Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

doi: 10.3791/51190 Published: January 30, 2014

Summary

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Abstract

Time-lapse beeldvorming is een techniek waarmee de directe observatie van het proces van morfogenese of het genereren van vorm. Door hun optische helderheid en ontvankelijkheid voor genetische manipulatie, heeft de zebravis embryo uitgegroeid tot een populaire modelorganisme waarmee time-lapse analyse van morfogenese voeren in levende embryo's. Confocale beeldvorming van een levende zebravis embryo vereist dat een van belang zijnd weefsel aanhoudend is gemerkt met een fluorescerende marker, zoals een transgen of geïnjecteerd kleurstof. De werkwijze vereist dat het embryo wordt verdoofd en bewaard op zodanige wijze dat gezonde ontwikkeling normaal verloopt. Parameters voor de beeldvorming moet worden ingesteld om rekening te houden driedimensionale groei en aan de eisen van het oplossen van individuele cellen terwijl het krijgen van snelle snapshots van ontwikkeling in evenwicht te brengen. Onze resultaten tonen het vermogen om op lange termijn te voeren in vivo beeldvorming van fluorescentie gelabelde zebravis embryo en gevarieerde weefsel gedrag detecterende craniale neurale dat craniofaciale afwijkingen veroorzaken. Ontwikkelingsstoornissen vertragingen veroorzaakt door de anesthesie en montage zijn minimaal, en embryo's zijn ongedeerd door het proces. Time-lapse afgebeeld embryo's kunnen worden teruggestuurd naar vloeibaar medium en vervolgens afgebeeld of vastgesteld op latere punten in ontwikkeling. Met een toenemende overvloed van transgene zebravis lijnen en goed gekarakteriseerd lot mapping en transplantatie technieken beeldvorming elke gewenste weefsel mogelijk. Als zodanig, time-lapse in vivo beeldvorming combineert krachtig met zebravissen genetische methoden, waaronder analyses van mutant en gemicroinjecteerd embryo's.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Craniofacial morfogenese is een complexe multi-step proces dat gecoördineerde interacties tussen verschillende celtypen vereist. De meeste craniofaciale skelet is afgeleid van neurale cellen, waarvan vele moeten migreren van de dorsale neurale buis in tijdelijke structuren genoemd pharynxbogen 1. Zoals met veel weefsels, morfogenese van het craniofaciale skelet is ingewikkelder dan kan worden begrepen door statische beelden van embryo op specifieke ontwikkelingsstoornissen tijdstippen. Hoewel het tijdrovend om uit te voeren, in vivo time-lapse microscopie wordt een continu blik op cellen en weefsels een ontwikkelend embryo. Elk beeld in een time-lapse serie leent context aan de anderen, en helpt een onderzoeker stap in de richting afleiden waarom een verschijnsel optreedt in plaats van af te leiden wat er gebeurt op dat moment.

In vivo beeldvorming is dus een krachtig instrument voor beschrijvende experimentele benaderingendeconstrueren de routes die morfogenese begeleiden. De zebravis Danio rerio is een populaire genetisch model van gewervelde embryonale ontwikkeling, en is bijzonder geschikt voor in vivo beeldvorming van morfogenese. Modern, worden geschikte methodes voor transgenese en genomische modificatie snel voortschrijdende het aantal tools beschikbaar om zebravis onderzoekers. Deze tools verbeteren reeds robuuste methoden voor genetische manipulatie en microscopie. In vivo beeldvorming van bijna elk weefsel in bijna elke gewenste genetische context is dichter bij de werkelijkheid dan de fantasie.

Morfogenetische bewegingen van de pharynxbogen worden geleid door signalering interacties tussen de neurale lijst en de aangrenzende epitheel, zowel ectoderm en endoderm. Er zijn tal van signaalmoleculen door de epitheel uitgesproken dat nodig is om de morfogenese van craniofaciale skelet elementen te rijden zijn. Onder deze signaalmoleculen, Sonic Hedgehog (Shh) is van cruciaal belang fof craniofaciale ontwikkeling 2-8. Shh wordt uitgedrukt door zowel de orale ectoderm en keelholte endoderm 2,6,9,10. De expressie van Shh in het endoderm regelt morfogenetische bewegingen van de bogen 10, het vormen van neurale binnen de bogen 10 en groei van het craniofaciale skelet 11.

