Summary
Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren, die die Differenzierung von dendritischen Zellen in plasmazytoiden Peyer-Plaques aus gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen zu bewerten, mit Hilfe von Techniken mit FACS-vermittelten Zellisolierung, hydrodynamische Gentransfer und Flow-Analyse von Immunteilmengen in Peyer-Plaques.
Abstract
Dieses Protokoll Details eine Methode, um die Fähigkeit der gereinigten hämatopoetischen Vorläuferzellen zu plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) in Darm-Peyer-Plaques (PP) zu erzeugen, zu analysieren. Gemeinsame dendritischen Zellvorläuferzellen (CDPs, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) wurden aus dem Knochenmark der C57BL/6-Mäuse durch FACS gereinigt und Empfängermäuse, die einen wesentlichen pDC Bevölkerung PP fehlt übertragen, in diesem Fall, IFNAR - / - Mäuse wurden als die Transferempfänger verwendet. In einigen Mäusen wurde die Überexpression der dendritischen Zellwachstumsfaktor Flt3-Ligand (Flt3L) vor der Übertragung von CDPs Adoptivdurchgesetzt, mit hydrodynamischen Gentransfer (HGT) von Flt3L-kodierenden Plasmid. Flt3L Überexpression erweitert DC-Populationen aus übertragen (oder endogenen) hämatopoetischen Vorläuferzellen stammen. Bei 7-10 Tage nach der Vorläufer Transfer wurden pDCs, die von den adoptiv übertragen entstehen aus Vorläuferzellen auf die Empfängerzellen unterschiedenGrundlage der Marker CD45 Expression mit pDCs aus übertragen CDPs als CD45.1 + und CD45.2 + als Empfänger. Die Fähigkeit der CDPs übertragen, um die Bevölkerung in pDC PP zu fördern und an Flt3L reagieren wurde mittels Durchflusszytometrie von PP-Einzelzellsuspensionen aus Empfängermäusen ausgewertet. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zu testen, ob andere Vorläuferpopulationen der Lage ist, PP pDCs. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz verwendet, um die Rolle von Faktoren, die voraussichtlich pDC Entwicklung PP beeinflussen, indem Vorläuferuntermengen mit einem geeigneten Zuschlags, KO oder Überexpression des mutmaßlichen Entwicklungsfaktor und / oder durch Manipulation einer zirkulierenden Cytokine über HGT untersuchen . Dieses Verfahren kann auch die eine Analyse der, wie PP pDCs beeinflussen die Frequenz oder die Funktion anderer Immunteilmengen in PPs. Ein einzigartiges Merkmal dieser Methode ist die Verwendung von IFNAR - / - Mäusen, die stark dezimiert pDCs PP im Vergleich zu Wildtyp-Tieren, so allowi zeigenng Rekonstitution von PP pDCs in Abwesenheit von Störfaktoren Effekte aus tödlichen Bestrahlung.
Introduction
Hier zeigen wir ein Protokoll zu prüfen, ob gemeinsame dendritischen Vorläuferzellen (CDP) sind in der Lage, aus der die plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) Bevölkerung in Peyer-Plaques (PP). Das übergeordnete Ziel der Verwendung dieser Methode war es, die Entwicklungsregulation von pDCs in Peyer-Plaques (PP pDCs) zu bewerten. Der Grund, warum dies wichtig ist, dass PP pDCs unterscheiden sich von pDCs in anderen Geweben, wie Knochenmark, Blut und Milz gefunden, und daher ist es unklar, ob PP pDCs pDC und andere Populationen sind entwicklungspolitisch und / oder funktionell verwandten. Insbesondere werden häufig für pDCs wobei der Haupt Typ I Interferon (IFN) Produzenten innerhalb der blutbildenden Systems, der Reaktion auf Toll-like Rezeptor 7 und 9 (TLR7 / 9) Stimulation durch schnelle IFN-Sekretion 3.1 bekannt. Allerdings sind PP pDCs mangelhaft in der Herstellung von Typ I IFN Antwort auf TLR-Agonisten-Stimulation 4,5. Darüber hinaus PP pDCs auch aus pDCs im Knochenmark und Milz gefunden unterscheidenSignale vom Typ I erfordert Interferon (IFN)-Rezeptor (IFNAR1) oder der IFN-Signalmolekül STAT1 für ihre Entwicklung und / oder Akkumulation 5. Diese Daten haben die Möglichkeit, dass verschiedene Regulationsmechanismen steuern PP pDCs gegen pDCs in anderen Organen (zB Knochenmark, Milz) 5 vorgeschlagen.
