Summary
Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.
Abstract
Bu protokol, bağırsak Peyer yama (PP) in plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) oluşturmak üzere saflaştırılmış hematopoietik progenitörlerin yeteneğini analiz etmek için bir yöntemi göstermektedir. Ortak dendritik hücre progenitörleri (CDP, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) FACS ile C57BL6 farelerin kemik iliğinden arıtıldı ve PP önemli bir nüfus pDC eksikliği alıcı farelere transfer edilmiştir, bu durumda, IFNAR / - - fareler transfer alıcı olarak kullanılmıştır. Bazı farelerde, dendritik hücre büyüme faktörü Flt3 ligandı (Flt3L) aşırı ifadesi Flt3L kodlayan plazmidin hidrodinamik gen transferi (hg) kullanılarak, CDP aktarımını EVLAT EDİNEN önce uygulanmıştır. Flt3L aşın transfer (ya da endojen) hematopoietik öncü kaynaklı DC popülasyonları genişler. Projenitör transfer edildikten sonra 7-10 gün sonra, adoptif transfer öncü hücrelerden meydana PDC üzerinde alıcı hücrelerden ayırt edilditransfer CDP + CD45.1 olmak ve alıcıların CD45.2 + olmaktan pDC'lerde ile CD45 işaretleyici ifade, temeli. PP pDC nüfusa katkıda bulunmak ve Flt3L yanıt transfer CDP yeteneği alıcı farelerden PP tek hücre süspansiyonları akış sitometrisi ile değerlendirildi. Bu yöntem, diğer projenitör popülasyonları PDC PP üretme yeteneğine sahip olup olmadığını test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu yaklaşım HGT yoluyla dolaşımdaki sitokinler manipüle ederek varsayılan gelişim faktörü ve / veya uygun bir yere serici, nakavt veya aşın progenitör kümelerine aktararak, PP pDC gelişimini etkilediği tahmin edilmektedir faktörlerin rolünü incelemek için kullanılan olabilir . Bu yöntem aynı zamanda PP PDCS santrallerin diğer bağışıklık altkümelerin frekansını veya fonksiyonlarını nasıl etkilediğini analiz izin verebilir. - / - Fareler, oldukça tüketilmiş PP PDC yabani tip hayvanlara kıyasla, bu nedenle allowi göstermektedir, bu yöntemin benzersiz bir özelliği IFNAR kullanılmasıdıröldürücü radyasyondan sonra karıştırıcı etkilerin yokluğunda PP PDC ng yeniden oluşturma.
Introduction
Burada, biz ortak dendritik hücre atalarıdır (CDP) Peyer yama (PP) de plazmasitoid dendritik hücre (PDC) nüfus sebebiyet verme yeteneğine sahip olup olmadığını değerlendirmek için bir protokol göstermektedir. Bu yöntemi kullanarak genel amacı Peyer yama (PP PDC) içinde pDC'lerde gelişimsel düzenleme değerlendirmektir. Bu önemli bir nedeni, PP PDC kemik iliği, kan ve dalak dahil olmak üzere diğer dokularda bulunan pDC'lerde farklıdır ve bu nedenle PP PDC ve diğer pDC nüfus gelişimsel ve / veya işlevsel olarak ilgili olup olmadığı açık olmasıdır. Özellikle, PDCS yaygın ben Toll-benzeri reseptör 7 ve hızlı IFN salgı 1-3 9 (TLR7 / 9) uyarısına yanıt, hematopoetik sistem içinde (IFN) üreticileri interferon ana türü olduğu için bilinir. Bununla birlikte, PP PDC I TLR agonist uyarma 4,5 'tepki olarak IFN tipi üretiminde eksikliği vardır. Ayrıca, PP PDC aynı zamanda kemik iliğinde ve dalak bulunan pDC'lerde farklılıktüründen sinyallerini gerektiren I (IFN) reseptörü (IFNAR 1) interferon ya da IFN gelişim ve / veya birikim 5 için molekül STAT1 işaret etmektedir. Bu veriler farklı düzenleme mekanizmaları diğer organlarda pDC'lerde karşı PP PDC (örneğin kemik iliği, dalak) kontrol 5 ihtimalini sürmüşlerdir.
