Summary
时间推移共焦成像是一个强大的技术表征胚胎发育有益。在这里，我们描述的方法和表征颅面形态发生在野生型，以及PDGFRA，Smad5和与SMO突变体胚胎。
Abstract
延时成像是一种技术，它允许直接观察形态发生的过程中，或形状的生成。由于它们的光学清晰度和顺从遗传操作，斑马鱼的胚胎已经成为一种流行的模式生物与在活胚胎进行形态的延时分析。一个活斑马鱼胚胎的共焦成像要求的感兴趣组织的持续标记有荧光标记物，如转基因或注射染料。该过程要求的胚胎被麻醉并在这里以这样一种方式，健康发展继续正常进行。成像参数必须设置为占三维增长和平衡解决单个细胞，而得到发展的快速快照的需求。我们的研究结果表明，以荧光标记的斑马鱼胚胎的体内成像进行长期检测在不同组织行为的能力颅神经嵴造成颅面畸形。造成麻醉和安装发育迟缓是微乎其微的，而且胚胎是安然无恙的过程。时移成像胚胎可以在以后的发展点返回到液体培养基中，随后成像或固定。随着转基因斑马鱼线和良好的特点命运映射和移植技术，成像越来越丰盈任何需要的组织是可能的。因此，时间推移的体内成像结合有力地与斑马鱼基因的方法，包括突变体和显微注射的胚胎的分析。
Introduction
颅面形态发生是一个复杂的多步骤的过程，需要多种细胞类型之间协调的相互作用。大部分颅面骨骼是由神经嵴细胞来源，其中许多必须从背神经管迁移到被称为咽弓1瞬态结构。与许多组织中，颅面骨骼的形态是不是可以通过胚胎在发育的特定时间点的静态图像理解更复杂。虽然它是耗时的执行， 在体内时间推移显微镜提供了一个连续的外观在发育中的胚胎的细胞和组织。在延时系列中的每个图像借给上下文别人，并帮助调查员走向推断，为什么出现一种现象，而不是演绎什么是发生在那个时候。
体内成像因此是一个功能强大的工具，描述实验方法解构，引导形态的途径。斑马鱼斑马鱼是脊椎动物胚胎发育的一个流行的遗传模式，并特别适于在体内成像形态的。现代，便利的方法转基因和基因组修饰突飞猛进提供给斑马鱼研究工具的数量。这些工具提升已经非常强大的方法进行基因操纵和显微镜。在几乎任何所需的遗传背景在体内几乎所有组织的成像更接近现实比幻想。
咽弓的形态发生运动是由信号的神经嵴和邻近的上皮细胞，两者外胚层和内胚层之间的交互引导。但是也有一些必要的驱动的颅面骨骼元素的形态由上皮细胞表达大量的信号分子。在这些信号分子，刺猬（嘘）是非常重要的f或颅面部发育2-8。嘘是由口腔外胚层和内胚层咽2,6,9,10均表示。 Shh的中内胚层表达调节拱门10，神经嵴的拱门10内的图案，和颅面骨骼11的生长形态发生运动。
BMP信号也是颅面部发育12极为重要，可能会改变咽弓的形态。 BMP信号调节波峰的咽弓13,14内背/腹图案。 SMAD5在斑马鱼的破坏会导致严重的腭缺陷和麦氏软骨的破坏在15中线适当地融合。此外，该突变体也显示出降低和融合在腹侧软骨的元素，与第2 次 ，第3 次 ，有时稠的中线15第 4 次咽弓元素。这些融合强烈建议Bmp信号指示这些咽元素的形态。
PDGF信号是必要的颅面发育，但在咽弓形态发生未知的角色。小鼠和斑马鱼突变体PDGFRA有深刻的面中部的clefting 16-18。至少在斑马鱼这面中部的clefting是由于适当的神经嵴细胞迁移16的故障。神经嵴细胞继续表达PDGFRA他们已经进入了咽弓后。此外，PDGF配体是由面部上皮细胞表达和咽弓16,19,20内，从而PDGF信号也可以在下面的迁移咽弓的形态发生中发挥作用。然而，分析，并没有被执行在PDGFRA突变咽弓的形态发生。
在这里，我们展示 pharyngul的活体共焦显微镜一个阶段的转基因斑马鱼，并描述此期间内，咽弓的形态。我们进一步表明，受扰乱的BMP，PDGF和Shh信号通路的突变组织行为。
