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Biology

4D confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग Zebrafish में Craniofacial Morphogenesis का विश्लेषण करना

Published: January 30, 2014 doi: 10.3791/51190
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute for Cell and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

समय चूक confocal इमेजिंग भ्रूण के विकास के लिए निस्र्पक उपयोगी एक शक्तिशाली तकनीक है. यहाँ, हम पद्धति का वर्णन और craniofacial जंगली प्रकार में morphogenesis, साथ ही pdgfra, smad5, और एसएमओ उत्परिवर्ती भ्रूण की विशेषताएँ.

Abstract

समय चूक इमेजिंग morphogenesis की प्रक्रिया का प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है एक तकनीक, या आकार की पीढ़ी है. कारण उनके ऑप्टिकल स्पष्टता और आनुवंशिक हेरफेर करने ज़िम्मा करने के लिए, zebrafish भ्रूण रहने वाले भ्रूण में morphogenesis का समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण करने के लिए जो के साथ एक लोकप्रिय मॉडल जीव बन गया है. एक जीवित zebrafish भ्रूण के confocal इमेजिंग ब्याज की एक ऊतक लगातार इस तरह के एक transgene या इंजेक्शन डाई के रूप में, एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल किया जाना जरूरी है. प्रक्रिया भ्रूण anesthetized और स्वस्थ विकास सामान्य रूप से आगे बढ़ती है कि इस तरह से जगह में आयोजित किया जाता है कि मांग. इमेजिंग के लिए पैरामीटर तीन आयामी विकास के लिए खाते में और विकास के त्वरित फोटो हो रही है जबकि व्यक्ति की कोशिकाओं को हल करने की मांगों को संतुलित करने के लिए सेट किया जाना चाहिए. हमारे परिणाम प्रतिदीप्ति लेबल zebrafish भ्रूण के vivo इमेजिंग में लंबे समय तक प्रदर्शन करने के लिए और में विभिन्न ऊतकों व्यवहार का पता लगाने के लिए क्षमता का प्रदर्शनcraniofacial असामान्यताओं का कारण है कि कपाल तंत्रिका शिखा. संज्ञाहरण और बढ़ते की वजह से विकास की देरी कम कर रहे हैं, और भ्रूण प्रक्रिया से नुकसान कर रहे हैं. समय चूक imaged भ्रूण विकास में बाद में बिंदुओं पर तरल माध्यम में लौट आए और बाद में imaged या तय किया जा सकता है. ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों और अच्छी तरह से विशेषता भाग्य मानचित्रण और प्रत्यारोपण तकनीक, इमेजिंग के एक बढ़ती हुई बहुतायत के साथ किसी भी वांछित ऊतक संभव है. जैसे, vivo इमेजिंग में समय व्यतीत उत्परिवर्ती और microinjected भ्रूण का विश्लेषण सहित zebrafish आनुवंशिक तरीकों, साथ शक्तिशाली जोड़ती है.

Introduction

Craniofacial morphogenesis अनेक प्रकार की कोशिकाओं के बीच समन्वय बातचीत की आवश्यकता है कि एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है. craniofacial कंकाल की बहुमत तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से ली गई है, जिनमें से कई ग्रसनी मेहराब 1 बुलाया क्षणिक संरचनाओं में पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से विस्थापित करना होगा. कई ऊतकों के रूप में, craniofacial कंकाल की morphogenesis विशिष्ट विकासात्मक समय बिंदुओं पर भ्रूण की स्थिर छवियों से समझा जा सकता है की तुलना में अधिक जटिल है. यह समय लेने वाली प्रदर्शन करने के लिए है, vivo में समय व्यतीत हो माइक्रोस्कोपी एक विकासशील भ्रूण की कोशिकाओं और ऊतकों को निरंतर रूप देता है. एक समय चूक श्रृंखला में प्रत्येक छवि दूसरों के लिए संदर्भ बख्शी, और एक घटना होती है क्यों deducing के बजाय उस समय क्या हो रहा है deducing की ओर एक अन्वेषक चाल में मदद करता है.

Vivo इमेजिंग में इस प्रकार के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए एक शक्तिशाली वर्णनात्मक उपकरण हैmorphogenesis गाइड कि रास्ते deconstruct. zebrafish Danio rerio हड्डीवाला भ्रूण के विकास की एक लोकप्रिय आनुवंशिक मॉडल है, और विशेष रूप से अच्छी तरह से morphogenesis के vivo इमेजिंग के लिए अनुकूल है. आधुनिक, transgenesis और जीनोमिक संशोधन के लिए सुविधाजनक तरीके तेजी से zebrafish शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध उपकरणों की संख्या बढ़ रहे हैं. ये उपकरण आनुवंशिक हेरफेर और माइक्रोस्कोपी के लिए पहले से ही मजबूत तरीकों में वृद्धि. लगभग किसी भी वांछित आनुवंशिक संदर्भ में लगभग किसी भी ऊतक के vivo इमेजिंग कल्पना से वास्तविकता के करीब है.

