Summary
الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة.
Abstract
الوقت الفاصل بين التصوير هو الاسلوب الذي يسمح لمراقبة مباشرة لعملية التشكل، أو جيل من الشكل. بسبب درجة وضوحها البصرية وقابليته للتلاعب الجيني، أصبح الجنين الزرد كائن نموذج شعبية مع الذي لإجراء تحليل الوقت الفاصل بين التشكل في الأجنة الحية. التصوير متحد البؤر من جنين الزرد الحية يتطلب أن الأنسجة من الاهتمام هو المسمى باستمرار مع علامة فلوري، مثل التحوير أو صبغ حقن. يطالب العملية أن الجنين هو تخدير والذي عقد في مكان في مثل هذه الطريقة التي التنمية الصحية العائدات بشكل طبيعي. يجب أن يتم تعيين المعلمات من أجل التصوير لحساب نمو ثلاثي الأبعاد، وتحقيق التوازن بين مطالب حل الخلايا الفردية حين الحصول على لقطات سريعة من التنمية. نتائجنا تثبت القدرة على أداء على المدى الطويل في مجال التصوير المجراة من الأجنة الزرد المسمى مضان وللكشف عن السلوكيات الأنسجة المتنوعة فيقمة الجمجمة العصبية التي تسبب تشوهات القحفي. تأخر في النمو الناجمة عن التخدير وتركيب هي الحد الأدنى، والأجنة دون أن يمسهم سوء من قبل العملية. يمكن إرجاع الأجنة الوقت الفاصل بين تصوير والمتوسطة السائل وبعد ذلك تصويرها أو ثابتة في نقطة لاحقة في عملية التنمية. مع وفرة متزايدة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا ورسم الخرائط مصير تتميز جيدا وتقنيات زرع، والتصوير أي نوع من الأنسجة المطلوب هو ممكن. على هذا النحو، والوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي يجمع بقوة مع الأساليب الوراثية الزرد، بما في ذلك تحليل الأجنة متحولة وmicroinjected.
Introduction
التشكل القحفي معقدة عملية متعددة الخطوات التي تتطلب التفاعلات المنسقة بين أنواع خلايا متعددة. مشتق غالبية الهيكل العظمي القحفي من الخلايا العصبية قمة، وكثير منها يجب أن يهاجر من الظهرية الأنبوب العصبي في الهياكل عابرة يسمى الأقواس البلعومية 1. كما هو الحال مع العديد من الأنسجة، التشكل من الهيكل العظمي القحفي هو أكثر تعقيدا مما يمكن أن يكون مفهوما من قبل صور ثابتة الأجنة في نقاط محددة الوقت التنموية. على الرغم من أنها لأداء تستغرق وقتا طويلا، ويوفر في الجسم الحي الوقت الفاصل بين المجهري نظرة المستمر في الخلايا والأنسجة الجنين النامي. كل صورة في سلسلة الوقت الفاصل بين يقرض السياق إلى الآخرين، ويساعد تحرك المحقق نحو استنتاج سبب حدوث ظاهرة بدلا من استنتاج ما يحدث في ذلك الوقت.
في الجسم الحي التصوير هو بالتالي أداة قوية لنهج وصفي التجريبية لتفكيك مسارات التي توجه التشكل. ودانيو rerio الزرد هو نموذج الجيني شعبية من التطور الجنيني الفقاريات، وبشكل خاص مناسبة تماما لفي الجسم الحي التصوير من التشكل. الحديثة، وأساليب مريحة لنقل الجينات والتعديل الجيني تتقدم بسرعة عدد الأدوات المتاحة للباحثين الزرد. هذه الأدوات تحسين أساليب قوية بالفعل للتلاعب الجيني والمجهري. في الجسم الحي التصوير من النسيج تقريبا أي في أي سياق الوراثية المطلوب تقريبا هو اقرب الى الواقع من الخيال.
