Summary
Ce protocole décrit les procédures expérimentales pour évaluer la différenciation des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer de progéniteurs de cellules dendritiques ordinaires, en utilisant des techniques impliquant l'isolement FACS à médiation cellulaire, le transfert de gène hydrodynamique, et l'analyse des flux de sous-ensembles immuns dans les plaques de Peyer.
Abstract
Ce protocole détaille une méthode pour analyser la capacité des progéniteurs hématopoïétiques purifiées pour produire des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) dans le patch de Peyer intestinale (PP). Progéniteurs des cellules dendritiques communes (CDPS, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) ont été purifiés à partir de la moelle osseuse de souris C57BL6 par FACS et transférés à des souris receveuses qui n'ont pas une population pDC significative en PP, dans ce cas, IFNAR - / - souris ont été utilisés comme les bénéficiaires de transferts. Chez certaines souris, la surexpression du facteur de croissance dendritique des cellules ligand Flt3 (Flt3L) a été appliqué avant le transfert adoptive de lecteurs de disques compacts, en utilisant le transfert de gène hydrodynamique (HGT) de Flt3L plasmide codant. Flt3L surexpression augmente populations de DC provenant de transférés (ou endogènes) progéniteurs hématopoïétiques. À 7-10 jours après le transfert de l'ancêtre, pDCs qui découlent des progéniteurs adoptive transférés ont été distinguées des cellules réceptrices sur labase de l'expression du marqueur CD45, avec pDCs du CDP transférés étant CD45.1 + et les bénéficiaires étant CD45.2 +. La capacité des lecteurs de disques compacts transférés à contribuer à la population pDC en PP et de répondre à Flt3L a été évaluée par cytométrie de flux de PP suspensions de cellules isolées à partir de souris receveuses. Cette méthode peut être utilisée pour tester si d'autres populations de cellules progénitrices sont capables de générer PP pDC. En outre, cette approche pourrait être utilisée pour examiner le rôle des facteurs qui sont prévus pour affecter le développement pDC en PP, en transférant des sous-ensembles de souches avec un effet de choc, coup de grâce ou la surexpression appropriée du facteur et / ou de développement putatif en manipulant cytokines circulantes par HGT . Cette méthode peut également permettre une analyse de la façon dont les pDC PP affectent la fréquence ou la fonction de sous-ensembles d'autres immunitaires en PP. Une caractéristique unique de cette méthode est l'utilisation de IFNAR souris - / -, qui montrent gravement appauvri PP pDC par rapport à des animaux de type sauvage, ainsi allowing reconstitution de PP pDC en l'absence d'effets confondants de l'irradiation mortelle.
Introduction
Ici, nous démontrons un protocole pour évaluer si progéniteurs des cellules dendritiques communes (CDPS) sont capables de donner naissance à la cellule dendritiques plasmacytoïdes (pDC) de la population dans les plaques de Peyer (PP). L'objectif global de cette méthode est d'évaluer la régulation du développement des pDC dans les plaques de Peyer (PP pDC). La raison pour cela est important, c'est que les pDC PP diffèrent de pDC trouvés dans d'autres tissus, y compris la moelle osseuse, du sang et de la rate, et il est donc difficile de savoir si les pDC PP et d'autres populations PDC sont de développement et / ou fonctionnellement liés. Plus précisément, les pDC sont largement connus pour être le principal type I interféron (IFN) producteurs dans le système hématopoïétique, répondant au récepteur Toll-like 7 et 9 (TLR7 / 9) par stimulation rapide sécrétion d'IFN 1-3. Toutefois, les pDC PP sont déficientes dans la production de IFN de type I en réponse à la stimulation agoniste TLR 4,5. En outre, PP pDCs diffèrent également des pDC présentes dans la moelle osseuse et la rate dansnécessitant des signaux provenant du interféron de type I (IFN) récepteur (IFNAR1) ou l'IFN de signalisation STAT1 molécule pour leur développement et / ou l'accumulation 5. Ces données ont suggéré la possibilité que des mécanismes de régulation distincts contrôlent pDCs PP contre pDC dans d'autres organes (par exemple, la moelle osseuse, la rate) 5.