Die Gründe, die zur Entwicklung dieser Methode führte, wurde über die jüngsten Fortschritte im Verständnis von dendritischen Zellen (DC)-Biologie. Die meisten, wenn nicht alle, abzuleiten DC Subsets von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die das FMS-ähnliche Tyrosinkinase 3-Rezeptor (Flt3) 6-10 exprimieren, allerdings wird die DC-Entwicklung nicht zu den klassischen myeloiden und lymphoiden Wege beschränkt. Zum Beispiel Flt3 + gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMPs, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcyR lo / -) Anlass zu CDPs (lin - c-kit + Flt3 lo CD115 +), which weiter zu differenzieren in pDCs und konventionelle DCs (cDCs) 9,10. Dagegen Flt3 + gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP, lin - IL-7R + Sca-1 lo lo c-kit) entwickeln in erster Linie in pDCs 11. Deshalb vor pDCs Studien zeigen, ergeben sich aus mindestens 2 verschiedene hämatopoetische Vorläuferpopulationen unter der Regulierung der Flt3L, obwohl der typische Analyse wurde dem Knochenmark, Milz und / oder Blut pDC Teilmengen eingeschränkt. Somit ist die Vorläufer-Population (n), PP pDCs erzeugt Untersuchung erforderlich. Das Verständnis der Ursprünge der PP pDCs wird Licht auf, ob sie gemeinsame Entwicklungswege mit anderen Populationen pDC Schuppen, oder nutzen verschiedene Mechanismen während ihrer Generation in PP.
Ein einzigartiger Vorteil des hier beschriebenen Ansatz ist die Verwendung von Mäusen, die einen schweren Mangel im PP pDCs als Empfänger für den adoptiven Transfer von hämatopoetischen Vorläuferzellen zeigen. Mäuse, die mit Gen-tic Deletion im Gen für IFNAR1 (IFNAR - / - Mäuse) oder STAT1 (Stat1 - / -) zeigte eine auffallende Abbau in PP pDCs 5. Daher sind diese Stämme eine Umgebung, in der PP pDCs reduziert werden, so dass die adoptive Übertragung Studien, in Abwesenheit von starken Zellablation Regime wie letalen Bestrahlung durchgeführt werden. Eine zusätzliche Festigkeit des hier vorgestellten Verfahrens ist die Verwendung von hydrodynamischen Gentransfer (HGT) erhöhten zirkulierenden Mengen an Flt3L stimulieren. Dies bietet eine kostengünstige Möglichkeit der Flt3L in vivo zu induzieren, gegen Injektion von rekombinanten Proteins. Zahlreiche Studien, einschließlich der in unserem Labor haben HGT verwendet, um Cytokin-Mengen in einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen 5,12,13 induzieren.
Die Arbeitsteilung und präzise Immunfunktionen für DCs ist von großem Interesse in der Immunologie. Insbesondere pDCs sind wichtige Mediatoren der oralen Toleranz und systemischen antiviralenReaktionen, aber sie scheinen auch an der Entstehung und Aufrechterhaltung von Autoimmunität und Krebs 14-17 beitragen. Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht es den Entwicklungsmechanismen Regel PP pDCs zu mehr vollständig erforscht. Darüber hinaus kann dieses Konzept ermöglichen Studien PP PDC-Funktion zu beurteilen und kann zum Verständnis der Regulation und Funktion von anderen Immun Populationen innerhalb PPs erweitert werden.
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Protocol
Institutionelle Genehmigung ist im Voraus für alle hier beschriebenen experimentelle Manipulationen an Mäusen gewonnen werden. Diese umfassen die Verwendung von C57BL/6-Mäuse zur Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen, IFNAR - / - Mäusen als Empfänger für die adoptive Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und der Verwendung von CGT für Zytokin-Überexpression in vivo. Entsprechende Gehäuse und Pflege der Tiere muss auch von dem Prüfer oder Institution gestellt werden. Darüber hinaus können institutionelle Zulassung für die in hydrodynamischen Gentransfer (dh rekombinante DNA-Zulassung) verwendeten Plasmide erforderlich. Die hier beschriebenen Untersuchungen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss bei UT MD Anderson Cancer Center genehmigt.