Bu yöntemin gelişmesine yol açmıştır gerekçe dendritik hücre (DC) biyoloji anlamada son gelişmeler üzerine dayanıyordu. En önemlisi, hepsi değilse de, alt-gruplar DC FMS benzeri tirozin kinaz 3 reseptörü (Flt3) 6-10 ifade hematopoietik öncü hücrelerden elde, ancak DC gelişme klasik miyeloid ve lemfoid yollar ile sınırlı değildir. Örneğin, Flt3 + ortak miyeloid atalarıdır (CMPS, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcyR lo / -) CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) doğuran, hangih daha pDC'lerde ve konvansiyonel DClerin (CDCS) 9,10 içine ayırt. Buna karşılık, Flt3 + ortak lenfoid progenitorlar (CLPS, lin - IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) pDC'lerde 11 içine öncelikle gelişir. Bu nedenle, önce yapılan çalışmalar, normal analiz kemik iliği, dalak ve / veya kan pDC alt-sınırlı olmasına rağmen PDC, Flt3L düzenlemesi altında, en az 2 ayrı hematopoietik projenitör popülasyonlarından ortaya göstermektedir. Böylece, PP PDCS üretir progenitör nüfus (ler) soruşturma gereklidir. PP pDC'lerde kökenlerini anlamak diğer pDC nüfusa sahip yaygın gelişimsel yolları paylaşmak konusunda ışık tutacak, ya da PP kendi üretimi sırasında farklı mekanizmaları kullanacak.
Burada tarif edilen benzersiz bir yaklaşımın avantajı, hematopoietik progenitörlerin adoptif nakli için alıcılar olarak PP pDC'lerde ciddi bir eksiklik göstermektedir farelerin kullanılmasıdır. Gen sahip olan fareler,gen kodlama tlc silme IFNAR1 (IFNAR - / - fareler) veya STAT1 (STAT1 - / -) PP pDC'lerde 5 çarpıcı bir tükenmesi saptandı. Bu nedenle, bu suşlar adoptif transfer çalışmalar, öldürücü ışıması gibi kuvvetli hücre ablasyon rejimlerin yokluğunda gerçekleştirilebilir sağlayan, PP PDC azalır bir ortam sağlar. Burada sunulan yöntemin bir ek kuvvet Flt3L yükseltilmiş dolaşan miktarlarda teşvik etmek için hidrodinamik gen transferi (hg) kullanılmasıdır. Bu, yeniden birleştirici proteinin püskürtülmesiyle, karşı in vivo Flt3L uyarılması için uygun maliyetli bir yaklaşım sağlar. Laboratuarımızda de dahil olmak üzere çok sayıda çalışma, deneysel koşullar 5,12,13 çeşitli miktarlarda sitokin indükleme Hgt kullanmışlardır.
DClerin için emek ve hassas bağışıklık fonksiyonları bölümü immünoloji büyük ilgi olduğunu. Özellikle, PDC oral tolerans ve sistemik anti-viral önemli aracılarıdırtepkiler, ancak aynı zamanda otoimmün ve kanser 14-17 gelişmesi ve devam etmesi için katkı görünmektedir. Burada açıklanan protokol PP PDCS düzenleyen gelişim mekanizmaları daha tam olarak keşfedilmeyi olmasını sağlayacaktır. Ayrıca, bu yaklaşım çalışmalar PP pDC fonksiyonunu değerlendirmek için izin verebilir, ve santrallerin içindeki diğer bağışıklık nüfus düzenleme ve işlevini anlamak için uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kurumsal onayı fareleri içeren burada anlatılan tüm deneysel manipülasyonlar için önceden alınmalıdır. Bu kemik iliği projenitör hücrelerin izolasyonu için C57BL6 farelerin kullanımını içerir, IFNAR - / - adoptif hematopoietik progenitörlerin transferi ve in vivo sitokin aşırı ekspresyonu için HGT kullanımı için alıcılar olarak farenin. Uygun konut ve hayvan bakımı da araştırmacı veya kurum tarafından sağlanmalıdır. Ayrıca, kurumsal onay hidrodinamik gen transferi (örneğin, yeniden birleştirici DNA onayı) kullanılan plasmidlerin için gerekli olabilir. Burada anlatılan çalışmalar, UT MD Anderson Kanser Merkezi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1.. Hidrodinamik Gen Transferi (HGT)
Bu adım, in vivo olarak 5 DC genişleme Flt3L dolaşan indükleme CDP en adoptif transfer 2 gün önce yapılmalıdır. Prepare en az 5 alıcı farenin / grup.