Le raisonnement qui a conduit à la mise au point de ce procédé a été basé sur les avancées récentes dans la compréhension de cellule dendritique (DC) de la biologie. La plupart, sinon la totalité, des sous-ensembles DC dérivent de progéniteurs hématopoïétiques qui expriment le récepteur de tyrosine kinase 3 de type fms (Flt3) 6-10, mais le développement à courant continu n'est pas limitée à l'myéloïde voies classique et lymphoïdes. Par exemple, Flt3 + progéniteurs myéloïdes communs (CMPS, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FCyR lo / -) donner lieu à CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +), which différencier davantage dans les pDC et DC classiques (CDCS) 9,10. En revanche, Flt3 + progéniteurs lymphoïdes communs (SPDP, lin - + Sca-1 lo c-kit IL-7R lo) se développent principalement dans les pDC 11. Par conséquent, des études antérieures indiquent pDCs proviennent d'au moins deux populations de cellules progénitrices hématopoïétiques distincts en vertu de la réglementation des Flt3L, bien que l'analyse typique a été limitée à la moelle osseuse, la rate et / ou des sous-ensembles de PDC sang. Ainsi, la population (s) de l'ancêtre qui génère PP pDCs requis enquête. Comprendre les origines de la PP pDCs fera la lumière sur si ils partagent les voies de développement communs avec d'autres populations pDC, ou utiliser des mécanismes distincts au cours de leur génération en PP.
Un avantage unique de l'approche décrite ici est l'utilisation de souris qui présentent un déficit sévère en PP pDCs que les destinataires du transfert adoptif progéniteurs hématopoïétiques de. Les souris avec le gènetic deletion dans le gène codant pour IFNAR1 (IFNAR - / - souris) ou STAT1 (Stat1 - / -) a révélé une diminution frappante dans les pDC PP 5. Par conséquent, ces souches fournissent un environnement dans lequel les pDC PP sont réduites, ce qui permet des études de transfert adoptif à effectuer en l'absence de régimes d'ablation de cellules puissants tels que l'irradiation létale. Une résistance supplémentaire de la méthode présentée ici consiste à utiliser du transfert de gène hydrodynamique (HGT) pour stimuler des quantités circulantes élevées de Flt3L. Ceci fournit une approche rentable pour induire Flt3L in vivo, par rapport à l'injection de la protéine recombinante. De nombreuses études, y compris celles de notre laboratoire, ont utilisé HGT pour induire des quantités de cytokines dans une variété de conditions expérimentales 5,12,13.
La division du travail et les fonctions immunitaires précises pour les PED est d'un intérêt majeur en immunologie. En particulier, les pDC sont des médiateurs importants de la tolérance orale et systémique anti-viraleréponses, pourtant ils semblent également contribuer au développement et la persistance de l'auto-immunité et le cancer de 14 à 17. Le protocole décrit ici permettra les mécanismes de développement de régulation PP pDCs d'être étudiées plus en détail. En outre, cette approche peut permettre des études pour évaluer la fonction PP pDC, et peut être étendu à la compréhension de la régulation et la fonction des autres populations immunitaires dans les PP.
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Protocol
Approbation de l'établissement doit être obtenue au préalable pour toutes les manipulations expérimentales décrites ici sur des souris. Ceux-ci comprennent l'utilisation de souris C57BL6 pour l'isolement de cellules progénitrices de la moelle osseuse, IFNAR - / - souris en tant que destinataires pour le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques et l'utilisation de HGT surexpression de cytokines in vivo. Logement approprié et les soins des animaux doivent aussi être fournies par l'enquêteur ou de l'institution. En outre, l'approbation institutionnelle peut être nécessaire pour les plasmides utilisés dans le transfert de gène hydrodynamique (ie l'approbation de l'ADN recombinant). Les études décrites ici ont été approuvés par l'établissement de soins et d'utilisation des animaux Comité à l'UT MD Anderson Cancer Center.
