Summary
Questo protocollo descrive come immagine divisione delle cellule all'interno di un tessuto in Caenorhabditis elegans embrioni. Mentre diversi protocolli descrivono come la divisione cellulare l'immagine in embrione precoce, questo protocollo viene descritto come immagine divisione cellulare all'interno di un tessuto in via di sviluppo durante la metà tarda embriogenesi.
Abstract
Questo protocollo descrive l'uso di microscopia a fluorescenza a immagine divisione delle cellule all'interno di sviluppare Caenorhabditis elegans embrioni. In particolare, questo protocollo si concentra su come un'immagine dividendo neuroblasti, che si trovano sotto le cellule epidermiche e possono essere importanti per epidermico morfogenesi. Formazione di tessuto è cruciale per lo sviluppo metazoi e si basa su stimoli esterni da tessuti vicini. C. elegans è un ottimo organismo modello per studiare morfogenesi dei tessuti in vivo a causa della sua trasparenza e semplice organizzazione, rendendo i tessuti facile da studiare tramite microscopia. Contenitore ventrale è il processo in cui la superficie ventrale dell'embrione è coperto da un singolo strato di cellule epiteliali. Questo evento è pensato per essere facilitato dai neuroblasti sottostanti, che forniscono spunti di orientamento chimica di mediare la migrazione delle cellule epiteliali sovrastanti. Tuttavia, i neuroblasti sono altamente proliferative, oppure possono agirecome substrato meccanico per le cellule epidermiche ventrali. Gli studi che utilizzano questo protocollo sperimentale potrebbe scoprire l'importanza della comunicazione intercellulare durante la formazione del tessuto, e potrebbero essere utilizzati per rivelare i ruoli dei geni coinvolti nella divisione cellulare nei tessuti in via di sviluppo.
Introduction
Mentre ci sono protocolli che descrivono come la divisione cellulare immagine nei primi C. elegans embrione, questo protocollo viene descritto come la divisione cellulare l'immagine all'interno di un tessuto durante la metà embriogenesi. Una delle principali sfide nel campo dell'imaging organismi in fase di sviluppo è stata la loro sensibilità alla fototossicità. Tuttavia, una maggiore accessibilità alle filatura microscopio confocale disco o microscopi campo spazzato ha permesso applicazioni di imaging più diffuse. Entrambi i sistemi utilizzano laser a stato solido e luce diffusa, limitando i livelli di UV che gli organismi sono esposti. Tuttavia, stand widefield possono ancora essere utilizzati per l'imaging in vivo, soprattutto se è provvisto di telecamere ad alta sensibilità (ad esempio EMCCD), controllo di apertura e di controllo della luce (ad esempio LED o lampade al mercurio regolabili). Questo protocollo descrive come utilizzare sia un sistema confocale o basato su un sistema widefield di divisione cellulare immagine all'interno di sviluppo C. elegans </ Em> embrioni. A titolo di esempio, descriviamo come immagine divisione cellulare neuroblasti. Neuroblasti possono facilitare epidermica morfogenesi fornendo segnali chimici o meccanici per le cellule epidermiche sovrastanti, e fornire un eccellente esempio dell'importanza della comunicazione intercellulare nella formazione dei tessuti.
Caenorhabditis elegans è un organismo modello ideale per studi basati microscopia essendo trasparente e semplice organizzazione tessuto 1. Inoltre, C. elegans è suscettibile di metodi genetici e RNAi, e dal momento che molti dei suoi geni hanno omologhi umani, può essere utilizzato per identificare i meccanismi conservati per formazione di tessuto 2-5. In C. elegans, la formazione dell'epidermide avviene in media embriogenesi, quando l'embrione ha> 300 cellule. Epidermal morfogenesi consiste di diverse fasi principali, durante il quale l'embrione è racchiuso in uno strato di cellule epidermiche che restringono e si estendono per trasformare il embryo da una forma ovoidale nella forma allungata di una vite senza fine 6. Contenitore ventrale descrive uno di questi eventi morfogenetici, quando le cellule epidermiche ventrali migrano verso la linea mediana ventrale per coprire la superficie ventrale dell'embrione (Figura 1). In primo luogo, due coppie di anteriori situato cellule Leading Edge migrano verso la linea mediana ventrale, dove aderiscono e si fondono con i loro vicini controlaterale 6. Questa è seguita da migrazione delle cellule posteriori situato tasca, che formano cuneo come forme creando una tasca ventrale 6-7. Il meccanismo che chiude la tasca non è ben compreso. Una possibilità è che una struttura di actina miosina contrattile sovracellulari lega le cellule tasca insieme in una stringa di borsa come la moda, simile alla guarigione delle ferite 8. È interessante notare che la migrazione di alcune delle cellule tasca è mediata da specifici sottoinsiemi di neuroblasti sottostanti 9 (precursori neuronali che si trovano sotto il epidermis; Figura 1B).
Studi precedenti hanno mostrato che i neuroblasti regolano ventrale migrazione delle cellule epidermiche e contenitore ventrale. VAB-1 (recettore Ephrin) e VAB-2 (Ephrin ligando) sono altamente espresso nei neuroblasti e facilitare lo smistamento delle anteriori e posteriori neuroblasti uno dall'altro, e mutazioni nel VAB-1 o VAB-2 causa custodia ventrale fenotipi 10-13. Tuttavia, gli esperimenti di soccorso Promotore mostrato che è richiesta anche VAB-1 nelle sovrastanti cellule epidermiche ventrali e recettori per altri segnali di orientamento secreti dai neuroblasti sono espressi nelle cellule epidermiche ventrali 9. Anche se le mutazioni in nessuno di questi recettori causano fenotipi recinzione ventrale, non è chiaro se i difetti sorgono a causa di problemi nel posizionamento neuroblast o dovuti a mancanza delle cellule epidermiche ventrale per rispondere alle linee guida spunti 14. Alterare la divisione dei neuroblasti wiThout alterano la capacità di secernere spunti di orientamento potrebbe far luce sul ruolo dei neuroblasti e la loro capacità di fornire un contributo meccanica durante la morfogenesi epidermica. Recentemente, è stato scoperto che un gene divisione cellulare, ani-1 (anillin) è altamente espresso in neuroblasti (Figura 2A) e il suo esaurimento causa difetti divisione neuroblasti. È interessante notare che questi embrioni mostrano ventrali fenotipi di recinzione (Fotopoulos, Wernike e Piekny, osservazioni non pubblicate).
Anillin è necessaria per la divisione cellulare, e in particolare per citochinesi, che descrive il processo in cui una cellula madre si divide fisicamente in due cellule figlie. Citochinesi è guidato dalla formazione di un anello contrattile actomyosin, che deve essere strettamente controllato nello spazio e nel tempo per assicurare che esso sia correttamente accoppiato con cromatidi fratelli segregazione. Il principale regolatore della citochinesi metazoi è RhoA (RHO-1 in C. elegans), una piccola GTPasi che è unctive nella sua forma GTP-bound. Il GEF Ect2/ECT-2 attiva RhoA, dopo di che RhoA-GTP interagisce con effettori a valle che formano l'anello contrattile e mediano suo ingresso di 15. Anillin è una proteina che si lega a più dominio di RhoA tramite il suo C-terminale e di actina e miosina attraverso il suo N-terminale. Anillin è necessario per stabilizzare la posizione dell'anello contrattile in cellule di mammifero o Drosophila S2 16. Anillin esaurimento provoca anelli contrattili a subire oscillazioni laterali, e cytokinesis alla fine non riesce formando cellule multinucleate 17-19. Curiosamente, sebbene C. elegans ani-1 Coordinate actomyosin contrattilità in embrione precoce, ma non è essenziale per la citochinesi. Tuttavia, come sopra descritto, è necessario ani-1 per neuroblast citochinesi durante la metà embriogenesi (Fotopoulos, Wernike e Piekny, osservazioni non pubblicate). Fallimento Citocinesi altererebbe il numero e la posizione dei neuroblasti e potrebbe influenzare il loczione dei segnali di orientamento chimici, o potrebbe alterare le proprietà meccaniche del tessuto. Entrambi i modelli evidenziano il ruolo non autonomo di neuroblasti per custodia ventrale, e l'importanza della comunicazione tessuto dei tessuti durante lo sviluppo embrionale.