1. Hydrodynamische Gentransfer (HGT)
Dieser Schritt soll 2 Tage vor dem adoptiven Transfer von CDPs herbeigeführt werden, um zirkulierende Flt3L für DC-Expansion in vivo-5. Prepare mindestens 5 Empfänger Mäuse / Gruppe.
- Um eine effiziente HGT zu erreichen, die Blutgefäße des Empfängers IFNAR - / - sollte Mäusen (CD45.2 +), indem Mäusen zu einer Wärmelampe für 5-10 min erweitert werden.
- Legen Sie die Maus in einem Rückhalteeinrichtung und zu desinfizieren sein Schwanz mit 70% Ethanol.
- Injizieren 5 ug Plasmid kodierend Flt3L in 2 ml sterilem PBS in die Schwanzvene unter Verwendung einer 27 G-Nadel. Für die Steuerung Kohorte injizieren 5 ug leeren Vektor (PORF) über die Schwanzvene wie angegeben.
- Überwachung der Mäuse 15-30 min, um sicherzustellen, gibt es keine nachteiligen Auswirkungen der Injektion in die Schwanzvene. Zurück Mäuse Wohnanlage für 2 Tage.
2. Isolierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Knochenmark der Maus
Dieser Schritt sollte 2 Tage nach HGT durchgeführt werden. Verwenden kongenen CD45.1 +-Mäusen als Quelle der Knochenmarkvorläuferzellen für Adoptiv-Transfer in Empfänger IFNAR - /- Tiere (CD45.2 +). In diesem Protokoll werden kongenen Stämmen erforderlich Spender und Empfänger abgeleiteten DCs unterscheiden, sowie Immunverarmung durch MHC-Fehlanpassung zu vermeiden. Ungefähr 10-20 Mäuse werden benötigt, um eine ausreichende Anzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen (10 5 Zellen / Empfängermaus) für die Transferexperimente liefern.
- Euthanize 10 kongenen CD45.1 + Mäusen durch CO 2-Erstickung und Genickbruch.
- Platzieren Sie jede Karkasse auf einer Dissektion Tablett und sterilisieren Sie den Bauch und Beine mit 70% Ethanol.
- Einen Einschnitt in der Mitte Bauch und Messer durch die Haut aus dem Bauch, um jedes Bein, Schneiden Haut nach unten der Länge des Beines.
- Entfernen Sie vorsichtig die Haut von jedem Bein, und schneiden und entfernen Sie die Beine von der Karkasse im Hüftgelenk mit einer scharfen Schere.
- Die Muskeln vorsichtig aus Femur und Tibia von jedem Bein mit einer scharfen Klinge.
- Entfernenbeide Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins mit einem scharfen Skalpell und legen Knochen in einer Kulturschale mit komplettem RPMI (RPMI mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat und 50 uM β-Mercaptoethanol) .
- Vorbereitung einer Spritze mit 1 ml vollständigem RPMI zu einer 27 G Nadel verbunden.
- Legen Sie die 27 G-Nadel in ein Ende des Oberschenkelknochens oder Tibia. Spülen Sie das Knochenmark aus dem Femur oder Tibia durch leichtes Einspritzen des kompletten RPMI in den Knochen. Stellen Sie sicher, dass Knochenmarkzellen werden aus dem Knochen entfernt, dies kann durch visuelles Erfassen vertrieben Medien, die trüb erscheint geführt werden.
- Wiederholen Spülung jeweils Femur und Tibia 3x gründlich zu entfernen, Knochenmarkszellen.
- Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren Zellen nach oben und unten 3-5x in der Kulturschale.
- Entfernen Sie Schmutz, indem die Knochenmarkszellen durch ein 40 uM Zellsieb, indem die Zellen ausgeschieden in eine neue culturE Gericht. Stören keine Zellklumpen, die auf dem Sieb durch sanften Druck mit dem Ende einer sterilen Spritzenkolben angezeigt.