Une. Hydrodynamique transfert de gènes (HGT)
Cette étape doit être effectuée deux jours avant le transfert adoptif de lecteurs de disques compacts pour induire une circulation de courant continu Flt3L pour l'expansion in vivo 5. Prepare au moins 5 destinataire souris / groupe.
- Pour atteindre efficace HGT, les vaisseaux sanguins du destinataire IFNAR - / - souris (CD45.2 +) doivent être dilatées en exposant les souris à une lampe chauffante pendant 5 à 10 min.
- Placez la souris dans un dispositif de butées et désinfecter sa queue avec 70% d'éthanol.
- Injecter 5 ug de plasmide codant pour Flt3L dans 2 ml de PBS stérile dans la veine de la queue en utilisant une aiguille 27 G. Pour la cohorte de contrôle, injecter 5 ug de vecteur vide (pORF) via la veine de la queue comme indiqué.
- Surveillance de la souris pendant 15-30 min pour s'assurer qu'il n'ya pas d'effets délétères de l'injection dans la veine caudale. Souris Retour à l'établissement de logements pour 2 jours.
2. Isolation des progéniteurs hématopoïétiques de moelle osseuse de souris
Cette étape doit être réalisée 2 jours après HGT. Utilisation CD45.1 + souris congéniques comme source de progéniteurs de la moelle osseuse pour le transfert adoptif dans destinataire IFNAR - /- les animaux (CD45.2 +). Dans ce protocole, les souches congéniques sont nécessaires pour distinguer les donateurs et pays en développement bénéficiaires dérivés, ainsi que d'éviter l'épuisement immunitaire due au CMH décalage. Environ 10-20 souris seront tenus de fournir un nombre suffisant de cellules souches hématopoïétiques (10 5 cellules / destinataire souris) pour les expériences de transfert.
- Euthanasier 10 congénique CD45.1 + souris par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale.
- Placez chaque carcasse sur un plateau de dissection et stériliser l'abdomen et les jambes avec 70% d'éthanol.
- Faire une incision au milieu de l'abdomen et couper à travers la peau de l'abdomen de chaque jambe, couper la peau sur toute la longueur de la jambe.
- Retirez délicatement la peau de chaque jambe, et couper et enlever les jambes de la carcasse à l'articulation de la hanche à l'aide des ciseaux pointus.
- Retirez délicatement les muscles du fémur et du tibia de chaque jambe à l'aide d'une lame tranchante.
- Supprimerles deux extrémités du fémur et du tibia avec un scalpel tranchant et placent les os dans une boîte de culture contenant du RPMI complet (RPMI avec 10% de sérum inactivé par la chaleur de veau fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine, du pyruvate de sodium 1 mM et 50 uM de β-mercaptoéthanol) .
- Préparer une seringue contenant 1 ml de RPMI complet, relié à une aiguille G 27.
- Insérer l'aiguille 27 G dans une extrémité du fémur ou du tibia. Rincer la moelle osseuse du fémur ou du tibia en injectant lentement le milieu RPMI complet dans l'os. Veiller à ce que les cellules de la moelle osseuse sont retirés de l'os, ce qui peut être accompli par la détection visuelle médias expulsés qui apparaît nuageux.
- Répétez le rinçage chaque fémur et le tibia 3x à éliminer complètement les cellules de la moelle osseuse.
- Préparer une suspension cellulaire unique par aspiration en douceur les cellules et en baisse de 3 à 5 fois dans la boîte de culture.
- Éliminer les débris passant par les cellules de moelle osseuse à travers un tamis de 40 uM de cellules, en plaçant les cellules dans un nouveau exsudé cultuAntenne e. Perturber un amas de cellules qui apparaissent sur le tamis par une légère pression avec le bout d'un piston de la seringue stérile.