Questo protocollo sperimentale descritto come la divisione cellulare immagini durante la C. elegans metà embriogenesi usando la microscopia a fluorescenza. La maggior parte degli esperimenti che studiano i meccanismi di divisione cellulare sono stati eseguiti in singole cellule all'interno piastre di coltura (per es. HeLa o cellule S2) o in embrioni precoci con un numero limitato di cellule (ad esempio C. elegans embrione unicellulare, Xenopus, o echinoderm embrioni). Tuttavia, è importante studiare la divisione cellulare nei tessuti, in quanto vi sono segnali esterni che possono influenzare la sincronizzazione e il posizionamento del piano di divisione. Inoltre, le cellule possono fornire segnali chimici o meccanici di influenzare lo sviluppo del tessuto limitrofos, ed è importante capire come la comunicazione intercellulare aiuta a formare tessuti durante lo sviluppo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di piatti per il mantenimento Ceppi Worm and Performing RNAi
- Piatti nematode crescita media
- Piatti
- Preparare piatti Nematode crescita media (NGM) per mantenere i ceppi di vermi e di eseguire incroci genetici. Combinare 3 g NaCl, 17 g Agar e 2,5 g BactoPeptone con 1 L di acqua distillata in un pallone da 2 L e aggiungere un agitatore metallo.
- Autoclavare il pallone per sciogliere l'agar e per sterilizzare media. Quindi mettere il pallone su un piatto mescolare e lasciare che i supporti raffreddare mescolando.
- Una volta che il supporto è raffreddato ed è ancora piuttosto caldo al tatto (45-50 ° C), aggiungere 1 ml di 1 M CaCl 2, 1 ml di 1 M MgSO4, soluzione 1 ml di colesterolo 5 mg / ml e 25 ml di 1 M tampone fosfato di potassio (PPB; ricetta nella tabella dei reagenti / materiali; filtro sterilizzare soluzioni madre) e versare immediatamente i mezzi di comunicazione in piccole piastre di Petri (60 mm x 15 mm, riempite i piatti ~ 3/4 verso l'alto o 13 ml / piastra USIng un distributore automatico). Nota: Per la manutenzione a lungo termine di alcuni ceppi tetraciclina può essere aggiunto alle piastre (12,5 mcg / ml) per consentire TN10 trasposone inattivazione del gene batterico RNAsi III.
- Lasciate che i media solidificano notte a temperatura ambiente. Nota: Le piastre devono essere conservati in una cappa biologica o in un'area di laboratorio che è meno soggetto a contaminazione. Inoltre, rimuovere l'eventuale condensa che ha costruito sui coperchi (ad es pulite con la carta velina) per limitare la contaminazione fungina. Se Tetracycline è aggiunto anche alle piastre, poi coprire con un foglio di alluminio come questo antibiotico è sensibile alla luce.
- Il giorno successivo, seminare le piastre NGM secco con una sospensione di E. coli (ceppo OP50, vedi punto 1.1.2) che è stato gentilmente in agitazione. Per rendere piastre per accoppiamento, aggiungere ~ 50 ml di OP50 al centro di ciascuna piastra (per formare un piccolo cerchio). Per fare le piastre per il mantenimento ceppi di vermi, seminare ogni piatto NGM con ~ 100-200 ml di OP50 (agarantire che copre una grande area della piastra).
- Lasciare le piastre seminate O secco / N a temperatura ambiente.
- Il giorno successivo, girare le piastre NGM secchi a testa in giù e impilarli in contenitori di plastica a 4 ° C. Nota: Le piastre sono utilizzabili fino a circa 3-4 settimane. Piastre contenenti tetraciclina devono essere tenuti all'oscuro.
- Cibo
- Utilizzare E. coli OP50 [dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] come fonte di cibo per C. . elegans Nota: OP50 può essere memorizzato come gli stock di glicerolo a -80 ° C (rapporto 1:1 nel 50% v / v glicerolo).
- Per rendere OP50 per le piastre NGM, fare un piatto realizzato con una piccola aliquota di stock di glicerolo (<10 ml, usare un puntale sterile). Stendere i batteri su una piastra di agar LB (ricetta nella tabella dei reagenti / materiali) e lasciare a 37 ° C per ~ 16 ore. Nota: Se ci sono problemi di contaminazione, streptomicina OP50 resistente può essere utilizzato, unnd streptomicina può essere aggiunto alle piastre di LB agar (50 mcg / ml).
- Il giorno seguente, scegliere la singola colonia e inoculare 100 ml di media LB liquido (ricetta nella tabella di reagenti / materiali) in un pallone da 500 ml.
- Lasciate che la cultura crescere O / N a 37 ° C con agitazione.
- Il giorno successivo, utilizzare la sospensione batterica per la semina piastre NGM. Nota: OP50 può essere aliquotati in 50 ml provette coniche e conservato a 4 ° C per ~ 4-6 settimane.
- Piatti
- RNAi
L'alimentazione è uno dei principali modi per eseguire RNA interferenza mediata (RNAi, per atterramento di un prodotto specifico gene) in C. elegans. C. ermafroditi elegans possono essere alimentati E. coli ceppo HT115 trasformato con un vettore che esprime alimentazione dsRNA dopo induzione. Questo dsRNA (o suoi frammenti) vengono trasmessi alla gonade, solitamente con conseguente sostanziale knockdown del gene bersaglio specifico.- Piatti RNAi
- Preparare piastre NGM come descritto sopra (si veda la Sezione 1.1.1), ma anche aggiungere 1 ml di 1 M IPTG (isopropiltio-beta-D-galattoside, per indurre l'espressione di dsRNA) e 500 ml di 50 mg / ml ampicillina (amp; vettori che esprimono dsRNA sono Amp resistente) ai media caldo (45-50 ° C).
- Dopo che le piastre si sono asciugati, li seminare con ~ 50-100 ml di E. coli HT115 (cfr. sezione 1.2.2). Nota: le piastre testa di serie possono essere conservati a 4 ° C per ~ 4-5 settimane.
- Lasciate le piastre seminate asciugare durante la notte a temperatura ambiente.
- Il giorno successivo, girare i piatti RNAi secchi a testa in giù e conservarli in un contenitore di plastica a 15-20 ° C. Nota: le piastre Prioritari conservano l'efficienza RNAi per un massimo di ~ 2-3 settimane.
- RNAi alimentare
- Utilizzare E. coli HT115 (dal CGC, vedi punto 1.1.2) trasformato con il vettore L4440 alimentazione, o L4440 contenente cDNA di un gene di interesse. Nota: Alimentazione librerie che colpiscono la maggioranza delle cornici di lettura aperte nel genomasono già stati fatti e sono disponibili (cloni L4440 trasformati in HT115, contenenti ad esempio un frammento di Y49E10.19 per ani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / pagine / rnai.html). Nota: HT115 può essere conservato come stock di glicerolo a -80 ° C (rapporto 1:1 nel 50% v / v glicerolo).
- Per generare un nuovo costrutto mira un gene di interesse, vedere la mappa vettoriale L4440 e clone di cDNA tra i promotori T7 di accompagnamento, che sono inducibile da IPTG.
- Trasforma HT115 con il costrutto L4440 utilizzando un protocollo standard per la trasformazione (ad esempio, rendere i batteri chimicamente competenti ed eseguire calore scossa di trasformazione).