- Lyse der roten Blutzellen (RBC) an der Gesamtknochenmarkzellsuspension mit kommerziellen RBC Lyse-Puffer pro Anweisungen des Herstellers vor. Verwenden 2 ml RBC-Lyse buffer/4-6 x 10 7 Zellen (Zellen aus generell eine Maus) und einer Inkubationszeit von 5 min bei RT.
- Waschen der Knochenmarkzellen durch Pelletieren Zellen durch Zentrifugation für 4 min bei 500 xg, sanft Absaugen des Kulturmediums resuspendiert in 10 ml FACS-Puffer (1 × PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS), Pelletierung Zellen durch Zentrifugation und Absaugen von Wasch sanft Puffer.
- Wiederholen des Wasch, wie in Schritt 2.13 beschrieben, für insgesamt 2 Wäschen.
3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zu isolieren CDPs
Dieser Schritt erfordert Zugang zu einem MidiMACS Zellseparator und MACS LD Spalten für eine anfängliche negative Selektionsverfahren,sowie eine FACS-Maschine mit mindestens 3, um die Mehrfarben-Laser-Vorläufermenge nach Färbung mit fluoreszenz konjugierten Antikörper zu reinigen.
- Nach dem zweiten Waschen in Schritt 2.14, zählen die Knochenmarkszellen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation in Schritt 2.13 beschrieben und resuspendieren in FACS-Puffer auf eine Endkonzentration von 4 x 10 7 Zellen pro 30 &mgr; l FACS-Puffer zu erreichen.
- Um Zellen für die FACS vorbereitet werden liniennegativen Zellen zuerst durch eine negative Selektionstechnik, die Linie-positiven Zellen aus dem Knochenmark Mischung mit magnetischen Kügelchen Säulenchromatographie entfernt angereichert. Für die negative Selektionsverfahren, fügen 1 ug jeder der folgenden Handels Ratte-Anti-Maus-Antikörper (Abs), die hämatopoetischen Linie Marker erkennen: CD3, CD19, CD11c, CD11b und Ter-119 Abs. Das ABS ist in einem Volumen von 2 ul / Ab zu den 30 &mgr; l Zellsuspension in FACS-Puffer zugegeben werden.
- Inkubieren der Zellsuspension bei 4 ° C für 30Minute Nach der Inkubation wurden die Zellen werden zweimal mit 10 ml FACS-Puffer, wie in Schritt 2.13 beschrieben.
- Die Zellen in einer Endkonzentration von 4 × 10 7 Zellen/40 &mgr; l FACS-Puffer zu erreichen. In 20 ul Ziege-anti-Ratte-IgG magnetischen Mikrokügelchen pro jeweils 40 ul Zellsuspension. Vorsichtig mischen und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min. Waschen der Zellen mit 10 ml FACS-Puffer, wie in Schritt 2.13 beschrieben.
- Resuspendieren bis 10 8 Knochenmarkzellen in 500 &mgr; l FACS-Puffer.
- Legen Sie eine MACS LD Spalte auf eine Zelle MidiMACS Trenn pro Anweisungen des Herstellers und Vorspülen der Säule mit 2 ml FACS-Puffer.
- Gelten die Knochenmarkszellsuspension auf die Säule geladen bis 5 x 10 8 Zellen in 2,5 ml FACS-Puffer. Achten Sie auf eine Sammelröhrchen (15 ml konischen Röhrchen) wird unter der Spalte platziert. Die Säule 3x mit 2 ml FACS-Puffer / Waschanlage, und sammeln Sie die Zellen, die durch die Säule, die angereichert werden vergehenLineage-negativen Zellen. Zählen Sie die Zellen, die in dem Material eluiert (Wash-Through) von der Säule.
- Um eine positive Selektion von hämatopoetischen Vorläufermengen durch FACS zuführen, Flecken Zellen mit dem folgenden fluoreszenz konjugierten Abs: IL-7R (Pacific Blue), Flt3-(PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, sowie eine Mischung von Linienmarker Abs gegen CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 und TER119 (alle mit PerCP Cy5.5 markiert) gerichtet ist. Verwenden 0,5-1 ul jeder Ab in einem Gesamtvolumen von 100 ul. Inkubieren Zellsuspension bei 4 ° C für 20-30 min.
- Waschen der Zellen in einer Konzentration von 2-3 x 10 7 Zellen / ml wie in Schritt 2.13 und resuspendieren in FACS-Puffer angegeben. Filter-Zellen durch ein 35 uM Zellsieb Kappe Rohr Zellklumpen zu entfernen. Dieser letzte Schritt ist entscheidend, um ein Verstopfen zu vermeiden, die FACS-Maschine.
