Summary
Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.
Abstract
Imagerie time-lapse est une technique qui permet l'observation directe du processus de morphogenèse, ou la génération de forme. En raison de leur clarté optique et la susceptibilité à la manipulation génétique, la embryon de poisson zèbre est devenu un organisme modèle populaire avec laquelle effectuer l'analyse time-lapse de la morphogenèse des embryons vivants. L'imagerie confocale d'un embryon de poisson zèbre direct requiert qu'un tissu d'intérêt est constamment marqué avec un marqueur fluorescent, comme un transgène ou d'un colorant injecté. Le processus exige que l'embryon est anesthésié et maintenu en place de manière à ce que le développement sain se déroule normalement. Paramètres pour l'imagerie doivent être définis pour tenir compte de la croissance en trois dimensions et à concilier les exigences de la résolution des cellules individuelles tout en obtenant des clichés de développement. Nos résultats démontrent la possibilité d'effectuer à long terme dans l'imagerie in vivo d'embryons de poisson zèbre de marquées par fluorescence et de détecter des comportements de tissus variés dansla crête neurale crânienne qui causent des anomalies cranio-faciales. Les retards de développement causés par l'anesthésie et le montage sont minimes, et les embryons sont sains et saufs par le processus. Embryons Time-lapse imagées peuvent être retournés pour un milieu liquide et ensuite imagés ou fixés à des points plus tard dans le développement. Avec une abondance croissante des lignes de poisson zèbre transgénique et cartographie sort bien caractérisé et techniques de transplantation, imagerie n'importe quel tissu désiré est possible. En tant que tel, time-lapse imagerie in vivo combine puissamment avec des méthodes génétiques de poisson zèbre, y compris les analyses des embryons mutants et micro-injection.
Introduction
Morphogenèse craniofaciale est un processus multi-étapes complexe qui nécessite des interactions coordonnées entre plusieurs types de cellules. La majorité du squelette cranio-facial est dérivé de cellules de la crête neurale, dont beaucoup doivent migrer du tube neural dorsal dans des structures appelées transitoires arcs branchiaux 1. Comme avec de nombreux tissus, la morphogenèse du squelette cranio-facial est plus complexe que ce qui peut être compris par des images statiques d'embryons à des points spécifiques de temps de développement. Bien que cela prend beaucoup de temps pour réaliser, in vivo microscopie time-lapse donnent un aspect continu à des cellules et des tissus d'un embryon en développement. Chaque image dans une série time-lapse prête contexte aux autres, et permet un mouvement d'enquêteur vers déduire pourquoi un phénomène se produit plutôt que de déduire ce qui se passe à ce moment-là.
L'imagerie in vivo est donc un outil descriptif puissant pour des approches expérimentales dedéconstruire les voies qui guident la morphogenèse. Le Danio rerio est un modèle génétique populaire du développement embryonnaire des vertébrés, et est particulièrement bien adapté pour l'imagerie in vivo de la morphogenèse. Moderne, des méthodes pratiques pour la transgenèse et la modification génomique sont progressent rapidement le nombre d'outils disponibles pour les chercheurs de poisson zèbre. Ces outils améliorent les méthodes déjà robustes pour la manipulation génétique et la microscopie. L'imagerie in vivo de presque n'importe quel tissu dans presque n'importe quel contexte génétique désiré est plus proche de la réalité que l'imagination.
Mouvements morphogénétiques des arcs branchiaux sont guidés par les interactions entre la crête neurale et l'épithélium adjacent, à la fois l'ectoderme et l'endoderme de signalisation. Il existe de nombreuses molécules de signalisation exprimés par l'épithélium qui sont nécessaires pour conduire la morphogenèse des éléments du squelette cranio-faciales. Parmi ces molécules de signalisation, Sonic Hedgehog (Shh) est d'une importance cruciale fou développement cranio-facial 2-8. Shh est exprimé à la fois par l'ectoderme bouche et du pharynx endoderme 2,6,9,10. L'expression de Shh dans l'endoderme régule les mouvements morphogénétiques des arceaux 10, la structuration de la crête neurale dans les arches 10, et la croissance du squelette cranio-facial 11.
