Summary
Time-lapse confocal bildebehandling er en kraftfull teknikk nyttig for å karakterisere embryoutvikling. Her beskriver vi metodikken og karakter kraniofaciale morphogenesis i villtype, samt PDGFRA, smad5, og SMO mutante embryoer.
Abstract
Tidsforsinkelse avbildning er en teknikk som gjør det mulig for den direkte observasjon av prosessen med morphogenesis eller generering av formen. På grunn av deres optisk klarhet og amenability til genetisk manipulasjon, har sebrafisk embryo blitt en populær modell organisme med å utføre intervall analyse av morfogenese i levende embryoer. Confocal avbildning av en levende sebrafisk embryo krever at en vev av interesse er vedvarende merket med en fluorescerende markør, som for eksempel en transgen eller injisert fargestoff. Prosessen krever at embryoet blir bedøvet og holdes på plass på en slik måte at sunn utvikling fortsetter på vanlig måte. Parametere for bildebehandling må stilles til ansvar for tredimensjonal vekst og å balansere kravene til å løse individuelle celler mens du får raske snapshots av utviklingen. Våre resultater viser evnen til å utføre langtids in vivo avbildning av fluorescens-merkede sebrafisk embryoer, og for å detektere ulike vev atferd ikranie neural crest som forårsaker kraniofaciale misdannelser. Utviklingsmessige forsinkelser forårsaket av anestesi og montering er minimal, og embryoer er uskadd etter prosessen. Time-lapse fotografert embryoer kan returneres til flytende medium og deretter avbildes eller fast på senere punkter i utvikling. Med et økende overflod av transgene sebrafisk linjer og godt karakterisert skjebne kartlegging og transplantasjon teknikker, bildebehandling enhver ønsket vev er mulig. Som sådan, time-lapse in vivo avbildning kombinerer kraftfullt med sebrafisk genetiske metoder, inkludert analyser av muterte og microinjected embryoer.
Introduction
Kraniofacial morfogenese er en kompleks multi-trinns prosess som krever koordinert samhandling mellom flere celletyper. Flertallet av kraniofaciale skjelettet er avledet fra neural crest cellene, må mange av dem forflytte seg fra rygg nevralrøret i forbigående strukturer kalt svelg buer en. Som med mange vev, er morfogenese av kraniofaciale skjelettet mer komplisert enn det som kan forstås av statiske bilder av embryoer ved spesifikke utviklings tidspunkter. Selv om det er tidkrevende å utføre, gir in vivo time-lapse mikros en kontinuerlig titt på en utvikling av embryo celler og vev. Hvert bilde i en time-lapse-serien gir kontekst til de andre, og hjelper en etterforsker trekk mot dedusere hvorfor et fenomen oppstår snarere enn dedusere hva som skjer på den tiden.
In vivo avbildning er således et kraftig verktøy for beskrivende eksperimentelle tilnærminger tildekonstruere banene som styrer morphogenesis. Sebrafisk Danio rerio er en populær genetisk modell av virveldyr embryoutvikling, og er spesielt godt egnet for in vivo avbildning av morphogenesis. Moderne, er praktiske metoder for transgenesis og genomisk modifikasjon raskt fremme antall verktøy tilgjengelig for sebrafisk forskere. Disse verktøyene forbedre allerede robuste metoder for genetisk manipulasjon og mikros. In vivo avbildning av nesten alle vev i nesten hvilken som helst ønsket genetisk sammenheng er nærmere virkeligheten enn fantasy.
Morphogenetic bevegelser av svelget buene blir guidet ved å signalisere samspillet mellom neural crest og tilstøtende epitel, både ectoderm og endoderm. Det er mange signalmolekyler uttrykt av epitel som er nødvendige for å drive morfogenese av kraniofaciale skjelettelementer. Blant disse signalmolekyler, Sonic Hedgehog (Hysj) er kritisk viktig feller kraniofaciale utvikling 2-8. Hysj er uttrykt av både muntlig ektoderm og pharyngeal endoderm 2,6,9,10. Uttrykket av Shh i endoderm regulerer morphogenetic bevegelser av buene 10, fordelingen av neural crest innenfor buene 10, og vekst av kraniofaciale skjelett 11.