- Les Lyse des globules rouges (RBC) présentes dans la suspension de cellules de la moelle osseuse totale avec un tampon de lyse RBC du commerce selon les instructions du fabricant. Utiliser 2 ml RBC lyse buffer/4-6 x 10 7 cellules (généralement des cellules provenant d'une souris) et un temps d'incubation de 5 min à température ambiante.
- Laver les cellules de la moelle osseuse par la granulation des cellules par centrifugation pendant 4 min à 500 x g, en aspirant doucement le milieu de culture, remise en suspension dans 10 ml de tampon FACS (PBS 1x + 2 mM d'EDTA + 1% de FBS), des cellules d'enrobage par centrifugation et doucement aspiration lavage tampon.
- Répéter le lavage, comme décrit dans l'étape 2.13, pour un total de deux lavages.
3. cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler CDP
Cette étape nécessite l'accès à un séparateur de cellules MidiMACS et colonnes MACS LD pour une procédure initiale négative de sélection,ainsi que d'une machine FACS avec au moins trois lasers à purifier le progéniteur sous-ensemble multicolore après coloration avec des anticorps conjugués par fluorescence.
- Après le second lavage à l'étape 2.14, compter les cellules de la moelle osseuse. Sédimenter les cellules par centrifugation comme décrit dans l'étape 2.13 et remettre en suspension dans du tampon FACS pour atteindre une concentration finale de 4 x 10 7 cellules par 30 pi de tampon FACS.
- Pour préparer les cellules pour FACS, les cellules de lignée négative sont d'abord enrichis par une technique de sélection négative qui élimine les cellules de lignée positive à partir du mélange de la moelle osseuse en utilisant une Chromatographie sur colonne de billes magnétiques. Pour la procédure de sélection négative, ajouter 1 pg de chacun des anticorps suivants de rat commercial anti-souris (ABS) qui reconnaissent des marqueurs de la lignée hématopoïétiques: CD3, CD19, CD11c, CD11b, et Ter-119 Abs. Les Abs doivent être ajoutées dans un volume de 2 pl / Ab à la suspension de cellules dans 30 ul de tampon FACS.
- Incuber la suspension de cellules à 4 ° C pendant 30min. Suite à l'incubation, laver les cellules deux fois avec 10 ml de tampon FACS, comme décrit à l'étape 2.13.
- Remettre en suspension les cellules pour obtenir une concentration finale de 4 x 10 7 cells/40 pi de tampon FACS. Ajouter 20 ul d'anticorps de chèvre anti-IgG de rat microbilles magnétiques par 40 ul de chaque suspension cellulaire. Mélanger doucement et incuber à 4 ° C pendant 30 min. Laver les cellules avec 10 ml de tampon FACS, comme décrit à l'étape 2.13.
- Remettre en suspension à 10 8 cellules de la moelle osseuse dans 500 ul de tampon FACS.
- Chargez une colonne MACS LD sur un séparateur de cellules MidiMACS selon les instructions du fabricant et prélavage de la colonne avec le tampon 2 ml FACS.
- Appliquer la suspension de cellules de moelle osseuse de la colonne, en chargeant jusqu'à 5 x 10 8 cellules dans 2,5 ml de tampon FACS. Assurer un tube de collecte (15 ml tube conique) est placé sous la colonne. Laver la colonne avec 3 x 2 ml de tampon FACS / cycle de lavage, et de recueillir les cellules qui passent à travers la colonne, qui sera enrichie encellules de la lignée négative. Compter les cellules dans le matériau élues (laver passage) de la colonne.
- Pour effectuer une sélection positive des sous-ensembles de progéniteurs hématopoïétiques par FACS, les cellules de tache avec la fluorescence Abs conjugué suivant: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, plus un mélange de lignée Abs marqueurs dirigés contre CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 et Ter119 (tous marqués avec PerCP Cy5.5). Utilisation de 0,5 à 1 ul de chaque Ab dans un volume total de 100 pl. Incuber la suspension de cellules à 4 ° C pendant 20 à 30 min.