- Etkili Hgt elde edilmesi için, alıcının IFNAR kan damarları - / - fareler (CD45.2 +) 5-10 dakika için bir ısıtma lambası için fareler maruz bırakılarak genişlemiş olmalıdır.
- Bir süzgeç cihaz fare yerleştirin ve% 70 etanol ile kuyruğunu dezenfekte.
- Bir 27 G iğne kullanılarak kuyruk damarının içine steril PBS ve 2 ml plazmid kodlayan Flt3L 5 ug enjekte edilir. Gösterildiği gibi kontrol kohortunda için, kuyruk damarından boş vektör (pORF) 5 ug enjekte edilir.
- Kuyruk ven enjeksiyon hiçbir zararlı etkisi vardır sağlamak için 15-30 dakika süreyle fareler izleyin. 2 gün boyunca konut tesis için fareler dönün.
2. Fare kemik iliğinden hematopoietik progenitörlerin izolasyonu
Bu adım 2 gün HGT sonra yapılmalıdır. Alıcı IFNAR'ın içine evlat edinen transferi için kemik iliği atalarıdır kaynağı olarak konjenik CD45.1 + fareler kullanın - /- Hayvanlar (CD45.2 +). Bu protokolde, konjenik suşları donör ve alıcı-türetilmiş DClerin ayırt etmek, hem de MHC uyumsuzluğu immün-aracılı tükenmesini önlemek için gereklidir. Yaklaşık 10-20 farenin transfer deneyleri için hematopoietik progenitör hücrelerin yeterli sayıda (10 5 hücre / alıcı fare) sağlamak için gerekli olacaktır.
- CO 2 boğulma ve servikal dislokasyon ile 10 konjenik CD45.1 + fareler Euthanize.
- Bir diseksiyon tepsiye her karkas yerleştirin ve% 70 etanol ile karın ve bacaklar sterilize.
- Orta karın bir kesi yapmak ve bacak uzunluğu aşağı deri kesme, her bacak karın deri kesti.
- Yavaşça her bacak cilt kaldırmak ve kesilmiş ve keskin bir makas kullanarak kalça ekleminde karkas bacakları kaldırmak.
- Dikkatlice keskin bir bıçak kullanarak her bacak femur ve tibia kasları çıkarın.
- KaldırmakHer iki keskin bir neşter ile femur ve tibia ve uçları (% 10 ısı ile pasifleştirilmiş cenin sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 50 uM β-mersaptoetanol Kan numuneleri) komple RPMI içeren bir kültür kabı içinde yer kemikleri .
- Bir 27 G iğne bağlı tam RPMI içinde 1 ml ihtiva eden bir şırınga hazırlayın.
- Femur veya tibia bir ucunu 27 G iğne takın. Yavaşça kemik içine komple RPMI enjekte femur ve tibia gelen kemik iliği yıkayın. Kemik iliği hücreleri kemik kaldırılır ediliyor sağlamak, bu görsel bulutlu görünür sınırdışı medya tespit yapılabilir.
- Iyice kemik iliği hücreleri çıkarmak için her femur ve tibia 3x yıkama tekrarlayın.
- Nazikçe kültür çanak yukarı ve aşağı 3-5x hücreleri pipetleme tarafından tek bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Yeni Kültür içine yayılır hücreleri yerleştirerek, 40 mikron hücre süzgecinden kemik iliği hücrelerini geçerek enkaz kaldırmake çanak. Steril bir şırınga pistonu sonu ile hafif basınç ile süzgeç görünen herhangi bir hücre kümeleri bozar.
- Lyse, üretici talimatlarına göre ticari RBC liziz tamponu ile toplam kemik iliği hücre süspansiyonu içinde mevcut olan kırmızı kan hücrelerinin (RBC). 2 ml RBC liziz buffer/4-6 x 10 7 hücrelerinin (bir fare genellikle hücreleri) ve oda sıcaklığında 5 dakika bir kuluçka zaman kullanın.