Bmp signalering er også kritisk viktig for kraniofaciale utvikling 12 og kan endre morfogenese av svelg buer. Bmp signale regulerer dorsal / ventral mønster av crest innenfor svelget buer 13,14. Forstyrrelse av smad5 i sebrafisk forårsaker alvorlige palatal feil og en svikt i Meckels brusk å fusjonere hensiktsmessig ved midtlinjen 15. I tillegg mutantene også vise reduksjoner og fusjon i ventrale brusk elementene med 2 nd, 3., og noen ganger 4 th pharyngeal erke elementer smeltet på midtlinjen 15. Disse fusjoner sterkt at BMP signale dirigerer morfogenese av disse svelg elementer.
PDGF signalering er nødvendig for kraniofaciale utvikling, men har ukjente roller i faryngeal bue morphogenesis. Både mus og sebrafisk PDGFRA mutanter har dyp midfacial clefting 16-18. I hvert fall i sebrafisk dette midfacial clefting skyldes en svikt i riktig neural crest celle migrasjon 16. Neural crest cellene fortsette å uttrykke PDGFRA etter at de har kommet inn i svelget buer. I tillegg er PDGF ligander uttrykt av ansikts epitel og innenfor de svelget buer 16,19,20, dermed PDGF signale kan også spille en rolle i morfogenese av svelg buer følgende migrasjon. Men analyser av morfogenese av svelg buer i PDGFRA mutanter har ikke blitt utført.
Her viser vi in vivo konfokalmikroskopi av pharyngulen-trinns transgen sebrafisk og beskrive morfogenese av svelg buer innenfor denne perioden. Vi ytterligere demonstrere vev atferd som påvirkes av mutasjoner som forstyrrer BMP, PDGF, og Shh signalveier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Husdyrhold og Mutant Alleler
- Hev og avle sebrafisk som beskrevet 21.
- Sebrafisk mutant alleler brukt i denne studien var PDGFRA b1059 16, smad5 B1100 22, og smo b577 23. Kilder for disse sebrafisk stammer inkluderer zi.
2. Utarbeidelse av løsninger og redskaper
Bemerk: Alle løsninger og redskap kan lages på forhånd og lagres for fremtidig bruk.
- Lag embryo media (EM) som tidligere beskrevet 21.
- Gjør 4 g / L MS-222 (Tricaine). Oppløs 4 g dinatrium-fosfat (Na-HPO 2-4) i 450 ml sterilt vann. Tilsett 2 g MS-222 til løsningen. Juster pH-verdien til innenfor 7,0 til 7,2. Legg sterilt vann til et totalt volum på 500 ml.
- Valgfritt: Gjør 4 g / L fedd olje. Vei 0,2 g ren fedd olje i en 50 ml konisk tube. Legg EM til et totalt volum på 50 ml. Oppbevar ved 4 ° C.
- Gjør 3% methylcellulose. Ta med 50 ml av EM + 0,1 M HEPES til en byll. Fjern fra varmen. Omrør i 1,5 g methylcellulose inntil oppløsningen er homogen. Oppbevar ved 4 ° C.
- Gjør 0,2% agarose. Til 0,1 g agarose i 50 ml EM. Ta EM til en byll i mikrobølgeovn eller på en kokeplate og verifisere at agarose er oppløst. Delmengde i 500 mL volumer i mikrosentrifugerør og oppbevar ved 4 ° C. Merk: Volumer kan justeres etter behov.
- Gjør kapillær poker. Plasser en dråpe superlim inne i en 0,9 mm ID kapillarrør. Sett i en 4-5 cm lengde av £ 6 monofilament test snøret inne i kapillarrøret slik at omtrent 3-4 mm fra linjen strekker seg ut over enden av røret.