Bmp signalering is ook van cruciaal belang voor craniofaciale ontwikkeling 12 en kunnen morfogenese van de pharynxbogen veranderen. BMP signalering regelt dorsale / ventrale patroonvorming van kuif binnen de pharynxbogen 13,14. Verstoring van Smad5 in zebravis veroorzaakt ernstige palatinale defecten en een falen van de Meckel's kraakbeen om adequaat te smelten bij de middellijn 15. Bovendien, de mutanten ook worden weergegeven verlagingen en smelten in het ventrale kraakbeen elementen, de 2e, 3e en 4e soms keelboog elementen gefuseerd aan de middellijn 15. Deze fusies suggereren sterk dat Bmp signalering leidt de morfogenese van deze pharyngeal elementen.

PDGF signalering is noodzakelijk voor craniofaciale ontwikkeling, maar heeft een onbekend rollen in keelboog morfogenese. Zowel de muis en zebravis PDGFRA mutanten hebben een diepgaande midfacial clefting 16-18. Tenminste in de zebravis dit midfacial clefting is te wijten aan een falen van de juiste neurale lijst cel migratie 16. Neurale cellen blijven PDGFRA uiten nadat ze de pharynxbogen hebt ingevoerd. Daarnaast worden Pdgf liganden uitgedrukt door gezichtsuitdrukkingen epitheel en in de pharynxbogen 16,19,20, dus Pdgf signalering kan ook een rol spelen bij morfogenese van de pharynxbogen volgende migratie. Echter, analyses van de morfogenese van het pharynxbogen in PDGFRA mutanten zijn niet uitgevoerd.

Hier laten we zien in vivo confocale microscopie van pharynguleen-fase transgene zebravis en beschrijven van de morfogenese van het pharynxbogen binnen deze periode. We tonen verder aan weefsel gedragingen die worden beïnvloed door mutaties die de BMP PDGF en Shh signaleringsroutes verstoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Dierhouderij en Mutant Allelen

  1. Verhogen en ras zebravis als beschreven 21.
  2. Zebravis mutante allelen die in deze studie waren PDGFRA B1059 16, Smad5 B1100 22 en SMO b577 23. Bronnen voor deze zebravis stammen omvatten Zirc.

2. Bereiding van oplossingen en implementeert

Opmerking: Alle oplossingen en werktuigen kunnen vooraf worden gemaakt en opgeslagen voor toekomstig gebruik.

  1. Voeg embryo medium (EM) zoals eerder beschreven 21.
  2. Maak 4 g / L MS-222 (tricaïne). Los op 4 g dinatriumfosfaat (Na 2 HPO 4) in 450 ml steriel water. Voeg 2 g MS-222 aan de oplossing. Breng de pH binnen 7,0-7,2. Voeg steriel water tot een totaal volume van 500 ml.
  3. Optioneel: Maak 4 g / L kruidnagelolie. Weeg 0,2 g pure kruidnagel olie in een 50 ml conische buis. Voeg EM tot een totaal volume van 50 ml. Bewaren bij 4 ° C.
  4. Maak 3% methylcellulose. Breng 50 ml van EM + 0,1 M HEPES aan de kook. Haal van het vuur. Roer 1,5 g methylcellulose tot de oplossing homogeen is. Bewaren bij 4 ° C.
  5. Voeg 0,2% agarose. Voeg 0,1 g agarose met 50 ml EM. Breng EM aan de kook in de magnetron of op een kookplaat en controleer of de agarose is opgelost. Aliquot in 500 gl volumes microcentrifugebuizen en bewaar bij 4 ° C. Opmerking: Volumes kan worden aangepast als dat nodig is.
  6. Maak capillaire poken. Breng een druppel superlijm in een 0,9 mm ID capillair. Plaats een 4-5 cm lengte van 6 £ proef monofilament vislijn in het capillair zodanig dat ongeveer 3-4 mm van de lijn na het einde van de buis.
  7. Maak twee overbrugd dekglaasjes per exemplaar. Super-lijm 22 x 22-1 dekglas op elk uiteinde van een 24 x 60-1 dekking van glas waardoor het midden vrij. Maak singles (1 kleine dekking van glas per einde) voor embryo's van minder dan een dag oud, verdubbelt (2 kleine deksel glazen bovenop elkaar per uiteinde) voor embryo 3:59 degen oud, of triples (3 kleine omslag bril op de top van elkaar per uiteinde) voor embryo's vijf dagen of ouder.
  8. Vul een 10 ml spuit met een hoog vacuüm vet. Opmerking: Vacuüm vet dient als een kit om uitdroging van specimens gedurende lange perioden van tijd te voorkomen, en heeft een laag potentieel voor toxiciteit in vergelijking met meer volatiele kit.

3. Montage zebravis embryo's voor confocale microscopie (zie figuur 1)

  1. Bereid verdoving medium. Smelt een hoeveelheid van 0,2% agarose door de magnetron in 20 seconden intervallen tot het volledig vloeibaar. Mix 8 gl MS-222 in 192 pl 0,2% agarose of 5 ul van 4 g / L kruidnagelolie in 195 ui van 0,2% agarose. Handhaven in een 42 ° C verwarmen blok. Let op: Langdurige blootstelling aan MS-222 veroorzaakt sterker vertraagde ontwikkeling dan kruidnagel olie doet in embryonale zebravis 24.
  2. Indien nodig: Handmatig dechorionate unhatched transgene embryo's te analyseren net vóór de analyse. Met behulp van een tang, langzaam tear het chorion open tot het embryo wordt bevrijd.
  3. Verdoven van de zebravis embryo's. Voeg 1 ml van een 4 g / L voorraad van MS-222-24 ml van embryo media. Als alternatief, voeg 390 ul van 4 g / L kruidnagel olie 24 ml vis water 24. Opmerking: Kruidnagel olie werkt langzaam, zodat het uitvoeren van deze stap minstens 15-20 minuten voor de time-lapse microscopie.
  4. Plaats een kraal van vacuüm vet rond het centrum ruimte van een naar boven gerichte overbrugd dekglaasje. Duw langzaam het vacuüm vet uit de spuit, waardoor een gladde, ononderbroken strook die grenst aan en de binnenkant van de bruggen en de rand van het dekglaasje.
  5. Spreid een cirkel van 4% methylcellulose in het midden van de gebrugde dekglaasje met een houten applicator.
  6. Breng de embryo te beelden. Wanneer het embryo wordt verdoofd het op te stellen in een glazen pipet. Houd de pipet verticaal om het embryo te zinken naar de bodem van de vloeistof in de pipet. Beweeg de pipet in de agarose oplossing en laat het embryo te laten vallenin de agarose. Laat de vloeistof niet te verdrijven.
  7. Plaats het monster. Teken enkele agarose-oplossing en het embryo in de pipet. Verdrijf het embryo in een druppel agarose oplossing bovenop de methylcellulose. Gebruik een capillair poker voor het embryo neerwaartse druk op de methylcellulose en oriënteren het embryo zoals gewenst voor de beeldvorming.
  8. Seal het monster.
    1. Plaats een overbrugde dekglaasje op de top van de gemonteerde een, naar beneden gericht. Solliciteer gelijkmatige druk op beide zijden van de ingeklemd dekglaasjes tot de bruggen maken direct contact en de agarose druppel afdichtingen aan beide dekglaasjes. Controleer of de embryo goed is georiënteerd.
    2. Wrijf een houten applicator langs de glazen te glad uit scheuren en gaten in de vacuüm vet kraal. Veeg overtollig vet van de randen weg.

4. Time-lapse confocale beeldvorming van transgene zebravis embryo's

(Dit protocol is geoptimaliseerd voor een Zeiss LSM 710 confocale microscoop onsing ZEN imaging software, en kan worden aangepast voor gebruik met andere systemen.)

  1. Activeren apparatuur. Zet de confocale microscoop en eventuele externe laser apparaten. Zet de computer is aangesloten op de confocale microscoop. Open confocale imaging software en selecteer "Start Systeem" om beeldopname besturingselementen opnieuw te gebruiken.
  2. Bereid verwarmde podium. Verlaag de enscenering platform van de confocale microscoop en verplaats de objectieven uit positie. Vervang de standaard podium met een elektronisch verwarmde podium. Zet de bedieningseenheid voor de verwarmde podium en stel de temperatuur 29,5 ° C.
  3. Plaats het model in het gezichtsveld. Plaats de gemonteerde monster op het podium. Verplaats de 20X objectief op zijn plaats en verhogen de enscenering platform. Activeer het zichtbare licht emitter en kijk door het oculair. Centreer hoofd van het embryo in het gezichtsveld.
  4. Definieer experiment instellingen.
    1. Activeer fluorescentie kanalen door te selecterende fluorescente golflengte te detecteren en kies kleur opzoektabellen (LUT) voor elk kanaal. Gebruik eventueel handmatige bediening in de software aan te zetten de nodige lasers (bijv. 561 nm voor RFP). Voor elke fluorescentie kanaal, stel de laser intensiteit tot 10,0 en de fotomultiplier voltage (HV of winst) tussen 600-700. Stel de middeling tot 4 en de bitdiepte 16 bit.
    2. Activeer de Z-stack en tijdreeksen modules. Stel de pinhole voor een 5 micrometer of kleiner Z-resolutie, en stel de Z-interval voor de voorgestelde optimale afstand.
      Opmerking: In het algemeen, 5 urn Z-resolutie maakt elk beeld Z-stack snel genoeg worden verzameld een "momentopname" van het embryo op een bepaald tijdstip tegelijkertijd sanering van afzonderlijke cellen. Het verlagen van de middeling vermindert ook de hoeveelheid tijd die per beeld.
    3. Definieer de tijd tussen twee beelden (meestal 10-20 min) en de totale lengte van het experiment.
  5. Stel positionelegegevens.
    1. Draai de camera om live-modus. Pas focus en verhogen laserintensiteit indien nodig fluorescentie te bekijken. Stel de digitale zoom tot 0,6 voor een breder zicht, indien gewenst.
    2. Plaats de fase zodanig dat alle structuren van belang zijn zichtbaar en er is ruimte in het gezichtsveld voor uitgroei dorsaal en ventraal. Focus via het embryo aan de boven-en ondergrenzen van de fluorescentie. Stel de eerste en laatste Z-stack slice posities ten minste 100 micrometer of meer buiten deze grenzen.
  6. Optimaliseren van fluorescentie-intensiteit.
    1. Stel de weergave LUT aan indicator bereik. Fluorescerende structuren moet nu wit, en de rest van het gezichtsveld moet blauw (geen detectie) of zwart zijn.
    2. Verhoog HV / gain tot een niveau net onder waar verzadigd (rood) pixels verschijnen. Pas zo nodig gecompenseerd zodat een meerderheid van de achtergrond wordt niet gedetecteerd (blauw). Opmerking: Kleinere pinhole diameter en verhoogde laserintensiteit beide verbeteren image definitio, maar laserintensiteit moet laag gehouden worden om levende weefsels te behouden. Verhoogde HV / gain en pinhole diameter (<5 micrometer) zijn over het algemeen de voorkeur aan grotere laserintensiteit.
    3. Houd de pinhole diameter breed genoeg om beelden te verzamelen in een tijdig, gemiddeld sets tot 4. Het Z-interval moet altijd worden ingesteld op de voorgestelde optimale afstand voor de pinhole diameter. Voer korte scans (gemiddelde = 1) met verschillende instellingen, en gebruik de minimale laser intensiteit die gewenste resolutie bereikt.
  7. Het experiment voor de gewenste tijdsduur. Daarna verwijder embryo uit de verwarmde podium en langzaam scheiden de dekglaasjes. Dompel het dekglaasje en embryo in EM in een 30 mm petrischaal. Met behulp van een glazen pipet voorzichtig te wassen het embryo uit van het dekglaasje en verwijder het dekglaasje van de petrischaal. Plaats het embryo in een 28,5 ° C incubator te blijven ontwikkelen.
  8. Vergelijk groei. Na afloop van het experiment, individuele positieve Zstack beelden van-agarose gemonteerde broer embryo's die op dezelfde wijze werden opgevoerd met het model aan het begin van het experiment, maar zijn gerezen in EM in een 28,5 ° C incubator.
  9. Meet pharynxbogen, indien nodig. Metingen kunnen worden uitgevoerd in een aantal confocale software suites. Metingen hier gevonden werden uitgevoerd met behulp Fiji25 door het importeren en Z-projecteren. Lsm dossiers van individuele frames.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In wild-type embryo's, volgende neurale bevolking, de pharynxbogen verlengen langs de anterior / posterior en dorsale / ventrale assen tijdens het verplaatsen in een rostrale richting (Film 1). Op 30 uur na de bevruchting (HPF), de voorste / achterste lengte van de eerste keelboog ligt tussen 1,8-1,9 maal de dorsale / ventrale hoogte. Dorsale / ventrale rek verloopt gestaag, sneller dan anterieure / posterieure verlenging tot 36,5 HPF. Vanaf hier dorsale / ventrale hoogte plateaus ongeveer 104 micrometer en met 48 HPF. Anterior / posterior uitbreiding gaat door 48 HPF, met algemene anterior / posterior lengte verhogen van onder 1,5 maal de dorsale / ventrale hoogte 36,5 HPF tot 1,95 maal de dorsale / ventrale hoogte op 48 hpf.