Signalisation BMP est également d'une importance cruciale pour le développement cranio-facial 12 et peut modifier la morphogenèse des arcs branchiaux. Signalisation de la Bmp régule dorsale / ventrale structuration de crête dans les arcs branchiaux 13,14. Perturbation des Smad5 chez le poisson zèbre provoque des malformations graves palatines et un échec des cartilages de Meckel à fusionner de manière appropriée à la ligne médiane 15. En outre, les mutants présentent également des réductions et de la fusion des éléments du cartilage ventrale, avec le 2 ème, 3 ème et 4 ème éléments parfois pharyngée arc soudés à la ligne médiane 15. Ces fusions suggèrent fortement que la signalisation BMP dirige la morphogenèse de ces éléments du pharynx.
Signalisation PDGF est nécessaire pour le développement cranio-facial, mais a des rôles inconnus en arc branchial morphogenèse. La souris et le poisson zèbre ont mutants PDGFRA profonde clefting midfacial 16-18. Au moins chez le poisson zèbre ce clefting midfacial est due à un échec de la migration des cellules de la crête neurale bon 16. Cellules de la crête neurale continuent d'exprimer PDGFRA après qu'ils ont pénétré dans les arcs branchiaux. En outre, les ligands de PDGF sont exprimés par l'épithélium du visage et dans les arcs branchiaux 16,19,20, ainsi signalisation Pdgf pourraient également jouer un rôle dans la morphogenèse des arcs pharyngiens après la migration. Toutefois, les analyses de la morphogenèse des arcs pharyngiens dans des mutants de PDGFRA n'ont pas été effectuées.
Ici, nous démontrons dans la microscopie confocale in vivo de pharyngulune étape de poisson zèbre transgénique et décrire la morphogenèse des arcs pharyngiens dans ce délai. Nous démontrons en outre les comportements de tissus qui sont touchés par des mutations qui perturbent le BMP, le PDGF, et les voies de signalisation de Shh.
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Protocol
Une. Elevage et Mutant allèles
- Élever du poisson zèbre comme décrit 21.
- Allèles mutants de poisson zèbre utilisés dans cette étude étaient PDGFRA b1059 16, B1100 Smad5 22, et SMO b577 23. Sources de ces souches de poisson zèbre comprennent ZIRC.
2. Préparation des solutions et met en œuvre
Remarque: Toutes les solutions et les outils peuvent être faites à l'avance et stockés pour une utilisation future.
- Sensibiliser les médias de l'embryon (EM) comme décrit précédemment 21.
- Faire 4 g / L MS-222 (Tricaine). Dissoudre 4 g de phosphate disodique (Na 2 HPO 4) dans 450 ml d'eau stérile. Ajouter 2 g de MS-222 à la solution. Ajuster le pH à l'intérieur de 7,0 à 7,2. Ajouter de l'eau stérile pour obtenir un volume total de 500 ml.
- Facultatif: Faire 4 g / L d'huile de clou de girofle. Peser 0,2 g de l'huile de girofle pure dans un tube conique de 50 ml. Ajouter EM pour un volume total de 50 ml. Stocker à 4 ° C.
- Faire 3% methylcellulose. Apportez 50 ml de EM + 0,1 M HEPES à ébullition. Retirer du feu. Incorporer 1,5 g méthylcellulose jusqu'à ce que la solution est homogène. Stocker à 4 ° C.
- Faire 0,2% d'agarose. Ajouter 0,1 g d'agarose à 50 ml EM. EM apporter à ébullition dans le four micro-ondes ou sur une plaque chauffante et de vérifier que l'agarose soit dissous. Aliquote dans 500 volumes ul dans des microtubes et conserver à 4 ° C. Remarque: Les volumes peuvent être ajustés au besoin.
- Assurez-pokers capillaires. Déposer une goutte de super glue intérieur d'un tube capillaire 0,9 mm d'identité. Insérez une longueur de 4-5 cm de 6 ligne de pêche monofilament de livres test à l'intérieur du tube capillaire de telle sorte que d'environ 3-4 mm de la ligne s'étend au-delà de la fin du tube.