- Lag to laskede Dekk per eksemplar. Super-lim 22 x 22-1 cover glass på hver ende av en 24 x 60-1 cover glass forlater midten gratis. Gjør singler (en liten cover glass per slutten) for embryoer mindre enn en dag gammel, dobler (2 små dekkglass oppå hverandre per ende) for embryoer 03:59 days gamle, eller tripler (tre små dekkglass oppå hverandre per ende) for embryoer fem dager eller eldre.
- Fyll en 10 ml sprøyte med høyvakuum fett. Merk: Vacuum fett fungerer som et tetningsmiddel for å unngå dehydrering av prøver over lange perioder av gangen, og har lavt potensial for toksisitet sammenlignet med mer volatile tetningsmidler.
Tre. Montering Sebrafisk embryo for konfokalmikroskopi (Se figur 1)
- Forbered bedøvelse medium. Smelt en delmengde av 0,2% agarose ved mikrobølgeovnen i 20 sek intervaller til det er helt flytende. Bland 8 mL av MS-222 til 192 mL av 0,2% agarose eller 5 pl av 4 g / L nellikolje inn i 195 pl av 0,2% agarose. Oppretthold i en 42 ° C varmeblokk. Merk: Lang eksponering for MS-222 forårsaker sterkere utviklingsmessige forsinkelser enn fedd olje gjør i embryonale sebrafisk 24.
- Om nødvendig: Manuelt dechorionate unhatched transgene embryoer som skal analyseres like før analyse. Bruk pinsett, sakte tear chorion åpent til embryoet er frigjort.
- Anesthetize de sebrafisk embryo. Tilsett 1 ml av en 4 g / L lager av MS-222 til 24 ml av embryo media. Alternativt, tilsett 390 pl av 4 g / L nellikolje og 24 ml av fisk vann 24. Merk: Clove olje virker langsomt slik utføre dette trinnet minst 15-20 min før time-lapse mikroskopi.
- Plasser en perle av vakuum fett rundt sentrum plass av en oppadvendte bro dekkglass. Trykk forsiktig vakuumfett ut av sprøyten, slik at en jevn, kontinuerlig streng som er tilstøtende til og på innsiden av broene og kanten av dekkglasset.
- Spre en sirkel på 4% metylcellulose i midten av den bro dekkglass ved hjelp av en tre-applikator.
- Overfør embryoet som skal avbildes. Når embryoet er bedøvet trekke den opp i et glass pipette. Hold pipetten opp vertikalt for å tillate at embryo for å synke til bunnen av væsken i pipetten. Beveg pipette inn i agarose-løsning og lar embryo for å slippeinn i agarosen. Må ikke utvise væsken.
- Plasser prøven. Tegn noen agarose-løsning og embryoet inn i pipetten. Utvise embryo i en dråpe av agarose-oppløsningen på toppen av methylcellulose. Bruk en kapillær poker å presse embryoet nedover på methylcellulose og orientere embryoet som ønsket for bildebehandling.
- Tett prøven.
- Plasser en bro dekkglass på toppen av montert en, vendt nedover. Påfør jevnt trykk på begge sider av de klemt Dekk inntil broene ta direkte kontakt og agarose slipp seler til begge dekkglass. Kontroller at embryoet er riktig orientert.
- Gni en tre applikator langs glasset for å jevne ut sprekker og hull i vakuum fett perle. Tørk bort overflødig fett fra kantene.
4. Time-lapse Confocal Imaging av transgene sebrafisk embryo
(Denne protokollen er optimalisert for en Zeiss LSM 710 konfokalmikroskop ossing ZEN bildebehandlingsprogrammer, og kan bli endret for bruk med andre systemer.)