- Legen Sie die Zellsuspension in einem FACS-Röhrchen auf der Bühne und sortieren FACS CDPs (lin - c-kit-lo CD115 + Flt3 +) auf derGrundlage der angegebenen Markerprofil. Sammeln gereinigten Zellen in einem 15 ml Röhrchen mit 5 ml vollständigem RPMI.
- Erfassen die absolute Anzahl der sortierten Zellen am Ende der FACS laufen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation in Schritt 2.13 und Resuspension in sterilem PBS für die adoptive Transferexperimente gezeigt.
4. Adoptiven Transfer von CDP
Dieser Schritt wird typischerweise in der Tierhaltung, wo die Empfänger-Mäuse untergebracht sind, durchgeführt. Abhängig von der Lage des FACS-Maschine kann es Transport der gereinigten Vorläuferzellpopulationen in der Tierhaltung vor adoptive Übertragung beinhalten. Vorläuferzellsuspensionen sollten steril gehalten und auf Eis transportiert werden.
- Zellsuspensionen herzustellen Injektions durch Verdünnen von 10 5 gereinigte CDPs in einem Gesamtvolumen von 100 &mgr; l steriler PBS. Zeigen Zellsuspension in einer Spritze zu einer 27 G Nadel.
- Setzen Sie die Empfänger IFNAR - / - +) zu einer Wärmelampe für 5-10 min auf effiziente Injektion über die Schwanzvene zu erreichen.
- Legen Sie die Maus in einem Rückhalteeinrichtung und zu desinfizieren sein Schwanz mit 70% Ethanol.
- Inject 10 5 FACS-gereinigte CDPs in 100 ul PBS in die Schwanzvene mit einer 27 G-Nadel.
- Überwachung der Mäuse 15-30 min, um sicherzustellen, gibt es keine nachteiligen Auswirkungen der Injektion in die Schwanzvene. Zurück Mäusen zu Wohnmöglichkeiten.
5. Isolierung von PP und Messung der pDC Beträge
- Bei 7-10 Tage nach Adoptivtransfer, einschläfern die Empfängermäuse. Öffnen Sie vorsichtig die Maus durch Dissektion und setzen den Darm.
- Entfernen Sie den gesamten Darm und legen Sie es auf PBS-getränkten Papierhandtücher. Sammeln Sie alle sichtbar PPs entlang der Wand des Dünndarms mit einer feinen Pinzette und Schere. C57BL6 und IFNAR - / - Mäuse haben in der Regel 5-10 PP / Maus, die sich von isolierten lymphatischen Follikel gefunden werden, sindentlang des Dünndarms 18. Beachten Sie, dass die PPs sind oft strukturell sogar innerhalb einer einzigen Maus, so sorgfältig sicherzustellen, dass alle PPs werden identifiziert und seziert.
- Zeigen PPs in eine Petrischale mit PBS, und verwenden Pinzette Kot zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal zu reinigen PPs.
- Digest PPs mit 1 mg / ml Collagenase IV in 10 ml 1x Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) in einem 50-ml-Kolben unter kräftigem Rühren für 1 h bei 37 ° C.
- Legen Sie das verdaut PP im oberen Fach eines 40 um Zellsieb und Kraftzellen durch Sieb mit einer sterilen Spritzenkolben. Sammeln Sie die PP-Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Pellet gespannten PP Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 Minuten und Resuspendieren in 6 ml 37% Percoll-Lösung (37% Percoll in RPMI Medium). Sanft Ort 6 ml 70% Percoll-Lösung (70% Percoll in RPMI-Medium) unterhalb der Zellsuspension, um eine Percoll Stufengradienten bilden.
- Zentrifuge Zellen für 20 min einT 800 xg mit der Zentrifugen abbrechen. Mononuklearen Zellen werden dem 37/70%-Schnittstelle migrieren. Nach der Zentrifugation sollte die einkernigen Zellpopulation durch Pipettieren vorsichtig an der Schnittstelle Region gesammelt werden. Pellet durch Zentrifugation gesammelt und zweimal waschen Zellen in 50 ml RPMI / Waschgang. Ein großes Volumen wird verwendet, um die vollständige Entfernung Percoll gewährleisten.