- (1x PBS + 2 mM EDTA +% 1 FBS), peletleme hücreler santrifüj ile ve yavaşça aspire yıkama 10 ml FACS tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona, yavaşça kültür ortamı aspire, 500 x g, 4 dakika için santrifüjleme ile tane haline hücreleri tarafından kemik iliği hücrelerinin yıkayın tampon eklendi.
- Adım 2.13 'de tarif edildiği gibi 2 yıkar, toplam, yıkama tekrarlayın.
3. Floresan-aktive edilmiş hücre CDP yalıtmak için (FACS)
Bu adım, bir başlangıç negatif seçim prosedürü için bir MidiMACS hücre ayırıcı ve MACS LD sütunları erişimi gerektirirfloresan konjuge antikor ile boyanarak renkli progenitör alt kümesini saflaştırmak için en az 3 lazer ile hem de bir FACS makinesi.
- Adım 2.14 ikinci yıkamadan sonra, kemik iliği hücreleri saymak. Adım 2.13 'de tarif edildiği gibi santrifüjleme ile Pelet hücreleri ve FACS tampon maddesi 30 ul başına 4 x 10 7 hücre bir son konsantrasyon elde etmek için FACS tamponu içerisinde yeniden süspanse edin.
- FACS için hücrelerin hazırlanması için, soy-negatif hücrelerin ilk manyetik boncuk kolon kromatografisini kullanarak kemik iliği karışımından soy pozitif hücrelerin çıkartılması için bir negatif seçim tekniği ile zenginleştirilmiştir. CD3, CD19, CD11c, CD11b ve Ter-119 Abs: negatif seçim prosedürü için, hematopoietik kökenli işaretlerini tanıyan aşağıdaki ticari sıçan anti-fare antikorları (Abs) her birinden 1 ug ekleyin. Abs FACS tamponu içinde 30 ul hücre süspansiyonu için 2 | il / Ab bir hacimde ilave edilmelidir.
- 30 boyunca 4 ° C'de bir hücre süspansiyonu inkübemin. Adım 2.13 'de tarif edildiği gibi inkübe edildikten sonra, FACS tamponu ile iki kez 10 ml hücreleri yıkayın.
- FACS tamponu 4 x 10 7 cells/40 ul bir son konsantrasyon elde etmek için hücrelere tekrar. Hücre süspansiyonu her bir 40 ul başına keçi anti-fare IgG mikroboncuk manyetik 20 ul ekle. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Adım 2.13 'de tarif edildiği gibi FACS tampon maddesi 10 ml hücreleri yıkayın.
- FACS tampon maddesi içinde 500 ul içinde 10 8, kemik iliği hücreleri kadar yeniden süspanse edin.
- Üreticinin talimatlarına göre bir hücre ayırma MidiMACS üzerine bir MACS kolonu LD yük ve 2 ml FACS tamponu ile sütun Ön yıkama.
- FACS tampon maddesi içinde 2.5 ml 5 x 10 8 hücrelere kadar yükleme, kolona kemik iliği hücre süspansiyonu uygulanır. Bir toplama tüpü (15 ml konik tüp) sağlamak sütununun altına yerleştirilir. Sütunu FACS tampon / yıkama, 2 ml ile 3 kez yıkanır ve için zenginleştirilmiş olacak sütun geçmesine hücreleri toplamaksoy-negatif hücrelerdir. Kolondan akıtılan malzeme hücrelerinin (yıkama-through) sayılır.
- FACS hematopoetik progenitör altkümelerin pozitif seçim gerçekleştirmek için, aşağıdaki floresan konjuge Abs ile leke hücreler: IL-7'yi (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs artı CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 ve Ter119 (tüm PerCP Cy5.5 ile etiketlenmiş) karşı soy işaretleyici antikorların bir karışımı olabilir. 100 ul'lik bir toplam hacimde her Ab'nin 0.5-1 ul kullanın. 20-30 dakika boyunca 4 ° C'de bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
- FACS tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon ve adım 2,13 gösterildiği gibi x 10 7 hücre / ml ', 2-3 arasında bir konsantrasyonda hücreler yıkayın. Hücre kümeleri kaldırmak için 35 mikron hücre süzgecinden kap tüp aracılığıyla hücrelerini filtre. Bu son adım FACS makineyi tıkanmasını önlemek için çok önemlidir.