- Laver les cellules comme indiqué à l'étape 2.13 et remettre en suspension dans un tampon FACS à une concentration de 2-3 x 10 7 cellules / ml. Filtrer cellules dans un tube de 35 uM de bouchon de crépine de cellule pour éliminer amas de cellules. Cette dernière étape est cruciale pour éviter le colmatage de la machine FACS.
- Placez la suspension de cellules dans un tube FACS sur la scène FACS et trier CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) sur labase du profil de marquage indiqué. Recueillir les cellules purifiées dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de RPMI complet.
- Notez le nombre absolu de cellules triées à la fin de la course FACS. Sédimenter les cellules par centrifugation comme indiqué à l'étape 2.13 et remettre en suspension dans du PBS stérile pour des expériences de transfert adoptif.
4. Le transfert adoptif de CDP
Cette étape est généralement effectuée dans l'animalerie où les souris receveuses sont logés. Selon l'emplacement de la machine FACS, il peut s'agir de transport des populations de cellules progénitrices purifiés dans l'installation pour animaux avant un transfert adoptif. suspensions de cellules souches doivent être conservés stérile et transportés sur de la glace.
- Préparer des suspensions de cellules pour l'injection par dilution de 5 à 10 CDPs purifiés dans un volume total de 100 ul de PBS stérile. Placer la suspension de cellules dans une seringue fixée à une aiguille G 27.
- Exposer le receveur IFNAR - / - +) pour une lampe chauffante pendant 5 à 10 min pour réaliser une injection efficace dans la veine caudale.
- Placez la souris dans un dispositif de butées et désinfecter sa queue avec 70% d'éthanol.
- Injecter 10 5 purifiées par FACS CDPs dans 100 ul de PBS dans la veine de la queue en utilisant une aiguille 27 G.
- Surveillance de la souris pendant 15-30 min pour s'assurer qu'il n'ya pas d'effets délétères de l'injection dans la veine caudale. Souris Retour à l'établissement de logements.
5. Isolation de PP et de mesure des pDC Montants
- À 7-10 jours suivants le transfert adoptif, euthanasier les souris receveuses. Ouvrez doucement la souris par la dissection et exposer l'intestin.
- Retirer tout l'intestin et le placer sur du papier absorbant PBS-imbibés. Collecter toutes les PP visibles le long de la paroi de l'intestin grêle à l'aide de pinces fines et des ciseaux. C57BL6 et IFNAR - / - souris ont typiquement 5-10 PP / souris, qui sont différentes de follicules lymphoïdes isolées trouvésle long de l'intestin grêle 18. Notez que les PP sont souvent structurellement distincts, même au sein d'un simple clic de souris, assurez-vous si soigneusement tous les PP sont identifiés et disséqués.
- Placez PP dans une boîte de Pétri contenant du PBS, et utiliser une pince pour enlever les matières fécales. Répétez cette procédure à deux reprises pour nettoyer PP.
- Digest PP avec 1 mg / ml de collagénase IV dans 10 ml de solution saline équilibrée de 1x Hank (HBSS) dans une fiole de 50 ml avec une agitation vigoureuse pendant 1 h à 37 ° C.
- Placez le PP digéré dans le compartiment supérieur d'une 40 um cellules tamis cellulaire et de la force par la crépine avec un piston de la seringue stérile. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube PP conique de 15 ml.
- Sédimenter les cellules PP tendues par centrifugation à 500 xg pendant 5 min et remis en suspension dans 6 ml d'une solution de Percoll à 37% (37% de Percoll dans du milieu RPMI). Placer délicatement 6 ml d'une solution de Percoll à 70% (70% de Percoll dans du milieu RPMI) en dessous de la suspension de cellules, pour former un gradient de Percoll étape.