- Aktiver utstyr. Slå på konfokalmikroskop og eventuelle eksterne laser enheter. Slå på datamaskinen som er koblet til konfokal mikroskop. Åpen konfokal bildebehandlingsprogrammer og velg "Start System" for å aktivere bildeoppkjøps kontroller.
- Forbered oppvarmet scenen. Senk iscenesettelsen plattformen på konfokalmikroskop og flytte objektiv ut av posisjon. Erstatte standard scenen med en elektronisk oppvarmet scenen. Slå på styringen i det oppvarmede scenen og stille inn temperaturen for 29,5 ° C.
- Plasser prøven i synsfeltet. Plasser de monterte prøven på scenen. Flytt 20X objektiv på plass og heve iscenesettelsen plattformen. Aktiver synlig lys emitter og ser gjennom okularene. Sentrer embryo hode i synsfeltet.
- Definer eksperimentinnstillinger.
- Aktiver fluorescens kanaler ved å velgefluorescerende bølgelengde for å bli oppdaget og velge farge oppslagstabeller (LUT) for hver kanal. Om nødvendig, bruk manuelle kontroller i programvaren for å slå på de nødvendige lasere (f.eks 561 nm for RFP). For hver fluorescens kanal, satt laser intensiteten til 10,0 og fotomultiplikatoren spenning (HV eller gevinst) mellom 600-700. Sett i snitt til fire og bitdybden til 16 bit.
- Aktiver Z-stack og tidsserie-moduler. Sett pinhole for en 5 mikrometer eller mindre Z-oppløsning, og sette Z-intervallet til den foreslåtte optimal avstand.
Merk: Vanligvis lar 5 mikrometer Z-oppløsning hver Z-stabel bilde som skal samles raskt nok for et "øyeblikksbilde" av embryoet på et bestemt tidspunkt og samtidig løse enkeltceller. Senke gjennomsnitt reduserer også mengden av tid per bilde. - Definer det ønskede tidsintervallet mellom bildene (vanligvis 10-20 min), og den totale lengden av forsøket.
- Sett posisjonellinformasjon.
- Slå på kameraet til live-modus. Juster fokus og øker laserintensitet hvis det er nødvendig å se fluorescens. Sett digital zoom til 0,6 for et bredere syn, hvis det er ønskelig.
- Plasser scenen slik at alle strukturer av interesse er synlige og det er plass i synsfeltet for utvekst dorsally og anteriorly. Fokus gjennom embryo til øvre og nedre grense for fluorescens. Sett de første og siste Z-stack stykkeplasseringer minst 100 mikrometer eller mer utover disse grensene.
- Optimaliser fluorescens intensitet.
- Sett visnings LUT å variere indikator. Fluorescent strukturer skal nå vises hvite, og resten av synsfeltet bør være blå (ingen registrering) eller svart.
- Øk HV / gevinst til et nivå rett under der mettet (rød) piksler vises. Juster om nødvendig forskyvning slik et flertall av bakgrunnen ikke blir oppdaget (blå). Merk: Mindre pinhole diameter og økt laser intensitet både forbedre bilde definition, men laserintensitet må holdes lav for å bevare levende vev. Økt HV / forsterkning og pinhole diameter (<5 pm) er generelt å foretrekke å økt laserintensiteten.
- Hold pinhole diameter bred nok til å samle bilder i tide, i snitt sett til fire. Z-intervall bør alltid settes til det foreslåtte optimal avstand for pinhole diameter. Utfør korte skanner (gjennomsnitt = 1) med forskjellige innstillinger, og bruke minst mulig laser intensitet som oppnår ønsket oppløsning.
- Kjør eksperiment for ønsket tidsrom. Etterpå fjerner embryo fra det oppvarmede scenen og langsomt løsne Dekkglass. Senk dekk og embryo i EM i en 30 mm petriskål. Ved hjelp av et glass pipette forsiktig vaske embryo ut av dekkglass og fjerne dekkglass fra petriskål. Plasser embryoet inn i en 28,5 ° C inkubator for å fortsette å utvikle.
- Sammenligne vekst. Ved slutten av forsøket, ta individuelle Zstack bilder av agarose montert søsken embryo som var tilsvarende iscenesatt til prøven i begynnelsen av forsøket, men ble reist i EM i en 28,5 ° C inkubator.
- Mål svelg buer, etter behov. Målinger kan utføres i noen confocal programvare suiter. Målinger funnet her ble utført ved hjelp Fiji25 ved å importere og Z-prosjektering. LSM filer av enkeltbilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vill type embryoer, etter neural crest befolkningen, svelg buer forlenge langs anterior / posterior og rygg / ventral akser samtidig beveger seg i en rostral retning (Movie 1). Ved 30 timer etter befruktning (HPF), er anterior / posterior lengden av den første svelg-buen mellom 1,8 til 1,9 ganger sin dorsal / ventral høyde. Dorsal / ventral forlengelse fortsetter jevnt og trutt, raskere enn anterior / posterior forlengelse inntil 36,5 HPF. Herfra dorsal / ventral høyde platåer rundt 104 mikrometer gjennom 48 HPF. Anterior / posterior forlengelse fortsetter gjennom 48 HPF, med samlede anterior / posterior lengde øker fra under 1,5 ganger dorsal / ventral høyde på 36,5 HPF til 1,95 ganger dorsal / ventral høyde på 48 HPF.
På sitt fremre enden, danner den første svelg-bue maxillaris (rygg) og kjeve (ventral) domener atskilt av den muntlige ektoderm. Den maxillaris domenet for første svelg-buen måles fROM dens distale spissen til den bakre spiss på oral ektoderm. Den vokser med en rate tilnærmes ved lineær regresjon på 4,6 mikrometer / time (r 2 = 0,9374) mellom 30-48 HPF og er ca 104 mikrometer lange på 48 HPF (Movie 1).
Svelget buer 3-7 all skjema fra segmentering av en eneste masse av neural crest cellene via svelg endoderm 26. Mellom 30-38 HPF, de 5 th gjennom 7 th svelg buer atskilt fra massen, de 3. og 4 th buer allerede har separert. Rundt 37 HPF begynner 3. faryngeale bue å flytte medialt til 2 nd bue. Lateralt, overgår den 7 th faryngeale bue de 5 th og 6 th buer i rostral bevegelse ved 48 HPF, forlater 3 rd gjennom seks th buer medial til 2. og 7 th buer (Movie 1).
Det er viktig at To Selv om konvensjonen er å beskrive morfologi HPF, forsinker mikros litt sebrafisk vekst sammenlignet med tilsvarende iscenesatt embryoer dyrket i en 28,5 ° C inkubator. For eksempel, etter 19 timer av mikroskopi, avstanden mellom øyet og øret av en avbildes villtype fosteret var ca 81,7 mikrometer, og gjennomsnittlig øye-øre avstand for to søsken embryoer avbildes umiddelbart etterpå var 71 mikrometer. Derfor embryoer er sannsynlig å være litt yngre enn iscenesettelsen serien 27.
Disse morphogenetic bevegelser er sterkt forstyrret i SMO mutanter. Som tidligere beskrevet, sebrafisk SMO mutanter mislykkes i å danne en overkjeve kondensering av den første bue, og med 48 HPF første svelg-bue er helt caudal til øyet 2.. Bakre bue bevegelser blir også forstyrret 10. Den 3. pharyngeal bue unnlater å flytte medial til 2 nd faryngeale bue, og Movie 2 th faryngeale bue klarer å migrere rostrally å overlappe med flere fremre buene ved 48 HPF.
Sebrafisk smad5 B1100 mutanter har mange kraniofaciale defekter, inkludert en nesten fullstendig tap av palatal skjelett og ventral fusjoner mellom 2., 3., og noen ganger 4 th svelg arch skjelettelementer 15, noe som tyder på at det kan være feil å Faryngeal bue morphogenesis . Faktisk, statisk confocal bildebehandling demonstrert fusjoner i ventral domener av 2. og 3. buene er åpenbart av 32 HPF (figur 2). Ved hjelp av time-lapse konfokalmikroskopi, analyserte vi den morfogenese av svelg buer i smad5 mutanter. I time-lapse-analyser, fusjoner mellom andre og tredje buer vises først på 32 HPF, i samsvar med statisk analyse (Movie 3, figur 3). I tilleggsmad5 mutanter har forstyrret utvekst av den første svelg-bue (Movie 3). Ved 30 HPF, er anterior / posterior lengden av den første svelg-buen (186,8 mm) over 35% lengre enn i vill-type, og er 2,5 ganger dorsal / ventral høyde av den første svelg-bue i en smad5 mutant. Men som den bakre kanten beveger rostrally, anterior / posterior lengden av den første svelg-buen avtar nesten 40 mikrometer mellom 30-39 HPF og deretter gjenvinner denne lengden med 48 HPF. Rygg / ventral høyden på første svelg-buen avtar jevnt til 62,3 mikrometer 30-48 HPF. Unnlatelse av fremre forlengelse i løpet av denne tiden blir reflektert i overkjevens domenet, som er usedvanlig lang (85 mikrometer) 30 HPF i forhold til vill-type. Maxillaris lengde reduseres med en hastighet tilnærmet ved lineær regresjon på 4,4 mikrometer / time (r 2 = 0,9032) 30-36 HPF, og holder seg ganske konsekvent etterpå. Her demonstrerer unik ti time-lapse bildebehandlingssue bevegelser som kan forklare tap av palatal skjelettet observert i smad5 mutanter.
Mens uttrykk for PDGF familiemedlemmer tyder på at det kan være bredt involvert i pharyngeal bue morfogenese, vises bevegelse av bakre buene normal i PDGFRA mutanter. Det er morfogenese av den første svelg-bue som vises spesielt forstyrret (Movie 4). Den totale størrelsen på den første svelg-buen er redusert i forhold til vill-type, og overkjevens domenet synes sterkt plast, med kondensering og uttak av celler over tid. Dette resulterer i en svikt i overkjevens tøyelighet, som topper rundt 39 HPF på 56,5 mikrometer. På 48 HPF, overkjevens domene måler bare 44,1 mikrometer. Sammen er disse funnene viser at forsiktig tid lapse analyser kan gi opplysninger om morfogenese potensielt tapt i statiske analyser.
Figur 1. Skjematisk av brokoblet dekk konstruksjon og embryo montering for konfokalmikroskopi.
. Figur 2 Den andre og tredje buer sikring i smad5 mutanter (A, B) Enkelt Z skiver fra en (A) fli1: EGFP og en (B) fli1: EGFP; smad5 B1100 mutant embryo.. (A) I embryoer vill-type for smad5 blir neural crest-celler i den andre og tredje bue adskilt av det andre svelg-posen (pilspiss). (B) neural crest cellene på ventral grensen for Second og tredje buer blander i smad5 mutanter (pilspiss). Svelget buer er nummerert. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Tap av smad5 funksjons resultater i forstyrret faryngeal bue morfogenese. (A, B, øvre paneler) Anslag og (nedre paneler) ortogonale utsikt over erke fusjon i Movie 3. Fusjon av buer to og tre er tydelig, pilspiss. Svelget buer er nummerert. Klikk her for å se større bilde.
Movie en. Utvikling av svelgbuer i en vill-type (fli1: EGFP) embryo 30-48 HPF. Anterior til venstre, dorsal til toppen. Klikk her for å se filmen.
Movie 2. Medial bevegelser av svelget buer mislykkes i SMO mutanter (fli1: eGFP; smob 577) Anterior til venstre, dorsal til toppen.. 30-48 HPF. Klikk her for å se filmen.
Movie 3. De to nd og 3 rd buer sikring i smad5 mutanter (fli1: EGFP; smad5 B1100) Anterior til venstre, dorsal til toppen.. Serie (A) projeksjoner, 30-48 HPF, og (b) enkelt Z skiver, 30-40 HPF. Klikk her for å se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse konfokalmikroskopi er et kraftig verktøy for analyse av utvikling. Her viser vi metodens nytten i å studere pharyngeal bue morfogenese i sebrafisk som er mutant for viktige signalveier ved hjelp av en transgen som etiketter neural crest cellene. I tillegg til vev-nivå analyser, tidsforløp analyser er også gjeldende for analyser på celle skala 28. Mange brukte sebrafisk metoder kan også være innarbeidet i time-lapse mikroskopi eksperimenter, inkludert mikroinjeksjon av Morpholinos, mRNA, eller i transgene-konstruksjoner, så vel som transplantasjoner mellom embryoer. Analyse av flere utviklings vev er bare begrenset av evnen til å fluorescently etikett vev og av et konfokalmikroskop evne til å detektere det ønskede antall forskjellige fluoroforer, uten krysstale. Antall individer som kan avbildes fra en clutch av sebrafisk embryo er sterkt begrenset, men avanserte teknikkertillater automatisert avbildning av flere embryoer i den samme tidsperiode. Dette er spesielt nyttig når du søker å utføre intervall analyse av en mutant som ikke er lett identifiseres på tidlige tidspunkter.
Når du utfører målinger fra time-lapse confocal bilder, er det viktig å tenke på at noen utviklingsmessige forsinkelsen er forårsaket av prosessen. Utviklingsmessige forsinkelser er ikke uvanlig i mutant embryo også, så avbildning av søsken kontroller er nødvendig for både muterte / manipulert embryoer samt vill type kontroller. Selv når kontrollert for oppsetningen, er vanskelig sammenlignende måling av fluorescens-merket strukturer. Fluorescens intensitet kan være meget variabel mellom individer eller mellom separate deler av den samme strukturen. Dermed nondiscrete kvantitative målinger har en grad av subjektivitet, og vi anbefaler at mer enn ett individ utføre målinger for å sikre konsistens. Etterforskerne må også være disiplinerte i orientere embryoerfor sammenlignende måling konsekvent, som unnlatelse av å gjøre dette vil føre til utseendet på morfologiske forskjeller hvor det kan være ingen. Bevegelser av prøve embryoer kan regelrett ødelegge et eksperiment, og vi finner at å legge bedøvelse etter varmes i mikrobølgeovn agarose har fått lov til å tykne reduserer sin effekt i sederende embryoer.
Selv vanskelig å skaffe, time-lapse mikros data har åpenbare fordeler fremfor statiske bilder i sammenligne morphogenesis kvalitativt. Statiske bilder vil ofte tillate enkel måling av strukturer på et bestemt tidspunkt, men gir ingen indikasjon på vev atferd som fører opp til eller etter det stadiet. Slik informasjon er viktig når en skal studere samspillet mellom to eller flere separate vev gjennomgår morphogenesis. For å oppnå den beste totale karakterisering av morfogenese, er det fordelaktig å utføre begge av tidsforskjøvede og statiske analyser å best utnytte de fordeler ved hver metode. I tidsbortfalt analyserer, kan de dynamiske celler og vev oppførsel skal analyseres, og i statiske analyser, kan et stort antall embryoer undersøkes for å oppnå den beste forståelse av variabilitet. Det økende antall sebrafisk transgene linjer og avansement av andre teknikker vil gjøre time-lapse konfokalmikroskopi av flere vev banale, som real-time in vivo data blir gullstandarden blant morphogenesis forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Melissa Griffin og Jenna Rozacky for deres ekspert fisk omsorg. PDM takk EGN for å skrive hjelp, raushet og tålmodighet. Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDCR R01DE020884 til JKE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 lb Test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24 x 60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
References
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