- FACS sahnede bir FACS tüp içinde hücre süspansiyonu yerleştirin ve CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) sıralamak üzerineBelirtilen işaretleyici profilinin temeli. Tam RPMI içinde 5 ml ihtiva eden bir 15 ml tüp içinde saflaştırılmış hücreleri toplamak.
- FACS çalışma sonunda kriteri hücrelerinin mutlak sayısı kaydedilir. Adoptif transfer deneyleri için steril PBS içinde tekrar süspansiyon ve adım 2,13 gösterildiği gibi santrifüj ile hücreler Pelet.
4. CDP evlatlık transferi
Bu adım, tipik olarak, alıcı farenin yerleştirilmiştir hayvan tesisinde yapılır. FACS makinesinin bulunduğu yere bağlı olarak, önce adoptif transfer etmek için hayvan tesisine içine saflaştırılmış progenitör hücre popülasyonlarının taşınmasını içerebilir. Progenitör Hücre süspansiyonları steril tutulur ve buz üzerinde taşınmalıdır.
- 100 ul steril PBS toplam hacim içinde 10 5 saflaştırılmış CDP seyreltilerek enjeksiyon için hücre süspansiyonları hazırlayın. Bir 27 G iğne bağlanmış bir şırınga içinde hücre süspansiyonu yerleştirin.
- Alıcı Açığa IFNAR - / - +).
- Bir süzgeç cihaz fare yerleştirin ve% 70 etanol ile kuyruğunu dezenfekte.
- Bir 27 G iğne kullanılarak kuyruk damarının içine 100 ul PBS içinde 10 5 FACS-arıtıldı CDP enjekte edilir.
- Kuyruk ven enjeksiyon hiçbir zararlı etkisi vardır sağlamak için 15-30 dakika süreyle fareler izleyin. Konut tesisine fareler dönün.
5. PDC PP ve Ölçme İzolasyonu Tutarları
- Evlatlık transferi sonrası 7-10 gün sonra, alıcı fareler euthanize. Yavaşça diseksiyon tarafından fareyi açın ve bağırsak maruz.
- Tüm bağırsak çıkarın ve PBS-ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin. Ince forseps ve makas kullanılarak ince bağırsak duvarı boyunca tüm görünür pps toplayın. C57BL6 ve IFNAR'ın - / - fareler genellikle bulundu izole lenfoid follikül farklı 5-10 PP / fare varince bağırsakta 18 boyunca. PPs yüzden dikkatli tüm PPs tespit ve disseke sağlamak, hatta tek bir fare içinde genellikle yapısal olarak farklı olduğunu unutmayın.
- PBS içeren bir Petri kabındaki pps yerleştirin ve dışkı çıkarmak için forseps kullanabilir. PPS temizlemek için iki kez bu işlemi tekrarlayın.
- 50 ml 10 mi 1 x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içerisinde 1 mg / ml kollajenaz IV Digest PPs 37 ° C'de 1 saat boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırılarak şişeye
- Steril bir şırınga pistonu ile süzgeç ile 40 um hücre filtresi ve kuvvet hücrelerin üst bölmeye dijeste PP yerleştirin. Bir 15 ml konik bir tüp içinde PP hücre süspansiyonu toplayın.
- % 37 Percoll çözeltisi (RPMI ortamı içinde% 37 Percoll) 6 ml ve 5 dakika tekrar süspansiyon için 500 x g'de santrifüj ile gergin PP Pelet hücreleri. Yavaşça bir Percoll basamaklı bir derece oluşturulması için, hücre süspansiyonu, alt (RPMI ortamı içinde% 70 Percoll)% 70 Percoll çözeltisi 6 ml yerleştirin.
- 20 dakika için a Santrifüj hücrelerisantrifüj kopmak ile 800 xg t. Mononükleer hücreler, 37/70% arayüzü göç edecektir. Santrifüj işleminden sonra, tek çekirdekli hücre popülasyonu arayüz bölgesinde dikkatli pipetleme toplanmalıdır. Pellet santrifüj ile hücreler toplandı ve tam RPMI / yıkama 50 ml iki kez yıkayın. Büyük hacimli bir Percoll tam olarak çıkarılmasının sağlanması için kullanılır.
- CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE: adoptively transfer atalarıdır (CD45.1 +) veya alıcı farelere (CD45.2 +) türeyen kemirgen PDCS algılamak için aşağıdaki antikorlar ile toplanan PP hücreleri leke . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) ve PDCA-1 (FITC) Abs. Adım 3.9 ve 3.10 'da belirtildiği gibi PP hücrelerin akış sitometrisi analizi yapın. Onların CD11c'nin + CD11 tarafından PDCS tanımak - B220 + Siglec-H + PUKÖ-1 + fenotip. % PDC x için: Mutlak pDC sayısı aşağıdaki denklem ile tespit edilebilirtal PP hücre sayısı = PP PDCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçlarımız Protokolleri 2 ve 3'te detaylı olarak, fare kemik iliği hücrelerinden CDP izolasyonu (Şekil 1) için bir strateji yolluk gösterir. CDP toplam kemik iliği hücrelerinin yaklaşık% 0,1 ihtiva eder ve yaklaşık 4-6 x 10 4 CDP bir fareden izole edilebilir. Evlatlık transferi üzerine, CDP pDC'lerde ve CDCS 10 içine ayırt.
CDP FACS saflaştırılması için Şekil 1. Yolluk stratejisi. Kemik iliği hücreleri, C57BL6 farelerden toplandı. Soy-pozitif hücreler soy belirteçleri (CD3, CD19, CD11, CD11c, Ter119) MACS microbead-aracılı seçimini kullanarak karşı Abs ile tüketildi. Zenginleştirilmiş soy-negatif, kemik iliği nüfus floresan etiketli A ile lekeliCDP ve soy belirteçleri ve gösterildiği gibi FACS tarafından arıtılmış için bs. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
PPS'de PDC belirlemek için, bir ileriye doğru kullanımı ve CD11c + Siglec-H + hücreleri (Şekil 2A ve 2B) için yolluk ardından yan dağılım yolluk strateji, ilk IFNAR -. / - Fareler için PPs nispetle pDC'lerde önemli bir azalma vardır vahşi tip fareler (Şekil 2B) 5. Kontrast, CD11c'nin + Siglec-H - CDCS hem genotipleri (Şekil 2B) benzer miktarlarda bulunur. Bu nedenle, IFNAR - / - fareler ölümcül radyasyonun 5 etkileri olmadan PP pDC sulandırma incelemek için bir fırsat sağlamaktadır. Örneğin, IFNAR içine vahşi tip CDP en adoptif transfer - / - fareler, Aşama 4'te tarif edildiği gibi, PP pDC'lerde (Şekil 2B) bir artışa yol açar. Ayrıca, Flt3L HGT (adım 1) santrallerin (Şekil 2B) daha da gelişmiş pDC genişleme, transfer CDP ve olasılık endojen Flt3 + atalarıdır ima ile ön işlem PP PDCS uyararak Flt3L yanıt. Her iki durum da CD11c'nin uyarılan + Siglec-H - CDCS, CDCS 6 gelişimsel kökeni ile tutarlı tutarlar. BES'te PDCS PDCA-1, Siglec-H ve B220 dahil olmak üzere geleneksel pDC işaretleri ifade ve CD11b'nin (Şekil 2B-D) 4,5 yoksundur. Buna ek olarak, IFNAR 'den santrallerin analizi - / - Flt3L Hgt hem alınan ve CDP transfer farenin pDC'lerde çoğunluğu (~% 70) vericiden (CD45.1 +) farenin (Şekil 2E) türetilmiş olduğunu gösterdi. Toplu olarak bu veriler, CDP adoptif transferi, in vivo olarak Flt3L aracılı sinyallere yanıt olarak PP popülasyonu pDC uyardığını göstermektedir.