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Protocol
1。畜牧突变等位基因
- 提高和斑马鱼的繁殖所描述的21。
- 在本研究中使用的斑马鱼突变体等位基因PDGFRA b1059 16，SMAD5 B1100 22，和SMO B577 23。来源这些斑马鱼品系包括ZIRC。
2。解决方案及器具的制备
注：所有的解决方案，并实现可预先和存储以供将来使用。
- 使胚胎培养基（EM），如前所述21。
- 使4克/升的MS-222（三卡因）。溶解4克磷酸二钠（的Na 2 HPO 4）在450ml的无菌水。加2克MS-222溶液中。内7.0-7.2调节pH至。加无菌水至500ml的总体积。
- 可选：4克/升丁香油。权衡0.2克纯丁香油在50ml锥形管中。添加EM至50ml的总体积。贮存于4℃。
- 使3％methylcellulo本身。把加入50ml的EM + 0.1 M羟乙基烧开。起锅。拌入1.5克甲基纤维素，直到溶液是均一的。贮存于4℃。
- 使0.2％的琼脂糖。添加0.1克琼脂糖至50ml的EM。把EM烧开在微波炉或放在热板上并验证琼脂糖完全溶解。等分入微量离心管中并储存500μl的量在4℃下注意：根据需要体积可以进行调整。
- 使毛细血管扑克。将下降0.9 mm内径的毛细管内的超级胶水。插入的6磅测试单丝钓线一个4-5厘米长的细管内，使得约3-4毫米线的延伸超过所述管的端部。
- 使每个试样2桥接盖玻片。超级胶水22 X 22-1玻璃盖到24×60-1盖板玻璃中间留自由的两端。让单打（每1月底小盖玻片）胚胎不到一天老了，双打（在彼此顶部每端2小盖玻片）胚胎差一分四点Ð胚胎五天年长AYS老，或三元（对方每月底的前3名小盖玻片）。
- 填充10毫升注射器用高真空润滑脂。注意：真空润滑脂用作密封剂，以防止试样过长时间脱水，并具有低电势的毒性相比更不稳定密封剂。
3。安装斑马鱼胚胎的共聚焦显微镜（见图1）
- 准备麻醉媒体。通过微波在20秒的间隔，直至完全融化液0.2％琼脂糖等分。拌8微升的MS-222的入192微升0.2％的琼脂糖或5微升4克/升丁香油入195微升0.2％的琼脂糖组成。保持在42℃加热块。注：长时间曝光到MS-222导致比丁香油强发育迟缓确实在斑马鱼胚胎24。
- 如果需要的话：手动dechorionate未孵化的转基因胚胎将只是之前技术分析。使用镊子，慢慢德AR绒毛膜打开，直到胚胎被释放。
- 麻醉斑马鱼胚胎。添加1ml的胚胎媒体的MS-222至24毫升4克/升的股票。或者，加390微升4克/升丁香油至24鱼水24毫升。注：丁香油行为慢慢等时间推移显微镜之前执行此步骤至少15-20分钟。
- 放置大约一个朝上的桥接盖玻片的中央空间的真空润滑脂珠。慢慢地推动真空润滑脂出注射器，使得一个平滑，连续的珠的靠近和桥梁和盖玻片的边缘的内侧。
- 传播4％的甲基纤维素中使用木敷贴桥接的盖玻片的中间的圆。
- 转移的胚胎将被成像。当胚胎被麻醉绘制成一个玻璃吸管。握住吸管垂直向上，以允许胚胎沉到液体底部的吸液管。使移液管插入琼脂糖溶液，并允许胚胎降到琼脂糖。也不排除液体。
- 放置标本。得出一些琼脂糖溶液和胚胎放入吸管。驱逐胚胎的琼脂糖溶液对甲基顶部的下降。使用毛细管扑克胚胎向下推到甲基纤维素和定位在所希望的成像胚胎。
- 密封标本。
- 广场上安装的一个顶一个桥接盖玻片，朝下。直到桥直接接触和琼脂糖滴密封到两个盖玻片施加均匀压力的夹在盖玻片的两侧。确认胚胎的方向正确。
- 擦沿玻璃的木制涂药，理顺在真空脂珠裂缝和缝隙。擦去边缘多余的油脂。
4。转基因斑马鱼的胚胎时移共聚焦成像
（该协议已被优化，蔡司LSM 710共聚焦显微镜我们ING ZEN成像软件，并且可以修改为与其他系统使用。）