ग्रसनी मेहराब के morphogenetic आंदोलनों तंत्रिका शिखा और आसन्न epithelia, बाहरी झिल्ली दोनों और अन्तर्जनस्तर के बीच बातचीत के संकेत द्वारा निर्देशित कर रहे हैं. Craniofacial कंकाल तत्वों के morphogenesis ड्राइव करने के लिए आवश्यक हैं कि epithelia द्वारा व्यक्त कई संकेतन अणुओं कर रहे हैं. इन संकेतन अणुओं के बीच, ध्वनि का हाथी (श्श्श) गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है चया craniofacial विकास 2-8. श्श्श मौखिक बाहरी झिल्ली और ग्रसनी अन्तर्जनस्तर 2,6,9,10 दोनों द्वारा व्यक्त की है. अन्तर्जनस्तर में श्श्श की अभिव्यक्ति मेहराब 10, मेहराब 10 भीतर तंत्रिका शिखा की patterning, और craniofacial कंकाल 11 की वृद्धि की morphogenetic आंदोलनों को नियंत्रित करता है.

बीएमपी संकेतन भी craniofacial विकास के लिए 12 गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है और ग्रसनी मेहराब के morphogenesis बदल सकता है. बीएमपी संकेतन ग्रसनी मेहराब 13,14 भीतर शिखा के पृष्ठीय / वेंट्रल patterning को नियंत्रित करता है. Zebrafish में smad5 के विघटन गंभीर तालु दोष और midline 15 पर उचित फ्यूज करने मेकेल उपास्थि की विफलता का कारण बनता है. इसके अलावा, म्यूटेंट भी एन डी 2, 3, और midline 15 पर जुड़े हुए कभी कभी 4 वें ग्रसनी कट्टर तत्वों के साथ उदर उपास्थि तत्वों में कटौती और फ्यूजन, प्रदर्शित. इन fusions जोरदार Bmp संकेतन इन ग्रसनी तत्वों के morphogenesis कि निर्देशन का सुझाव.

PDGF संकेतन craniofacial विकास के लिए आवश्यक है, लेकिन ग्रसनी मेहराब morphogenesis में अज्ञात भूमिका है. माउस और zebrafish Pdgfra म्यूटेंट दोनों गहरा midfacial clefting 16-18 है. कम से कम zebrafish में इस midfacial clefting उचित तंत्रिका शिखा सेल प्रवास 16 की विफलता की वजह से है. तंत्रिका शिखा कोशिकाओं वे ग्रसनी मेहराब दर्ज करने के बाद pdgfra व्यक्त करने के लिए जारी है. इसके अतिरिक्त, PDGF ligands के चेहरे epithelia द्वारा व्यक्त कर रहे हैं और ग्रसनी मेहराब 16,19,20 के भीतर, इस प्रकार PDGF संकेतन भी माइग्रेशन निम्नलिखित ग्रसनी मेहराब के morphogenesis में एक भूमिका निभा सकता है. हालांकि, pdgfra म्यूटेंट में ग्रसनी मेहराब प्रदर्शन किया नहीं किया गया है की morphogenesis का विश्लेषण करती है.

यहाँ, हम pharyngul के vivo confocal माइक्रोस्कोपी में प्रदर्शितएक चरण ट्रांसजेनिक zebrafish और इस अवधि के भीतर ग्रसनी मेहराब के morphogenesis का वर्णन. हम आगे BMP, PDGF, और श्श्श संकेत दे रास्ते को बाधित कि परिवर्तन से प्रभावित कर रहे हैं कि ऊतक व्यवहार प्रदर्शित करता है.

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Protocol

1. पशुपालन और उत्परिवर्ती alleles

  1. 21 के रूप में वर्णित zebrafish उठाएँ और नस्ल.
  2. इस अध्ययन में इस्तेमाल Zebrafish उत्परिवर्ती alleles, 16 b1059 smad5 b1100 22, और एसएमओ b577 23 pdgfra थे. इन zebrafish उपभेदों के लिए सूत्रों का कहना है Zirc शामिल हैं.

2. समाधान और लागू की तैयारी

नोट: सभी समाधान और लागू अग्रिम में किया और भविष्य में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है.