içerik "fo: keep-together.within-page =" Her zaman ">
. IFNAR PP pDC Şekil 2 Analizi - / -. - / - Flt3L HGT ve CDP IFNAR adoptif transfer edilmesi üzerine farenin farenin plazmid kodlayan Flt3L veya HGT ile boş bir vektör (pORF) 5 ug ile intravenöz olarak enjekte edilmiştir. İki gün sonra, 10 5 FACS-arıtıldı CDP adoptif kuyruk damarı enjeksiyonu ile transfer edilmiştir. Yedi gün CDP transferi yayınlamak, PPs pDC tutarlar için toplandı ve analiz edildi (A, B). CDP + Flt3L Hgt alan farelerde, CD11c + Siglec-H + PDC ayrıca PDCA-1, B220 (C), CD11b (D), ve CD45.1 CD45.2 (E) ekspresyonu için analiz edildi. PDCA-1, B220, CD11b'nin salgılama modeli 3 grup (veriler pDC'lerde benzerdi) gösterilmemiştir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
(- / - Fareler örneğin IFNAR) açıklanan adoptif transfer tekniği, PP pDC'lerde eksikliği olan alıcı farelerde PP pDC nüfusa CDP katkısını değerlendirdik. Gelecekteki deneylerde, bu PP PDCS Flt3 + CLPS türeyen olsun, özellikle PP PDCS üreten diğer öncül altkümelerin potansiyelini değerlendirmek için önemli olacaktır. Bu soru PP PDCS PP tahakkuk 5 için IFNAR'ın-STAT1 sinyallere benzersiz duyarlı neden belirsizliğini korumaktadır önemli olduğunu, ve PP PDCS diğer organlarda pDC'lerde gibi benzer gelişimsel ipuçlarını takip ederseniz.
Teorik olarak, bu yöntem, aynı zamanda tüm organlarda pDC popülasyonları yoksun farelerde gerçekleştirilen olabilir. Örneğin, transkripsiyon faktörü E2-2, pDC "ana düzenleyici" in eksikliği olan fareler (yani Tcf4 - / - fareler), gösteri çarpıcı pDC tükenmesi 19. Ancak, Tcf4 - / - mikrofone öldürücü embriyonik ve bu nedenle, Tcf4 - / - kemik iliği kimerik farenin adoptif transfer deneyleri için alıcılar olarak kullanılabilir olması gerekir. - / - Kimera Bununla birlikte, PP PDC ışınlama duyarlıdır ve etkili Tcf4 olarak tükenebilir olup olmayacağı bilinmemektedir. Ayrıca, ölümcül radyasyon hematopoetik sistem üzerinde ve PP pDC sulandırma etkileyebilecek stromal popülasyonlarını destekleyen geniş etkileri vardır. Bu nedenle, IFNAR kullanımı - / - PDC farenin PP elde etmek için adoptif transfer progenitör alt-yeteneğine değerlendirmek için alıcılar Tcf4 tercih edilebilir olarak - / -. kimeralardır STAT1 - / - fareler de PP pDC'lerde çarpıcı bir azalma göstermektedir ve adoptif transfer çalışmaları için alıcılar olarak kullanılabilir olabilir Çalışma PP pDC gelişimsel kökenleri 5. - / - Veya STAT1 - IFNAR kullanımına bir uyarı / - fareler, WHI kendi bağışıklık yetersizliği durumudurch bilinmeyen yollarla PP pDC veya yeniden fonksiyonunu etkileyebilir. Böylece, PP pDC gelişimsel kökeni değerlendirmek için bağımsız yaklaşımlar veri yorumlama güveni artıracaktır.
Teknik olarak, CDP nüfusun toplam kemik iliği önce, FACS manyetik boncuk aracılı sütun kromatografisi ile soy işaretleyici-pozitif hücrelerinin tükenmesi, böylece çok düşük bir frekansta bulunan unutulmamalıdır ile projenitör hücrelerin etkili temizleme için önemlidir FACS. Bu tükenmesi adım ata arıtma azalmıştır FACS zaman (ve maliyeti) sonuçlanan, soy-negatif hücrelerin zenginleştirir. Burada tarif edilen prosedür, tüketen her bir deney için birleştirilir soy spesifik antikorların bir karışımını kullanır. Ticari soy antikor kokteyli de mevcuttur ve tarif karışımın yerine soy pozitif hücrelerin ayrılması için de kullanılabilir. Açıklanan yaklaşımın avantajı Değişik için uyarlanabilir olmak, esneklikferent tükenmesi amaçları, karışımda mevcut olan antikorları ayarlayarak.