- Centrifuger les cellules pendant 20 minutes unet 800 xg avec la centrifugeuse rompre. Les cellules mononucléaires vont migrer vers l'interface 37/70% d'. Après centrifugation, la population de cellules mononucléaires devraient être collectées par pipetage soigneux à la région d'interface. Pellet les cellules recueillies par centrifugation et lavage à deux reprises dans 50 ml de RPMI complet / cycle de lavage. Un grand volume est utilisé pour assurer une élimination complète de Percoll.
- Colorer les cellules PP recueillies avec les anticorps suivants pour détecter les pDC murines qui dérivent des progéniteurs adoptive transférés (CD45.1 +) ou des souris receveuses (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) et PDCA-1 (FITC) Abs. Effectuer cytométrie en flux des cellules PP comme indiqué dans les étapes 3.9 et 3.10. Identifier les pDC par leur CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + phénotype. Nombres absolus pDC peuvent être déterminées par l'équation suivante:% pDCs x ànombre de cellules tal PP = PP pDC.
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Representative Results
Nos résultats démontrent la stratégie de déclenchement pour l'isolement des lecteurs de disques compacts à partir de cellules de moelle osseuse de souris (Figure 1), tel que décrit dans les protocoles 2 et 3. CDPs représentent environ 0,1% des cellules totales de la moelle osseuse, et environ 6.4 x 10 4 CDPs peuvent être isolés à partir de l'une souris. Lors du transfert adoptif, lecteurs de disques compacts se différencient en pDC et CDC 10.
Figure 1. Stratégie gate pour FACS purification des PDC. Cellules de moelle osseuse ont été collectées à partir de souris C57BL6. cellules de la lignée positive ont été épuisées avec Abs contre des marqueurs de la lignée (CD3, CD19, CD11b, CD11c, Ter119) à l'aide de microbilles MACS sélection médiation. La population de la moelle osseuse lignée négatif enrichi a été coloré avec marquage fluorescent Abs pour CDP et la lignée des marqueurs, et purifié par FACS comme indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour identifier les pDC en PP, nous utilisons une première en avant et stratégie de déclenchement de la diffusion latérale, suivie par gating pour CD11c + Siglec-H + cellules (Figures 2A et 2B) IFNAR -. / - Souris ont une réduction significative dans les pDC en PP par rapport à souris de type sauvage (Figure 2B) 5. En revanche, CD11c + Siglec-H - CDC se trouvent à des quantités similaires dans les deux génotypes (figure 2B). Ainsi, IFNAR - / - souris fournissent l'occasion d'examiner PP pDC reconstitution sans effets de l'irradiation létale 5. Par exemple, le transfert adoptif de lecteurs de disques compacts de type sauvage dans IFNAR - / - souris, comme décrit dans l'étape 4, stimule une augmentation de la PP pDC (figure 2B). En outre, un prétraitement avec Flt3L HGT (étape 1) la poursuite de l'expansion de pDC améliorée en PP (figure 2B), ce qui implique CDP transférés et possibilité endogènes Flt3 + progéniteurs répondre à Flt3L en induisant pDCs PP. Les deux conditions ont également stimulé CD11c + Siglec-H - CDC s'élève, conformément à l'origine du développement de CDC 6. pDC en PP expriment des marqueurs pDC traditionnels, y compris PDCA-1, Siglec-H et B220, et manquent CD11b (figures 2B-D) 4,5. En outre, l'analyse de PP à partir de IFNAR - / - souris qui ont reçu à la fois Flt3L HGT et transférés PDC ont montré que la majorité (environ 70%) des pDC ont été dérivées de donneur (CD45.1 +) chez la souris (figure 2E). Collectivement, ces données démontrent que le transfert adoptif de CDP induit la population PP pDC en réponse à des signaux Flt3L médiées in vivo.