- 激活设备。打开激光共聚焦显微镜和任何外部激光设备。打开连接到共聚焦显微镜在电脑上。开放式共焦成像软件，并选择“启动系统”，以激活图像采集控制。
- 准备加热阶段。降低共聚焦显微镜的工作平台和移动物镜出来的位置。配有电子加热阶段替换默认的阶段。旋转控制器，用于加热的阶段，并设定为29.5℃的温度
- 放置标本中的视场。放置在台上的装片。将20X物镜到位，提高了工作平台。激活可见光发射器，并期待通过目镜。围绕胚胎的头部在视场中。
- 定义实验的设置。
- 通过选择激活荧光通道被检测和荧光波长选择颜色查找表（LUT）每个通道。如有必要，可使用手动控制，在软件中打开所需的激光（ 如 561纳米的RFP）。对于每个荧光通道，设置激光强度为10.0和600-700之间的光电倍增管电压（HV或收益）。设置平均到4和位深度为16位。
- 激活的Z堆栈和时间系列模块。设置在针孔的5微米或更小的Z-的分辨率，并将Z-间隔对所建议的最佳距离。
注：一般情况下，5微米的Z-分辨率允许每个Z堆栈图像采集速度不够快的一个“快照”胚胎在特定的时间点，同时也解决单个细胞。降低了平均化也降低了每个图像的时间量。 - 确定图像之间的实验的总长度所需的时间间隔（通常10-20分钟）和。
- 设置位置信息。
- 打开相机到现场模式。调整对焦和提高激光强度，如果要看到荧光。设置数码变焦0.6为更广泛的观点，如果需要的话。
- 定位阶段，使得所有的利益结构是可见的，有房的视野的生长和背部向前。聚焦通过胚胎到荧光的上限和下限。设置在第一和最后Z堆叠切片位置至少100μm以上超出这些限制。
- 优化的荧光强度。
- 设置显示LUT到的范围的指标。荧光结构现在应出现白色，和视场的其余部分应该是蓝色的（无检测）或黑色。
- 增加高压/增益略低于饱和地方的水平（红色）像素，显示效果。如果需要，调整偏移，因此大部分的背景没有检测到（蓝色）。注：小针孔直径，增加激光强度既提高了图像清晰度从头，但激光的强度必须保持低以保持活体组织。增加高压/增益和针孔直径（<5微米），一般最好增加激光强度。
- 保持针孔直径宽，足以采集图像及时，平均套4。的Z间隔应始终设置为针孔直径所建议的最佳距离。进行短扫描（平均= 1）不同的设置，并使用最小的激光强度，实现所需的分辨率。
- 运行该实验所需的时间长度。随后，从加热阶段的胚胎取出，慢慢地分开盖玻片。淹没在电磁盖玻片和胚胎在30毫米培养皿。使用玻璃移液管轻轻地清洗胚胎关闭盖玻片并从培养皿取出盖玻片。将胚胎成28.5℃培养箱中继续发展。
- 比较增长。在实验结束时，采取个别Zs的即进行类似上演到试样在实验的开始，但琼脂糖安装同级胚胎钉图像，在28.5℃培养箱中提出的EM。
- 测量咽弓，如需要。测量可以在一些共聚焦软件套件来执行。发现这里测量了使用Fiji25通过导入和Z-投射个别帧。LSM文件执行。
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Representative Results
在野生型胚胎中，神经嵴人口下面，沿前/后和背/腹轴咽弓伸长移动时在一个方向喙（ 电影1）。在30小时后，受精（HPF），第一咽弓的前/后长度为1.8-1.9倍，其背/腹高度之间。背/腹伸长率稳步前进，比前/后延长至36.5 HPF更快。从这里，背/腹高高原各地的104微米至48 HPF。前/后继续延长至48个高倍视野，从低于1.5倍的背/腹高度36.5 HPF至1.95倍的背/腹高度在48 HPF整体前/后长度增加。