Santrallerin ikinci tek hücre süspansiyonları hazırlanmasında, mümkün olduğunca PPS çevreleyen intestinal doku olduğu kadar ortadan kaldırmak için önemlidir. Bu santrallerin dikkatli disseksiyon yolu ile gerçekleştirilebilir. Kollagenaz'la santrallerin yeterli sindirim bağırsak dokusu Lökositleri serbest bırakmak için önemli bir adımdır. Açıklanan Percoll yoğunluk gradyanlı santrifüj teknik sindirilmiş PP örneklerinden lökositleri zenginleştirmek için bir tercih edilen yöntemdir. Buna ek olarak, bu pDC işaretleyici protein PUKÖ-1 I IFN türü ve diğer uyaranlarla 20 tarafından düzenlenmiş olabilir dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, Siglec-H sitokin manipülasyonu ile ilgili çalışmalar için bir işaretleyici olarak pDC tercih edilir.
HGT kullanımı oldukça maliyetli olması açısından açık bir avantaja sahiptir. Flt3L HGT bu çalışmada kullanılmıştır olsa da, diğer sitokinler veya çözünür faktörlerin yeteneği regulate PP PDC hematopoietik öncü hücre adoptif transfer varlığında veya yokluğunda, Hgt kullanılarak test edilebilir. Ancak, sitokin HGT yarı ömrü 5,13 bağlıdır rekombinan sitokin enjeksiyon sırasında gözlenen daha fazla geçici arttıkça, karşı transfer plazmidinden sitokinlerin sürekli üretimi ile sonuçlanır. Sitokin dolaşan genişletilmiş yükseklik acil hematopoetik ya da enfeksiyon yanıtları sırasında elde fizyolojik tutarları yansıtmayabilir. Bu ihtar deneysel planlama aşamaları ve verilerin değerlendirilmesi sırasında akılda tutulmalıdır.
Gelecekteki çalışmaları olarak, PP pDC nüfusun seçici manipülasyonu, burada tarif edildiği gibi, PP pDC fonksiyonu ele yardımcı olabilir. PP PDCS mukozal ortamda mevcut arabulucular tarafından klimalı ve TLR aktivasyon 4,5 'üzerine üretim IFN tip eksikliği vardır. STAT1 içinde yeniden PP PDC Analizi - / - fareler bu ce gösterdiLLS doğal PP PDC en azından bu özellik korumak transfer CDP türetilmiş PP PDC gösteren I (gösterilmemiştir) doğal olarak ortaya çıkan PP pDC'lerde göreli tetikleme TLR9 üzerine IFN tipi uyarılması için bir nispeten düşük bir yeteneği vardır. Ben PP pDC'lerde üretimini IFN azaltılmış tip diğer pDC nüfus salgılanmasını IFN sağlam türü ile tezat ve PP pDC'lerde işlevsel rolüne ilişkin bir soru yükseltir. Ayrıca, PP PDC I IFN tipi, IL-17 üreten CD4 + T lenfositleri (Th17 hücreleri) etkin bir şekilde uyarılması gösteren bir pDC nüfus mevcudiyetinde geliştirmek PDC benzerler 5. Th17 hücreleri yaygın inflamatuar bir indükleyici nüfus olarak kabul edilir olsa da, bağırsakta 21 hem de koruyucu ve patojenik rol oynarlar. Ayrı, PDCS oral antijen 15 uygulanan sistemik tolerans aracılık bildirilmiştir. Bu noktayı anlamak NE açığa çıkabilir gibi yerel ve sistemik bağışıklık PP pDC'lerde rolü, önemli ilgiHastalık tedavi intestinal immün ve enflamatuar tepkileri işlemek için w yaklaşımlar.
Sonuç olarak, burada sunulan yöntem PP PDC üretilmesi için hematopoietik projenitör alt-gelişim potansiyelinin değerlendirilmesini sağlar. Bu işlem sulandırılmış PP pDC'lerde farelere sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşım, PP pDC hematopoietik kökenli değerlendirmek için değil, aynı zamanda, bağırsak ortamında bağışıklık fonksiyonları için PP PDC katkı anlaşılması için sadece kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.
Acknowledgments
Biz Dr teşekkür ederim. Hidrodinamik gen transferi tavsiye Alex Gelbard ve Willem Overwijk. Bu çalışma NIH (AI098099, SSW), Kanser Epigenetik için MD Anderson Merkezi, iltihaplanma ve Kanser için MD Anderson Merkezi (SSW), ve RE Bob Smith Eğitim Fonu (HSL) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