  1. पहले 21 में वर्णित के रूप में भ्रूण मीडिया (ईएम) बनाते हैं.
  2. 4 जी / एल एम एस-222 (Tricaine) बनाते हैं. 450 मिलीलीटर बाँझ पानी में 4 जी disodium फॉस्फेट (ना 2 4 HPO) भंग. समाधान के लिए 2 जी एम एस-222 जोड़ें. 7.0-7.2 भीतर पीएच को समायोजित करें. 500 मिलीलीटर की कुल मात्रा को बाँझ पानी जोड़ें.
  3. वैकल्पिक: 4 जी / एल लौंग के तेल बनाओ. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 0.2 ग्राम शुद्ध लौंग के तेल वजन. 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए उन्हें जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  4. 3% methylcellulo बनाओएसई. एक फोड़ा करने के लिए उन्हें + 0.1 एम HEPES की 50 मिलीलीटर लाओ. गर्मी से निकालें. समाधान सजातीय है जब तक 1.5 ग्राम methylcellulose में हलचल. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  5. 0.2% agarose बनाओ. 50 मिलीलीटर उन्हें करने के लिए 0.1 ग्राम agarose जोड़ें. माइक्रोवेव में या एक hotplate पर एक फोड़ा करने के लिए उन्हें ले आओ और agarose भंग कर दिया है सत्यापित. 4 डिग्री सेल्सियस पर microcentrifuge ट्यूब और दुकान में 500 μl संस्करणों में विभाज्य नोट: जरूरत के रूप में वॉल्यूम समायोजित किया जा सकता है.
  6. केशिका pokers बनाओ. एक 0.9 मिमी आईडी केशिका ट्यूब के अंदर सुपर गोंद की एक बूंद रखें. लाइन के लगभग 3-4 मिमी ट्यूब के अंत से परे फैली हुई है कि इस तरह के केशिका ट्यूब के अंदर 6 £ परीक्षण monofilament मछली पकड़ने लाइन का एक 4-5 सेमी लंबाई डालें.
  7. नमूने के अनुसार दो पाटने coverslips बनाओ. बीच मुक्त छोड़ने के एक 24 x 60-1 कवर कांच के प्रत्येक के अंत पर सुपर गोंद 22 x 22-1 कवर गिलास. पुराने एक दिन से भी कम भ्रूण के लिए एकल (अंत प्रति 1 छोटा गिलास को कवर) बनाओ, 1-4 डी भ्रूण के लिए (अंत प्रति एक दूसरे के ऊपर 2 छोटे कवर चश्मा) डबल्सभ्रूण पांच दिन या पुराने के लिए पुराने ays, या ट्रिपल (अंत प्रति एक दूसरे के ऊपर पर 3 छोटे कवर चश्मा).
  8. उच्च वैक्यूम तेल के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें. नोट: वैक्यूम तेल समय की लंबी अवधि में नमूनों की निर्जलीकरण को रोकने के लिए एक सीलेंट के रूप में कार्य करता है, और अधिक अस्थिर सीलंट की तुलना में विषाक्तता के लिए कम क्षमता है.

3. Confocal माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते Zebrafish भ्रूण (1 चित्र देखें)

  1. संवेदनाहारी मध्यम तैयार. पूरी तरह से तरल तक के 20 सेकंड के अंतराल में microwaving द्वारा 0.2% agarose के एक विभाज्य पिघला. 0.2% agarose के 195 μl में 0.2% agarose या 4 जी / एल लौंग के तेल की 5 μl के 192 μl में एमएस-222 के 8 μl मिलाएं. एक 42 डिग्री सेल्सियस ताप ब्लॉक में बनाए रखें. नोट: एमएस-222 के लिए लंबे समय प्रदर्शन भ्रूण zebrafish 24 में करता लौंग के तेल की तुलना में मजबूत विकास की देरी का कारण बनता है.
  2. यदि आवश्यक हो: मैन्युअल unhatched ट्रांसजेनिक भ्रूण सिर्फ विश्लेषण करने से पहले विश्लेषण किया जा dechorionate. संदंश का प्रयोग, धीरे धीरे तेभ्रूण मुक्त कर दिया है जब तक खुला जरायु गिरफ्तारी.
  3. Zebrafish भ्रूण anesthetize. एमएस-222 भ्रूण मीडिया की मिलीलीटर 24 तक की एक 4 जी / एल शेयर के 1 मिलीलीटर जोड़ें. वैकल्पिक रूप से, मछली पानी 24 से 24 मिलीलीटर तक 4 जी / एल लौंग के तेल की 390 μl जोड़ें. नोट: लौंग के तेल में कार्य करता है धीरे धीरे इतना समय व्यतीत हो माइक्रोस्कोपी से पहले कम से कम 15-20 मिनट के इस कदम प्रदर्शन.
  4. एक ऊपर की ओर का सामना करना पड़ पाटने coverslip के केंद्र स्थान के आसपास वैक्यूम तेल की एक मनका रखें. धीरे धीरे करने के लिए और पुलों और coverslip के किनारे के अंदर आसन्न है कि एक चिकनी, सतत मनका बनाना, सिरिंज से बाहर वैक्यूम तेल धक्का.
  5. एक लकड़ी के applicator का उपयोग पाटने coverslip के बीच में 4% methylcellulose के एक चक्र बिखरा हुआ है.
  6. Imaged किया जा भ्रूण स्थानांतरण. भ्रूण anesthetized है जब एक गिलास पिपेट में इसे खींचना. भ्रूण पिपेट में तरल के नीचे सिंक करने के लिए अनुमति देने के लिए खड़ी पिपेट पकड़ो. Agarose समाधान में पिपेट ले जाएँ और भ्रूण ड्रॉप करने की अनुमतिagarose में. तरल निष्कासित न करें.
  7. नमूना रखें. पिपेट में कुछ agarose समाधान और भ्रूण ड्रा. Methylcellulose के शीर्ष पर agarose समाधान की एक बूंद में भ्रूण निष्कासित. Methylcellulose पर नीचे भ्रूण धक्का और इमेजिंग के लिए वांछित के रूप में भ्रूण उन्मुख करने के लिए एक केशिका पोकर का प्रयोग करें.
  8. नमूना सील.
    1. नीचे का सामना करना पड़, घुड़सवार एक के ऊपर एक पाटने coverslip जगह. पुलों दोनों coverslips के लिए सीधे संपर्क और agarose ड्रॉप जवानों जब तक शोर coverslips के दोनों पक्षों के लिए भी दबाव लागू करें. भ्रूण को ठीक से उन्मुख है सत्यापित करें.
    2. वैक्यूम तेल मनका में दरारें और अंतराल को सुचारू करने के गिलास के साथ एक लकड़ी applicator रगड़ें. किनारों से अतिरिक्त तेल पोंछ.