- Faire deux lamelles pontés par spécimen. Super-colle 22 x 22-1 couvercle verre à chaque extrémité d'un couvercle en verre 24 x 60-1 quitter le milieu libre. Faire simple (1 petit verre de couverture par la fin) pour les embryons de moins d'un jour vieux, double (deux petits verres de couverture sur le dessus de l'autre par la fin) pour les embryons de une à quatre days vieux, ou triples (3 petits verres de couverture sur le dessus de l'autre par la fin) pour les embryons de cinq jours ou plus âgés.
- Remplir une seringue de 10 ml avec de la graisse à vide élevé. Remarque: de la graisse à vide sert de matériau d'étanchéité pour prévenir la déshydratation des échantillons sur de longues périodes de temps, et a une faible toxicité potentielle par rapport à des produits d'étanchéité plus volatils.
3. Montage embryons de poisson zèbre pour la microscopie confocale (voir la figure 1)
- Préparer milieu anesthésique. Faire fondre une aliquote de 0,2% d'agarose par micro-ondes dans toutes les 20 secondes jusqu'à ce que complètement liquide. Mélanger 8 pi de MS-222 dans 192 ul de 0,2% d'agarose ou de 5 pi de 4 g / L de l'essence de girofle dans 195 ul de 0,2% d'agarose. Maintenir dans un bloc de chauffage à 42 ° C. Remarque: Une longue exposition au MS-222 provoque des retards de développement plus fort que l'huile de clou de girofle fait chez le poisson zèbre embryonnaire 24.
- Si nécessaire: dechorionate manuellement embryons transgéniques non éclos à analyser juste avant l'analyse. En utilisant des pinces, lentement tear le chorion ouvert jusqu'à l'embryon est libéré.
- Anesthésier les embryons de poisson zèbre. Ajouter 1 ml d'une 4 g / L stock de MS-222 24 ml de médias de l'embryon. Sinon, ajouter 390 ul de 4 g / L d'huile de clou de girofle pour 24 ml d'eau du poisson 24. Remarque: les actes de l'huile de girofle lentement pour effectuer cette étape au moins 15-20 minutes avant la microscopie time-lapse.
- Placer un cordon de graisse à vide autour de l'espace central d'une lamelle couvre-ponté orientée vers le haut. Pousser lentement la graisse à vide hors de la seringue, ce qui rend, d'un cordon lisse continue qui est adjacent à et à l'intérieur des ponts et le bord de la lamelle.
- Etaler un cercle de 4% de méthylcellulose dans le milieu de la lamelle couvre-objet en utilisant un applicateur à pont en bois.
- Transférer l'embryon à imager. Lorsque l'embryon est anesthésié tirer vers le haut dans une pipette en verre. Maintenir la pipette à la verticale afin de permettre à l'embryon de couler au fond du liquide dans la pipette. Déplacer la pipette dans la solution d'agarose et permettre à l'embryon de tomberdans l'agarose. Ne pas expulser le liquide.
- Placer l'échantillon. Dessiner une partie de la solution d'agarose et l'embryon dans la pipette. Expulser l'embryon dans une goutte de solution d'agarose sur le dessus de la méthylcellulose. Utilisez un tisonnier capillaire pour pousser l'embryon à la baisse sur la méthylcellulose et orienter l'embryon comme on le souhaite pour l'imagerie.
- Sceller l'échantillon.
- Placez une lamelle pont au-dessus d'une montée, vers le bas. Appliquer une pression uniforme sur les deux côtés des lamelles en sandwich jusqu'à ce que les ponts sont en contact direct et les joints d'abandon agarose à deux lamelles. Vérifiez que l'embryon est correctement orienté.
- Frottez un applicateur en bois le long de la vitre pour lisser les fissures et les lacunes dans le bourrelet de graisse à vide. Essuyez l'excès de graisse à partir des bords.
4. Time-lapse imagerie confocale de poisson zèbre transgénique embryons
(Ce protocole a été optimisé pour un Zeiss LSM 710 microscope confocal nousment logiciel d'imagerie ZEN, et peuvent être modifiés pour être utilisés avec d'autres systèmes.)