在其前端，第一咽弓形成上颌（背）和下颌骨的口腔外胚层分离（腹）域。第一咽弓的上颌域测量f它的rom远端尖端的口腔外胚层的后顶点。它生长于在4.6微米/小时（R 2 = 0.9374）30-48 HPF之间近似为线性回归的速度和大约为104微米长，48个高倍视野（ 电影1）。
咽弓3-7从神经嵴细胞的单传经咽部内胚层26分段的所有形式。 30-38之间的HPF，第五次到7 次咽弓分开的肿块，3 次和第4 次拱门已经有分离。约37 HPF， 第三咽弓开始向内侧移动到第二拱。横向， 第 7 次咽弓超越了5 日和6 日在拱门延髓运动由48个高倍视野，通过6 个拱门内侧留下第三至第 2和第7 届拱门（ 电影1）。
重要的是吨Ø注意，虽然该公约是描述形态HPF，显微镜略有相比，在28.5℃培养箱培养同样上演胚胎斑马鱼的延迟增长。例如，19小时镜后，成像的野生型胚胎的眼睛和耳朵之间的距离为大约81.7微米，而平均眼耳距离为成像之后立即2同级的胚胎为71微米。因此，胚胎很可能要稍微晚于分期系列27。
这些形态动作都极大地扰乱在SMO的突变体。如前所述，斑马鱼SMO突变体不能形成第一拱的上颌缩合，并通过48个高倍视野的第一咽弓完全尾椎到眼2。后弓的动作也被打乱了10。第三咽弓没有移动到内侧的第二咽弓，和Movie 2 次咽弓无法迁移吻侧与更多的拱门前48个高倍视野重叠。
斑马鱼SMAD5 B1100突变体有众多的颅面畸形，包括腭骨骼几乎完全丧失和第二 ， 第三 ，有时候第四咽弓骨骼元素15，这表明可能存在缺陷咽弓形态之间的融合腹侧。实际上，静态聚焦成像显示出在第 2 次和第3 次拱腹结构域融合物是由32个高倍视野明显（ 图2）。使用时间推移共聚焦显微镜，我们分析了突变体SMAD5咽弓的形态。在延时分析，第二和第三拱之间的融合首先出现在32个高倍视野，与静态分析（ 动画3，图3）一致。此外，SMAD5突变打乱了第一咽弓（ 动画3）的产物。在30个高倍视野，第一咽弓（186.8微米）的前部/后部的长度比在野生型长超过35％，并且是在一个SMAD5突变体的第一咽弓的2.5倍背/腹高度。然而，由于后缘移动吻侧，第一咽弓的前/后长度的减小几乎40微米之间30-39 HPF，然后通过48个高倍视野收复这个长度。第一咽弓的背/腹高度从30-48 HPF稳步下降到62.3微米。前部延伸的在这段时间内故障也反映在上颌域，相对于野生型是格外长（85微米）在30个高倍视野。在从30-36 HPF 4.4微米/小时（R 2 = 0.9032）近似为线性回归的速率上颌长度减小，并保持相当一致之后。在这里，时间推移成像演示了独特的钛SSUE运动，也许可以解释在SMAD5的突变体中观察到的腭骨骼的损失。
而PDGF家族成员的表达表明，它可广泛地参与咽弓形态，后拱的运动PDGFRA突变显示正常。它是专门破坏（ 动画4）在出现的第一咽弓的形态。第一咽弓的总体尺寸相对减少至野生型和上颌域出现高塑性，与细胞的冷凝和吸随着时间的推移。这将导致一个失败上颌伸长率，其峰值周围39个高倍视野为56.5微米。在48个高倍视野，上颌领域的措施只有44.1微米。总的来说，这些研究结果显示，小心时间的推移分析可以提供形态的细节在静态分析可能会丢失。
图1。示意图桥接盖玻片建设和胚胎安装的共聚焦显微镜。
图2中的第二个和第三个拱融合在SMAD5的突变体（A，B）从（A）FLI1单个z片：EGFP和（B）FLI1：EGFP; SMAD5 B1100突变体胚胎。 （A）在胚胎野生型为Smad5和神经嵴细胞在所述第二和第三拱形由第二咽囊（箭头）是分开的。 （二）神经嵴细胞在塞科的腹侧极限第二和第三个拱门交融在SMAD5的突变体（箭头）。咽弓的编号。 点击这里查看大图。
图3。损失SMAD5功能结果打乱了咽弓形态（A，B，上图）和预测（下图）拱融合在电影3的正交视图。拱门两个和三个融合明显，箭头。咽弓的编号。 点击这里查看大图。