4. ट्रांसजेनिक Zebrafish भ्रूण के समय चूक confocal इमेजिंग

(इस प्रोटोकॉल एक Zeiss LSM 710 confocal खुर्दबीन हमारे लिए अनुकूलित किया गया हैज़ेन इमेजिंग सॉफ्टवेयर आईएनजी, और अन्य प्रणालियों के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है.)

  1. उपकरण को सक्रिय करें. Confocal खुर्दबीन और किसी भी बाहरी लेजर उपकरणों पर मुड़ें. Confocal खुर्दबीन से जुड़ा कंप्यूटर पर मुड़ें. ओपन confocal इमेजिंग सॉफ्टवेयर और छवि अधिग्रहण नियंत्रण को सक्रिय करने के लिए "प्रारंभ सिस्टम" का चयन करें.
  2. गरम मंच तैयार करें. Confocal खुर्दबीन के मंचन मंच लोअर और स्थिति से बाहर उद्देश्य लेंस चाल है. एक इलेक्ट्रॉनिक गर्म मंच के साथ डिफ़ॉल्ट चरण बदलें. गरम चरण के लिए नियंत्रक पर मुड़ें और 29.5 डिग्री सेल्सियस के तापमान सेट
  3. देखने के क्षेत्र में नमूना स्थिति. मंच पर घुड़सवार नमूना रखें. स्थिति में 20X उद्देश्य लेंस ले जाएँ और मचान मंच बढ़ा. दृश्य प्रकाश emitter सक्रिय और eyepieces के माध्यम से देखो. देखने के क्षेत्र में भ्रूण के सिर का केंद्र.
  4. प्रयोग सेटिंग निर्धारित करें.
    1. चयन करके प्रतिदीप्ति चैनलों को सक्रिय करेंऔर पता लगाया जा करने के लिए फ्लोरोसेंट तरंगदैर्ध्य हर चैनल के लिए रंग देखने सारणी (lut) का चयन करें. यदि आवश्यक हो, अपेक्षित लेजर (आरएफपी के लिए जैसे 561 एनएम) को चालू करने के लिए सॉफ्टवेयर में मैनुअल नियंत्रण का उपयोग करें. प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए, 10.0 लेजर तीव्रता और 600-700 के बीच photomultiplier वोल्टेज (एचवी या लाभ) की स्थापना की. 4 के लिए औसत और 16 बिट के लिए बिट गहराई सेट करें.
    2. Z-ढेर और समय श्रृंखला मॉड्यूल सक्रिय करें. एक 5 माइक्रोन या छोटे जेड संकल्प के लिए पिनहोल सेट, और सुझाव इष्टतम दूरी को जेड अंतराल सेट.
      नोट: आम तौर पर, 5 माइक्रोन जेड संकल्प प्रत्येक Z-ढेर छवि के लिए जल्दी से पर्याप्त एकत्र होने के लिए अनुमति देता है एक भी व्यक्ति की कोशिकाओं को हल करते हुए एक विशेष समय बिंदु पर भ्रूण की "स्नैपशॉट". औसतन कम भी छवि प्रति समय की राशि कम कर देता है.
    3. छवियों के बीच वांछित समय अंतराल (आमतौर पर 10-20 मिनट) और प्रयोग की कुल लंबाई निर्धारित करें.
  5. स्थितीय सेटजानकारी.
    1. लाइव मोड में कैमरे की बारी. फोकस समायोजित करें और यदि आवश्यक हो तो प्रतिदीप्ति देखने के लिए लेजर तीव्रता में वृद्धि. अगर वांछित, एक व्यापक दृष्टि के लिए 0.6 के लिए डिजिटल ज़ूम सेट करें.
    2. ब्याज की सभी संरचनाओं दिखाई दे रहे हैं कि इस तरह की स्थिति चरण और पूर्व से परिणाम पृष्ठीय और के लिए देखने के क्षेत्र में जगह नहीं है. प्रतिदीप्ति की ऊपरी और निचली सीमाओं को भ्रूण के माध्यम से ध्यान दें. पहली और आखिरी Z-ढेर टुकड़ा पदों इन सीमाओं से परे कम से कम 100 मीटर या अधिक सेट करें.
  6. प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुकूलन.
    1. सूचक लेकर प्रदर्शन lut के सेट करें. फ्लोरोसेंट संरचनाओं अब सफेद दिखाई देनी चाहिए, और देखने के क्षेत्र के बाकी (कोई पहचान) नीला या काला होना चाहिए.
    2. बस संतृप्त जहां नीचे एक स्तर तक एचवी / लाभ में वृद्धि (लाल) पिक्सल दिखाई देते हैं. यदि आवश्यक हो, तो पृष्ठभूमि के बहुमत (नीला) का पता नहीं है ऑफसेट समायोजित करें. नोट: छोटे pinhole व्यास और वृद्धि लेजर तीव्रता छवि डेफ में सुधार दोनोंInition, लेकिन लेजर तीव्रता जीवित ऊतकों की रक्षा करने के लिए कम रखा जाना चाहिए. बढ़ी हुई एचवी / लाभ और पिनहोल व्यास (<5 माइक्रोन) आम तौर पर वृद्धि हुई लेजर तीव्रता को बेहतर कर रहे हैं.
    3. पर्याप्त चौड़ा करने के लिए 4 सेट औसतन, एक समय पर फैशन में छवियों को इकट्ठा करने के लिए पिनहोल व्यास रखें. जेड अंतराल हमेशा पिनहोल व्यास के लिए सुझाव दिया इष्टतम दूरी पर सेट किया जाना चाहिए. विभिन्न सेटिंग्स के साथ कम स्कैन (औसत = 1) करें, और इच्छा के संकल्प को प्राप्त होता है कि कम से कम लेजर तीव्रता का उपयोग करें.
  7. समय के वांछित लंबाई के लिए प्रयोग चलाएँ. बाद में, गर्म मंच से भ्रूण को हटा दें और धीरे धीरे coverslips अलग. एक 30 मिमी पेट्री डिश में ईएम में coverslip और भ्रूण डूब. एक गिलास पिपेट का उपयोग धीरे coverslip के बंद भ्रूण धोने और पेट्री डिश से coverslip हटा दें. विकसित करने के लिए जारी रखने के लिए एक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण रखें.
  8. विकास से तुलना कर लें. प्रयोग के अंत में, व्यक्तिगत Zs लेइसी प्रयोग की शुरुआत में नमूना का मंचन किया, लेकिन थे कि agarose घुड़सवार भाई भ्रूण की कील छवियों 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ईएम में उठाए गए थे.
  9. जरूरत के रूप में, ग्रसनी मेहराब उपाय. माप कुछ confocal सॉफ्टवेयर सूट में किया जा सकता है. यहां पाया माप व्यक्तिगत तख्ते की. एल एस एम फ़ाइलें आयात और जेड पेश Fiji25 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया.