- Come descritto per OP50 (vedi Sezione 1.1.2), i batteri striscia dal magazzino glicerolo su una piastra di agar LB, ma il piatto dovrebbe contenere anche 50 ug / ml di ampicillina. Nota: Se si utilizza un pre costrutto L4440 esistente, saltare sezioni 1.2.2.2-1.2.2.3.
- Scegli una singola colonia e inoculare 5 mldi LB supporti contenenti 5 ml di ampicillina da un / magazzino ml 50 mg (LB Amp), e posizionarlo a 37 ° C con agitazione.
- Dopo circa 16 ore, inoculare 5 ml di LB fresco supporti Amp con 50 microlitri della coltura O / N e crescere la coltura per 7-8 ore con agitazione a 37 ° C.
- Centrifugare i batteri per 1 min a 4.000-8.000 xg, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di fresca mezzi LB Amp.
- Utilizzare questa soluzione batterica per seminare le piastre RNAi come descritto in precedenza (vedi punto 1.2.1). Nota: HT115 deve essere utilizzato immediatamente e non deve essere conservato.
- Piatti RNAi
2. Coltivare ceppi Worm
Mantenere C. ceppi elegans ordinati dal CGC su piastre NGM secondo protocollo standard 1. I ceppi utilizzati per questo protocollo sono: C. elegans var Bristol, wild-type (ID ceppo a CGC N2); unc-119 (tm4063); wgIs102 [ham-1 unc-119 (+)] (ID deformazione alla CGC OP102); unc-119 (ED3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (ID deformazione alla CGC OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (ID deformazione alla CGC SU159); unc-119 (ED3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1p :: HMR-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR + unc-119 (+)] (ID deformazione alla CGC FT250).
- Scegli ~ 3 giovani ermafroditi adulti che mostrano il fenotipo corretto per un piatto NGM fresca. Nota: N2 (var. Bristol; wild-type) può essere mantenuta tra 15-25 ° C, ma raggiungono densità più velocemente a temperature più elevate. Nuove scorte devono essere effettuate quando la densità worm è alto.
- Conservare tutti i ceppi fluorescenti (es. GFP e / o worm mCherry esprimono) a 20-25 ° C per l'espressione ottimale di proteine fluorescenti. Nuove scorte devono essere effettuate quando la densità worm è alta e il cibo è bassa.
- Per scegliere i vermi, utilizzare unaccompagnamento fatto da una pipetta di vetro tirato con un filo di platino fuso alla fine tirato (~ 3-5 cm di lunghezza). Appiattire il filo con un bordo liscio. Utilizzare il pick per 'paletta' fino ermafroditi e trasferirli su nuovi piatti. Fiamma il filo tra l'uso per evitare la contaminazione incrociata dei ceppi.
3. RNAi
- Esecuzione di RNAi
- In primo luogo, posto ~ 8 ermafroditi L4 su un piatto NGM testa di serie per ~ 30-60 min per rimuovere i batteri OP50 dai vermi.
- Poi posto le 8 ermafroditi su una piastra NGM Amp IPTG seminato con HT115 che porta il plasmide L4440 esprimere dsRNA ad un gene di interesse (ad esempio, ani-1;. Vedi 1.2) per ~ 24 ore. Nota: A seconda del gene di interesse, o dei fenotipi desiderati (che può dipendere dalla forza del knockdown), worm possono essere lasciati sui piatti RNAi per periodi di tempo più o meno lunghi (dopo 24 ore, posizionare gli ermafroditi su RNAi fresco piastre).
- Per un negcontrollo ative, posto vermi su un piatto di RNAi seminati con HT115 che trasporta la L4440 vettore vuoto. Nota: Questi embrioni dovrebbero avere fenotipi.
- Per un controllo positivo, collocare vermi su una piastra RNAi esprimendo dsRNA che mira ad un gene con fenotipi ben caratterizzati. Nota: Per rho-1 (Y51H4A.3), gli embrioni sono al 100% letali dopo 24 ore e ermafroditi sono sterili dopo 48 ore.
- RNAi Efficacia
I livelli di knockdown di RNAi devono essere testati, soprattutto perché alcuni tessuti possono essere più resistenti di altre. Durante la prima metà di embriogenesi, la maggior parte dei tessuti sono RNAi-sensibili, ma nel tardo embrione o larva, i neuroni sono RNAi-resistenti. Ceppi diversi possono essere usati per migliorare la sensibilità RNAi (es RRF-3), o per generare tessuto-specifico RNAi (es sid-1 in combinazione con un transgene espresso dal promotore neurale unc-119).- Western blotting
Immunoblotting utilizzando C. elegans proteine possono essereeseguiti secondo il protocollo standard 22.- Dopo aver eseguito RNAi, raccogliere ~ 10 gravido (riempito di embrioni) ermafroditi in una provetta, aggiungere 20-30 microlitri 1x tampone campione SDS-PAGE e lyse facendo bollire per ~ 2 min. Allo stesso modo, raccogliere i vermi N2 in un tubo separato per il campione di controllo. Nota: Il numero di ermafroditi può variare a seconda della sensibilità degli anticorpi primari.
- Creare diluizioni del campione di controllo (ad esempio 3-100%) in tampone campione. Caricare il controllo e campioni RNAi e gestito da SDS-PAGE secondo la procedura standard (il gel% varierà a seconda delle dimensioni della proteina di interesse).
- Trasferire il gel ad una membrana ed eseguire immunoblotting secondo la procedura standard. Nota: Utilizzare diverse diluizioni di anticorpi primari e secondari come raccomandato per ogni anticorpo.
- Sviluppare (ad esempio, se si utilizza la chemiluminescenza) o la scansione (ad esempio, se si utilizza fluorescenza) il immunoblot e confrontare °e densità delle bande nelle corsie N2 vs corsia RNAi, e determinare il livello di knockdown (ad esempio la densità della corsia RNAi corrisponde alla corsia di controllo 12%, questo suggerisce che la proteina è ridotta del 88%). Nota: Per vedere l'efficienza del ANI-1 knockdown, vedere Maddox et al 23.
- Immunostaining
Immunostaining in C. elegans possono essere eseguiti secondo il protocollo standard di 22.- Dopo aver eseguito RNAi, raccogliere ermafroditi gravide ed embrioni raccolti utilizzando uno dei due metodi. Per uno dei metodi, posto ermafroditi in tampone M9 (ricetta nella tabella dei reagenti / materiali) in 1,5 ml siliconato provette da microcentrifuga e pellet tramite centrifugazione (1,000-4,000 xg). Nota: Analogamente raccogliere N2 ermafroditi gravide.
- Rimuovere la soluzione M9.
- Espellere embrioni aggiungendo 1 ml di soluzione di sbianca (1 M NaOH, 5% candeggina) alla provetta per 3 min. Allo stesso modo, candeggina N2 harmaphrodites per fare vetrini di controllo.
- Vortex delicatamente, quindi pellet subito gli embrioni tramite centrifugazione (4.000-8.000 xg) e rimuovere la soluzione sbiancante. Nota: Il tempo totale che i vermi sono incubati con candeggina non deve superare i 5 minuti.
- Lavare gli embrioni 3x con Tris Buffered Saline (TBS, 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) ed embrioni trasferire con una pipetta Pasteur di vetro su un poli-L-lisina rivestite vetrino da microscopio. Nota: Per ricoprire un vetrino da microscopio in vetro con poli-L-lisina, in primo luogo pulire la diapositiva, quindi aggiungere una goccia (~ 20-30 ml) di poli-L-lisina e distribuirlo in modo uniforme su tutta la superficie e lasciare asciugare. Per risultati ottimali, cappotto diapositive altre due volte. Un metodo alternativo per raccogliere embrioni (Sezioni 3.2.2.1-3.2.2.5) è quello di mettere una goccia di M9 su una poli-L-lisina rivestite vetrino da microscopio e prendere ~ 10 ermafroditi gravide nella goccia.
- Aggiungere un coprioggetto sopra l'vetrino da microscopio (per l'area che contiene la maggior parte degli embrioni) e postole diapositive in azoto liquido. Nota: Per ermafroditi collocati direttamente nella goccia, mettere pressione sul vetrino per rompere gli ermafroditi ed espellere gli embrioni.
- Freeze-rompere gli embrioni muovendo fuori i coprioggetti subito dopo congelamento in azoto liquido.
- Porre i vetrini in ghiaccio metanolo freddo per 20 minuti per fissare gli embrioni. Nota: Per alcuni antigeni, un fissativo reticolazione come paraformaldeide può essere preferibile. Vedere il protocollo da Duerr 22.
- Reidratare e permeabilize gli embrioni lavando i vetrini 4x con Tris Buffered Saline contenente Tween-20 (TBST, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) per 10 minuti ciascuno.
- Asciugare ogni diapositiva intorno all'area che contiene la maggior parte degli embrioni e disegnare un cerchio intorno gli embrioni utilizzando una penna di blocco liquido (ad esempio pen PAP).
- Aggiungere ~ 100 ml di TBST con 5% di siero normale asino (NDS, blocco) per ogni diapositiva (area cerchiata) e incubare per20 min a RT. Nota: Porre i vetrini in una 'camera di bagnato' (ad esempio un piatto con un coperchio contenente asciugamani di carta bagnati).
- Rimuovere il blocco, aggiungere ~ 50-100 ml di anticorpi primari (diluito in TBST) per ogni diapositiva (area cerchiata) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Nota: A seconda della anticorpo, il tempo di diluizione e di incubazione può variare. Per rilevare GFP, usiamo un anticorpo primario anti-GFP anti-topo in una diluizione 1/200. Per rilevare ANI-1, usiamo un anti-ANI-1 anticorpo primario anti-coniglio in una diluizione 1/1600 (gentilmente offerto da Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill). Per tempi di incubazione più lungo, mettere i vetrini a 4 ° C.
- Rimuovere anticorpi primari (se possibile, conservare per uso futuro) e lavare i vetrini 3x con TBS per 5 minuti ciascuna.
- Rimuovere l'ultimo lavaggio e aggiungere ~ 50-100 ml di anticorpi secondari (diluito in TBST) per ogni diapositiva (area cerchiata) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Nota: a seconda dell'anticorpo, diluizione può variare. Per rilevare GFP, usiamo un unnti-topo Alexa Fluor 488 anticorpo secondario in una diluizione 1/250. Per rilevare ANI-1, usiamo un anti-coniglio Alexa Fluor 568 anticorpo secondario in una diluizione 1/250.
- Rimuovere anticorpi secondari e lavare i vetrini 3x con TBS per 5 minuti ciascuno. Nota: Per colorare DNA, aggiungere ~ 50-100 ml di DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole; 1 mg / ml) a 1/500 di diluizione in TBST per 5 min.
- Rimuovere DAPI e lavare i vetrini 2x con TBS per 5 minuti ciascuna. Nota: Se DAPI colorazione non viene eseguita, ignorare questa fase di lavaggio in più.
- Eseguire un lavaggio rapido con 0.1M Tris (pH 9), togliere e aggiungere ~ 15 ml di mezzo di montaggio preriscaldata a 37 ° C (4% n-propile 3.4.5-trihydroxybenzoate (gallato di propile), Tris 50 mM, pH 9 50% glicerolo) a ciascun vetrino (area cerchiata).
- Aggiungere un vetrino di ogni diapositiva (sulla parte superiore del supporto di montaggio nella zona cerchiata), evacuare il liquido in eccesso e sigillare i vetrini con smalto. Nota: Le diapositive possono essere conservati a -20 ° C.
- Osservare gli embrioni sule diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza widefield o scansione laser confocale. Importante, regolare le impostazioni di raccogliere immagini di intensità ottimale dei pixel utilizzando il controllo (N2 o non RNAi) embrioni. Poi, raccogliere immagini da embrioni RNAi utilizzando le stesse impostazioni. Esempi di immagini raccolte per il controllo del rispetto ani-1 embrioni RNAi sono mostrati nella Figura 2B.
- Western blotting
4. Preparazione di vetrini per Imaging Live e raccolta embrioni
- Preparazione di pastiglie di agarosio per l'imaging dal vivo
- Posizionare un pulito, pre vetrino da microscopio riscaldato tra due vetrini, ciascuno con 1-2 strisce di nastro adesivo su di loro.
- Usando una pipetta Pasteur di vetro, aggiungere una goccia di 2% w / v agarosio (disciolto in acqua distillata riscaldata) alla slitta.
- Inserire rapidamente una seconda, pulito vetrino da microscopio in cima alla prima slitta in maniera perpendicolare ad appiattire la goccia di agarosio. Nota: Il nastro sulla vicina scivolòes fornisce lo spessore del pad.
- Lasciate che il pad agarosio secco per un 1-2 minuti prima di togliere la slitta superiore. Sfilare la slitta superiore con attenzione per evitare di rompere il pad agarosio sotto. Nota: A volte il pad viene trasferito alla slitta superiore ed è ancora utilizzabile, fintanto che rimane intatto.
- Trasferire gli embrioni sul pad agarosio entro pochi minuti dopo la sua preparazione come descritto di seguito (vedi punto 4.2). Nota: Il pad dovrebbe avere un aspetto opaco, una volta che è chiaro, è troppo secca per l'uso.
- Embrioni di raccolta
- Utilizzare il seguente protocollo per raccogliere embrioni per l'imaging in tempo reale, che è derivata da Sulston et al. 24
- Scegli circa 4-6 adulti gravide (non fame) da piastre NGM o RNAi e metterli in 20-30 ml di tampone M9 in un pozzo in una diapositiva depressione.
- Utilizzare un bisturi sterilizzato per tagliare i vermi su entrambi i lati del spermatheca (o in alternativa vicino alla vulva) perrilasciare embrioni nella soluzione.
- Utilizzare un tubo di gomma con un boccaglio collegato ad un capillare di vetro / pipetta tirato avere un piccolo foro e aspirare gli embrioni da pipette a bocca. In alternativa, raccogliere embrioni con un tubo di vetro capillare che è collegato a una pipetta Pasteur bulbo di gomma.
- Trasferire gli embrioni aspirati ad un secondo pozzo anche contenente tampone M9, per aiutarli a separare dai detriti worm.
- Poi, l'aspirazione degli embrioni su un blocchetto di agarosio preparato al momento (vedi punto 4.1).
- Embrioni ammassarsi usando un ciglio (incollato ad uno stuzzicadenti) per aumentare il numero di embrioni che possono essere filmate in una x, y aereo. Nota: Per evitare la privazione di ossigeno, non aggregano più di 10 embrioni insieme.
- Successivamente, coprire il vetrino con coprioggetto e parzialmente sigillarla con del liquido pre VALAP riscaldato (vaselina, lanolina e paraffina, fuso e combinato 01:01:01) per prevenire la disidratazione degli embrioni durante l'imaging. Nota: Ulteriori M9 tampone can essere aggiunto al pad per garantire che gli embrioni hanno liquido sufficiente per l'imaging. Al posto di VALAP, vaselina può essere utilizzato per sigillare parzialmente coprioggetti, ma è meno rigido causando i coprioggetti a slittare e potrebbero ottenere sui obiettivi del microscopio.
5. Immagini dal vivo
- Per visualizzare neuroblasti, ottenere un ceppo di worm che esprime una proteina specifica-neuroblast attaccato ad una proteina fluorescente (ad es HAM-1: GFP, ID deformazione alla CGC OP102). Per rilevare le membrane cellulari, utilizzare un ceppo verme che esprime anche un dominio proteina che riconosce i lipidi collegati a una proteina fluorescente diversa (ad esempio mCherry:. PH, ID deformazione alla CGC OD70).