- Activer équipement. Allumez le microscope confocal et des dispositifs laser externes. Allumer l'ordinateur connecté au microscope confocal. Logiciel d'imagerie confocale Open et sélectionnez "Système Start" pour activer les commandes d'acquisition d'image.
- Préparer stade chauffé. Abaissez la plate-forme de mise en scène du microscope confocal et déplacer les lentilles de l'objectif hors de position. Remplacer la scène par défaut avec une scène électronique chauffée. Allumez le contrôleur de la platine chauffante et régler la température de 29,5 ° C.
- Placer l'échantillon dans le champ de vision. Placer l'échantillon montés sur la scène. Déplacez la lentille de l'objectif 20X en position et soulever la plate-forme de mise en scène. Activer l'émetteur de lumière visible et de regarder à travers les oculaires. Centrer la tête de l'embryon dans le champ de vision.
- Définir les paramètres du test.
- Activer les canaux de fluorescence en sélectionnantla longueur d'onde de fluorescence à détecter et choisissez tables des couleurs (LUT) pour chaque canal. Si nécessaire, utiliser les commandes manuelles dans le logiciel pour activer les lasers nécessaires (par exemple 561 nm pour DP). Pour chaque canal de fluorescence, réglez l'intensité du laser à 10,0 et la tension photomultiplicateur (HV ou le gain) entre 600-700. Réglez le calcul de la moyenne de quatre et la profondeur de bits à 16 bits.
- Activer les modules de la série Z-stack et time. Réglez le trou pour un Z-résolution 5 pm ou moins, et définir le Z-intervalle à la distance optimale suggéré.
Remarque: En général, 5 um Z-résolution permet chaque image Z-stack à collecter assez rapidement pour un «instantané» de l'embryon à un point de temps particulier, tout en la résolution des cellules individuelles. L'abaissement de la moyenne réduit également la quantité de temps par image. - Définir l'intervalle de temps désiré entre les images (généralement 10 à 20 mn) et la durée totale de l'expérience.
- Définir positioninformation.
- Mettez l'appareil photo en mode direct. Réglez la mise et augmenter l'intensité laser si nécessaire pour voir fluorescence. Réglez le zoom numérique à 0,6 pour une vue plus large, si désiré.
- Placez la scène de telle sorte que toutes les structures d'intérêt sont visibles et il ya de la place dans le champ de vision pour le dos prolongement et en avant. Concentrer l'embryon à travers les limites supérieure et inférieure de la fluorescence. Définissez les première et dernière positions Z-stack tranche d'au moins 100 um ou plus au-delà de ces limites.
- Optimiser l'intensité de la fluorescence.
- Réglez le LUT d'affichage à aller indicateur. Structures fluorescentes doivent maintenant apparaissent en blanc, et le reste du champ de vision doivent être bleues (pas de détection) ou noir.
- Augmenter HT / le gain à un niveau juste en dessous saturé (rouge) pixels apparaissent. Si nécessaire, régler le décalage si une majorité de l'arrière-plan n'est pas détecté (bleu). Remarque: diamètre du trou microscopique petit et augmentation de l'intensité du laser à la fois d'améliorer l'image defnition, mais intensité du laser doit être faible pour préserver les tissus vivants. Augmentation HT / gain et diamètre du trou microscopique (<5 um) sont généralement préférable d'augmentation de l'intensité du laser.
- Gardez le diamètre de trou d'épingle assez large pour recueillir des images en temps opportun, la moyenne des jeux à 4. Le Z-intervalle doit toujours être réglé à la distance optimale suggérée pour le diamètre de trou d'épingle. Effectuer des analyses de courte durée (moyenne = 1) avec des paramètres différents, et d'utiliser l'intensité du laser minimum qui permet d'atteindre la résolution désirée.
- Exécutez l'expérience pour la durée souhaitée. Ensuite, retirez embryon du stade chauffée et séparer lentement les lamelles. Immerger la lamelle et l'embryon dans EM dans une boîte de Pétri de 30 mm. En utilisant une pipette en verre laver doucement l'embryon hors de la lamelle et enlever la lamelle de la boîte de Pétri. Placez l'embryon dans un incubateur à 28,5 ° C pour continuer à se développer.