- Färben Sie die gesammelten PP-Zellen mit den folgenden Antikörpern gegen murine pDCs, die von den adoptiv übertragen Vorfahren (CD45.1 +) oder Empfängermäusen (CD45.2 +) ableiten zu erkennen: CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) und PDCA-1 (FITC) Abs. Führen Durchflusszytometrie Analyse der PP-Zellen wie in den Schritten 3.9 und 3.10 angegeben. Identifizieren pDCs durch ihre CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 +-Phänotyp. PDCs% x: Absolute pDC Zahlen können durch die folgende Gleichung bestimmt werdental PP-Zellzahl = PP pDCs.
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Representative Results
Unsere Ergebnisse zeigen die Gating-Strategie zur Isolierung von CDPs aus Mausknochenmarkszellen (Abbildung 1), in den Protokollen 2 und 3 beschrieben. CDPs enthalten etwa 0,1% des gesamten Knochenmarkzellen und etwa 4-6 x 10 4 CDPs kann von einer Maus isoliert werden. Bei Adoptivtransfer, unterscheiden CDPs in pDCs und cDCs 10.
Fig. 1 ist. Gating-Strategie für FACS Reinigung CDPs. Knochenmarkszellen wurden von C57BL6 Mäusen gesammelt. Lineage-positiven Zellen wurden mit Abs Linie gegen Marker (CD3, CD19, CD11b, CD11c, TER119) mittels MACS-Mikrokügelchen-vermittelte Auswahl erschöpft. Das angereicherte Linie-negative Knochenmark Bevölkerung wurde mit fluoreszenzmarkierten Ein Buntbs für CDP und Abstammung Marker und durch FACS wie gezeigt gereinigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Um pDCs in PPs zu identifizieren, verwenden wir eine erste Vor-und Seitenstreuung Gating-Strategie, gefolgt von Gating für CD11c + Siglec-H +-Zellen (2A und 2B) IFNAR -. / - Mäuse haben eine signifikante Reduktion der pDCs PPs in Bezug auf Wildtyp-Mäusen (2B) 5. Dagegen CD11c + Siglec-H - cDCs an ähnliche, in beiden Genotypen (2B) gefunden. Daher IFNAR - Mäuse bieten eine Gelegenheit, PP pDC Rekonstitution ohne Effekte von tödlichen Bestrahlung 5 untersuchen - /. Zum Beispiel die Adoptiv Übertragung von Wildtyp-CDPs in IFNAR - / - Mäusen, wie in Schritt 4 beschrieben, stimuliert eine Zunahme PP pDCs (2B). Darüber hinaus Vorbehandlung mit Flt3L HGT (Schritt 1) weiter verbessert pDC Expansion in PPs (2B), was bedeutet, übertragen CDPs und Möglichkeit endogenen Flt3 +-Vorläuferzellen reagieren auf Flt3L durch Induktion PP pDCs. Beide Bedingungen stimuliert auch CD11c + Siglec-H - cDCs beträgt, im Einklang mit der Entwicklungsursprung cDCs 6. pDCs in PPs auszudrücken traditionellen pDC Marker einschließlich PDCA-1, Siglec-H und B220, und es fehlt CD11b (2B-D) 4,5. Zusätzlich Analyse von PPs IFNAR - / - Mäusen, die sowohl Flt3L HGT aufgenommen und übertragen CDPs zeigte, dass die Mehrheit (ca. 70%) der pDCs wurden von Spender (CD45.1 +)-Mäusen (Fig. 2E) abgeleitet. Gemeinsam zeigen diese Daten, dass der adoptive Transfer CDPs induziert die PP pDC Bevölkerung in Reaktion auf Flt3L-vermittelte Signale in vivo.