وتسترشد الحركات التخلق من الأقواس البلعومية بواسطة إشارات التفاعلات بين قمة العصبية وظهائر المجاورة، سواء الأديم الظاهر الأديم الباطن و. هناك العديد من الجزيئات يشير أعرب عنها ظهائر والتي هي ضرورية لدفع التشكل من عناصر الهيكل العظمي القحفي. بين هذه الجزيئات يشير، سونيك القنفذ (شش) هو و أهمية حاسمةأو تطوير القحفي 2-8. وأعرب عن شش كل من الأديم الظاهر الأديم الباطن الفم والبلعوم 2،6،9،10. التعبير عن شش في الأديم الباطن ينظم الحركات التخلق من الأقواس 10، الزخرفة من قمة العصبية داخل الأقواس 10، ونمو الهيكل العظمي القحفي 11.
BMP يشير أيضا أهمية حاسمة للتنمية القحفي 12، ويمكن تغيير التشكل من الأقواس البلعومية. BMP إشارات ينظم ظهري / بطني الزخرفة من قمة داخل الأقواس البلعومية 13،14. تعطل smad5 في الزرد يسبب تشوهات الحنك الشديد وفشل الغضاريف وميكل لتندمج بشكل مناسب في خط الوسط 15. بالإضافة إلى ذلك، عرض المسوخ أيضا تخفيضات والانصهار في العناصر الغضروف بطني، مع الثانية 2، 3 الثالثة، وأحيانا عناصر ال 4 البلعوم القوس تنصهر في خط الوسط 15. هذه اندماج توحي بقوة تلك BMP إشارات يوجه التشكل من هذه العناصر البلعوم.
PDGF إشارات ضرورية للتنمية القحفي، ولكن لديها أدوار معروفة في البلعوم القوس التشكل. كلا الماوس والمسوخ Pdgfra الزرد ديك عميقة clefting midfacial 16-18. على الأقل في الزرد ويرجع ذلك إلى فشل السليم الهجرة الخلية قمة العصبية 16 هذا clefting midfacial. تستمر الخلايا العصبية للتعبير عن قمة pdgfra بعد أن تكون قد دخلت الأقواس البلعومية. بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير بروابط PDGF بواسطة ظهائر الوجه وداخل الأقواس البلعومية 16،19،20، وبالتالي PDGF الإشارات ويمكن أيضا أن تلعب دورا في التشكل من الأقواس البلعومية التالية الهجرة. ومع ذلك، يحلل من التشكل من الأقواس البلعومية في المسوخ pdgfra لم يتم تنفيذها.
هنا، علينا أن نظهر في الجسم الحي المجهري متحد البؤر من pharyngulمرحلة-الزرد المعدلة وراثيا ووصف التشكل من الأقواس البلعومية خلال هذه الفترة. نحن كذلك إظهار السلوكيات الأنسجة التي تتأثر الطفرات التي تعطل BMP و PDGF، وشش مسارات الإشارات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تربية الحيوان والمسخ جمع أليل
- رفع وتولد الزرد كما هو موضح 21.
- كانت الأليلات الطافرة الزرد المستخدمة في هذه الدراسة pdgfra b1059 16، B1100 smad5 22، وSMO b577 23. مصادر لهذه السلالات الزرد تشمل ZIRC.
2. إعداد حلول وتطبيقات
ملاحظة: جميع الحلول والأدوات يمكن أن يتم في وقت مبكر وتخزينها لاستخدامها في المستقبل.
- جعل وسائل الإعلام الجنين (EM) كما هو موضح سابقا 21.
- جعل 4 ز / L MS-222 (تريكين). حل 4 غ فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4) في 450 مل من الماء المعقم. إضافة 2 غ MS-222 إلى الحل. ضبط درجة الحموضة إلى 7،0-7،2 داخل. إضافة الماء المعقم إلى وحدة تخزين ما مجموعه 500 مل.
- اختياري: جعل 4 جرام / لتر زيت القرنفل. تزن 0.2 غرام زيت القرنفل النقي في أنبوب 50 مل المخروطية. إضافة EM إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل. تخزين عند 4 درجات مئوية.