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Representative Results

एक व्याख्यान चबूतरे वाला दिशा (1 मूवी) में बढ़ रहा है, जबकि जंगली प्रकार के भ्रूण में, तंत्रिका शिखा आबादी निम्नलिखित, ग्रसनी मेहराब पूर्वकाल / पीछे और पृष्ठीय / वेंट्रल axes साथ बढ़ाना. 30 घंटे के बाद निषेचन (HPF) में पहली ग्रसनी मेहराब के पूर्वकाल / पीछे लंबाई 1.8-1.9 गुना पृष्ठीय / वेंट्रल ऊंचाई के बीच है. पृष्ठीय / वेंट्रल बढ़ाव तेजी से 36.5 HPF तक पूर्वकाल / पीछे विस्तार से तेजी से आगे बढ़ती है. यहाँ से, पृष्ठीय / वेंट्रल ऊंचाई पठार के चारों ओर 104 मीटर 48 HPF के माध्यम से. पूर्वकाल / पीछे विस्तार समग्र पूर्वकाल / पीछे लंबाई 48 HPF में 1.95 गुना पृष्ठीय / वेंट्रल ऊँचाई HPF 36.5 में 1.5 गुना पृष्ठीय / वेंट्रल ऊंचाई के नीचे से बढ़ रही है, के साथ 48 HPF के माध्यम से जारी है.

इसके पूर्वकाल अंत में, पहले ग्रसनी मेहराब दाढ़ की हड्डी (पृष्ठीय) और जबड़े मौखिक बाहरी झिल्ली द्वारा अलग (उदर) डोमेन रूपों. पहले ग्रसनी चाप की दाढ़ डोमेन च मापा जाता हैमौखिक बाहरी झिल्ली के पीछे सुप्रीम इसके बाहर का टिप रोम. यह 30-48 HPF के बीच 4.6 माइक्रोन / घंटा (नि. 2 = 0.9374) में रेखीय प्रतिगमन द्वारा approximated दर से बढ़ता है और 48 HPF (1 मूवी) में लगभग 104 मीटर लंबा है.

ग्रसनी मेहराब 3-7 ग्रसनी अन्तर्जनस्तर 26 के माध्यम से तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की एक जन के विभाजन से सभी फार्म. 30-38 HPF के बीच, ग्रसनी मेहराब वें से 7 तक 5 वें 3 और 4 वें मेहराब पहले ही अलग हो रहा है, जन से अलग. 37 HPF के आसपास, 3 ग्रसनी मेहराब 2 एन डी आर्क को medially स्थानांतरित करने के लिए शुरू होता है. Laterally, 7 वें ग्रसनी मेहराब 2 और 7 वें मेहराब (1 मूवी) को 6 वें मेहराब औसत दर्जे के माध्यम से 3 छोड़ने, 48 HPF द्वारा व्याख्यान चबूतरे वाला आंदोलन में 5 वीं और 6 वीं मेहराब overtakes.

यह महत्वपूर्ण है टीओ कन्वेंशन HPF में आकृति विज्ञान का वर्णन करने के लिए है, हालांकि, माइक्रोस्कोपी थोड़ा एक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उगाई इसी मंचन भ्रूण की तुलना में zebrafish विकास देरी ध्यान दें कि. उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोपी के 19 घंटे के बाद, एक imaged जंगली प्रकार भ्रूण की आंख और कान के बीच की दूरी लगभग 81.7 माइक्रोन था, और तुरंत बाद imaged दो भाई भ्रूण के लिए औसत आंख कान दूरी 71 माइक्रोन था. इसलिए, भ्रूण मचान श्रृंखला 27 की तुलना में थोड़ा कम उम्र के होने की संभावना है.

ये morphogenetic आंदोलनों बहुत एसएमओ म्यूटेंट में बाधित कर रहे हैं. पहले से वर्णित है, zebrafish एसएमओ म्यूटेंट पहले आर्क की एक दाढ़ की हड्डी का संक्षेपण फार्म करने में विफल रहते हैं और पहले ग्रसनी मेहराब HPF 48 से आंख 2 के लिए पूरी तरह दुम है. पोस्टीरियर कट्टर आंदोलनों भी 10 बाधित कर रहे हैं. 3 ग्रसनी मेहराब 2 एन डी ग्रसनी चाप को औसत दर्जे स्थानांतरित करने में विफल रहता है, और 2 मूवी वें ग्रसनी मेहराब 48 HPF से अधिक पूर्वकाल मेहराब के साथ ओवरलैप rostrally विस्थापित करने में विफल रहता है दिखाता है.

Zebrafish smad5 b1100 म्यूटेंट एक तालु कंकाल के पास पूरा नुकसान और कट्टर morphogenesis ग्रसनी को दोष हो सकता है वहाँ सुझाव है कि ग्रसनी मेहराब कंकाल तत्वों 15 वें, 2, 3, और कभी कभी 4 के बीच उदर fusions सहित कई craniofacial दोष है, . दरअसल, स्थिर confocal इमेजिंग 2 एन डी और 3 मेहराब के उदर में डोमेन में fusions (चित्रा 2) 32 HPF द्वारा स्पष्ट कर रहे हैं प्रदर्शन किया. समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, हम smad5 म्यूटेंट में ग्रसनी मेहराब के morphogenesis का विश्लेषण किया. समय चूक विश्लेषण में, 2 और 3 मेहराब के बीच fusions स्थैतिक विश्लेषण (3 मूवी, चित्रा 3) के साथ संगत, 32 HPF पर पहले दिखाई देते हैं. इसके अतिरिक्त,smad5 म्यूटेंट पहले ग्रसनी मेहराब (मूवी 3) का परिणाम बाधित है. 30 HPF में पहली ग्रसनी मेहराब (186.8 मीटर) के पूर्वकाल / पीछे लंबाई जंगली प्रकार की तुलना में 35% से अधिक लंबी है, और एक smad5 उत्परिवर्ती में पहली ग्रसनी मेहराब के 2.5 गुना पृष्ठीय / वेंट्रल ऊंचाई है. पीछे बढ़त rostrally चलता रहता है लेकिन, जैसा कि पहले ग्रसनी मेहराब के पूर्वकाल / पीछे लंबाई लगभग 40 मीटर 30-39 के बीच HPF कम हो जाती है और उसके बाद 48 HPF द्वारा इस लंबाई आएगा. पहले ग्रसनी मेहराब के पृष्ठीय / वेंट्रल ऊंचाई 30-48 HPF से 62.3 माइक्रोन के लिए तेजी से कम हो जाती है. इस समय के दौरान पूर्वकाल विस्तार की विफलता जंगली प्रकार की तुलना में 30 HPF पर (85 माइक्रोन) असाधारण लंबी है जो दाढ़ डोमेन, में परिलक्षित होता है. दाढ़ की लंबाई 30-36 HPF से 4.4 माइक्रोन / घंटा (नि. 2 = 0.9032) में रेखीय प्रतिगमन द्वारा approximated दर से कम हो जाती है, और उसके बाद काफी सुसंगत रहता है. इधर, समय चूक इमेजिंग अनूठा तिवारी दर्शाताsmad5 म्यूटेंट में मनाया तालु कंकाल के नुकसान के लिए खाते सकता है कि ssue आंदोलनों.