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. Abbildung 2 Analyse der PP pDC in IFNAR - / - Mäusen auf Flt3L HGT und adoptiven Transfer von CDPs IFNAR -. / - Mäuse wurden intravenös mit 5 ug Plasmid-Codierung Flt3L oder einem leeren Vektor (PORF) von HGT injiziert. Zwei Tage später wurden 10 5 FACS-gereinigte CDPs adoptiv durch Schwanzveneninjektion transferiert. Sieben Tage nach der CDP Transfer wurden PPs gesammelt und analysiert für pDC Mengen (A, B). CD11c + Siglec-H + pDCs bei Mäusen, die CDP + Flt3L HGT aufgenommen wurden weiter auf PDCA-1, B220 (C), CD11b (D), CD45.1 und CD45.2 (E)-Expression analysiert. Das Expressionsmuster von PDCA-1, B220 und CD11b war in pDCs in allen 3 Gruppen (Datennicht gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die beschriebene Adoptivtransfertechnik hier beurteilt den Beitrag der CDP auf die PP pDC Bevölkerung in Empfängermäuse, die einen Mangel an PP pDCs sind (zB IFNAR - / - Mäuse). In zukünftigen Experimenten wird es wichtig sein, das Potenzial der anderen Vorläuferuntermengen bei der Erzeugung von PP pDCs bewerten, insbesondere darüber, ob PP pDCs von Flt3 + CLP abzuleiten. Diese Frage ist von Bedeutung, da es unklar bleibt, warum PP pDCs sind eindeutig empfindlich auf IFNAR-STAT1 Signale für PP perioden 5, und wenn PP pDCs folgen ähnlichen Entwicklungsanzeichen wie pDCs in anderen Organen.
In der Theorie könnte diese Methode auch bei Mäusen, die pDC Populationen in allen Organen fehlt geführt werden. Zum Beispiel, Mäuse mit einem Mangel in der Transkriptionsfaktor E2-2, der PDC "Master-Regulator" (dh Tcf4 - / - Mäuse), zeigen auffallend pDC Erschöpfung 19. Allerdings Tcf4 - / - mice embryonalen tödlich, und so Tcf4 - / - Knochenmark chimären Mäuse müssten als Empfänger für Adoptivtransferexperimente verwendet werden. Es bleibt jedoch unklar, ob PP pDCs sind empfindlich gegen Bestrahlung und würde effektiv in Tcf4 erschöpft sein - / - Chimären. Darüber hinaus hat tödliche Bestrahlung breite Auswirkungen auf die blutbildenden Systems und die Unterstützung Stroma Populationen, die PP pDC Rekonstitution auswirken könnten. So ist die Verwendung von IFNAR - / - Mäusen als Empfänger, die Fähigkeit der adoptiv übertragen Vorläuferuntermengen zu erzeugen PP pDCs beurteilen könnte Tcf4 bevorzugt werden - / -. Chimären Stat1 - / - Mäuse zeigen auch eine markante Reduktion der PP pDCs und konnte als Empfänger für Adoptiv-Transfer-Studien eingesetzt werden Studie PP pDC Entwicklungsursprung 5. Eine Einschränkung der Verwendung von IFNAR - / - oder Stat1 - / - Mäusen ist ihre immungeschwächten Zustand, welch könnte PP pDC Rekonstitution oder Funktion in unbekannte Art und Weise auswirken. So würde unabhängigen Ansätze zur PP pDC Entwicklungsursprung beurteilen Vertrauen in die Interpretation der Daten zu verbessern.
Technisch ist zu beachten, dass die CDP Bevölkerung wird auf einer sehr niedrigen Frequenz in Gesamtknochenmark, so Depletion von Lineage Marker-positive Zellen durch magnetische Kügelchen-vermittelte Säulenchromatographie vor der FACS finden ist wichtig für eine effiziente Reinigung der Vorläuferzellen durch FACS. Diese Verarmung Schritt bereichert liniennegativen Zellen, was zu einer verminderten FACS Zeit (und Kosten) für Vorläufer Reinigung. Das hierin beschriebene Verfahren verwendet abbau eine Mischung von Lineage-spezifische Antikörper, die für jedes Experiment kombiniert wird. Handels Linie Antikörper Cocktails sind ebenfalls verfügbar und kann für die Entfernung von Lineage-positiven Zellen, anstelle der Mischung, die wir beschreiben, verwendet werden. Der Vorteil des beschriebenen Ansatzes ist seine Flexibilität im Sein für verschie anpassungsfähigschiedenen Verarmungs Zwecke durch Einstellen der Antikörper, die in der Mischung vorhanden sind.
Bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen von PPs, ist es wichtig, so viel von der Umgebung des PPs möglichst Darmgewebe zu entfernen. Dies kann durch sorgfältige Dissektion der PPs erreicht werden. Ausreichende Verdauung von PPs mit Kollagenase ist ein wichtiger Schritt, um Leukozyten aus dem Darmgewebe lösen. Die beschriebene Percoll-Dichtegradientenzentrifugation Technik ist eine bevorzugte Methode, um Leukozyten aus PP verdauten Proben anzureichern. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass der PDC-Markerprotein PDCA-1 kann von Typ-I-IFN und andere Reize 20 geregelt werden. Deshalb wird Siglec-H als PDC Marker für Studien mit Zytokin Manipulation bevorzugt.
Die Verwendung von HGT hat einen klaren Vorteil in Bezug auf sein sehr kostengünstig. Während Flt3L HGT wurde in dieser Untersuchung verwendet, um die Fähigkeit von anderen Zytokinen oder lösliche Faktoren regulate PP pDCs konnte mit HGT getestet werden, in Abwesenheit oder Anwesenheit von Adoptivzelltransfer von hämatopoetischen Vorläuferzellen. Allerdings führt HGT in nachhaltige Produktion von Zytokinen aus den übertragenen Plasmid im Vergleich zu den mehr vorübergehende Erhöhungen während der rekombinanten Zytokin Injektion beobachtet, die auf die Cytokin-Halbwertszeit 5,13 ab. Die erweiterte Erhebung von zirkulierenden Zytokin nicht unbedingt in Krisen hämatopoetischen oder Infektion Antworten erreicht physiologischen Mengen. Diese Einschränkung sollte während der experimentellen Planung und Auswertung von Daten im Auge behalten werden.
In künftigen Arbeiten, selektive Manipulation der PP pDC Bevölkerung, wie hier beschrieben, kann bei der Bewältigung PP PDC-Funktion unterstützen. PP pDCs werden durch in der Umwelt vorhanden Schleimhautmediatoren Anlage und einen Mangel an Typ I-IFN-Produktion nach TLR-Aktivierung 4,5. Analyse der PP pDCs innerhalb Stat1 wiederhergestellt - / - Mäuse zeigten diese cells haben eine vergleichsweise geringe Fähigkeit, Typ-I-IFN induzieren auf TLR9 Auslösen zu PP pDCs sich natürlich (nicht gezeigt), was darauf hinweist PP pDCs aus übertragen CDPs abgeleitet zumindest diese Eigenschaft der natürlichen PP pDCs behalten. Die reduzierte Typ I IFN Produktion von PP pDCs kontrastiert mit der robusten Typ I IFN Sekretion anderer pDC Bevölkerung und wirft eine Frage in Bezug auf die funktionelle Rolle der PP pDCs. Darüber hinaus PP pDCs ähneln pDCs, die in Gegenwart von Typ-I-IFN, PDC Bevölkerung, die effiziente Stimulation der IL-17-produzierenden CD4 +-T-Lymphozyten (Th17-Zellen) entwickeln 5 zeigt. Während Th17-Zellen gelten weithin als eine entzündliche treibenden Bevölkerung, sie haben beide Schutz und pathogene Rolle im Darm 21. Getrennt pDCs wurde berichtet, dass die systemische Toleranz oral verabreichtes Antigen 15 zu vermitteln. Die Rolle der PP pDCs in lokale und systemische Immunität ist von großem Interesse, da das Verständnis dieser Punkt kann ne zeigenw Ansätze zur Darm-Immun-und Entzündungsreaktionen in der Krankheitstherapie zu manipulieren.
Im Ergebnis ist die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Beurteilung des Entwicklungspotenzials von hämatopoetischen Vorläuferuntermengen zur Erzeugung von PP pDCs. Dieses Verfahren stellt Mäuse mit PP rekonstituiert pDCs. Daher kann dieser Ansatz nicht nur zur Auswertung PP pDC hämatopoetischen Ursprungs, sondern auch für das Verständnis des Beitrags der PP pDCs Immunfunktionen innerhalb der Darmumgebung verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir danken Drs.. Alex Gelbard und Willem Overwijk für Beratung in hydrodynamischen Gentransfer. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH (AI098099, SSW), dem MD Anderson Cancer Center for Epigenetik, dem MD Anderson Center for Entzündung und Krebs (SSW) und der RE Bob Smith Education Fund (HSL) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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