- جعل 3٪ methylcelluloحد ذاتها. جلب 50 مل من EM + 0.1 M HEPES ليغلي. إزالة من الحرارة. ضجة في 1.5 غرام ميثيل حتى الحل هو متجانس. تخزين عند 4 درجات مئوية.
- جعل 0.2٪ الاغاروز. إضافة 0.1 غ الاغاروز إلى 50 مل EM. جلب EM ليغلي في الميكروويف أو على موقد والتحقق من أن الاغاروز قد حلت. قسامة في 500 مجلدات ميكرولتر في أنابيب microcentrifuge وتخزينها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يمكن تعديل وحدات التخزين حسب الحاجة.
- جعل المساعر الشعرية. ضع قطرة من الغراء عظمى داخل أنبوب شعري 0.9 ملم معرف. إدراج طول 4-5 سم من 6 £ اختبار حيدة خط الصيد داخل الأنبوب الشعرية مثل أن ما يقرب من 3-4 ملم من خط يمتد إلى أبعد من نهاية الأنبوب.
- جعل اثنين coverslips سدها في العينة. سوبر الغراء 22 × 22-1 غطاء زجاجي على كل نهاية 24 × 60-1 غطاء زجاجي وترك الوسط المجانية. جعل الفردي (1 غطاء زجاجي صغير في النهاية) لأجنة أقل من يوم من العمر، يتضاعف (2 أكواب غطاء صغير على رأس كل منهما الآخر في النهاية) لأجنة 03:59 دAYS القديمة، أو مثلثات (3 أكواب غطاء صغير على رأس كل منهما الآخر في النهاية) لأجنة خمسة أيام أو أكثر.
- ملء حقنة 10 مل مع ارتفاع الشحوم فراغ. ملاحظة: يقدم فراغ الشحوم كما تسرب لمنع الجفاف العينات على مدى فترات طويلة من الزمن، ولها قدرة منخفضة السمية مقارنة المواد المانعة للتسرب أكثر تقلبا.
3. تصاعد الأجنة الزرد لمتحد البؤر المجهري (انظر الشكل 1)
- إعداد المتوسطة مخدر. تذوب قسامة من 0.2٪ الاغاروز بواسطة الميكروويف في 20 ثانية فترات حتى السائل تماما. مزيج 8 ميكرولتر من MS-222 في 192 ميكرولتر من 0.2٪ الاغاروز أو 5 ميكرولتر من 4 جرام / لتر زيت القرنفل في 195 ميكرولتر من 0.2٪ الاغاروز. المحافظة في 42 ° C كتلة التدفئة. ملاحظة: التعرض الطويل لMS-222 يسبب تأخر النمو أقوى من زيت القرنفل يفعل في الزرد الجنينية 24.
- إذا لزم الأمر: dechorionate يدويا الأجنة وراثيا لم يفقس ليتم تحليلها فقط قبل التحليل. باستخدام ملقط، الشركة المصرية للاتصالات ببطءع المشيماء مفتوحة حتى يتم تحرير الجنين.
- تخدير الأجنة الزرد. إضافة 1 مل من الأسهم 4 ز / L من MS-222-24 مل من وسائل الإعلام الجنين. بدلا من ذلك، إضافة 390 ميكرولتر من 4 جرام / لتر زيت القرنفل إلى 24 مل من الماء الأسماك 24. ملاحظة: الأفعال زيت القرنفل ببطء حتى تنفيذ هذه الخطوة لا يقل عن 15-20 دقيقة قبل الوقت الفاصل بين المجهري.
- وضع حبة من الشحوم فراغ حول مركز الفضاء من ساترة تواجه التصاعدي سدها. دفع ببطء الشحوم فراغ من حقنة، مما يجعل على نحو سلس، وحبة مستمرة المجاور لوالداخل من الجسور وحافة ساترة.
- تنتشر دائرة من 4٪ ميثيل في منتصف ساترة سدها باستخدام قضيب خشبي.
- نقل الجنين المراد تصويره. عندما يتم تخدير الجنين استدراجه حتى في ماصة الزجاج. عقد ماصة صعودا عموديا للسماح للجنين أن تنزل الى القاع من السائل في ماصة. نقل ماصة في الحل الاغاروز والسماح لإسقاط الجنينفي الاغاروز. لا طرد السائل.