PDGF परिवार के सदस्यों की अभिव्यक्ति यह ग्रसनी मेहराब morphogenesis में मोटे तौर पर शामिल किया जा सकता है, वहीं पीछे मेहराब के आंदोलन pdgfra म्यूटेंट में सामान्य दिखाई देता है. यह विशेष रूप से (मूवी 4) बाधित प्रकट होता है कि पहले ग्रसनी मेहराब के morphogenesis है. पहले ग्रसनी मेहराब के समग्र आकार जंगली प्रकार के सापेक्ष कम है, और दाढ़ की हड्डी डोमेन कोशिकाओं संघनक और समय के साथ वापस लेने के साथ, अत्यधिक प्लास्टिक प्रकट होता है. यह 56.5 माइक्रोन पर चारों ओर 39 HPF जो चोटियों दाढ़ की हड्डी बढ़ाव की विफलता, में यह परिणाम है. 48 HPF में, दाढ़ की हड्डी डोमेन उपाय केवल 44.1 माइक्रोन. सामूहिक, इन निष्कर्षों को सावधान समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण के संभावित स्थैतिक विश्लेषण में खो morphogenesis का विवरण प्रदान कर सकते हैं.

चित्रा 1 चित्रा 1. Confocal माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते पाटने coverslip निर्माण और भ्रूण के योजनाबद्ध.

चित्रा 2
. चित्रा 2 दूसरे और तीसरे मेहराब smad5 म्यूटेंट में फ्यूज (ए, बी) ए (ए) FLI1 से सिंगल जेड स्लाइस: EGFP और एक (बी) FLI1: EGFP; smad5 b1100 उत्परिवर्ती भ्रूण.. (ए) smad5 के लिए भ्रूण जंगली प्रकार में, दूसरे और तीसरे आर्क में तंत्रिका शिखा कोशिकाओं दूसरा ग्रसनी थैली (arrowhead) से अलग होती है. Seco के उदर सीमा पर (बी) के तंत्रिका शिखा कोशिकाओंएन डी और तीसरे मेहराब smad5 म्यूटेंट (arrowhead) में मिलाना. ग्रसनी मेहराब गिने जा रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. बाधित ग्रसनी मेहराब morphogenesis में smad5 समारोह परिणाम का अंत. (ए, बी, ऊपरी पैनल) अनुमान और कम (पैनल) मूवी 3 में कट्टर संलयन के orthogonal देखा गया. मेहराब दो और तीन का फ्यूजन स्पष्ट, Arrowhead है. ग्रसनी मेहराब गिने जा रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 1. ग्रसनी का विकासएक जंगली प्रकार में मेहराब (FLI1: EGFP) 30-48 HPF से भ्रूण. पूर्वकाल बाईं ओर, शीर्ष पर पृष्ठीय. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 2. ग्रसनी मेहराब की औसत दर्जे आंदोलनों एसएमओ म्यूटेंट में (FLI1: EGFP, 577 smob) असफल पूर्वकाल छोड़ दिया, शीर्ष पर पृष्ठीय लिए.. 30-48 HPF. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 3. (: EGFP; smad5 b1100 FLI1) पूर्वकाल छोड़ दिया, शीर्ष पर पृष्ठीय को 2 एन डी और 3 मेहराब smad5 म्यूटेंट में फ्यूज.. (ए) के अनुमानों, 30-48 HPF, और (बी) की श्रृंखला एकल जेड स्लाइस, 30-40 HPF. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 4. . शीर्ष करने के लिए छोड़ दिया, पृष्ठीय पूर्वकाल;: (pdgfra b1059 EGFP FLI1) दाढ़ की हड्डी क्षेत्र के बढ़ाव pdgfra म्यूटेंट में विफल रहता है. 30-48 HPF. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी विकास के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. यहाँ, हम तंत्रिका शिखा कोशिकाओं लेबल है कि एक ट्रांसजेनिक का उपयोग महत्वपूर्ण संकेत दे रास्ते के लिए उत्परिवर्ती हैं कि zebrafish में ग्रसनी मेहराब morphogenesis अध्ययन में विधि की उपयोगिता प्रदर्शित करता है. ऊतक स्तर के अलावा समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण भी एक सेलुलर स्तर 28 पर विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं, का विश्लेषण करती है. कई व्यापक रूप से इस्तेमाल किया zebrafish तरीकों में भी morpholinos के microinjection, mRNAs, या ट्रांसजेनिक निर्माणों, साथ ही भ्रूण के बीच प्रत्यारोपण सहित समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रयोगों में शामिल किया जा सकता है. कई विकासशील ऊतकों का विश्लेषण केवल fluorescently लेबल ऊतकों करने की क्षमता से और crosstalk बिना विभिन्न fluorophores की वांछित संख्या का पता लगाने के लिए एक confocal खुर्दबीन क्षमता द्वारा सीमित है. zebrafish भ्रूण की एक क्लच से imaged किया जा सकता है कि व्यक्तियों की संख्या गंभीर रूप से विवश है, लेकिन उन्नत तकनीकएक ही समय अवधि में कई भ्रूण की स्वचालित इमेजिंग अनुमति देते हैं. आसानी से जल्दी समय बिंदुओं पर पहचान नहीं है कि एक उत्परिवर्ती का समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण प्रदर्शन करने की मांग करते हैं तो यह विशेष रूप से उपयोगी है.