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. Figure 2 Analyse des PP pDC dans IFNAR - / - souris sur Flt3L HGT et transfert adoptif de CDP IFNAR -. / - Souris ont été injectés par voie intraveineuse avec 5 ug de plasmide codant Flt3L ou un vecteur vide (pORF) par HGT. Deux jours plus tard, 10 5 PDC FACS purifié ont été transférés adoptive par injection dans la veine caudale. Sept jours après le transfert CDP, PP ont été recueillis et analysés pour des montants PDC (A, B). CD11c + Siglec-H + pDC chez les souris qui ont reçu PDC + Flt3L HGT ont en outre été analysés pour PDCA-1, B220 (C), CD11b (D), CD45.1 et CD45.2 (E) expression. Le profil d'expression de PDCA-1, B220 et CD11b a été similaire dans les pDC dans les 3 groupes (donnéesnon représenté). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La technique du transfert adoptif décrit ici a évalué la contribution de la population de CDP PP pDC dans des souris receveuses qui sont déficientes en PP pDC (par exemple IFNAR - / - souris). Dans les expériences à venir, il sera important d'évaluer le potentiel d'autres sous-ensembles de souches à générer pDCs PP, en particulier si les pDC PP proviennent de Flt3 + PLC. Cette question est importante, car on ne sait pas pourquoi pDCs PP sont particulièrement sensibles aux signaux IFNAR-STAT 1 pour PP exercice 5, et si pDCs PP suivent des indices de développement similaires à celles pDC dans d'autres organes.
En théorie, cette méthode peut également être réalisée chez les souris qui n'ont pas de populations pDC dans tous les organes. Par exemple, les souris présentant un déficit en facteur de transcription E2-2, le «régulateur maître" PDC (c.-à-Tcf4 souris - / -), spectacle frappant pDC épuisement 19. Cependant, Tcf4 - / - microe sont embryonnaire létal, et donc Tcf4 - / - souris chimérique de moelle osseuse devrait être utilisés comme receveurs pour des expériences de transfert adoptif. Cependant, il ne sait pas si les pDC PP sont sensibles à l'irradiation et seraient effectivement épuisés dans TCF4 - / - chimères. En outre, l'irradiation mortelle a des effets de large sur le système hématopoïétique et le soutien des populations stromales qui pourraient influer PP pDC reconstitution. Ainsi, l'utilisation de IFNAR - / - souris en tant que bénéficiaires d'évaluer la capacité des adoptive sous-ensembles de souches transférés à générer pDCs PP pourrait être préféré à Tcf4 - / -. chimères Stat1 - / - souris montrent également une diminution frappante dans les pDC PP et pourraient être utilisés comme receveurs pour des études de transfert adoptif à origines développementales étude PP pDC 5. Une mise en garde à l'utilisation de IFNAR - / - ou Stat1 - / - souris est leur statut immunodéprimé, la WHIch pourraient avoir une incidence PP pDC reconstitution ou de la fonction dans des voies inconnues. Ainsi, les approches indépendantes pour évaluer origines développementales PP pDC renforcerait la confiance dans l'interprétation des données.
Techniquement, il est à noter que la population CDP se trouve à une fréquence très faible dans la moelle osseuse totale, donc la déplétion des cellules positives au marqueur lignée par Chromatographie sur colonne de talon à médiation magnétique avant le FACS est important pour une purification efficace des cellules progénitrices par FACS. Cette étape de l'épuisement enrichit les cellules de la lignée négative, ce qui réduit le temps de FACS (et le coût) pour la purification de l'ancêtre. La procédure décrite ici appauvrissant utilise un mélange d'anticorps spécifiques de la lignée qui est combinée pour chaque expérience. Cocktails d'anticorps de lignée commerciaux sont également disponibles et peuvent être utilisés pour l'élimination des cellules de la lignée positive, à la place du mélange que nous allons décrire. L'avantage de l'approche décrite est sa flexibilité en étant adaptable pour difrentes fins de déplétion, en ajustant les anticorps qui sont présents dans le mélange.