- وضع العينة. رسم بعض الحلول الاغاروز والجنين في ماصة. طرد الجنين في قطرة من حل الاغاروز على أعلى من ميثيل. استخدام لعبة البوكر الشعرية لدفع الجنين نحو الانخفاض على ميثيل وتوجيه الجنين كما تريد للتصوير.
- ختم العينة.
- مكان واحد ساترة سد على رأس شنت واحد، أسفل. تنطبق حتى الضغط على كلا الجانبين لل coverslips محصورة حتى الجسور إجراء اتصال مباشر والأختام قطرة الاغاروز لكلا coverslips. تحقق من أن الجنين هو المنحى بشكل صحيح.
- فرك قضيب خشبي على طول الزجاج للتخفيف من الشقوق والفجوات في حبة الشحوم فراغ. يمحو الشحوم الزائدة من الحواف.
4. الوقت الفاصل بين متحد البؤر التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا الأجنة
(وقد تم تحسين هذا البروتوكول لزايس LSM 710 المجهر متحد البؤر بنايمكن تعديلها للاستخدام مع أنظمة أخرى جي برامج التصوير ZEN، و.)
- تفعيل المعدات. بدوره على المجهر متحد البؤر وأية أجهزة ليزر الخارجية. بدوره على جهاز كمبيوتر متصل المجهر متحد البؤر. برامج التصوير المفتوحة متحد البؤر وحدد "نظام تشغيل" لتفعيل ضوابط الحصول على الصور.
- إعداد مرحلة ساخنة. خفض منصة انطلاق المجهر متحد البؤر ونقل العدسات الهدف للخروج من الموقف. استبدال الافتراضي مع المرحلة مرحلة ساخنة الإلكترونية. تشغيل وحدة تحكم للمرحلة ساخنة وضبط درجة الحرارة ل29.5 درجة مئوية.
- وضع العينة في مجال الرؤية. وضع العينة التي شنت على خشبة المسرح. تحريك عدسة الهدف 20X في الموقف ورفع منصة انطلاق. تنشيط باعث الضوء المرئي وننظر من خلال العدسات. توسيط رأس الجنين في مجال الرؤية.
- تحديد إعدادات التجربة.
- تفعيل قنوات مضان من خلال تحديدالطول الموجي الفلورسنت ليتم الكشف عن واختيار لون الجداول البحث (طرفية) لكل قناة. إذا لزم الأمر، استخدام عناصر التحكم اليدوي في البرنامج لتشغيل الليزر المطلوبة (على سبيل المثال 561 نانومتر لRFP). لكل قناة مضان، تعيين كثافة الليزر إلى 10.0 والجهد مضخم (HV أو مكسب) بين 600-700. تعيين المتوسط إلى 4 وعمق بت إلى 16 بت.
- تفعيل Z-مكدس والوقت وحدات السلسلة. تعيين الثقب لقرار Z-5 ميكرون أو أصغر، وتعيين Z-الفاصل إلى مسافة الأمثل المقترحة.
ملاحظة: بشكل عام، 5 ميكرون Z-قرار يسمح كل صورة Z-مكدس التي سيتم جمعها بسرعة كافية ل"لقطة" من الجنين عند نقطة زمنية معينة بينما حل أيضا الخلايا الفردية. تخفيض المتوسط أيضا يقلل من مقدار الوقت لكل صورة. - تحديد الفاصل الزمني المطلوب الوقت بين الصور (عادة 10-20 دقيقة) ويبلغ طول التجربة.
- تعيين الموضعيةالمعلومات.
- تتحول الكاميرا إلى وضع الحية. ضبط التركيز وزيادة كثافة الليزر إذا لزم الأمر لمعرفة مضان. ضبط الزوم الرقمي إلى 0.6 للحصول على عرض أوسع، إذا رغبت في ذلك.