- Embrioni raccolto da ermafroditi fluorescenti tenuti al controllo o ani-1 piastre di RNAi (vedi protocolli 3 e 4), e preparare le diapositive come descritto in precedenza (vedi protocollo 4).
- Embrioni di immagine in 4D (x, y, z e time-lapse) mediante microscopia in epifluorescenza. Utilizzare una connessione wisistema defield [microscopio a fluorescenza automatizzata con filtri per la GFP e TexasRed, obiettivi fino a 60X o 100X, un CCD ad alta risoluzione (Charge Coupled Device) della fotocamera, altamente motorizzato fase (ad es. Piezo Z) e il software di acquisizione specializzati] o un livescan spazzato campo microscopio confocale [automatizzati microscopio a scansione a fluorescenza con 488 nm e 561 nm laser, obiettivi fino a 100X, un EMCCD (elettrone CCD moltiplicazione) della fotocamera, altamente motorizzato fase (ad es Piezo Z) e il software di acquisizione specializzati]. Nota: Per il sistema widefield, tramite LED e una fotocamera EMCCD limiterà fototossicità. Inoltre, un microscopio confocale disco rotante può essere utilizzato al posto del sistema di campo spazzato.
- Per la divisione cellulare immagine neuroblast su entrambi i sistemi, trovare x, y cornici di embrioni utilizzando gli obiettivi 10X o 20X, e scegliere un ottimale x, y fotogramma in cui gli embrioni sono in fase di intercalazione dorsale (passo prima di custodia ventrale; Figura 1A) o sono nelle fasi inizialidel contenitore ventrale (~ 350 min dopo la prima divisione cellulare; Figura 1A).
- Al microscopio a campo spazzato, utilizzare il 488 nm e 561 nm laser 100 MW alla potenza del 40%, con una fessura di 50. Sul sistema widefield, utilizzare i filtri GFP e TexasRed con intensità di luce medio-basso (se controllabile). Nota: Per il sistema widefield, i LED hanno una bassa fototossicità e sono preferibili.
- In entrambi i sistemi, utilizzare gli obiettivi ad immersione olio 60X o 100X e raccogliere 20 Z-stack di 0,2 micron ogni 2 minuti per un totale di 10 min. Nota: Anche se la HAM-1: GFP e mCherry: le sonde PH esprimono a livelli relativamente elevati, i tempi di esposizione per ogni sonda dovranno essere ottimizzati per i diversi microscopi. Nota: Per il sistema widefield, un minor numero Z-stack si raccomanda di limitare fototossicità e per l'imaging su periodi di tempo più lunghi, usa meno punti temporali.
- Per minimizzare fototossicità causato dalla esposizione di embrioni di luce UV sul sistema widefield (se si utilizza un mercenarioury lampadina), chiudere il diaframma al 30% e diminuire l'intensità della luce (utilizzando un sistema di illuminazione regolabile). Nota: Anche se il guadagno non è necessario utilizzare uno dei due sistemi, altri microscopi possono avere fonti di luce con intensità inferiori o obiettivi con diverse aperture numeriche, che potrebbero richiedere l'utilizzo di guadagno per ottenere immagini di intensità ottimale dei pixel. Verificare le condizioni usando un embrione di controllo per garantire che eventuali fenotipi osservati non sono dovuti a fototossicità artefatta.
6. Analisi di microscopia dati
- Per analizzare le immagini, file di esportazione come TIFF e aprire i TIFF come uno stack utilizzando software specializzati come ad esempio un programma di elaborazione di immagini basato su Java (ad esempio ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Nota: A seconda del software di acquisizione utilizzato per raccogliere le immagini, i file possono essere conservati nella loro forma originale e aperti in ImageJ. Questo è preferibile in quanto i metadati è mantenuto con i file.
- Separare lo stackin "immagini" e punti di selezionare temporali e Z aerei come desiderato. Nota: Anche se una pila di 20 Z-piani è preso, molti dei neuroblasti sono <1 micron di spessore in media tarda embriogenesi e sono necessari solo pochi Z-aerei.
- Impilare i piani Z selezionati per ogni punto di tempo e fare proiezioni Z-stack separati. Poi, impilare le proiezioni per ogni volta sottolineano insieme per fare una sequenza temporale.
- Apportare modifiche alla luminosità e / o contrasto per ciascun canale.
- Quindi, selezionare una regione di interesse, colture (e ruotare se necessario) la regione.
- Creare immagini unite utilizzando la funzione "canali fuse e scegliere un colore diverso per ogni canale. Converti immagini unite a RGB.
- Invertire le immagini in scala di grigio per ogni canale da passi 6.3 o 6.4 (Utilizzare la funzione 'invertito' sotto 'Modifica') di visualizzare più chiaramente le immagini.
- Salvare tutte le immagini finali come TIFF a 8 bit per fare figure in vettoriale basato softwsono programmi o come file Quicktime per fare i film.
- Se sono necessarie misurazioni di dimensione dei pixel (ad esempio includere una barra di scala con le immagini), utilizzare ImageJ, o altri software di elaborazione delle immagini per misurare la dimensione dell'embrione. Nota: Le immagini raccolte con obiettivi diversi avranno diverse dimensioni in pixel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo protocollo sperimentale descritto come immagine divisione cellulare in C. elegans embrioni in media embriogenesi. In particolare, si descrive come neuroblasti immagine, che può facilitare epidermica morfogenesi. Epidermal morfogenesi verifica a causa di una combinazione di cambiamenti di forma delle cellule epidermiche, la migrazione e l'adesione, ma anche si basa su segnali chimici o meccanici dai neuroblasti sottostanti (Figura 1B). I neuroblasti secernono spunti di orientamento che vengono ricevuti dai recettori sulla superficie delle cellule epidermiche ventrali, che regola la loro 10,14,25 migrazione. Inoltre, i neuroblasti sono altamente proliferative, che può prevedere forze meccaniche che contribuiscono alla migrazione delle cellule epidermiche ventrali 26. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare la divisione cellulare neuroblast durante la metà embriogenesi. In primo luogo, gli embrioni coexpressing marcatori per visualizzare i neuroblasti vengono generati:: (PH mCherry) (HAM-1 GFP) in fase di citochinesi. HAM-1: GFP esprime GFP (green fluorescent protein) etichettato proteina che si localizza neuroblasti nuclei 27, ed è necessario utilizzare poiché ci sono molti altri tipi di cellule presenti in media embriogenesi (> 300 cellule; la figura 3). Questo agisce anche come un buon marcatore per le cellule in divisione, poiché il DNA si condensa in cromosomi durante la mitosi. mCherry: PH è una proteina fluorescente mCherry-tag che viene espresso da un promotore materno (pie-1), e contiene il dominio di legame lipidico PLC1 ∂ 1 28, che localizza alle membrane cellulari. Questa proteina è necessario per poter visualizzare citochinesi, quando la membrana e citosol pizzicare per separare la cellula madre in due cellule figlie; la figura 3; Video 1). Sebbene questo protocollo descritto come immagine divisione neuroblasti, (dimostrato da HAM-1: espressione GFP), altri marcatori possono essere usati per visualizzare altri tipi di cellule.
Per visualizzare dividendo neuroblasts, embrioni coexpressing HAM-1: GFP e mCherry: PH sono ripreso ogni 2 min (per un totale di 10 min). Ogni neuroblast è solo ~ 1-4 micron di diametro, ed è <1 micron di spessore, ed è meglio usare un obiettivo con ingrandimento elevato (ad es. 100X). Inoltre, numerosi Z-stack (~ 20) sono raccolti con un piccolo passo (0,2 micron) per assicurare che i vari angoli di ciascuna cella (forma sferica) sono state riprodotte. Per raccogliere questo molte immagini senza compromettere i punti di tempo, si consiglia una tappa altamente motorizzato (es. Piezo Z Stage). Dopo aver raccolto una serie di immagini, che vengono analizzate per trovare le celle a pochi Z-stack che si dividono, il DNA è condensato, la membrana viene ingressed e le nuove cellule figlie si stanno formando (punti temporali della pila previsto di canali incorporate sono mostrati nella Figura 3A, e pile di canali selezionati fuse sono mostrati in Figura 3B; Video 1). Per visualizzare meglio le cellule, si raccomanda ditenere ogni canale in scala di grigi e capovolgere le immagini (ad esempio Figura 4).
La risoluzione dell'immagine è diverso per il sistema widefield utilizzando una fotocamera CCD ad alta risoluzione (1344 x 1024 pixel) vs. il sistema campo spazzato utilizzando una fotocamera EMCCD alta velocità con elevata sensibilità (~ 35 fotogrammi / sec e 512 x 512 pixel). Immagini capovolte di divisione neuroblasti da embrioni di controllo adottate con entrambi i sistemi sono presentati per il confronto (Figura 4 vs. 5). Come mostrato nella Figura 4A (sistema widefield; Video 2), le immagini sono più chiare vs Figura 5A. (Sistema campo spazzato; Video 4). Tuttavia, quando si utilizza il sistema widefield, gli embrioni sono suscettibili di fototossicità e punti di tempo più veloci non sono possibili con la fotocamera ad alta risoluzione. Ad esempio, per esaminare i cambiamenti nella localizzazione di varie proteine (ad es. To studiare i cambiamenti nella loro dinamica), punti di tempo potrebbe essere necessario raccolto più spesso. Inoltre, potrebbe non essere possibile immagine per lunghi periodi di tempo senza ridurre il numero di Z-stack e punti temporali. Utilizzo di una fotocamera EMCCD sul sistema widefield può consentire una più ampia gamma di applicazioni di imaging. Telecamere che hanno sia alta risoluzione e ad alta velocità sono state sviluppate, ma i driver potrebbero non essere disponibili a seconda del software di acquisizione in uso, e che ancora potrebbero non essere così sensibile come le macchine fotografiche EMCCD. Un altro sistema che viene comunemente utilizzato per l'imaging C. elegans è il confocale disco rotante, che ha anche minore di fototossicità e può essere equipaggiato sia con EMCCD o camere CCD (vedi discussione).
Per studiare geni che sono richiesti per la divisione cellulare, ermafroditi sono trattati con RNAi contro un gene di interesse (ad es ani-1; vedere sezioni 1.2 e 3 del protocollo) e loro embrioni vengono esposte nello stesso modo come Controembrioni l. Per confrontare le cellule da embrioni RNAi per controllare gli embrioni, è meglio l'immagine in fasi simili di sviluppo embrionale (per aiutare le forme cellulari partita e posizioni). Ad esempio, vi è una cella più grande visibile nel centro dell'embrione durante contenitore ventrale che può agire come un buon punto di riferimento per neuroblasti imaging (figure 4 e 5). Il gene studiato qui, ani-1 (anillin), organizza actomyosin contrattilità, ma non è necessario per citochinesi in embrione precoce 23,29-30. Omologhi di Anillin, tuttavia, sono necessari per la citochinesi in eucarioti superiori a 16, e ani-1 è richiesto per neuroblast citochinesi (Fotopoulos, Wernike e Piekny, osservazioni non pubblicate). Come mostrato nelle Figure 4B (Video 3) e 5B (Video 5), diversi neuroblasti avviare citochinesi e loro membrane pizzicare in, ma invece di formare due figlia separatacellule, le membrane regrediscono e le cellule diventano multinucleate (> 1 nucleo / cella). Si deve notare che ani-1 può essere richiesto per la divisione o cambiare forma di altri tipi di cellule, che non vengono rivelati da questo protocollo. Inoltre, questo protocollo non mostra i risultati di RNAi specifico tessuto (vedi discussione).
Figura 1. Custodia ventrale durante C. elegans epidermica morfogenesi. A) le proiezioni Z-stack (3 Z-pile di 0,5 micron di spessore) di un AJM-1 di controllo: GFP (marcatore adherens bivio per visualizzare i confini delle cellule epidermiche; ID deformazione alla CGC SU159) embrione in fase di intercalazione dorsale (a sinistra, vista dorsale ) e un controllo AJM-1: embrione GFP in fase di custodia ventrale (a destra, vista ventrale). Le immagini sono invertite per meglio visualize bordi delle celle. B) Cartoni Animati mostrano una vista ventrale di C. embrioni elegans sottoposti a custodia ventrale. In primo luogo, due paia di importanti cellule di bordo (blu) utilizzano actina ricco filopodia (linee nere) per migrare verso la linea mediana ventrale (embrione a sinistra). Successivamente, le cellule posteriori tasca ventrale (rosso) migrano verso la linea mediana creando un foro sulla superficie ventrale che può chiudere da una stringa di borsa come meccanismo (B '; nera tratteggiata retta / cerchio; ricorda guarigione delle ferite) 25. Inoltre sono riportati i neuroblasti sottostanti (come cerchi grigi). Il secondo embrione (B ") mostra come la migrazione di specifici sottoinsiemi di cellule epidermiche sono mediate da un 'ponte' formata dal riarrangiamento di cellule PLX-2/plexin e VAB-1/Ephrin-recettore esprimendo« banda plexin '(verdi cerchi). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
ANI-1 localizzazione in C. Figura 2. elegans embrioni. A) C. A fisso elegans embrione esprimendo HMR-1: GFP (E-caderina, indicatore dei limiti di cellule epidermiche) costained per GFP (verde) e ANI-1 (rossa). Immagini confocale degli strati cellulari esterni (4 Z-pile di 0,2 micron di spessore) mostrano le cellule epidermiche sovrastanti e sottostanti neuroblasti, che sono ANI-1 positive B) Immobilizzazioni N2 e N2;. Ani-1 embrioni RNAi sono co colorate per ANI-1. ANI-1 è notevolmente ridotto nell'embrione ani-1-impoverito. Bar Scala: 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Visualizing dividendo neuroblast durante C. elegans embriogenesi. (A) Le proiezioni Z-stack (20 Z-pile di 0,2 micron di spessore) sono indicati da un embrione di controllo coexpressing HAM-1: GFP (per visualizzare nuclei neuroblasti, verde) e mCherry: PH (per visualizzare le membrane cellulari; red) . Molti neuroblasti e altri tipi di cellule sono visibili nelle proiezioni (B) Le proiezioni Z-stack utilizzando un minor numero di piani Z sono mostrati da un altro embrione controllo coexpressing HAM-1:. GFP (verde) e mCherry: PH (rosso). Un'area è ingrandita (scatola bianca) per mostrare più chiaramente un individuo neuroblasti divisione. Le frecce bianche indicano la membrana ingressing plasmatica di una cellula di divisione e cerchi verdi evidenziare il DNA condensata durante la mitosi e di recenteformando nuclei figli verso la fine della mitosi. La grande cella serve come punto di riferimento (asterisco bianco) per determinare lo stadio di sviluppo e posizione all'interno dell'embrione. Bar Scala: 10 micron. (Bianco) e 3,5 micron (giallo) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4. Visualizzazione neuroblast citochinesi durante C. elegans embriogenesi utilizzando un sistema di widefield. A) invertito proiezioni Z-stack (2 Z-pile di 0,2 micron di spessore) sono indicati da un embrione di controllo coexpressing HAM-1: GFP e mCherry: PH raccolti dal sistema widefield utilizzando una telecamera CCD ad alta risoluzione. Frecce rosse indicano neuroblasti divisorie con ingressing membrane cellulari. Cerchi verdi evidenziano DNA condensato durante le prime fasi della mitosi o di nuova formazione di nuclei figli verso la fine della mitosi / citochinesi. Il grande cellulare funge da punto di riferimento (asterisco giallo) per determinare lo stadio di sviluppo. B) Le immagini mostrate sono simili a A), ma sono da un embrione trattato con ani-1 RNAi. Le ingresses membrana cellulare in quanto la cella procede attraverso la mitosi, ma rilassa poco dopo, lasciando una cella multinucleate. Scala bar:. 10 micron (nero), 3,5 micron (giallo) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 5. Visualizzazione neuroblast citochinesi durante C. elegans embriogenesi utilizzando un sistema di campo spazzato. A) invertito proiezioni Z-stack di 2 Z-pile di 0,2 micron (totale 0,4 micron) sono mostrati da un embrione coexpressing HAM-1: GFP e mCherry: PH raccolti dal sistema campo spazzato utilizzando una fotocamera EMCCD ad alta sensibilità, ma risoluzione inferiore. I punti di punta di freccia rossa ad un citochinesi neuroblast sottoposti. Cerchi verdi evidenziano DNA condensato durante la mitosi e la nuova formazione figlia nuclei dopo citochinesi. Il grande cellulare funge da punto di riferimento (asterisco giallo) per determinare lo stadio di sviluppo. B) Le immagini mostrate sono simili a A), ma sono da un embrione trattato con ani-1 RNAi, e 3 Z-stack vengono usati (totale 0,6 micron ). Come descritto sopra, le ingresses membrana In come cellula procede attraverso la mitosi, ma poi si rilassa provocando la cella a diventare multinucleate. Scala bar: 10 micron (nero), 3,5 micron (giallo).188/51188fig5highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Video 1. Visualizzazione neuroblasti divisorie durante C. elegans embriogenesi. Proiezioni Z-stack di due piani Z (0,4 micron / aereo) da un embrione di controllo coexpressing HAM-1: GFP (verde) e mCherry: PH (rosso). Le immagini raccolte dal microscopio widefield sono indicati per entrambi i canali. Il video corrisponde alla embrione mostrato nel terzo pannello della figura 3B. Clicca qui per vedere il video.
Video 2. Visualizzazione neuroblasti divisorie durante C. elegans embriogenesi. Proiezioni Z-stack di due piani Z (0,4 micron / aereo) da un embrione di controllo coexpressing HAM-1: GFP (verde) e mCherry: PH (rosso). Il video corrisponde a immagini invertite raccolte dal microscopio widefield per il mCherry: onl canale PHy (embrione nella Figura 4A). Clicca qui per vedere il video.
Video 3. Visualizzazione neuroblasti divisorie durante C. elegans embriogenesi. Proiezioni Z-stack di due piani Z (0,4 micron / aereo) da un embrione trattati ani-1 RNAi coexpressing HAM-1: GFP (green) e mCherry: PH (rosso). Il video corrisponde a immagini invertite raccolte dal microscopio widefield per il mCherry:. Unico canale PH (embrione in Figura 4B) Clicca qui per vedere il video.
Video 4. Visualizzazione dividendo neuroblast durante C. elegans embriogenesi. Proiezioni Z-stack di due piani Z (0,4 micron / aereo) da un embrione di controllo coexpressing HAM-1: GFP (verde) e mCherry: PH (rosso). Il video corrisponde invertireimmagini raccolte dal campo spazzato microscopio confocale per il mCherry Ed.:. unico canale PH (embrione in figura 5A) Clicca qui per vedere il video.
Video 5. Visualizzazione dividendo neuroblast durante C. elegans embriogenesi. Proiezioni Z-stack di tre piani Z (0,4 micron / aereo) da un embrione trattati ani-1 RNAi coexpressing HAM-1: GFP (green) e mCherry: PH (rosso). Il video corrisponde a immagini invertite raccolte dal campo di microscopio confocale spazzato per il mCherry:. Unico canale PH (embrione in figura 5B) Clicca qui per vedere il video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive l'uso di vari tipi di microscopia a divisioni cellulari immagine in media embriogenesi. In particolare, questo protocollo evidenzia come immagine la divisione dei neuroblasti, cellule che possono facilitare epidermica morfogenesi. Comunicazione cellula-cellula è importante per la formazione di tessuto durante lo sviluppo metazoi e C. elegans è un modello eccellente per studiare la formazione di tessuto in vivo. Un evento che ritrae bene l'interazione dei tessuti è epidermica morfogenesi, che copre l'embrione in uno strato di cellule epiteliali. In particolare, Box ventrale è il processo in cui le cellule epidermiche ventrali migrano per racchiudere la superficie ventrale dell'embrione, e si basa sulle neuroblasti sottostanti. I neuroblasti forniscono segnali chimici o meccanici, e la recinzione ventrale è compromessa se la posizione di neuroblasti è alterato. Il numero (o polarità) di neuroblasti anche possono essere essenziali per la custodia ventrale avvenga correttamente,ed è importante per comprendere i meccanismi che regolano la loro divisione. Questo protocollo descrive come la divisione cellulare l'immagine all'interno di un tessuto vivente utilizzando C. elegans embrioni coexpressing due sonde fluorescenti (mCherry: PH per delineare le membrane plasmatiche e HAM-1: GFP per etichettare nuclei neuroblasti).
I passi più importanti per l'immagine che vivono C. elegans embrioni che esprimono sonde fluorescenti sono: i) utilizzare sani, giovani adulti ermafroditi che esprimono i marcatori fluorescenti desiderati (mantenuta a 20-25 ° C), ii) utilizzare mutanti o RNAi per studiare le esigenze di geni durante la formazione del tessuto, iii) raccogliere embrioni allo palcoscenico giusto per microscopia (ad es. metà embriogenesi) e iv) eseguire microscopia a fluorescenza utilizzando le impostazioni ottimizzate per mantenere fototossicità basso, ma per mantenere la qualità di immagine.
Per identificare cellule specifiche e / o compartimenti intracellulari all'interno di un tessuto di interesse, utilizzare i vermi esprimendo marcatori con etichetta fluorescente probes. Il Caenorhabditis Genetics Center (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) offre una varietà di ceppi che coesprimere più marcatori. Tuttavia, due ceppi (ognuno esprimendo un singolo marcatore di interesse) possono essere incrociate e schermato con un microscopio a fluorescenza per diverse generazioni per generare un ceppo che esprimono stabilmente entrambe le sonde. Ad esempio, per effettuare questo protocollo sperimentale, un ceppo che esprime un marcatore per visualizzare membrane cellulari (mCherry: PH; OP70) è stato incrociato con un ceppo esprimente un marcatore per visualizzare nuclei neuroblasti (HAM-1: GFP; OP102) per generare un ceppo coexpressing entrambi.
Il modo migliore per studiare le esigenze del gene durante lo sviluppo embrionale è quello di eseguire la perdita di esperimenti funzionali, dove il prodotto del gene viene abbattuto o mutato. Questo protocollo sperimentale descrive l'esecuzione di RNAi contro anillin (ani-1) per ridurre endogeni ANI-1 livelli in tutti i tessuti embrionali. Ci sono alleli hypomorphic non ben caratterizzatidi ani-1. Pertanto, RNAi è l'opzione migliore per esaminare la perdita di ani-1 s 'di fenotipi funzionali e determinare la sua funzione durante lo sviluppo embrionale. In genere, è meglio usare mutanti invece di RNAi, come l'efficienza di knockdown può essere variabile e raramente è nullo. Uno dei problemi più comuni riscontrati con l'alimentazione protocolli di RNAi è contaminazione, che ridurrà l'efficienza RNAi. Per ridurre il rischio di contaminazione, preparare le piastre RNAi e prodotti alimentari in condizioni asettiche. La contaminazione può essere rilevato mediante screening di alcune delle piastre prima dell'uso, e piastre con batteri latteo / opaco cercano deve essere eliminata. Un altro problema che può ridurre l'efficienza RNAi è di non scegliere ermafroditi allo stadio di sviluppo di destra. E 'meglio usare i vermi adulti L4-messe in scena o giovani (la vulva di sviluppo appare come un cerchio / foro biancastra sul lato ventrale del worm), che non hanno / alcuni embrioni fecondati. Inoltre, le condizioni RNAi e trattamenti may variare a seconda dei prodotti genici. Diversi modi per aumentare o diminuire la forza del RNAi è risospendendo batteri HT115 pellet in quantità diverse di LB Amp media (vedi sezione 1.2.2), e alterando la durata del trattamento RNAi (periodo di tempo che i vermi sono tenuti su piastre di RNAi, vedi protocollo 3). Per rendere ottimali ani-1 fenotipi RNAi per questo protocollo, i batteri sono stati risospesi in 500 ml di media LB Amp e vermi sono stati tenuti su piastre di RNAi per 2 giorni (ani-1 RNAi è stato precedentemente caratterizzato da Maddox et al. 23). Ceppi resistenti o sensibili RNAi (ad es. RDE-1, sid-1 o RRF-3) possono anche essere utilizzati per modificare la forza di RNAi. Ancora più importante, questi ceppi possono essere accoppiati con l'espressione specifica del tessuto dei loro geni wild type per creare ceppi sensibili di tessuto. Ad esempio, per eseguire neuroblast specifici RNAi, si potrebbe usare sid-1 embrioni mutanti (RNAi-resistente) che esprimono peso
Questo protocollo descrive come la divisione cellulare immagine neuroblast durante la metà embriogenesi. Ci sono diversi aspetti del protocollo che richiedono un attento esame, come lo stadio di sviluppo degli embrioni, raccogliendo le opportune Z-stack e ottimizzando le condizioni di imaging per minimizzare fototossicità senza compromettere la qualità dell'immagine. Per catturare punti di tempo nella fase di sviluppo di destra (ad esempio confinamento ventrale), gli embrioni dovrebbero essere girati da intercalazione dorsale (coppie di cellule epidermiche dorsali interdigitarsi e fusibile per formare un singolo strato di epidermide sul lato dorsale dell'embrione; Figura 1A6). In questo momento, i neuroblasti dividono rapidamente. Poiché in scena gli embrioni può essere difficile in basso ingrandimento (ad esempio utilizzando un microscopio da dissezione), aiuta a raccogliere molti embrioni di fasi diverse e embrioni allofase diritto può essere selezionato mediante ingrandimento maggiore.
Neuroblasti sono relativamente piccoli e sottili, e si trovano in tutto il centro dell'embrione. È essenziale per ottimizzare il numero e la dimensione di Z-stack per assicurare che l'intera cella viene catturato durante la divisione. Ad esempio, la raccolta di troppe immagini esporrà embrioni più luce e renderli soggetti a fototossicità. Tuttavia, raccogliendo troppo pochi Z-stack o utilizzando profilati a Z spessore potrebbe rendere difficile l'immagine correttamente un'intera divisione cellulare neuroblasti.
Questo protocollo descrive l'uso di un campo spazzato microscopio confocale o sistema widefield di divisione cellulare neuroblasti immagine. Come descritto in precedenza, uno dei principali limitazioni di utilizzo di un microscopio widefield epifluorescente è il potenziale di fototossicità. Mentre si consiglia vivamente di utilizzare un confocale disco rotante o spazzato confocale campo per l'imaging C. elegans embrioni, alcuni laboratori possono avere un accesso limitato a questi sistemi. Questo protocol dà alcuni suggerimenti per limitare fototossicità quando si utilizzano sistemi widefield, come ad esempio la chiusura del diaframma al 30%, abbassando l'intensità della luce dal bulbo di mercurio (o, preferibilmente, tramite LED), utilizzando una macchina fotografica EMCCD, e aumentando il guadagno o binning per consentire una diminuzione del tempo di esposizione. Il numero di Z-stack e punti di tempo sarà anche limitato mediante un sistema widefield. Anche se non è stato descritto in questo protocollo, il microscopio confocale disco rotante è comunemente utilizzato per l'imaging in tempo reale in quanto causa di fototossicità inferiore rispetto ad un microscopio widefield. Simile al sistema campo spazzato, utilizza laser a stato solido e diffonde la luce (anche se in modo diverso rispetto al campo spazzato). Telecamere CCD o EMCCD possono essere utilizzati con il sistema disco rotante, che spesso ha più porte fotocamera per consentire dual imaging. Simile al microscopio a campo spazzato, le immagini possono essere catturate con tempi di esposizione inferiori del 50-90% rispetto al sistema widefield.
Questo protocolo può essere usato per studiare la funzione dei vari geni che regolano la mitosi durante la formazione del tessuto. Il tempo tra ogni immagine potrebbe essere ridotto (ad es. Ogni 15-30 secondi vs. 2-3 min) per visualizzare meglio i fenotipi mitotico. Diverse sonde potrebbero essere utilizzati (ad esempio, invece di utilizzare HAM-1:. GFP, H2B fluorescenti-tag può essere utilizzato per visualizzare il DNA, e / o fluorescente etichettato tubulina potrebbe essere usato per visualizzare fusi mitotici). Il numero di Z-stack e lo spessore di ciascuna pila potrebbe essere alterata (per esempio più pile di un passo più piccolo). Come descritto sopra, scegliendo le impostazioni appropriate è fondamentale per limitare fototossicità e ottimizzare la qualità dell'immagine. Anche se il mCherry: PH e HAM-1: sonde GFP esprimono a livelli relativamente elevati, la raccolta punti di tempo più veloci, aumentando il numero di Z-stack o di imaging per periodi di tempo più lunghi rispetto a quello che è descritto in questo protocollo non può essere possibile su un sistema widefield.
A im basato su Javaprogramma di elaborazione di età (ImageJ, NIH) può essere utilizzato per elaborare le immagini raccolte dai diversi microscopi e le immagini possono essere esportate come file TIFF. Tuttavia, a seconda del software utilizzato per l'acquisizione, i file possono già essere compatibili con il software di elaborazione. E 'meglio aprire i file originali vs immagini esportate (ad esempio TIFF), dal momento che i metadati viene mantenuta con i file originali. Software di elaborazione può essere utilizzato per manipolare le immagini per fare figure o film. Inoltre, le analisi quantitative anche possono essere eseguite, come la misurazione della intensità dei pixel in regioni selezionate. Software ottimale dovrebbe essere selezionato in base all'analisi, come ad esempio Image Processing Toolbox (MathWorks, Matlab) o 3D e 4D Real-Time Interactive Data Visualization (Imaris, Bitplane).
Usando questo protocollo, è stato mostrato ani-1 devono essere richiesti per neuroblast citochinesi, anche se non è richiesto per citochinesi in embrione precoce. È interessante notare, controllando il number e la posizione di neuroblasti, ani-1 potrebbero limitare la migrazione delle cellule epidermiche ventrali per custodia ventrale, perché i neuroblasti forniscono segnali chimici o meccanici alle cellule epiteliali sovrastanti. Tuttavia, non è noto se è necessaria ani-1 per la divisione o cambiamento di forma di altri tipi di cellule in media ritardo embriogenesi. Mostrando come la composizione complessiva di un tessuto colpisce i tessuti limitrofi sottolinea l'importanza della comunicazione dei tessuti durante lo sviluppo metazoi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere che questo lavoro è stato supportato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) sovvenzione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
- Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
- Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
- Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
- Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
- Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
- Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
- Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
- Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
- Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
- Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
- Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
- Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
- Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
- Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
- Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
- Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
- Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
- Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
- Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
- Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
- Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
- Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).