- Comparer la croissance. A la fin de l'expérience, prendre individu Zsimages de selleries d'embryons de frères agarose monté qui ont été mis en scène de manière similaire à l'échantillon au début de l'expérience, mais ont été soulevées dans EM dans un incubateur à 28,5 ° C.
- Mesurer arcs pharyngiens, au besoin. Les mesures peuvent être effectuées dans certaines suites logicielles confocale. Mesures trouvés ici ont été réalisées à l'aide Fiji25 par l'importation et Z saillie fichiers. LSM de cadres individuels.
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Representative Results
Chez les embryons de type sauvage, à la suite de neurones population de crête, les arcs pharyngiens allongés le long des antérieure / postérieure et dorsale / ventrale axes tout en se déplaçant dans une direction rostrale (Film 1). 30 heures après la fécondation (HPF), la longueur antérieure / postérieure du premier arc pharyngien est comprise entre 1.8 à 1.9 fois sa dorsale / ventrale hauteur. Dorsale / ventrale allongement procède régulièrement, plus rapide que l'extension antérieure / postérieure jusqu'à 36,5 HPF. De là, dorsale / ventrale plateaux de hauteur environ 104 um à 48 HPF. Prolongement antérieur / postérieure continue à 48 HPF, avec longueur totale antérieure / postérieure passant de moins de 1,5 fois la hauteur de dorsale / ventrale à 36,5 HPF à 1,95 fois la dorsale / ventrale hauteur à 48 HPF.
A son extrémité antérieure, le premier arc pharyngien forme maxillaire (dorsale) et mandibulaire domaines (ventrales) séparées par l'ectoderme oral. Le domaine maxillaire du premier arc pharyngien est mesurée felon son extrémité distale par rapport à l'apex postérieure de l'ectoderme oral. Il pousse à une vitesse évaluée par régression linéaire à 4,6 um / h (r 2 = 0,9374) entre 30-48 HPF et est d'environ 104 m de long à 48 HPF (film 1).
Arcs pharyngés 3-7 toute forme de la segmentation d'une seule masse de cellules de la crête neurale via le pharynx endoderme 26. Entre 30-38 HPF, la 5 e à 7 e arcs pharyngiens séparer de la masse, les 3 ème et 4 ème arcs ayant déjà séparés. Environ 37 HPF, le pharynx arc 3 ème commence à se déplacer dedans à la 2 ème arc. Latéralement, la 7 ème arc branchial dépasse les 5 e et 6 e arches en mouvement rostrale par 48 HPF, laissant la 3 e à 6 e arches interne à la 2 ème et 7 ème arcs (film 1).
Il est important de to noter que bien que la convention est de décrire la morphologie de HPF, microscopie ralentit légèrement la croissance de poisson zèbre par rapport aux embryons mis en scène de façon similaire cultivées dans un incubateur à 28,5 ° C. Par exemple, après 19 h de la microscopie, la distance entre l'œil et l'oreille d'un type sauvage embryon imagée était d'environ 81,7 um, et la distance moyenne œil-oreille pour deux embryons jumelles imagées immédiatement après était de 71 um. Par conséquent, les embryons sont susceptibles d'être légèrement plus jeune que la série de transit 27.
Ces mouvements morphogénétiques sont fortement perturbés dans des mutants de SMO. Comme décrit précédemment, les mutants SMO poisson zèbre ne parviennent pas à former une condensation maxillaire du premier arc, et de 48 HPF le premier arc pharyngien est complètement caudale à l'oeil 2. Postérieures mouvements en arc sont également perturbées 10. L'arc branchial 3 ème ne se déplace pas en dedans de l'arc branchial 2 ème et Movie 2 ème arc branchial ne migrer rostralement à chevaucher plusieurs arcs antérieurs de 48 HPF.
Mutants B1100 Smad5 poisson zèbre ont de nombreux défauts cranio-faciales, y compris une perte presque complète du squelette palatine et fusions ventrales entre la 2 ème, 3 ème, et parfois 4 ème pharynx éléments arc squelettiques 15, ce qui suggère qu'il peut y avoir des défauts à arc pharyngien morphogenèse . En effet, l'imagerie confocale statique démontré fusions dans les domaines ventrale de la 2 ème et 3 ème arcs sont apparents de 32 HPF (Figure 2). Utilisation de time-lapse microscopie confocale, nous avons analysé la morphogenèse des arcs pharyngiens dans Smad5 mutants. Dans les analyses de time-lapse, des fusions entre les 2ème et 3ème arcs apparaissent d'abord à 32 HPF, compatible avec l'analyse statique (Movie 3, figure 3). De plus,mutants Smad5 ont perturbé prolongement du premier arc pharyngien (Movie 3). Au 30 HPF, la longueur antérieure / postérieure du premier arc pharyngien (186,8 um) est de plus de 35% plus longue que dans le type sauvage, et 2,5 fois la dorsale / ventrale hauteur du premier arc pharyngien dans un mutant Smad5. Cependant, comme le bord postérieur se déplace rostrale, la longueur antérieure / postérieure du premier arc pharyngien diminue de près de 40 um entre 30-39 hpf puis retrouve cette longueur par 48 hpf. La dorsale / ventrale hauteur de la première arche du pharynx diminue de façon constante à 62,3 um 30-48 HPF. Le défaut de l'extension antéro pendant ce temps se reflète dans le domaine du maxillaire supérieur, qui est exceptionnellement longue (85 pm) à 30 hpf par rapport au type sauvage. Longueur maxillaire diminue à une vitesse évaluée par régression linéaire à 4,4 um / h (r 2 = 0,9032) de 30 à 36 HPF, et reste assez constante par la suite. Ici, imagerie time-lapse montre ti uniquesssu mouvements qui peuvent expliquer la perte du squelette palatine observée chez les mutants Smad5.
Bien que l'expression des membres de la famille PDGF suggère qu'il peut être largement impliquée dans la morphogenèse du pharynx arc, le mouvement des arcs postérieurs apparaît normale dans les mutants de PDGFRA. C'est la morphogenèse du premier arc pharyngien qui apparaît particulièrement perturbé (Film 4). La taille globale du premier arc pharyngien est réduite par rapport au type sauvage, et le domaine maxillaire apparaît très plastique, avec des cellules de condensation et de retrait du fil du temps. Il en résulte une insuffisance de l'allongement maxillaire, qui culmine autour de 39 HPF à 56,5 um. À 48 HPF, les mesures de domaine maxillaires seulement 44,1 um. Collectivement, ces résultats montrent que les analyses de time lapse attention peuvent fournir des détails de la morphogenèse potentiellement perdues dans les analyses statiques.
Figure 1. Schéma de construction de lamelle ponté et embryon de montage pour la microscopie confocale.
. Figure 2 Les deuxième et troisième arcs fusionnent dans des mutants Smad5 (A, B) à l'unité Z tranches d'une (A) FLI1: EGFP et un (B) FLI1: de egfp; Smad5 embryon mutant B1100.. (A) Les embryons de type sauvage pour Smad5, les cellules de la crête neurale dans la deuxième et la troisième arche sont séparés par la deuxième poche pharyngée (tête de flèche). (B) des cellules de la crête neurale à la limite ventrale du secoarcs ème et troisième s'entremêlent dans des mutants Smad5 (tête de flèche). Arcs pharyngés sont numérotées. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Perte de résultats de la fonction Smad5 dans perturbé arc branchial morphogenèse. (A, B, panneaux supérieurs) et les projections (panneaux inférieurs) vues orthogonales de voûte fusion dans Movie 3. Fusion de deux et trois arches est évident, pointe de flèche. Arcs pharyngés sont numérotées. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Film 1. Développement du pharynxarcs en un de type sauvage (FLI1: egfp) embryon 30-48 HPF. Antérieure à gauche, dorsale vers le haut. Cliquez ici pour voir le film.
Movie 2. Mouvements médians des arcs pharyngiens échouent dans des mutants de SMO (FLI1: EGFP; SMOB 577) antérieur à la gauche, dorsale vers le haut.. 30-48 HPF. Cliquez ici pour voir le film.
Movie 3. Les 2 e et 3 e arcs fusionnent dans des mutants Smad5 (FLI1: egfp; B1100 Smad5) antérieur à la gauche, dorsale vers le haut.. Série de projections (A), 30-48 HPF, et (B) des tranches de Z simples, 30-40 HPF. Cliquez ici pour voir le film.
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Discussion
Time-lapse microscopie confocale est un outil puissant pour l'analyse du développement. Ici, nous démontrons l'utilité de la méthode dans l'étude de la morphogenèse arc branchial chez le poisson zèbre qui sont mutantes pour voies de signalisation importantes en utilisant un transgéniques qui marque les cellules de la crête neurale. En plus du niveau des tissus analyses, des analyses de déchéance de temps sont également applicables à des analyses à l'échelle cellulaire 28. De nombreuses méthodes de poisson zèbre largement utilisés peuvent également être incorporés dans des expériences de microscopie time-lapse, y compris une micro-injection des morpholinos, des ARNm, ou des constructions transgéniques, ainsi que des transplants entre des embryons. L'analyse de plusieurs tissus en développement est limité seulement par la capacité de l'étiquette par fluorescence des tissus et par la capacité d'un microscope confocal à détecter le nombre souhaité de différents fluorophores sans diaphonie. Le nombre de personnes qui peuvent être imagées d'un embrayage d'embryons de poisson zèbre est très limité, mais les techniques avancéespermettre l'imagerie automatisée de plusieurs embryons dans le même laps de temps. Ceci est particulièrement utile quand on cherche à effectuer une analyse time-lapse d'un mutant qui n'est pas facilement identifiable à des moments précoces.
Pour effectuer des mesures de time-lapse images confocales, il est important de considérer que certains retards de développement est causée par le processus. Les retards de développement ne sont pas rares dans les embryons mutants ainsi, si l'imagerie des contrôles fratrie est nécessaire pour les deux embryons mutants / manipulés ainsi que des contrôles de type sauvage. Même une fois contrôlé pour la mise en scène, la mesure comparative des structures marquées par fluorescence est difficile. L'intensité de fluorescence peut être très variable entre les individus et entre des parties distinctes de la même structure. Ainsi, des mesures quantitatives nondiscrete ont un degré de subjectivité, et nous recommandons que plus d'une personne d'effectuer des mesures pour assurer la cohérence. Les chercheurs doivent aussi être sanctionnés dans l'orientation des embryonspour la mesure comparative constante, que le défaut de le faire entraînera l'apparition de différences morphologiques où il peut y avoir aucun. Mouvements d'embryons de spécimens peuvent carrément ruiner une expérience, et nous trouvons que l'ajout d'anesthésie après l'agarose au micro-ondes a été autorisé à épaissir réduit son efficacité dans sédatif embryons.
Bien que difficile à acquérir, les données de microscopie time-lapse ont des avantages évidents sur les images statiques en comparant la morphogenèse qualitativement. Images statiques permettent souvent de mesurer facilement les structures à un certain point dans le temps, mais ne donnent aucune indication de comportements de tissus qui ont précédé ou suivi ce stade. Cette information est cruciale pour l'étude des interactions entre deux ou plusieurs tissus différents subissant la morphogenèse. Afin d'obtenir la meilleure caractérisation globale de la morphogenèse, il est avantageux d'effectuer deux analyses de temps écoulé et statique d'utiliser au mieux les avantages de chaque méthode. Dans la ana de temps écoulélyses, les comportements de cellules et de tissus dynamiques peuvent être analysées et, dans les analyses statiques, un grand nombre d'embryons peuvent être examinées pour tirer le meilleur compréhension de la variabilité. Le nombre croissant de lignées transgéniques de poisson zèbre et la promotion d'autres techniques fera time-lapse microscopie confocale de multiples tissus banales, comme en temps réel des données in vivo devient l'étalon-or entre les chercheurs de morphogenèse.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Melissa Griffin et Jenna Rozacky pour leurs soins de poissons d'experts. PDM grâce EGN pour aide à la rédaction, la générosité et la patience. Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR R01DE020884 à JKE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 lb Test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24 x 60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
References
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