- ضع المرحلة بحيث كل الهياكل التي تهم واضحة، وهناك غرفة في مجال الرؤية لظهريا ثمرة والأمامية. التركيز من خلال الجنين الى الحدود العليا والدنيا من مضان. تعيين المناصب شريحة Z-كومة الأول والأخير لا يقل عن 100 ميكرون أو أكثر وراء هذه الحدود.
- تحسين كثافة مضان.
- تعيين طرفية عرض يتراوح المؤشر. يجب أن تظهر الآن الهياكل الفلورسنت الأبيض، وينبغي أن تكون بقية مجال الرؤية الأزرق (أي الكشف عن) أو أسود.
- زيادة HV / أرباح إلى مستوى أقل بقليل حيث المشبعة (الأحمر) بكسل تظهر. إذا لزم الأمر، وضبط تعويض ذلك لم يتم الكشف عن أغلبية الخلفية (الأزرق). ملاحظة: أصغر قطر الثقب وزيادة كثافة الليزر على حد سواء تحسين صورة مواطنهيجب أن تبقى inition، ولكن كثافة الليزر منخفض للحفاظ على الأنسجة الحية. زيادة HV / ربح وقطر الثقب (<5 ميكرومتر) أفضل بشكل عام إلى زيادة كثافة الليزر.
- الحفاظ على قطر الثقب واسعة بما يكفي لجمع الصور في الوقت المناسب، حيث بلغ متوسطها إلى 4 مجموعات. وينبغي دائما أن يتم تعيين الفاصل الزمني Z لبعد المسافة المثلى المقترحة لقطر الثقب. القيام بمسح قصيرة (المتوسط = 1) مع إعدادات مختلفة، واستخدام الحد الأدنى من كثافة الليزر الذي يحقق الدقة المطلوبة.
- تشغيل التجربة لمدة من الوقت المطلوب. بعد ذلك، وإزالة الجنين من مرحلة ساخنة وفصل ببطء لل coverslips. يغرق ساترة والجنين في EM في 30 ملم طبق بيتري. باستخدام ماصة الزجاج غسل بلطف الجنين الخروج من ساترة وإزالة ساترة من طبق بيتري. وضع الجنين في الحاضنة 28.5 درجة مئوية إلى مواصلة تطوير.
- قارن النمو. في نهاية التجربة، واتخاذ الفردية زينب صالحوأثيرت الصور تك الأجنة الأخوة محمولة الاغاروز التي نظمت على غرار العينة في بداية التجربة، ولكن في EM في حاضنة 28.5 درجة مئوية.
- قياس الأقواس البلعومية، حسب الحاجة. قياسات لا يمكن أن يؤديها في بعض الأجنحة البرمجيات متحد البؤر. أجريت القياسات وجدت هنا باستخدام Fiji25 عن طريق استيراد وZ-إسقاط الملفات. LSM من الأطر الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في البرية من نوع الأجنة بعد السكان قمة العصبية، الأقواس البلعومية استطال على طول الأمامي / الخلفي وظهري / بطني محاور بينما تتحرك في اتجاه منقاري (فيلم 1). في 30 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، وطول الأمامي / الخلفي من أول القوس البلعومية ما بين 1،8-1،9 مرات ظهري / بطني ذروته. ظهري / بطني استطالة العائدات بشكل مطرد، وأسرع من تمديد الأمامي / الخلفي حتى 36.5 HPF. من هنا، ظهري / بطني الهضاب ارتفاع حوالي 104 ميكرون من خلال 48 HPF. تواصل تمديد الأمامي / الخلفي خلال 48 HPF، مع طول العام الأمامي / الخلفي زيادة من تحت 1.5 مرة من ارتفاع ظهري / بطني في HPF 36.5 إلى 1.95 أضعاف ظهري / بطني ارتفاع بنسبة 48 HPF.
في نهايتها الأمامية، أول القوس البلعومية يشكل الفك العلوي (الظهرية) والفك السفلي (البطني) المجالات مفصولة الأديم الظاهر عن طريق الفم. يتم قياس المجال الفك العلوي من أول القوس البلعومية وROM طرفها البعيد لقمة الخلفي من الأديم الظاهر عن طريق الفم. أنها تنمو بمعدل يقترب من قبل الانحدار الخطي عند 4.6 ميكرون / ساعة (ص 2 = 0.9374) بين 30-48 HPF وحوالي 104 ميكرون طويلة في 48 HPF (فيلم 1).