समय चूक confocal छवियों से माप प्रदर्शन करते हैं, तो यह कुछ विकासात्मक देरी प्रक्रिया के कारण होता है कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. विकास की देरी के रूप में अच्छी तरह से उत्परिवर्ती भ्रूण में असामान्य नहीं हैं, इसलिए नियंत्रण भाई की इमेजिंग उत्परिवर्ती / चालाकी भ्रूण के साथ ही जंगली प्रकार नियंत्रण दोनों के लिए आवश्यक है. यहां तक ​​कि एक बार मंचन के लिए नियंत्रित, प्रतिदीप्ति लेबल संरचनाओं का तुलनात्मक माप मुश्किल है. प्रतिदीप्ति तीव्रता व्यक्तियों के बीच और एक ही संरचना के अलग अलग हिस्सों के बीच अत्यधिक चर हो सकता है. इस प्रकार, nondiscrete मात्रात्मक माप आत्मीयता की एक डिग्री है, और हम अधिक से अधिक एक व्यक्ति स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए माप अनुशंसा करते हैं कि. जांचकर्ताओं ने यह भी भ्रूण orienting में अनुशासित होना चाहिएतुलनात्मक माप के लिए लगातार ऐसा करने में विफलता के रूप में वहाँ कोई नहीं हो सकता है, जहां रूपात्मक मतभेद की उपस्थिति का कारण होगा. नमूना भ्रूण के आंदोलनों एकमुश्त एक प्रयोग बर्बाद कर सकते हैं, और हम Microwaved agarose गाढ़ा करने के लिए अनुमति दी गई है के बाद संवेदनाहारी जोड़ने भ्रूण sedating में इसकी क्षमता कम कर देता है कि लगता है.

कठिन प्राप्त करने के लिए हालांकि, समय चूक माइक्रोस्कोपी डेटा गुणात्मक morphogenesis की तुलना में स्थिर चित्र पर स्पष्ट लाभ है. स्थिर छवियों अक्सर एक निश्चित समय बिंदु पर संरचनाओं की आसान माप की अनुमति है, लेकिन करने के लिए अग्रणी या उस स्तर निम्न ऊतक व्यवहार का कोई संकेत नहीं देना होगा. Morphogenesis के दौर से गुजर दो या अधिक अलग ऊतकों की बातचीत का अध्ययन करते समय इस तरह की जानकारी महत्वपूर्ण है. Morphogenesis का सबसे अच्छा समग्र लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए, यह सबसे अच्छा प्रत्येक विधि के लाभ का उपयोग करने के लिए दोनों समय व्यपगत और स्थैतिक विश्लेषण प्रदर्शन के लिए फायदेमंद है. समय व्यपगत एना मेंlyses, गतिशील सेल और ऊतक व्यवहार स्थैतिक विश्लेषण में, भ्रूण की बड़ी संख्या परिवर्तनशीलता की सबसे अच्छी समझ हासिल करने के लिए जांच की जा सकती, और विश्लेषण किया जा सकता है. विवो डेटा में वास्तविक समय morphogenesis शोधकर्ताओं के बीच सोने के मानक बन जाता है जैसे अन्य तकनीकों के zebrafish ट्रांसजेनिक लाइनों और उन्नति की संख्या बढ़ रही है, आम कई ऊतकों के समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी कर देगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम उनके विशेषज्ञ मछली की देखभाल के लिए मेलिस्सा ग्रिफिन और जेना Rozacky धन्यवाद. PDM धन्यवाद EGN सहायता, उदारता, और धैर्य लिखने के लिए. इस काम JKE लिए एनआईएच / NIDCR R01DE020884 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 lb Test monofilament line Cortland Line Company SLB16
Agarose I Amresco 0710
Argon laser LASOS Lasertechnik GmbH LGN 3001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID FHC 30-31-0
Clove oil Hilltech Canada, Inc. HB-102
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator Fisher Scientific 2050FS
Laser scanning microscope Carl Zeiss AG LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific 12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1 Fisher Scientific 12-545-M
Potassium chloride Fisher Scientific M-11321
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Sodium chloride Fisher Scientific M-11624
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907
TempController 2000-2 PeCon GmbH
Tricaine-S Western Chemical, Inc.

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 83 zebrafish तंत्रिका शिखा समय चूक ट्रांसजेनिक morphogenesis craniofacial सिर विकास confocal माइक्रोस्कोपी, फिल्म
4D confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग Zebrafish में Craniofacial Morphogenesis का विश्लेषण करना
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McGurk, P. D., Lovely, C. B.,… More

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).

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