Dans la préparation des suspensions de cellules isolées à partir de PP, il est important d'éliminer autant du tissu intestinal entourant le PP que possible. Ceci peut être accompli par une dissection minutieuse de la PP. Digestion suffisante de PP avec de la collagénase est une étape clé pour libérer leucocytes du tissu intestinal. La technique de centrifugation en gradient de densité Percoll décrit est un procédé préféré pour enrichir des leucocytes à partir des échantillons digérés PP. En outre, il est important de noter que la protéine marqueur pDC PDCA-1 peut être régulée par IFN de type I et d'autres stimuli 20. Par conséquent, Siglec-H est préféré en tant que marqueur de pDC pour les études impliquant la manipulation de cytokine.
L'utilisation de HGT a un net avantage en termes d'être très rentable. Bien que Flt3L HGT a été utilisé dans cette étude, la capacité d'autres cytokines ou facteurs solubles à regpDC uler PP peuvent être testés en utilisant HGT, en l'absence ou en présence d'un transfert adoptif de cellules de progéniteurs hématopoïétiques. Cependant, HGT en résulte une production soutenue de cytokines par les plasmide transférées par rapport aux augmentations observées plus transitoire lors de l'injection de la cytokine recombinante, qui dépendent de cytokine demi-vie 5,13. L'élévation prolongée de cytokines circulation peut ne pas refléter quantités physiologiques obtenus lors des interventions d'urgence hématopoïétiques ou infection. Cette mise en garde doit être gardé à l'esprit au cours des étapes de planification expérimentales et l'évaluation des données.
À l'avenir, la manipulation sélective de la population PP pDC, tel que décrit ici, peut aider à la fonction adressage PP pDC. PDC PP sont conditionnés par des médiateurs présents dans l'environnement de la muqueuse et sont déficientes dans la production d'IFN de type I à 4,5 TLR d'activation. Analyse des pDC PP reconstituées dans Stat1 - / - souris a démontré les CElls ont une faible capacité comparable à induire IFN de type I sur TLR9 déclenchement par rapport à pDCs PP découlant naturellement (non représenté), indiquant pDCs PP provenant de CDP transférés conserver au moins cette propriété de naturel PP pDC. Le type I réduite la production d'IFN de PP pDCs contraste avec le type solide je IFN sécrétion d'autres populations PDC et pose une question concernant le rôle fonctionnel de la PP pDC. Par ailleurs, les pDC PP ressemblent pDC qui se développent en présence d'IFN de type I, une population de pDC démontre que la stimulation efficace de l'IL-17 produisant des lymphocytes T CD4 + (cellules Th17) 5. Alors que les cellules Th17 sont largement considérés comme une population inflammatoire induisant, ils ont deux rôles de protection et de pathogènes dans l'intestin 21. Par ailleurs, les pDC ont été signalés à la médiation de tolérance systémique administré par voie orale antigène 15. Le rôle des pDC PP dans l'immunité locale et systémique est d'un grand intérêt, que la compréhension de ce point ne peut révélerw approches de manipulation des réponses immunitaires et inflammatoires de l'intestin dans la thérapie de la maladie.
En conclusion, le procédé présenté ici permet d'évaluer le potentiel du développement de sous-ensembles de progéniteurs hématopoïétiques pour générer PP pDC. Cette procédure prévoit souris avec pDCs PP reconstituées. Ainsi, cette approche peut être utilisée non seulement pour évaluer origines hématopoïétiques PP pDC mais aussi pour la compréhension de la contribution des pDC PP pour les fonctions immunitaires dans le milieu intestinal.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs. Alex Gelbard et Willem Overwijk pour obtenir des conseils sur le transfert de gène hydrodynamique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (AI098099, SSW), le Centre MD Anderson Cancer de l'épigénétique, le Centre MD Anderson pour l'inflammation et le cancer (SSW), et le Fonds RE Bob Smith éducation (HSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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