الأقواس البلعومية 3-7 كل شكل من تجزئة كتلة واحدة من الخلايا العصبية قمة عبر الأديم الباطن البلعوم 26. بين 30-38 HPF، الموافق من 5 إلى 7 ال الأقواس البلعومية فصل من الكتلة، والثالثة 3 و 4 ال الأقواس بالفعل بعد فصلها. نحو 37 HPF، يبدأ 3 الثالثة البلعوم القوس للتحرك إعلامي إلى الثانية قوس 2. أفقيا، ال 7 البلعوم القوس يتفوق على ال 5 و 6 عشر الأقواس في حركة منقاري بنسبة 48 HPF، وترك الثالثة من 3 إلى 6 عشر الأقواس وسطي إلى الثانية 2 و 7 أقواس عشر (فيلم 1).
فمن المهم رس لاحظ أنه بالرغم من أن الاتفاقية هو لوصف التشكل في HPF، المجهري يؤخر قليلا نمو الأجنة الزرد مقارنة نظموا بالمثل نمت في حاضنة 28.5 درجة مئوية. على سبيل المثال، بعد 19 ساعة من الفحص المجهري، كانت المسافة بين العين والأذن من تصوير البرية من نوع الجنين حوالي 81.7 ميكرون، وكان متوسط المسافة العين الأذن لمدة الأجنة الأخوة تصويرها مباشرة بعد ذلك 71 ميكرون. لذلك، من المرجح أن تكون أصغر قليلا من سلسلة التدريج 27 الأجنة.
تتعطل هذه الحركات التخلق بشكل كبير في المسوخ SMO. كما هو موضح سابقا، تفشل المسوخ SMO الزرد لتشكيل التكثيف الفك العلوي من القوس الأول، وبنسبة 48 HPF أول القوس البلعومية هو الذيلية تماما للعين 2. كما تعطلت حركة القوس الخلفي 10. فشل البلعوم القوس 3 الثالثة لنقل الإنسي إلى 2 الثانية البلعوم القوس، وفيلم 2 ال 7 البلعوم القوس لترحيل rostrally لتتداخل مع أكثر الأقواس الأمامي بنسبة 48 HPF.
الزرد المسوخ B1100 smad5 دينا العديد من العيوب القحفي، بما في ذلك فقدان شبه كامل للهيكل عظمي الحنك واندماج بين بطني الثانية 2، 3 الثالثة، وأحيانا ال 4 البلعوم عناصر قوس الهيكل العظمي 15، مما يشير إلى أنه قد يكون هناك عيوب في البلعوم القوس التشكل . في الواقع، والتصوير متحد البؤر ثابت أثبت اندماج في المجالات البطنية من الثانية 2 و 3 أقواس طريق واضحة بنسبة 32 HPF (الشكل 2). باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر، قمنا بتحليل التشكل من الأقواس البلعومية في المسوخ smad5. في تحليل الوقت الفاصل، اندماج بين 2 و 3 أقواس تظهر للمرة الأولى في 32 HPF، بما يتفق مع تحليل ثابت (فيلم 3، الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك،عطلت المسوخ smad5 ثمرة من أول القوس البلعومية (فيلم 3). في 30 HPF، وطول الأمامي / الخلفي من أول القوس البلعومية (186.8 ميكرون) أطول أكثر من 35٪ مما كانت عليه في البرية من نوع، و2.5 مرة ظهري / بطني ارتفاع من أول القوس البلعومية في smad5 متحولة. لكن، وكما يتحرك الحافة الخلفية rostrally، وطول الأمامي / الخلفي من أول القوس البلعومية يقلل ما يقرب من 40 ميكرومتر بين 30-39 HPF ثم يستعيد هذا الطول بنسبة 48 HPF. ظهري / بطني ارتفاع من أول القوس البلعومية تتناقص باطراد إلى 62.3 ميكرون 30-48 HPF. ويتجلى عدم تمديد الأمامية خلال هذه الفترة في المجال الفك العلوي، وهو طويل بشكل استثنائي (85 ميكرون) في 30 HPF مقارنة من النوع البري. يقلل طول الفك العلوي بمعدل يقترب من قبل الانحدار الخطي عند 4.4 ميكرون / ساعة (ص 2 = 0.9032) 30-36 HPF، ويبقى متناسقا إلى حد ما بعد ذلك. هنا، يوضح الوقت الفاصل بين التصوير تي فريدة من نوعهاالحركات ssue التي قد تكون مسؤولة عن فقدان الهيكل العظمي حنكي لوحظ في المسوخ smad5.
في حين أن التعبير عن أفراد الأسرة PDGF يشير إلى أنه قد يكون متورطا بشكل واسع في البلعوم القوس التشكل، تظهر حركة الأقواس الخلفي العادي في المسوخ pdgfra. فمن التشكل من أول القوس البلعومية التي تظهر تعطلت تحديدا (السينما 4). يتم تقليل الحجم الكلي للقوس البلعومية الأولى بالنسبة إلى النوع البري، ويبدو المجال الفك العلوي من البلاستيك للغاية، مع الخلايا التكثيف وسحب على مر الزمن. هذه النتائج في فشل استطالة الفك العلوي، والذي يصل إلى ذروته حوالي 39 HPF في 56.5 ميكرون. في 48 HPF، التدابير مجال الفك العلوي فقط 44.1 ميكرون. بشكل جماعي، وتظهر هذه النتائج أن التحليلات الفاصل الزمني الدقيق يمكن أن توفر تفاصيل التشكل يحتمل أن خسر في التحليلات ثابت.
الشكل 1. تخطيطي الموصولة البناء ساترة والجنين المتزايدة للفحص المجهري متحد البؤر.
. الرقم 2 الصمامات والأقواس الثاني والثالث في المسوخ smad5 (A، B) Z واحدة من شرائح (A) fli1: EGFP و(B) fli1: EGFP؛ smad5 الجنين المسخ B1100. (أ) في الأجنة من النوع البري لsmad5، يتم فصل الخلايا العصبية قمة في القوس الثاني والثالث من الحقيبة البلعوم الثانية (رأس السهم). (ب) الخلايا العصبية قمة في حد البطنية من سكأقواس الثانية والثالثة تتداخل في المسوخ smad5 (رأس السهم). يتم ترقيم الأقواس البلعومية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. فقدان وظيفة نتائج smad5 في تعطلت البلعوم القوس التشكل. (A، B، لوحات العلوي) والتوقعات (لوحات أقل) مشاهدة متعامد الانصهار اللدود في فيلم 3. انصهار أقواس اثنين وثلاثة هو واضح، رأس السهم. يتم ترقيم الأقواس البلعومية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الفيلم 1. تطوير البلعومأقواس في البرية من نوع (fli1: EGFP) الجنين 30-48 HPF. الأمامي إلى اليسار، والظهرية إلى الأعلى. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
الفيلم 2. فشل الحركات وسطي من الأقواس البلعومية في المسوخ SMO (fli1: EGFP؛ smob 577) الأمامي إلى اليسار، والظهرية إلى الأعلى. 30-48 HPF. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
الفيلم 3. والثانية والثالثة 3 أقواس 2 الصمامات في المسوخ smad5 (fli1: EGFP؛ B1100 smad5) الأمامي إلى اليسار، والظهرية إلى الأعلى. سلسلة من (A) التوقعات، 30-48 HPF، و (ب) شرائح Z واحد، 30-40 HPF. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر هو أداة قوية لتحليل التنمية. هنا، علينا أن نظهر فائدة الأسلوب في دراسة البلعوم القوس التشكل في الزرد التي هي متحولة لمسارات الإشارات الهامة باستخدام الخلايا المعدلة وراثيا التي تصف قمة العصبية. بالإضافة إلى مستوى الأنسجة التحليلات، تحليلات مرور الوقت تنطبق أيضا على تحليلات على نطاق الخلوية 28. ويمكن أيضا أن تدمج العديد من الطرق المستخدمة على نطاق واسع في الزرد تجارب المجهري الوقت الفاصل، بما في ذلك Microinjection من morpholinos، mRNAs و، أو يبني المعدلة وراثيا، وكذلك زرع بين الأجنة. تحليل الأنسجة النامية متعددة محدود فقط من القدرة على تسمية fluorescently الأنسجة والقدرة المجهر متحد البؤر على الكشف عن العدد المرغوب فيه من fluorophores مختلفة دون الحديث المتبادل. يتم تقييد عدد الأفراد التي يمكن تصويرها من مخلب الأجنة الزرد بشدة، ولكن التقنيات المتقدمةيسمح التصوير الآلي من عدة أجنة في نفس الفترة الزمنية. وهذا مفيد خصوصا عندما تسعى إلى إجراء تحليل الوقت الفاصل بين المسخ التي لم يتم التعرف عليها بسهولة في نقاط زمنية مبكرة.
عند تنفيذ القياسات من الوقت الفاصل بين الصور مبائر، فمن المهم أن نرى أن بعض تأخر في النمو والناجم عن العملية. تأخر في النمو ليست غير شائعة في الأجنة متحولة كذلك، حتى التصوير من الأخوة الضوابط ضروري لكلا متحولة الأجنة / التلاعب بها وكذلك من النوع البري الضوابط. تسيطر ولو مرة واحدة للانطلاق، وقياس مقارن للهياكل المسمى مضان أمر صعب. كثافة مضان يمكن أن يكون اختلافا كبيرا بين الأفراد وبين أجزاء منفصلة من نفس الهيكل. وبالتالي، القياسات الكمية nondiscrete يكون على درجة من الذاتية، ونحن نوصي بأن أكثر من فرد أداء قياسات لضمان الاتساق. كما يجب أن تكون منضبطة المحققين في توجيه الأجنةلقياس نسبية على الدوام، وعدم القيام بذلك سوف يتسبب في ظهور الاختلافات المورفولوجية حيث قد يكون هناك شيء. يمكن للحركات الأجنة عينة التام الخراب تجربة، ونجد أن إضافة مخدر بعد أن تم السماح للالاغاروز المايكرويف لرشاقته يقلل من فعاليته في المسكنة الأجنة.
وإن كان من الصعب الحصول على بيانات المجهري الوقت الفاصل لديها مزايا واضحة على الصور الثابتة في المقارنة بين التشكل نوعيا. والصور الثابتة يسمح في كثير من الأحيان قياس سهلة الهياكل عند نقطة زمنية معينة، ولكن لا تعطي مؤشرا على السلوكيات المؤدية إلى الأنسجة أو بعد تلك المرحلة. مثل هذه المعلومات أمر حاسم عند دراسة التفاعلات بين اثنين أو أكثر من الأنسجة منفصلة تمر التشكل. من أجل الحصول على أفضل توصيف العام للالتشكل، فإنه مفيد لأداء كل من التحليلات في الوقت ساقطا وثابت للاستفادة من أفضل مزايا كل أسلوب. في الوقت ANA-ساقطاlyses، الخلية والأنسجة الحيوية السلوكيات يمكن تحليلها و، في التحليلات ثابت، أعداد كبيرة من الأجنة يمكن فحصها لاكتساب فهم أفضل لتقلبية. فإن عددا متزايدا من خطوط المعدلة وراثيا الزرد والنهوض غيرها من التقنيات جعل الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر من أنسجة متعددة شائعا، كما في الوقت الحقيقي البيانات فيفو يصبح معيار الذهب بين الباحثين التشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر ميليسا غريفين وجينا Rozacky لرعايتهم الأسماك الخبراء. الحركة الديمقراطية الشعبية وذلك بفضل EGN لكتابة المساعدة، والكرم، والصبر. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR R01DE020884 لJKE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 lb Test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24 x 60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
References
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