电影1。咽的发展拱门在野生型（FLI1：EGFP）从30-48 HPF胚胎。前方左侧，背部顶端。 点击这里观看电影。
电影2。咽弓的内侧变动SMO突变体失败（FLI1：EGFP; smob 577）前向左侧，背部顶端。 30-48 HPF。 点击这里观看电影。
电影3。 第 2 次和第3 次拱SMAD5突变体融合（FLI1：EGFP; SMAD5 B1100）前向左侧，背部顶端。系列（ 一 ）预测，30-48 HPF，和（B）单个z切片，30-40 HPF。 点击这里观看电影。
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Discussion
时间推移共聚焦显微镜是一个强大的工具，用于发展的分析。在这里，我们验证了该方法的有效性学习咽弓形态中的斑马鱼突变体是采用转基因的标记的神经嵴细胞的重要信号通路。除了 组织水平进行分析，时间流逝的分析也适用于分析在细胞尺度28。许多广泛使用的斑马鱼的方法也可以被掺入到时间推移显微镜实验，包括显微注射吗啉代的，mRNA表达，或转基因构建体，以及胚胎之间移植。的多个显影组织分析仅由能力荧光标记的组织和由共聚焦显微镜的能力来检测不同的荧光基团的期望数目无串扰限制。可以从斑马鱼胚胎的离合器被成像的个体的数目受到严格的限制，但先进的技术允许几个胚胎在相同的时间段自动成像。求来执行，是不容易在早期时间点确定一个突变体的时间推移分析时，这是特别有用的。
当执行从时间推移共焦图象的测量，重要的是考虑某些发育延迟是由于该过程是很重要的。发育迟缓的情况并不少见的突变胚胎一样，所以兄弟控制的成像是必要的两个突变体/操纵胚胎以及野生型对照。甚至一度控制了分期，荧光标记的结构比较测量是困难的。荧光强度可以是个人之间以及同一结构的不同部分之间的高度变化。因此，非离散定量测量有一定程度的主观性，我们建议一个以上的个人进行测量，以确保一致性。调查人员也必须在胚胎定向纪律对于比较一致的测量，因为不这样做会导致形态差异，其中有可能是没有出现。标本胚胎运动可以彻底毁了一个实验，我们发现添加麻醉后微波处理琼脂糖已被允许勾芡降低其疗效镇静胚胎。
虽然很难获得，时间推移显微镜的数据有超过静态图像明显的优势，在质量上比较形态。静态图像往往会使得容易测量结构在某个时间点，但没有说明组织行为导致或以下的舞台。研究的两个或更多个形态进行单独的组织的相互作用时，这些信息是至关重要的。为了获得形态的最佳整体表征，它是有益的，同时执行时间流逝和静态分析来最好地利用各方法的优点。在时间失效模拟裂解，动态的细胞和组织的行为可以被分析，并且在静态分析中，大量的胚胎可进行检查，以获得变化的最好理解。越来越多的斑马鱼转基因株系的其他技术和进步将使司空见惯多个组织时移共聚焦显微镜，实时的体内数据变得形态研究人员之间的黄金标准。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢梅丽莎格里芬和詹娜Rozacky为他们的专家鱼护。 PDM感谢EGN写的援助，慷慨和忍耐。这项工作是由美国国立卫生研究院/ NIDCR R01DE020884到JKE支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 lb Test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24 x 60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
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