוגנזה אפידרמיס. תקשורת בין התאים חשובה להיווצרות רקמה במהלך פיתוח מטזואניים וג elegans הוא מודל מצוין ללמוד היווצרות רקמה בגוף חי. אירוע אחד שמתאר בצורה יפה את משחק הגומלין של רקמות הוא המורפוגנזה אפידרמיס, אשר מכסה את העובר בשכבה של תאי האפיתל. בפרט, מתחם הגחון הוא התהליך שבו תאי האפידרמיס הגחון להגר לתחום את פני השטח הגחון של העובר, והוא מסתמך על neuroblasts הבסיסית. Neuroblasts לספק אותות כימיים או מכאניים, ומתחם הגחון נפגעת אם התפקיד של neuroblasts משתנה. המספר (או הקוטביות) של neuroblasts גם עשוי להיות חיוני למתחם הגחון להתרחש כראוי,וזה חשוב להבין את המנגנונים המווסתים את החלוקה שלהם. פרוטוקול זה מתאר כיצד חלוקת תא תמונה בתוך רקמת חיה באמצעות ג elegans עוברי coexpressing שתי בדיקות ניאון (mCherry: PH להתוות ממברנות פלזמה וHAM-1: ה-GFP לתייג גרעיני neuroblast).
הצעדים החיוניים ביותר לתמונת החיים ג elegans עוברים להביע בדיקות ניאון הם: i) להשתמש הרמפרודיטים בריאים, צעירים מבוגרים המבטאים את סמני ניאון הרצויים (שמרו על 20-25 ° C), ii) להשתמש במוטציות או RNAi ללמוד דרישות גנים במהלך היווצרות רקמות, ג) לאסוף עובר ב שלב נכון למיקרוסקופיה (למשל. אמצע עובר), וד) לבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הגדרות מותאמות לשמירת phototoxicity נמוכה, אבל כדי לשמור על איכות תמונה גבוהה.

כדי לזהות תאים ספציפיים ו / או תאים תאיים בתוך רקמה של עניין, להשתמש בתולעים מבטאים סמנים מתויגים עם פרו ניאוןBES. מרכז Caenorhabditis הגנטיקה (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) מציע מגוון רחב של זנים שcoexpress סמנים מרובים. עם זאת, שני זנים (כל אחד להביע את סמן בודד של עניין) עשויים להיות חצו והוקרנו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי במשך כמה דורות כדי ליצור מתח ביציבות להביע את שני הבדיקות. לדוגמה, כדי לבצע את פרוטוקול זה ניסיוני, מתח להביע סמן לדמיין קרום תא (mCherry: PH; OP70) היה חצה עם זן מבטא את סמן כדי להמחיש גרעיני neuroblast (HAM-1: ה-GFP; OP102) כדי ליצור זן coexpressing שניהם.

הדרך הטובה ביותר ללמוד דרישות גנים במהלך ההתפתחות עוברית היא לבצע ניסויי אובדן תפקוד, שבו מוצר הגן הוא דפק למטה או שעברו מוטציה. פרוטוקול ניסוי זה מתאר ביצוע RNAi נגד anillin (ani-1) כדי להפחית את רמות ANI-1 אנדוגני בכל הרקמות העוברית. יש אללים hypomorphic לא מאופיינים היטבשל ani-1. לכן, RNAi הוא האפשרות הטובה ביותר כדי לבחון אובדן של ani-1 של פנוטיפים פונקציה ולקבוע את תפקידיו במהלך התפתחות עוברית. בדרך כלל, עדיף להשתמש במוטציות במקום RNAi, כיעילות של מציאה יכולה להיות משתנה ורק לעתים נדירות הוא null. אחת הבעיות הנפוצות ביותר נתקלו עם האכלת פרוטוקולי RNAi הוא זיהום, אשר יפחית את יעילות RNAi. כדי להקטין את הסיכון לזיהום, להכין צלחות ומזון RNAi בתנאים אספטיים. זיהום יכול להיות מזוהה על ידי הקרנה של כמה צלחות לפני השימוש, וצלחות עם חיידקים אטומים / חלביים מחפשים צריכה להיות מושלכות. בעיה נוספת שיכול להפחית את יעילות RNAi היא בכך שלא בוחרים הרמפרודיטים בשלב התפתחותי תקין. עדיף להשתמש בתולעים מבוימים L4 או מבוגרים צעירים (פות הפיתוח מופיעה כעיגול / חור בנבן בצד הגחון של התולעת), אשר אין להם / כמה עוברים מופרים. יתר על כן, תנאי RNAi וטיפולים מ 'איי להשתנות למוצרי גן שונים. דרכים שונות כדי להגדיל או להקטין את כוחו של RNAi היא על ידי resuspending חיידקי HT115 pelleted בכמויות שונות של תקשורת LB Amp (ראה סעיף 1.2.2), ועל ידי שינוי משך טיפול RNAi (משך הזמן שהתולעים נשמרים על צלחות RNAi, ראה פרוטוקול 3). להניב פנוטיפים RNAi ani-1 אופטימליים עבור פרוטוקול זה, חיידקים היו resuspended ב500 μl של תקשורת LB Amp ותולעים הוחזקו על צלחות RNAi עבור 2 ימים (ani-1 RNAi אופיין בעבר על ידי מדוקס et al. 23). גם זני RNAi עמידים או רגישים (למשל. rde-1, sid-1 או rrf-3) יכולים לשמש כדי לשנות את הכוח של RNAi. חשוב מכך, יכולים להיות בשילוב זנים אלה עם ביטוי הרקמות הספציפי של גנים מהסוג בר שלהם כדי ליצור זנים רגישים רקמות. לדוגמה, כדי לבצע neuroblast RNAi הספציפי, אפשר להשתמש sid-1 עובר מוטציה (RNAi עמיד) להביע WT UNC-119 (מזהה מתח בCGC TU3401) ביום 31.

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלוקת תא neuroblast תמונה במהלך אמצע העובר. ישנם כמה היבטים של הפרוטוקול הדורשים שיקול דעת, כגון שלב ההתפתחות של העוברים, איסוף Z-הערימות המתאימות ואופטימיזציה של תנאי ההדמיה כדי למזער phototoxicity מבלי להתפשר על איכות תמונה. כדי ללכוד את נקודות זמן בשלב הנכון התפתחותיים (למשל מתחם הגחון), צריכים להיות מצולמים מעיבור הגבי עוברים (זוגות של תאי האפידרמיס הגבי interdigitate ופתיל כדי ליצור שכבה אחת של האפידרמיס בצד הגבי של העובר; איור 1A6). בשלב זה, neuroblasts במהירות החלוקה. מאז ביים את העוברים יכולים להיות קשה בהגדלה נמוכה (למשל באמצעות מיקרוסקופ לנתח), זה עוזר לאסוף עוברים רבים של שלבים ועוברים שונים בשלב נכון ניתן לבחור באמצעות ההגדלה גבוהה יותר.

Neuroblasts יחסית קטנה ורזה, ונמצאות בכל האמצע של העובר. זה חיוני כדי לייעל את המספר והגודל של Z-ערימות כדי להבטיח שכל התא הוא נתפס בעת החלוקה. לדוגמא, איסוף תמונות רבות מדי יחשוף את העוברים ליותר אור ולגרום להם נטייה phototoxicity. עם זאת, איסוף מעט מדי Z-ערימות או באמצעות סעיפי Z עבים יכול לעשות את זה קשה לתדמיתה כראוי תא neuroblast המפרידה כולו.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ שדה סחף confocal או מערכת Widefield לחלוקת תא neuroblast תמונה. כפי שתואר קודם, אחת המגבלות העיקריות של שימוש במיקרוסקופ epifluorescent widefield הוא הפוטנציאל לphototoxicity. בזמן שהוא מומלץ מאוד להשתמש confocal דיסק מסתובב או confocal שדה נסחף לג הדמיה elegans עוברים, ייתכן שיש כמה מעבדות גישה מוגבלת למערכות אלה. p זהrotocol נותן כמה הצעות להגביל phototoxicity בעת שימוש במערכות widefield, כגון סגירת הצמצם ל30%, הפחתת עוצמת האור של הנורה הכספית (או רצוי בעזרת נוריות), תוך שימוש במצלמת EMCCD, ולהגדיל את הרווח או binning להתיר ירידה בזמן חשיפה. מספר Z-ערימות ונקודות זמן גם יהיה מוגבל באמצעות מערכת widefield. למרות שזה לא תואר בפרוטוקול זה, מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב משמש בדרך כלל להדמיה לחיות כפי שהוא גורם phototoxicity נמוך יותר בהשוואה למיקרוסקופ widefield. דומה למערכת השדה נסחפה, הוא משתמש בלייזרים של מצב מוצקים ומפזר אור (אם כי באופן שונה לעומת השדה נסחף). מצלמות או CCD או EMCCD ניתן להשתמש עם מערכת דיסק ספינינג, אשר לעתים קרובות יש לו יציאות מצלמה מרובות כדי לאפשר הדמיה כפולה. דומה למיקרוסקופ השדה נסחף, ניתן ללכוד תמונות עם זמני חשיפת 50-90% נמוכים יותר לעומת מערכת widefield.
protoc זהol יכול לשמש כדי לחקור את תפקודם של גנים שונים המסדירים מיטוזה במהלך היווצרות רקמה. הזמן בין כל תמונה יכול להיות מקוצר (למשל. כל 15-30 שניות לעומת. 2-3 דקות) כדי להמחיש טוב יותר פנוטיפים mitotic. יכולים לשמש בדיקות שונות (לדוגמא במקום להשתמש HAM-1:. ה-GFP, H2B ניאון מתויג יכולה לשמש כדי להמחיש DNA, ו / או ניאון מתויג טובולין יכול לשמש כדי לחזות צירים mitotic). מספר Z-ערימות והעובי עבור כל מחסנית גם אפשר לשנות (לדוגמא: יותר ערימות של גודל צעד קטן יותר). כפי שתואר לעיל, בחירת ההגדרות המתאימות הוא קריטי להגבלת phototoxicity ואופטימיזציה של איכות תמונה. למרות mCherry: PH וHAM-1: בדיקות ה-GFP להביע ברמות גבוהות יחסית, איסוף נקודות זמן מהיר יותר, הגדלת מספר Z-ערימות או ההדמיה לתקופות זמן ארוכות יותר לעומת מה שמתואר בפרוטוקול זה לא יכול להיות אפשרי במערכת widefield.
Im מבוסס ג'אווהתכנית עיבוד גיל (ImageJ, NIH) יכול לשמש לעיבוד תמונות שנאספו על ידי המיקרוסקופים השונים ותמונות ניתן לייצא כפורמט TIFF. עם זאת, בהתאם לתוכנה המשמשת לרכישה, הקבצים כבר יכולים להיות תואמים עם תוכנת העיבוד. עדיף לפתוח קבצים מקוריים לעומת תמונות מיוצאות (למשל בפורמט TIFF), שכן מטה נשמר בקבצים המקוריים. תוכנת עיבוד יכולה לשמש כדי לתפעל את התמונות להכנת דמויות או סרטים. בנוסף, ניתוחים כמותיים יכולים גם להתבצע, כגון מדידת עוצמות פיקסל באזורים נבחרים. תוכנה אופטימלית יש לבחור בהתאם לניתוח, כגון עיבוד תמונה ארגז כלים (MathWorks, Matlab) או 3D ו 4D בזמן אמת נתונים האינטראקטיבי ויזואליזציה (Imaris, Bitplane).
באמצעות פרוטוקול זה, ani-1 הוצג יידרש לcytokinesis neuroblast, למרות שהיא אינה נדרשת לcytokinesis בעובר המוקדם. מעניין, על ידי שליטה על נוmber ועמדה של neuroblasts, ani-1 יכולים לווסת את ההגירה של תאי האפידרמיס הגחון למתחם הגחון, כי neuroblasts לספק אותות כימיים או מכאניים לתאי האפיתל שמעליה. עם זאת, לא ידוע אם נדרש ani-1 לחלוקה או שינוי צורה של סוגי תאים אחרים בעובר אמצע סוף. המראה כיצד את ההרכב הכולל של רקמה משפיע על רקמות שכנות מדגיש את חשיבותה של תקשורת רקמות במהלך התפתחות מטזואניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר בכך שעבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה מענק (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada Inc. #AGR001.1 For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar Bio Basic Inc. #9002-18-0 For making bacteria LB agar plates
Agarose BioShop Canada Inc. #AGA001.500
Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody Roche Applied Science #11814460001
Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody Life Technologies Corporation (Invitrogen) #A11011
Ampicillin BioShop Canada Inc. #AMP201.5 Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A) Bio Basic Inc. #G213
CaCl2 (calcium chloride) BioShop Canada Inc. #C302.1
Cholesterol BioShop Canada Inc. #CHL380.25 Dissolve in ethanol
DAPI  Sigma-Aldrich #D9542 Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol BioShop Canada Inc. #GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside) Bio Basic Inc. #367-93-1 Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) BioShop Canada Inc. #PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) BioShop Canada Inc. #PPD303.1
L4440  (feeding vector) Addgene #1654 Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate) BioShop Canada Inc. #MAG511.500
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. #7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. #7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS) Wisent Bioproducts #035-110
n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) Alfa Aesar #A10877
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich #P8920 For optimal results coat microscope slides three times 
Streptomycin BioShop Canada Inc. #STP101.50 Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin BioShop Canada Inc. #TET701.10 Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20 Bio Basic Inc. CAS#9005-64-5
Tryptone BioShop Canada Inc. #TRP402.500
Yeast Extract Bio Basic Inc. #8013-01-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

Tags

Neuroscience גיליון 85, המורפוגנזה cytokinesis neuroblasts anillin מיקרוסקופיה חלוקת תא
חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wernike, D., van Oostende, C.,… More

Wernike, D., van Oostende, C., Piekny, A. Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis. J. Vis. Exp. (85), e51188, doi:10.3791/51188 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter