Summary
confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.
Abstract
זמן לשגות הדמיה היא טכניקה המאפשרת תצפית הישירה של תהליך המורפוגנזה, או הדור של צורה. בשל הבהירות האופטית שלהם ורמת מוכנות למניפולציה גנטית, עובר דג הזברה הפך אורגניזם מודל פופולרי שבה לביצוע ניתוח הזמן לשגות של המורפוגנזה בעוברי חיים. ההדמיה confocal של עובר דג הזברה לחיות דורשת כי רקמה של עניין היא שכותרתו בהתמדה עם סמן פלואורסצנטי, כגון transgene או צבע שהוחדר. התהליך דורש כי העובר הוא הרדים ושנערך במקום בצורה כזאת, שהתפתחות בריאה ממשיכה כרגיל. פרמטרים להדמיה חייבים להיות מוגדרים חשבון לצמיחה תלת ממדים וכדי לאזן את הדרישות של פתרון תאים בודדים תוך קבלת תמונות מהירות של פיתוח. התוצאות שלנו מראות את היכולת לבצע לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo של עוברי דג הזברה שכותרתו הקרינה ולזהות התנהגויות רקמה מגוונות בהרכס עצבי הגולגולת שגורמים למומי craniofacial. עיכובים התפתחותיים הנגרמים על ידי הרדמה והרכבה הם מינימאליים, והם עוברים ללא פגע על ידי התהליך. ניתן להחזיר עובר זמן לשגות הדמיה למדיום נוזלי ולאחר מכן צילם או קבוע בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. עם שפע הולך וגדל של קווים מהונדסים דג הזברה ומיפוי גורל מאופיין היטב וטכניקות השתלה, הדמיה כל רקמה רצויה אפשרית. ככזה, זמן לשגות בתחום ההדמיה vivo משלב עוצמה עם שיטות גנטיות דג הזברה, כוללים ניתוחים של עוברים שעברו מוטציה וmicroinjected.
Introduction
המורפוגנזה Craniofacial היא תהליך רב שלבים מורכב הדורש אינטראקציות מתואמות בין סוגי תאים מרובים. רוב שלד craniofacial נגזר מתאי רכס עצביים, שרבים מהם חייבים לעבור מ הצינור העצבי הגבי למבנים ארעיים שנקראים קשתות בלוע 1. כמו ברקמות רבות, המורפוגנזה של שלד craniofacial היא יותר מסובכת ממה יכול להיות מובן על ידי תמונות סטטיות של עוברים בנקודות זמן ההתפתחותי ספציפיות. למרות שזה הוא לבצע זמן רב, in vivo מיקרוסקופיה זמן לשגות מספקת מבט מתמשך בתאים של עובר המתפתח ורקמות. כל תמונה בסדרת הזמן לשגות מעניקה הקשר לאחרים, ומסייעת למהלך חוקר לכיוון של הסקה מדוע תופעה מתרחשת ולא הסיק את מה שמתרחש באותו זמן.
בתחום ההדמיה vivo הוא אפוא כלי תיאורים רב עוצמה לגישות ניסיוניות ללפרק את המסלולים המנחים המורפוגנזה. Rerio Danio דג הזברה הוא מודל גנטי פופולרי של התפתחות עוברית של בעלי החוליות, והוא מתאים במיוחד גם בתחום ההדמיה vivo של המורפוגנזה. מודרני, שיטות נוחים לtransgenesis ושינוי גנומי הן מתקדמות במהירות מספר הכלים העומדים לרשות חוקרי דג הזברה. כלים אלה לשפר את השיטות חזקות כבר למניפולציה ומיקרוסקופיה גנטיות. בvivo הדמיה של כמעט כל רקמה בכמעט כל קשר גנטי רצוי היא קרובה יותר למציאות מאשר לדמיון.
תנועות morphogenetic של קשתות בלוע הם מודרכים על ידי איתות אינטראקציות בין הרכס העצבי והאפיטל הסמוך, שניהם האאקטודרם והאנדודרם. ישנן מולקולות רבות איתות שהביעו האפיטל כי יש צורך לנהוג המורפוגנזה של אלמנטי שלד craniofacial. בין מולקולות האיתות הללו, סוניק קיפוד (ששש) הוא f החשובה באופן קריטיאו פיתוח craniofacial 2-8. ששש מתבטאים בשני האאקטודרם הפה ובלוע האנדודרם 2,6,9,10. הביטוי של ששש בהאנדודרם מסדיר תנועות morphogenetic של הקשתות 10, דפוסים של רכס עצבי בתוך הקשתות 10, וצמיחה של שלד craniofacial 11.
איתות bmp היא גם חשובה באופן קריטי לפיתוח craniofacial 12 ועשויה לשנות המורפוגנזה של קשתות בלוע. איתות bmp מסדירה גב / הגחון דפוסים של רכס בתוך קשתות בלוע 13,14. שיבוש של smad5 בדג הזברה גורם למומי חיך קשים וכישלון של סחוסים של המקלה הפתיל כראוי על קו האמצע 15. בנוסף, מוטציות גם להציג ירידות ואיחוי באלמנטי סחוס הגחון, עם nd 2, 3 rd, ולפעמים אלמנטי קשת בלוע 4 ה התמזגו בקו האמצע 15. שילובים אלו ממליצים כי איתות Bmp מכוונת המורפוגנזה של אלמנטי בלוע אלה.
איתות PDGF היא הכרחית להתפתחות craniofacial, אבל יש לו תפקידים ידועים בהמורפוגנזה קשת בלוע. עכבר ומוטציות PDGFRA דג הזברה לשניהם יש clefting midfacial העמוק 16-18. לפחות בדג הזברה clefting midfacial זאת בשל כישלונה של נדידת תאי רכס עצביים תקינה 16. תאי רכס עצביים ממשיכים להביע PDGFRA אחרי שהם נכנסו לקשתות בלוע. בנוסף, ligands PDGF באים לידי ביטוי על ידי epithelia פנים ובתוך קשתות בלוע 16,19,20, ובכך איתות PDGF יכולה גם לשחק תפקיד בהמורפוגנזה של קשתות בלוע בעקבות הגירה. עם זאת, ניתוח של המורפוגנזה של קשתות בלוע במוטנטים PDGFRA לא בוצעו.
הנה, אנחנו מדגימים במיקרוסקופיה confocal vivo של pharyngulבשלב דג הזברה מהונדס ולתאר את המורפוגנזה של קשתות בלוע בתוך תקופה זו. בנוסף, אנו מראים התנהגויות רקמה שמושפעות על ידי מוטציות המשבשות את BMP, PDGF, ומסלולי איתות ששש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול בעלי חיים וMutant אללים
- לגדל ולהרבות דג הזברה כמתואר 21.
- אללים מוטציה דג הזברה השתמשו במחקר זה היו PDGFRA b1059 16, B1100 smad5 22, וb577 SMO 23. מקורות לזני דג הזברה אלה כוללים Zirc.
2. הכנה של פתרונות ומיישמת
הערה: כל הפתרונות וכלים יכולים להתבצע מראש ולאחסן לשימוש עתידי.
- הפוך תקשורת עובר (EM) כפי שתואר 21 בעבר.
- הפוך 4 גר '/ ליטר MS-222 (Tricaine). לפזר 4 פוספט גרם disodium (Na 2 HPO 4) ב450 מיליליטר מים סטריליים. הוסף 2 גרם של MS-222 לפתרון. התאם ל-pH בתוך 7.0-7.2. מוסיף מים סטריליים להיקף כולל של 500 מיליליטר.
- אופציונאלי: הפוך שמן ציפורן 4 גר '/ ליטר. שוקל שמן ציפורן טהורה 0.2 גרם בצינור חרוטי 50 מיליליטר. הוספת EM להיקף כולל של 50 מיליליטר. חנות ב 4 ° C.
- הפוך methylcellulo 3%se. להביא 50 מיליליטר של EM + M 0.1 HEPES לרתיחה. מסירים מאש. מערבבים ב1.5 methylcellulose גרם עד שהתמיסה אחידה. חנות ב 4 ° C.
- הפוך agarose 0.2%. הוסף 0.1 agarose גרם ל50 EM מיליליטר. אביא אותם לרתיחה במיקרוגל או על פלטה חמה ולוודא כי agarose נמס. Aliquot לתוך 500 כרכי μl בmicrocentrifuge צינורות ולאחסן ב 4 ° C. הערה: ניתן להתאים כרכים בהתאם לצורך.
- הפוך דוקרנים נימים. מניחים ירידה של דבק סופר בתוך צינור נימים מזהה 0.9 מ"מ. הכנס אורך 4-5 סנטימטר של קו 6 £ מבחן monofilament דיג בתוך צינור הנימים כך שכ 3-4 מ"מ של קו משתרע מעבר לקצה הצינורית.
- בצע שני coverslips גישר לדגימה. Super-דבק 22 x 22-1 מכסה זכוכית על כל קצה של מכסה זכוכית 24 x 60-1 עוזבת באמצע בחינם. הפוך רווקים (1 מכסה זכוכית קטנה לסוף) לעוברים פחות מיום ישן, זוגות (2 כוסות כיסוי קטנות על גב אחד את השני לסוף) לעוברים 03:59 דays הישן, או משולשים (3 כוסות כיסוי קטנות על גב אחד את השני לסוף) לעוברים חמישה ימים ומעלה.
- ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום גבוה. הערה: גריז אבק משמש כחומר איטום על מנת למנוע התייבשות של דגימות על פני תקופות זמן ארוכות, ויש לו פוטנציאל נמוך לרעילות בהשוואה לחומרי איטום תנודתי יותר.
3. עוברי דג הזברה הרכבה למיקרוסקופיה confocal (ראה איור 1)
- להכין מדיום הרדמה. ממסים aliquot של agarose 0.2% על ידי במיקרוגל ב20 מרווחי שניות עד שנוזלים לחלוטין. מערבבים 8 μl של MS-222 ל192 μl של agarose 0.2% או 5 μl של שמן ציפורן 4 גר '/ ליטר ל195 μl של agarose 0.2%. לשמור בבלוק חימום 42 מעלות צלזיוס. הערה: חשיפה ארוכה ל-MS-222 גורמת לעיכובים התפתחותיים חזקים יותר משמן ציפורן עושה בדג זברה עוברי 24.
- במידת צורך: ידני dechorionate עוברים מהונדסים ביצה שלא נולדו כדי להיות מנותחים רק לפני הניתוח. בעזרת מלקחיים, te לאטar סיסית פתוח עד העובר הוא שוחרר.
- להרדים את עוברי דג הזברה. הוסף 1 מיליליטר של מניית 4 גר '/ ליטר של MS-222-24 מיליליטר של תקשורת עובר. לחלופין, להוסיף 390 μl של שמן ציפורן 4 גר '/ ליטר ל24 מיליליטר מים דגים 24. הערה: מעשי שמן ציפורן לאט כל כך לבצע שלב זה לפחות 15-20 דקות לפני מיקרוסקופיה הזמן לשגות.
- הנח טיפת שומן ואקום סביב מרחב מרכז coverslip גישר הפונה כלפי מעלה. לאט לאט לדחוף את גריז הוואקום מהמזרק, מה שהופך את חרוז חלק, רציף שנמצא בסמוך ולפנימי של הגשרים וקצה coverslip.
- מורחים מעגל methylcellulose 4% באמצע coverslip לגישור באמצעות המוליך עץ.
- העבר את העובר להיות צילם. כאשר העובר הוא מורדם לצייר אותו לתוך כוס טפטפת. החזק את פיפטה בצורה אנכית על מנת לאפשר לעובר לשקוע לתחתית של הנוזל בפיפטה. הזז את פיפטה לתוך פתרון agarose ולאפשר לעובר לרדתלagarose. אל תגרש את הנוזל.
- מניחים את הדגימה. צייר כמה פתרון agarose ואת העובר לתוך פיפטה. לגרש את העובר בירידה של פתרון agarose על גבי methylcellulose. השתמש בפוקר נימים לדחוף את העובר כלפי מטה על methylcellulose ולכוון את העובר כרצוי להדמיה.
- לאטום את הדגימה.
- מניחים coverslip גישר אחד על גבי רכוב אחד, פונה כלפי מטה. לחול גם לחץ על שני הצדדים של את coverslips דחוק עד הגשרים ליצור קשר ישיר וחותמות ירידת agarose לשני coverslips. ודא שהעובר הוא בכיוון נכון.
- לשפשף המוליך עץ לאורך הזכוכית כדי להחליק את סדקים ופערים בחרוז גריז ואקום. למחות שומן עודף מהקצוות.
4. זמן לשגות Confocal הדמיה של עוברי דג הזברה מהונדסים
(פרוטוקול זה כבר מותאם למיקרוסקופ confocal Zeiss LSM 710ing תוכנת הדמיה ZEN, והוא יכול להיות שונה לשימוש עם מערכות אחרות.)
- הפעל ציוד. הפעל מיקרוסקופ confocal וכל מכשירי לייזר חיצוניים. הפעל את המחשב מחובר למיקרוסקופ confocal. תוכנת הדמיה confocal הפתוח ובחר "מערכת התחל" כדי להפעיל את פקדי רכישת תמונה.
- הכן את הבמה מחוממת. מנמיכים את פלטפורמת האחסון הזמני של מיקרוסקופ confocal ולהעביר את העדשות אובייקטיביות מחוץ לעמדה. החלף את שלב ברירת המחדל עם במה מחוממת אלקטרונית. הפעל את הבקר לבמה המחוממת ולהגדיר את הטמפרטורה ל29.5 ° C.
- מקם את הדגימה בשדה הראייה. הנח את הדגימה רכוב על הבמה. להעביר העדשה האובייקטיבית 20X למצב ולגדל פלטפורמת הבימוי. הפעל את פולט האור הנראה ולהסתכל דרך העיני. מרכז את ראשו של העובר בשדה הראייה.
- להגדיר הגדרות ניסוי.
- הפעל ערוצי הקרינה על ידי בחירהאורך גל הניאון כדי להיות מזוהה ולבחור שולחנות בדיקת צבע (LUT) עבור כל ערוץ. במידת צורך, השתמש בפקדים ידניים בתוכנה כדי להפעיל את הלייזרים הנדרשים (למשל 561 ננומטר עבור RFP). עבור כל ערוץ הקרינה, הגדר את עוצמת הלייזר ל10.0 והמתח מכפיל (HV או רווח) בין 600-700. הגדר את המיצוע עד 4 ומעט עומק ל16 קצת.
- הפעל את המודולים סדרת Z-מחסנית וזמן. הגדר את חריר לרזולוציה-Z 5 מיקרומטר או קטן יותר, ולהגדיר את Z-המרווח למרחק האופטימלי שהציע.
הערה: באופן כללי, 5 ברזולוציה Z מיקרומטר מאפשרת לכל תמונת Z-מחסנית להיות שנאספו במהירות מספקת ל" צילום "של העובר בנקודת זמן מסוימת גם בעת פתרון תאים בודדים. הורדת המיצוע גם מפחיתה את כמות הזמן לכל תמונה. - הגדר את מרווח הזמן הרצוי בין תמונות (בדרך כלל 10-20 דק ') ואת האורך הכולל של הניסוי.
- הגדר positionalמידע.
- הפעל את המצלמה למצב חי. התאם את המיקוד ולהגביר את עוצמת לייזר במידת צורך כדי לראות הקרינה. הגדר את הזום הדיגיטלי ל0.6 לראייה רחבה יותר, אם תרצה בכך.
- מקם את הבמה באופן שכל המבנים של עניין גלויים ויש מקום בשדה הראייה לdorsally תולדה וanteriorly. תתמקד בעובר לגבולות העליונים ותחתונים של הקרינה. הגדר את העמדות הפרוסה Z-המחסנית הראשונה ואחרונים לפחות 100 מיקרומטר או יותר מעבר לגבולות אלה.
- לייעל את עוצמת הקרינה.
- הגדר את LUT התצוגה לטווח מחוון. מבני ניאון אמורים להופיע כעת לבנים, ושאר שדה הראיה צריך להיות כחול (אין זיהוי) או שחורים.
- הגדל HV / רווח לרמה ממש מתחת איפה רווי פיקסלים (אדום) יופיעו. במידת צורך, להתאים קיזוז כך רוב הרקע לא מזוהה (כחול). הערה: קטן יותר בקוטר חריר ועוצמת לייזר גדלה גם לשפר def תמונהinition, אבל עוצמת לייזר חייבת להישמר נמוכה כדי לשמור על רקמות חיות. HV / רווח גדל וקוטר חריר (<מיקרומטר 5) הם בדרך כלל עדיפים על עוצמת לייזר מוגברת.
- שמור את קוטר חריר רחב מספיק כדי לאסוף תמונות מבעוד מועד, עם ממוצע של ערכות ל4. Z-המרווח תמיד צריך להיות מוגדר למרחק האופטימלי הציע לקוטר חריר. לבצע סריקות קצרות (מיצוע = 1) עם הגדרות שונות, ולהשתמש בעוצמת הלייזר המינימלית שמשיגה רזולוציה רצויה.
- הפעל את הניסוי לכל האורך הרצוי של זמן. לאחר מכן, להסיר את העובר מן הבמה המחוממת ולהפריד לאט coverslips. להטביע את coverslip ועובר בEM בצלחת פטרי 30 מ"מ. בעזרת פיפטה זכוכית לשטוף בעדינות את העובר משל coverslip ולהסיר את coverslip מצלחת פטרי. מניחים את העובר לאינקובטור C ° 28.5 להמשיך ולפתח.
- שקלו את הצמיחה. בסוף הניסוי, תיקח ZS הבודדתמונות נקודת סימון של עוברי אח רכוב agarose שהועלו באופן דומה לדגימה בתחילת הניסוי, אבל הועלו בEM בחממה 28.5 מעלות צלזיוס.
- למדוד קשתות בלוע, במידת הצורך. ניתן לבצע מדידות בכמה חבילות תוכנת confocal. מדידות מצאו כאן בוצעו באמצעות Fiji25 ידי יבוא ו-Z-מקרין קבצים. LSM של מסגרות פרטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעוברי wild-type, בעקבות אוכלוסיית רכס עצבית, קשתות בלוע להאריך לאורך צירי הגחון קדמי / אחורי וגב / תוך כדי התנועה בכיוון מקורי (סרט 1). ב30 שעות לאחר הפריה (hpf), האורך קדמי / האחורי של קשת בלוע הראשונה הוא בין 1.8-1.9 פעמים הגבי / גובה גחונה. גב / התארכות הגחון ממשיכה בהתמדה, מהר יותר מאשר הארכה קדמית / אחורי עד 36.5 hpf. מכאן, גב / מישורים גובה הגחון סביב 104 מיקרומטר באמצעות 48 hpf. הרחבה קדמית / אחורית ממשיכה דרך 48 hpf, עם אורך קדמי / אחורי הכולל הגדלת מתחת 1.5 פעמים את גובה הגב / הגחון ב36.5 HPF ל1.95 פעמים הגבי / גובה הגחון ב48 hpf.
בקצה הקדמי שלה, קשת בלוע הראשונה יוצרת לסת (גב) ולסת תחתונה, תחומים (הגחון) מופרדים על ידי האאקטודרם האוראלי. תחום הלסת של קשת בלוע הראשונה נמדד וrom הקצה הדיסטלי שלו לקודקוד האחורי של האאקטודרם האוראלי. הוא צומח בקצב מקורב על ידי רגרסיה ליניארית ב4.6 מיקרומטר / שעה (r 2 = .9374) בין 30-48 hpf והוא על 104 מיקרומטר ארוך ב48 hpf (סרט 1).
קשתות בלוע 3-7 כל הטופס מהפילוח של מסה אחת של תאי רכס עצביים באמצעות האנדודרם בלוע 26. בין 30-38 hpf, 5 ה עד 7 ה קשתות בלוע נפרד מההמוני, קשתות -3 ו -4 ה כבר לאחר שנפרדו. סביב 37 hpf, קשת בלוע 3 rd מתחילה לנוע מדיאלית לnd 2 הקשת. רוחבי, קשת בלוע ה -7 עוקפת קשתות ה 5 ו 6 ה בתנועה מקורי על ידי 48 hpf, עוזב את rd 3 עד 6 המדיאלי קשתות עד ה -2 ו -7 קשתות ה (סרט 1).
זה לא חשובo לב שלמרות שהאמנה היא לתאר את המורפולוגיה בhpf, מיקרוסקופיה מעט מעכבת צמיחת דג הזברה בהשוואה לעוברים מבוימים באופן דומה גדלו בחממה 28.5 מעלות צלזיוס. לדוגמא, לאחר 19 שעות של מיקרוסקופיה, המרחק בין העין והאוזן של עובר wild-type צילם היה כ 81.7 מיקרומטר, ומרחק עין האוזן הממוצע עבור שני עוברי אחים צילמו מייד לאחר מכן היה 71 מיקרומטר. לכן, עוברים נוטים להיות מעט צעיר יותר מאשר בסדרת הבימוי 27.
תנועות morphogenetic אלה הם שיבשו באופן משמעותי במוטנטים SMO. כפי שתואר לעיל, מוטציות SMO דג הזברה להיכשל כדי ליצור עיבוי לסת של הקשת הראשונה, ועל ידי 48 hpf קשת בלוע הראשונה היא לגמרי הזנב לעין 2. תנועות קשת אחורית גם הם שיבשו 10. קשת בלוע 3 rd לא מצליחה להעביר המדיאלי לקשת בלוע 2 nd, וסרט 2 ה -7 לא מצליחה להעביר rostrally חפיפה עם יותר קשתות קדמי על ידי 48 hpf.
יש מוטציות B1100 smad5 דג הזברה פגמים craniofacial רבות, ביניהן אובדן כמעט מוחלט של שלד החך והתכת הגחון בין nd 2, 3 rd, ולפעמים 4 ה בלוע 15 אלמנטי קשת שלד, מה שמרמז כי ייתכן שיש פגמים ללועיים המורפוגנזה קשת . ואכן, confocal הדמיה סטטית הפגינה התכה בתחומים הגחון של nd 2 ו 3 rd קשתות הן לכאורה על ידי 32 hpf (איור 2). באמצעות מיקרוסקופיה confocal הזמן לשגות, נתחנו המורפוגנזה של קשתות בלוע במוטנטים smad5. בזמן לשגות ניתוחים, שילובים בין 2 ו 3 הקשתות מופיעים לראשונה ב32 hpf, עולים בקנה אחד עם הניתוח סטטי (סרט 3, איור 3). בנוסף,מוטציות smad5 שיבשו תולדה של הקשת הראשונה בלוע (סרט 3). ב30 hpf, האורך קדמי / האחורי של הקשת הראשונה בלוע (186.8 מיקרומטר) הוא מעל 35% יותר מאשר בסוג פראי, והוא פי 2.5 גב / גובה הגחון של קשת בלוע הראשונה במוטצית smad5. עם זאת, כפי שהקצה האחורי נע rostrally, האורך קדמי / האחורי של קשת בלוע הראשונה יורד כמעט 40 מיקרומטר בין 30-39 hpf ולאחר מכן חוזר לאורך זה על ידי 48 hpf. הגב / גובה הגחון של קשת בלוע הראשונה יורד בהתמדה ל62.3 מיקרומטר 30-48 hpf. כישלון של הרחבה קדמית בתקופה זו באה לידי ביטוי בתחום הלסת, שהוא ארוך במיוחד (85 מיקרומטר) ב30 hpf לעומת wild-type. אורך לסת פוחת בקצב מקורב על ידי רגרסיה ליניארית ב4.4 מיקרומטר / שעה (r 2 = .9032) 30-36 hpf, ונשאר עקבי למדי לאחר מכן. הנה, הזמן לשגות הדמיה מדגימה TI הייחודיתנועות ssue שעשוי להסביר את ההפסד של שלד החך נצפה במוטנטים smad5.
בעוד הביטוי של בני משפחת PDGF מרמז כי הוא עשוי להיות מעורב באופן נרחב בהמורפוגנזה קשת בלוע, התנועה של הקשתות האחורית מופיעה נורמלית במוטנטים PDGFRA. זה המורפוגנזה של קשת בלוע הראשונה שמופיעה במיוחד שיבש (סרט 4). הגודל הכולל של קשת בלוע הראשונה מצטמצם ביחס לסוג פראי, ותחום הלסת מופיע פלסטיק מאוד, עם תאי עיבוי והנסיגה לאורך זמן. התוצאה היא כישלון של התארכות ולסת, אשר פסגות סביב 39 hpf ב56.5 מיקרומטר. ב48 hpf, צעדי תחום הלסת רק 44.1 מיקרומטר. באופן קולקטיבי, ממצאים אלה מראים כי ניתוחי זמן לשגות זהיר יכולים לספק פרטים של המורפוגנזה פוטנציאל לאיבוד בניתוחי סטטי.
איור 1. סכמטי של הבנייה מגושרת coverslip ועובר הגובר למיקרוסקופיה confocal.
. איור 2 הקשתות השניה ושלישית הפתיל במוטנטים smad5 (A, B) פרוסות Z יחיד מ() fli1: egfp וfli1 (ב '): egfp; עובר המוטציה B1100 smad5.. (א) בעוברים פראי מסוג לsmad5, תאי רכס עצביים בקשת השנייה ושלישית הם מופרדים על ידי הכיס השני בלוע (ראש החץ). תאים (B) עצביים לפסגה בגבול הגחון של הערוץקשתות nd והשלישית להתערבב במוטנטים smad5 (ראש חץ). קשתות בלוע ממוספרות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. אובדן של תוצאות תפקוד smad5 בהמורפוגנזה קשת בלוע משובשת. (A, B, פנלים העליונים) היטלים ו( לוחות נמוכים) צפיות המאונכות של היתוך קשת בסרט 3. שילוב של קשתות שתיים ושלוש הוא מאליו, ראש החץ. קשתות בלוע ממוספרות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
סרט 1. פיתוח בלועקשתות בwild-type (fli1: egfp) עובר 30-48 hpf. קדמי בצד השמאל, גב לפסגה. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 2. תנועות המדיאלי של קשתות בלוע להיכשל במוטנטים SMO (fli1: egfp; smob 577) קדמית בצד השמאל, הגב לפסגה.. 30-48 hpf. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 3. 2 nd הקשתות ו3 rd הפתיל במוטנטים smad5 (fli1: egfp; B1100 smad5) קדמית בצד השמאל, הגב לפסגה.. סדרה של תחזיות (), 30-48 hpf, ו (ב) פרוסות בודדות Z, 30-40 hpf. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות היא כלי רב עוצמה לניתוח של התפתחות. הנה, אנחנו מדגימים את התועלת של השיטה בלימוד המורפוגנזה קשת בלוע בדג זברה שהן מוטציה למסלולי איתות חשובות באמצעות מהונדס כי תוויות בתאי רכס עצביים. בנוסף לרמת רקמת ניתוחים, ניתוחי זמן לשגות תקפים גם לניתוח בקנה מידה סלולרית 28. יכולות גם להיות משולבות שיטות דג הזברה בשימוש נרחבת רבות לניסויים במיקרוסקופיה הזמן לשגות, כולל microinjection של morpholinos, mRNAs, או בונה מהונדס, כמו גם השתלות בין עוברים. ניתוח של רקמות מתפתחות מספר מוגבל רק על ידי יכולת רקמות תווית fluorescently ועל ידי היכולת של מיקרוסקופ confocal כדי לזהות את המספר הרצוי של fluorophores שונה ללא crosstalk. מספר האנשים שיכולים להיות צילמו ממצמד של עוברי דג הזברה הוא מוגבל באופן חמור, אבל טכניקות מתקדמותלאפשר הדמיה אוטומטית של מספר עוברים באותה תקופת הזמן. האפשרות זו שימושית במיוחד כאשר מבקש לבצע ניתוח הזמן לשגות של מוטציה שאינו מזוהות בקלות בנקודות זמן מוקדמת.
בעת ביצוע מדידות מתמונות confocal הזמן לשגות, חשוב להביא בחשבון כי חלק מהעיכוב התפתחותי נגרמת על ידי התהליך. עיכובים התפתחותיים אינם נדירים בעוברים שעברו מוטציה, כמו גם, ולכן הדמיה של אחים שולט היא הכרחית עבור שניהם עוברים מוטציה / מניפולציות, כמו גם בקרות wild-type. נשלט אפילו פעם אחת לבימוי, מדידה השוואתית של מבנים שבכותרת הקרינה היא קשה. עוצמת הקרינה יכולה להיות משתנה מאוד בין אדם לאדם ובין חלקים נפרדים של אותו המבנה. לכן, מדידות כמותיות nondiscrete יש מידה מסוימת של סובייקטיביות, ואנו ממליצים שאדם אחד או יותר לבצע מדידות על מנת להבטיח עקביות. החוקרים גם חייב להיות ממושמע במכוון עובריםלמדידה השוואתית באופן עקבי, ככישלון לעשות זאת תהיה לגרום למראה של הבדלים מורפולוגיים שבו אולי לא יהיו בכלל. תנועות של עוברי דגימה יכולות על הסף להרוס את הניסוי, ואנו מוצאים כי הוספת חומר הרדמה לאחר agarose במיקרוגל כבר מותר לעבות מפחיתה את יעילותו במרגיעה עוברים.
למרות שקשה לרכוש, יש נתונים מיקרוסקופיה הזמן לשגות יתרונות ברורים על פני תמונות סטטיות בהשוואת המורפוגנזה איכותית. תמונות סטטיות לעתים קרובות תאפשר מדידה קלה של מבנים בנקודת זמן מסוימת, אבל נותנת שום אינדיקציה של התנהגויות רקמה שהובילו לאו לאחר שלב זה. מידע כזה הוא חיוני כאשר לומדים את האינטראקציות של שתיים או יותר רקמות נפרדות עוברות המורפוגנזה. על מנת לקבל את האפיון הכולל הטוב ביותר של המורפוגנזה, זה מועיל לביצוע שני ניתוחים בזמן שחלף ובסטטי לנצל הטוב ביותר את היתרונות של כל שיטה. בana-פקע הזמןlyses, ניתן לנתח את התנהגות התא והרקמה דינמית, בניתוח סטטי, מספר גדול של עוברים ניתן לבחון כדי לקבל ההבנה הטובה ביותר של השתנות. המספר הולך וגדל של קווי דג הזברה מהונדסים וקידום טכניקות אחרות יעשה מיקרוסקופיה confocal הזמן לשגות של רקמות רבות שבשגרה, כמו בזמן אמת בנתונים vivo הופך להיות סטנדרטי בין חוקרי המורפוגנזה זהב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים למליסה גריפין וג'נה Rozacky לטיפול דגי המומחה שלהם. הודות PDM EGN לכתיבת סיוע, נדיבות, וסבלנות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR R01DE020884 לJKE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 lb Test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24 x 60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
References
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