Op zijn voorste einde, de eerste keelboog vormt bovenkaak (dorsale) en onderkaak (ventrale) domeinen gescheiden door de orale ectoderm. De bovenkaak domein van het eerste keelboog wordt gemeten from zijn distale tip om het achterste punt van de orale ectoderm. Het groeit met een snelheid benaderd door lineaire regressie op 4,6 micrometer / uur (r 2 = 0,9374) tussen 30-48 HPF en is ongeveer 104 micrometer lang op 48 hpf (Film 1).

Pharynxbogen 3-7 alle vorm van de segmentatie van een enkele massa van neurale lijst cellen via de keelholte endoderm 26. Tussen 30-38 HPF, de 5 e tot en met 7 th pharynxbogen scheiden van de massa, de 3 e en 4 e bogen al hebben gescheiden. Rond 37 HPF, de 3 e keelboog begint te mediaal verplaatsen naar de 2 e boog. Lateraal, de 7 e keelboog haalt de 5 e en 6 e bogen in rostrale beweging met 48 HPF, het verlaten van de 3e tot 6e bogen mediaal van de 2 e en 7 e bogen (Film 1).

Het is belangrijk to er rekening mee dat, hoewel de conventie is om de morfologie beschrijven HPF, microscopie een lichte vertraging van de zebravis groei ten opzichte van dezelfde wijze geënsceneerd embryo's gekweekt in een 28,5 ° C incubator. Bijvoorbeeld na 19 uur van microscopie, de afstand tussen het oog en oor van een afgebeelde wildtype embryo ongeveer 81,7 urn, en de gemiddelde oog-oor verte twee broers en zussen embryo afgebeeld onmiddellijk daarna was 71 urn. Daarom embryo waarschijnlijk iets jonger dan de enscenering serie 27 zijn.

Deze morfogenetische bewegingen zijn sterk verstoord in SMO mutanten. Zoals eerder beschreven, zebravis SMO mutanten niet een maxillaris condensatie van de eerste boog te vormen, en 48 HPF de eerste keelboog volledig caudaal van het oog 2. Posterieure boog bewegingen worden ook verstoord 10. De 3 e keelboog nalaat mediaal verplaatsen naar de 2 e keelboog, en Movie 2 e keelboog nalaat rostraal migreren naar overlappen met meer voorste bogen met 48 HPF.

Zebravis Smad5 B1100 mutanten hebben tal craniofaciale afwijkingen, waaronder een bijna volledig verlies van de palatale skelet en ventrale fusies tussen de 2 e, 3 e en 4 e soms boog skelet elementen pharyngeal 15, wat suggereert dat er mogelijk defecten aan boog morfogenese keelholte . Inderdaad, statische confocale beeldvorming aangetoond fusies in de ventrale gebieden van de 2e en 3e bogen duidelijk door HPF 32 (figuur 2). Met behulp van time-lapse confocale microscopie, analyseerden we de morfogenese van de pharynxbogen in Smad5 mutanten. In analyseert time-lapse, fusies tussen de 2e en 3e bogen verschijnen eerst op 32 HPF, in overeenstemming met de statische analyse (Movie 3, figuur 3). Bovendien,Smad5 mutanten verstoord uitgroei van de eerste keelboog (Movie 3). Op 30 HPF, de anterior / posterior lengte van de eerste keelboog (186,8 micrometer) is meer dan 35% langer dan in wild-type en is 2,5 keer de dorsale / ventrale hoogte van de eerste keelboog in een Smad5 mutant. Echter, zoals de achterste rand beweegt rostraal, de anterior / posterior lengte van de eerste keelboog daalt bijna 40 micrometer tussen 30-39 HPF en dan herwint deze lengte met 48 HPF. De dorsale / ventrale hoogte van de eerste keelboog daalt gestaag tot 62,3 micrometer 30-48 HPF. Niet voorste verlenging gedurende deze tijd wordt weerspiegeld in de bovenkaak domein, die uitzonderlijk lang (85 urn) en 30 hpf vergelijking met wild type. Maxillaire lengte afneemt met een snelheid benaderd door lineaire regressie op 4,4 micrometer / uur (r 2 = 0,9032) 30-36 HPF, en blijft redelijk consistent daarna. Hier, time-lapse imaging toont unieke tissue bewegingen die goed zijn voor het verlies van de palatale skelet waargenomen in Smad5 mutanten.

Terwijl de expressie van Pdgf familieleden suggereert dat het in grote lijnen betrokken bij keelboog morfogenese kan zijn, lijkt de beweging van de achterste bogen normaal in PDGFRA mutanten. Het is morfogenese van de eerste keelboog dat verschijnt specifiek verstoord (Movie 4). De totale omvang van de eerste keelboog wordt verminderd ten opzichte van wild-type, en de bovenkaak domein lijkt sterk kunststof, met cellen condenseren of intrekking van de tijd. Dit resulteert in een falen van maxillaris rek die ongeveer 39 HPF pieken op 56,5 urn. Op 48 HPF, de bovenkaak domein meet slechts 44,1 micrometer. Tezamen zijn deze bevindingen tonen aan dat een zorgvuldige time lapse analyses details van de morfogenese potentieel verloren in statische analyses kan bieden.

Figuur 1 Figuur 1. Schema van gebrugde dekglaasje bouw en embryo montage voor confocale microscopie.

Figuur 2
. Figuur 2 Het tweede en derde bogen fuseren Smad5 mutanten (A, B) Single Z segmenten van een (A) FLI1: EGFP en een (B) FLI1: egfp; Smad5 B1100 mutant embryo.. (A) In embryo's wild-type voor Smad5, neurale cellen in de tweede en derde boog worden gescheiden door de tweede faryngeale zakje (pijlpunt). (B) Neurale cellen op het ventrale limiet van de second en derde bogen vermengen in Smad5 mutanten (pijlpunt). Pharynxbogen zijn genummerd. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Verlies van Smad5 functie resulteert in verstoorde keelboog morfogenese. (A, B, bovenste panelen) Projecties en (onderste panelen) orthogonale uitzicht boog fusie in Film 3. Fusie van bogen twee en drie is evident, pijlpunt. Pharynxbogen zijn genummerd. Klik hier voor grotere afbeelding.

Film 1. Ontwikkeling van de keelholtebogen in een wild-type (FLI1: EGFP) embryo 30-48 HPF. Anterior naar links, rug naar de top. Klik hier om de film te bekijken.

Movie 2. Mediale bewegingen van de pharynxbogen falen in SMO mutanten (FLI1: EGFP; SMOB 577) Voorafgaande aan de linker-, rug naar de top.. 30-48 hpf. Klik hier om de film te bekijken.

Movie 3. De 2 e en 3 e bogen fuseren Smad5 mutanten (FLI1: egfp; Smad5 B1100) Voorafgaande aan de linker-, rug naar de top.. Serie van (A) projecties, 30-48 HPF, en (B) enkele Z plakjes, 30-40 HPF. Klik hier om film te bekijken.

Movie 4. Verlenging van de bovenkaak regio faalt in PDGFRA mutanten (FLI1: egfp; PDGFRA B1059) Anterior naar links, rug naar de top.. 30-48 hpf. Klik hier om de film te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Time-lapse confocale microscopie is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van ontwikkeling. Hier tonen we het nut van de methode in het bestuderen keelboog morfogenese in zebravis die mutant voor belangrijke signalerende wegen met behulp van een transgeen dat neurale lijst cellen etiketten zijn. In aanvulling op het weefsel niveau analyseert, time lapse analyses zijn ook van toepassing op analyses op een cellulair schaal 28. Veel gebruikte zebravis methoden kunnen eveneens in time-lapse microscopie experimenten, waaronder micro-injectie van morpholinos, mRNA of transgene constructen en transplantaties tussen embryo's worden opgenomen. Analyse van meerdere ontwikkelende weefsels wordt alleen beperkt door het vermogen om fluorescent label weefsels en vermogen van een confocale microscoop om het gewenste aantal verschillende fluoroforen detecteren, zonder overspraak. Het aantal personen dat kan worden afgebeeld uit een koppeling van zebravis embryo's wordt ernstig beperkt, maar geavanceerde techniekenmaken geautomatiseerde beeldvorming van meerdere embryo's in dezelfde periode. Dit is vooral handig bij het zoeken naar een time-lapse analyse van een mutant die niet gemakkelijk te herkennen op vroege tijdstippen uit te voeren.

Wanneer de metingen van time-lapse confocale beelden, is het belangrijk om te overwegen dat sommige ontwikkelingsstoornissen vertraging wordt veroorzaakt door het proces. Ontwikkelingsstoornissen vertragingen zijn niet ongewoon in mutant embryo's zo goed, dus beeldvorming van sibling controles is noodzakelijk voor zowel mutant / gemanipuleerde embryo's alsmede wild-type controles. Zelfs een keer gecontroleerd voor enscenering, vergelijkende meting van de fluorescentie gelabelde structuren is moeilijk. Fluorescentie intensiteit kan zeer variabel zijn tussen individuen en tussen afzonderlijke delen van dezelfde structuur. Zo nondiscrete kwantitatieve metingen hebben een zekere mate van subjectiviteit, en we raden meer dan een afzonderlijke metingen uit te voeren om consistentie te waarborgen. Onderzoekers moeten ook worden gedisciplineerd in het oriënteren van embryo'svoor vergelijkende metingen consequent, zo niet te doen zal de verschijning van morfologische verschillen waar er geen kunnen veroorzaken. Bewegingen van specimen embryo's kunnen regelrechte ondergang een experiment, en we vinden dat het toevoegen van verdoving na de zeer correct agarose heeft gekregen om te verdikken vermindert de werkzaamheid bij sederende embryo.

Hoewel moeilijk te verwerven, time-lapse microscopie gegevens hebben duidelijke voordelen ten opzichte van statische afbeeldingen in het vergelijken van morfogenese kwalitatief. Statische beelden zal vaak maken een eenvoudige meting van de structuren op een bepaald tijdstip, maar geven geen indicatie van weefsel gedrag in de aanloop naar of na die fase. Dergelijke informatie is van cruciaal belang bij het bestuderen van de interactie van twee of meer afzonderlijke weefsels ondergaan morfogenese. Om de beste algemene karakterisering morfogenese verkrijgen, is het gunstig om tijd-vervallen en statische analyses optimaal gebruik maken van de voordelen van elke methode. In de tijd verstreken analyses, de dynamische cellen en weefsels gedrag kan worden geanalyseerd en, in statische analyses, kunnen grote aantallen embryo's worden onderzocht om de beste begrip van variabiliteit te krijgen. Het groeiende aantal zebravis transgene lijnen en de vooruitgang van andere technieken zal time-lapse confocale microscopie maken van meerdere weefsels gemeengoed, zoals real-time in vivo gegevens wordt de gouden standaard onder morfogenese onderzoekers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Melissa Griffin en Jenna Rozacky voor hun deskundige vis zorg. PDM dank EGN voor het schrijven van hulp, vrijgevigheid, en geduld. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCR R01DE020884 te JKE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 lb Test monofilament line Cortland Line Company SLB16
Agarose I Amresco 0710
Argon laser LASOS Lasertechnik GmbH LGN 3001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID FHC 30-31-0
Clove oil Hilltech Canada, Inc. HB-102
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator Fisher Scientific 2050FS
Laser scanning microscope Carl Zeiss AG LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific 12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1 Fisher Scientific 12-545-M
Potassium chloride Fisher Scientific M-11321
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Sodium chloride Fisher Scientific M-11624
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907
TempController 2000-2 PeCon GmbH
Tricaine-S Western Chemical, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
  2. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  3. Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  4. Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
  5. Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
  7. Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
  8. Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
  9. Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
  10. Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
  11. Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. (2011).
  12. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
  13. Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
  14. Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
  15. Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
  16. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
  17. Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
  18. Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
  19. Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
  20. Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). (1993).
  22. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
  23. Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
  24. Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  26. Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).More

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter