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Biology

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

doi: 10.3791/51190 Published: January 30, 2014

Summary

Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.

Abstract

Imagiologia de lapso de tempo é uma técnica que permite a observação directa do processo de morfogénese, ou a geração de forma. Devido à sua claridade óptica e responsabilidade para com a manipulação genética, o embrião de peixe-zebra tornou-se um organismo modelo popular com a qual para realizar a análise de lapso de tempo de morfogênese em embriões vivos. Imagem confocal de um embrião do peixe-zebra vivos exige que um tecido de interesse é persistentemente marcado com um marcador fluorescente, tal como um transgene ou corante injectado. O processo exige que o embrião é anestesiado e mantido no lugar, de tal maneira que o desenvolvimento prossegue normalmente saudável. Parâmetros para a imagem deve ser ajustado para ter em conta o crescimento tridimensional e para equilibrar as exigências da resolução de células individuais ao obter fotos rápidas de desenvolvimento. Os nossos resultados demonstram a capacidade de executar a longo prazo in vivo de imagens de embriões de peixes-zebra marcados com fluorescência para detectar e comportamentos de tecidos em variadasda crista neural cranial que causam anomalias craniofaciais. Atrasos de desenvolvimento causados ​​pela anestesia e montagem são mínimos, e os embriões são ileso pelo processo. Embriões temporizadoP fotografada pode ser devolvido ao meio líquido e subsequentemente visualizados ou fixado em pontos mais tarde no desenvolvimento. Com um aumento da abundância de linhas de peixes-zebra transgénicos e mapeamento de destino bem caracterizados e as técnicas de transplante, imagiologia qualquer tecido desejado é possível. Como tal, de lapso de tempo em imagem in vivo combina poderosamente com métodos genéticos peixe-zebra, incluindo análises de embriões mutantes e microinjetados.

Introduction

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Morfogênese craniofacial é um processo multi-passo complexo que requer interações coordenadas entre vários tipos de células. A maior parte do esqueleto craniofacial é derivada a partir de células da crista neural, muitas das quais devem migrar a partir do tubo neural dorsal em estruturas transientes chamados arcos faringe 1. Tal como acontece com muitos tecidos, morfogênese do esqueleto craniofacial é mais complicado do que pode ser entendido por imagens estáticas de embriões em pontos específicos de tempo de desenvolvimento. Embora seja para realizar demorado, in vivo, a microscopia de lapso de tempo proporciona uma aparência contínua em células e tecidos de um embrião em desenvolvimento. Cada imagem em uma série de lapso de tempo dá contexto para os outros, e ajuda a um movimento em direção investigador deduzir por que um fenômeno ocorre, em vez de deduzir o que está ocorrendo naquele momento.

Na imagem in vivo é, portanto, uma poderosa ferramenta descritiva de abordagens experimentais paradesconstruir os caminhos que guiam morfogênese. O Danio rerio peixe-zebra é um modelo genético popular de desenvolvimento embrionário dos vertebrados, e é particularmente bem adaptado para imagiologia in vivo de morfogénese. Modern, métodos convenientes para transgenia e genômica modificação estão avançando rapidamente o número de ferramentas disponíveis para pesquisadores peixe-zebra. Estas ferramentas de melhorar os métodos já robustos para manipulação genética e microscopia. Imagem in vivo de praticamente qualquer tecido em quase qualquer contexto genético desejado é mais próximo da realidade do que a fantasia.

Movimentos morfogenéticos dos arcos faríngeos são guiados por sinalização interações entre a crista neural e do epitélio adjacente, tanto ectoderma e endoderma. Existem inúmeras moléculas sinalizadoras expressas pelo epitélio que são necessários para accionar a morfogénese dos elementos esqueléticos craniofaciais. Entre essas moléculas sinalizadoras, Sonic Hedgehog (Shh) é extremamente importante fou desenvolvimento craniofacial 2-8. Shh é expressa tanto pelo ectoderma oral e faringe endoderme 2,6,9,10. A expressão de Shh em endoderme regula movimentos morfogenéticas dos arcos 10, padronização de crista neural dentro dos arcos 10, e o crescimento do esqueleto craniofacial 11.

Bmp sinalização também é extremamente importante para o desenvolvimento craniofacial 12 e pode alterar a morfogênese dos arcos faríngeos. Sinalização Bmp regula dorsal / ventral padronização de crista dentro dos arcos faríngeos 13,14. Rompimento de smad5 em zebrafish provoca graves defeitos palatais e um fracasso das cartilagens de Meckel para fundir de forma adequada na linha média 15. Além disso, os mutantes também exibem reduções e fusão dos elementos de cartilagem ventrais, com o 2 o, 3 o, e, por vezes, os elementos do arco 4 º faringe fundidos na linha média 15. Estas fusões sugerem fortemente que a sinalização BMP dirige a morfogênese destes elementos da faringe.

Sinalização PDGF é necessário para o desenvolvimento craniofacial, mas tem papéis desconhecidos em arco faríngeo morfogênese. Ambos rato e mutantes PDGFRA peixe-zebra tem profunda clefting terço médio da face 16-18. Pelo menos, no peixe-zebra este clefting média facial é devido a uma falha de migração de células da crista neural apropriado 16. Células da crista neural continuam a expressar PDGFRA depois de terem entrado os arcos faríngeos. Além disso, os ligandos de PDGF são expressos por epitélios facial e dentro dos arcos da faringe 16,19,20, assim sinalização PDGF pode também desempenhar um papel importante na morfogénese dos arcos da faringe após a migração. No entanto, as análises da morfogênese dos arcos faríngeos em mutantes PDGFRA não foram realizadas.

Aqui, nós demonstramos em microscopia confocal in vivo de pharyngulum estágio zebrafish transgênicos e descrever a morfogênese dos arcos faríngeos dentro deste período. Demonstramos mais comportamentos de tecido que são afetados por mutações que perturbam a BMP, PDGF, e Shh vias de sinalização.

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Protocol

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1. Pecuária e Mutant alelos

  1. Levantar e produzir peixe-zebra como descrito 21.
  2. Alelos mutantes Zebrafish utilizados neste estudo foram PDGFRA b1059 16, B1100 smad5 22, e b577 smo 23. Fontes para essas cepas zebrafish incluem Zirc.

2. Preparação de Soluções e Implementos

Nota: Todas as soluções e as ferramentas podem ser feitas com antecedência e armazenado para uso futuro.

  1. Adicione mídia embrião (EM) como descrito anteriormente 21.
  2. Adicione 4 g / L de MS-222 (tricaina). Dissolve-se 4 g de fosfato dissódico (Na 2 HPO 4) em 450 ml de água estéril. Adicionar 2 g MS-222 à solução. Ajustar o pH para dentro de 7,0-7,2. Adicionar água estéril para um volume total de 500 ml.
  3. Opcional: Faça 4 g / L de óleo de cravo. Pesar 0,2 g óleo de cravo puro em um tubo de 50 ml. Adicionar EM para um volume total de 50 ml. Armazenar a 4 ° C.
  4. Faça 3% methylcellulosi. Traga 50 ml de EM + 0,1 M HEPES para ferver. Retire do fogo. Misture em 1,5 g de metilcelulose até que a solução é homogênea. Armazenar a 4 ° C.
  5. Adicione 0,2% de agarose. Adicionar 0,1 g de agarose com 50 ml de EM. Traga EM para ferver no microondas ou numa placa de aquecimento e verifique se a agarose se dissolva. Alíquota em 500 volumes ul em tubos de microcentrífuga e armazenar a 4 ° C. Nota: Os volumes podem ser ajustados conforme necessário.
  6. Faça pokers capilares. Coloque uma gota de super-cola dentro de um tubo capilar 0,9 milímetros ID. Inserir um comprimento de 4-5 cm de 6 £ de teste de linha de pesca monofilamento no interior do tubo capilar de tal modo que, aproximadamente, 3-4 mm de linha estende-se para além da extremidade do tubo.
  7. Faça duas lamelas em ponte por espécime. Super-cola 22 x 22-1 tampa de vidro em cada extremidade de uma tampa de vidro de 24 x 60-1 deixando o meio livre. Faça singles (1 pequena tampa de vidro por fim) para os embriões com menos de um dia de idade, duplos (dois copos pequenos de cobertura em cima uns dos outros por fim) para os embriões de um a quatro days de idade, ou triplos (três pequenos copos de cobertura em cima uns dos outros por fim) para embriões cinco dias ou mais.
  8. Encha uma seringa de 10 ml, com alta graxa de vácuo. Nota: Vácuo graxa serve como um vedante para evitar a desidratação de espécimes durante longos períodos de tempo, e tem um baixo potencial de toxicidade em comparação com os selantes mais voláteis.

3. Montagem embriões Zebrafish por microscopia confocal (veja a Figura 1)

  1. Prepare médio anestésico. Derreter-se uma alíquota de 0,2% de agarose por microondas em intervalos de 20 seg até completamente líquido. Misturar 8 ul de MS-222 em 192 uL de 0,2% de agarose ou 5 ul de 4 g / L de óleo de cravo em 195 ul de 0,2% de agarose. Manter em um bloco de aquecimento de 42 ° C. Nota: A exposição longa a MS-222 provoca atrasos de desenvolvimento mais fortes do que o óleo de cravo faz no peixe-zebra embrionária 24.
  2. Se necessário: dechorionate manualmente embriões transgénicos não eclodidos para ser analisada imediatamente antes da análise. Utilizando uma pinça, lentamente tear o córion aberto até o embrião é liberado.
  3. Anestesiar os embriões de peixe-zebra. Adicionar 1 ml de uma unidade de 4 g / L de MS-222-24 ml de meio de embrião. Alternativamente, adicione 390 mL de 4 g / L de óleo de cravo a 24 ml de água de peixe 24. Nota: atos óleo de cravo lentamente para realizar esta etapa, pelo menos, 15-20 minutos antes de microscopia de lapso de tempo.
  4. Coloque uma gota de graxa de vácuo em torno do espaço centro de uma lamela de ponte para cima virada. Empurrar lentamente a gordura vácuo para fora da seringa, fazendo com que um talão suave, contínua, que é adjacente e no interior das pontes e a extremidade da lamela.
  5. Espalhe um círculo de 4% de metilcelulose em meio da lamela em ponte usando um aplicador de madeira.
  6. Transferência do embrião a ser trabalhada. Quando o embrião é anestesiado desenhar-lo em uma pipeta de vidro. Manter a pipeta-se verticalmente para permitir que o embrião se afundam para o fundo do líquido na pipeta. Mover a pipeta para dentro da solução de agarose e permitir que o embrião a cairem que a agarose. Não expulsar o líquido.
  7. Colocar a amostra. Desenhar uma solução de agarose e o embrião para a pipeta. Expelir o embrião de uma gota da solução de agarose no topo da metilcelulose. Use um atiçador capilar para empurrar o embrião para baixo na metilcelulose e orientar o embrião como desejado para a imagem latente.
  8. Selar o espécime.
    1. Coloque uma lamela em ponte na parte superior da montagem de um, virado para baixo. Aplique pressão uniforme para ambos os lados das lamelas imprensado até as pontes fazer contato direto e os selos gota de agarose a ambos lamelas. Verifique se o embrião está orientado corretamente.
    2. Esfregue um aplicador de madeira ao longo do vidro para suavizar rachaduras e falhas no talão de graxa de vácuo. Limpe o excesso de graxa das bordas.

4. Time-lapse confocal de Transgênicos Zebrafish embriões

(Este protocolo foi otimizado para uma Zeiss LSM 710 microscópio confocal nosing software de imagem ZEN, e pode ser modificado para ser utilizado com outros sistemas.)

  1. Ative equipamento. Ligue o microscópio confocal a laser e todos os dispositivos externos. Ligue o computador conectado ao microscópio confocal. Abra o software de imagem confocal e selecione "Sistema Start" para ativar os controles de aquisição de imagem.
  2. Prepare palco aquecida. Abaixe a plataforma de teste do microscópio confocal e mover as lentes objetivas fora de posição. Substitua o estágio padrão com uma fase aquecida eletrônico. Ligue o controlador para a fase aquecida e ajustar a temperatura para 29,5 ° C.
  3. Coloque a amostra no campo de visão. Coloque as amostras montadas no palco. Mova a lente objetiva de 20X para a posição e elevar a plataforma de teste. Ative o emissor de luz visível e olhar através das oculares. Centralize a cabeça do embrião no campo de visão.
  4. Definir configurações da experiência.
    1. Ative canais de fluorescência, selecionandoo comprimento de onda fluorescente para ser detectado e escolher tabelas de pesquisa de cores (LUT) para cada canal. Se necessário, use os controles manuais no software para ligar os lasers necessárias (por exemplo, 561 nm para RFP). Para cada canal de fluorescência, a intensidade do laser definido para 10,0 e a voltagem do fotomultiplicador (HV ou ganho) entre 600-700. Defina a média a 4 e a profundidade de bits para 16 bits.
    2. Ative os módulos da série Z-stack e time. Defina o pinhole para uma resolução Z-5 mm ou menor, e definir o Z-intervalo para a distância ideal sugerido.
      Nota: Geralmente, 5 mm Z-resolução permite que cada imagem Z-stack a recolher rapidamente o suficiente para um "instantâneo" do embrião em um ponto de tempo específico e ao mesmo tempo resolver células individuais. Baixando a média também reduz a quantidade de tempo por imagem.
    3. Definir o intervalo de tempo desejado entre imagens (geralmente 10-20 minutos) e o comprimento total do experimento.
  5. Definir posicionalinformações.
    1. Ligue a câmera para o modo de viver. Ajuste o foco e aumentar a intensidade do laser se necessário, para ver a fluorescência. Defina o zoom digital de 0,6 para uma visão mais ampla, se desejar.
    2. Posicione o palco de tal forma que todas as estruturas de interesse são visíveis e há espaço no campo de visão para dorsal conseqüência e anteriormente. Concentre-se através do embrião para os limites superiores e inferiores de fluorescência. Defina as primeiras e últimas posições fatia Z-stack, no mínimo, 100 mm ou mais para além destes limites.
  6. Otimizar intensidade de fluorescência.
    1. Defina a LUT exibição para variar indicador. Estruturas fluorescentes agora deve aparecer branco, e no resto do campo de visão deve ser azul (sem detecção) ou preto.
    2. Aumentar HV / ganho para um nível logo abaixo de onde saturada (vermelho) pixels aparecer. Se necessário, ajuste compensar assim a maior parte do fundo não é detectado (azul). Nota: diâmetro pinhole menor e aumento da intensidade do laser, tanto melhorar a imagem defrial, mas a intensidade do laser deve ser mantida baixa para preservar os tecidos vivos. Aumento HV / ganho e diâmetro do furo de pino (<5 mm) são geralmente preferidas para o aumento da intensidade do laser.
    3. Mantenha o diâmetro pinhole grande o suficiente para coletar imagens em tempo hábil, com média de sets a 4. O intervalo de-Z deve sempre ser definida para a distância ideal sugerido para o diâmetro pinhole. Realizar exames de curta duração (média = 1) com configurações diferentes, e usar a intensidade mínima de laser que atinge resolução desejada.
  7. Executar o experimento para o período de tempo desejado. Depois, retire do embrião a partir da fase aquecida e lentamente separar as lamelas. Mergulhe a lamela e embrião em EM em um 30 milímetros placa de Petri. Usando uma pipeta de vidro lavar cuidadosamente o embrião fora da lamela e remover as lamelas da placa de Petri. Coloque o embrião para uma incubadora de 28,5 ° C para continuar a desenvolver-se.
  8. Comparar crescimento. No fim do experimento, tomar Zs indivíduotack imagens de embriões irmão montado na agarose que foram similarmente encenadas para a amostra no início da experiência, mas foram levantadas em EM numa incubadora 28,5 ° C.
  9. Meça arcos faríngeos, conforme necessário. As medições podem ser realizadas em alguns conjuntos de software confocal. Medidas encontrados aqui foram realizadas utilizando Fiji25 importando e Z-projetando arquivos. LSM de quadros individuais.

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Representative Results

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Em embriões do tipo selvagem, seguindo população crista neural, os arcos da faringe alongar ao longo dos anterior / posterior e dorsal / ventral eixos enquanto se move em uma direção rostral (Filme 1). Aos 30 horas após a fertilização (hpf), a duração anterior / posterior do primeiro arco faríngeo é entre 1,8-1,9 vezes o seu dorsal / altura ventral. Dorsal / alongamento ventral procede de forma constante, mais rápido do que a extensão anterior / posterior até 36,5 hpf. A partir daqui, dorsal / ventral planaltos altura cerca de 104 mM a 48 hpf. Extensão anterior / posterior continua até 48 hpf, com comprimento total anterior / posterior aumentando de menos de 1,5 vezes a altura dorsal / ventral de 36,5 HPF a 1,95 vezes o dorsal / ventral altura em 48 hpf.

Na sua extremidade anterior, o primeiro arco faríngeo forma superior (dorsal) e mandibular domínios (ventral) separados por ectoderma oral. O domínio maxilar do primeiro arco faríngeo é medido from a sua ponta distal ao vértice posterior da ectoderme oral. Ela cresce a uma taxa aproximada por regressão linear de 4,6 mM / h (r 2 = 0,9374) entre 30-48 hpf e é cerca de 104 mM longo de 48 hpf (Filme 1).

Arcos faríngeos 3-7 todas as formas a partir da segmentação de uma única massa de células da crista neural através da endoderme da faringe 26. Entre 30-38 hpf, o 5 º a 7 º arcos faríngeos separar a massa, os 3 º e 4 º arcos já ter separado. Cerca de 37 hpf, a faringe arco 3 º começa a se mover medialmente ao arco 2 ª. Lateralmente, o 7 º faríngeo arco ultrapassa as 5 ª e 6 ª arcos em movimento rostral por 48 hpf, deixando o 3 º a 6 º arcos medial para o 2 º e 7 º arcos (Filme 1).

É importante to observar que, embora a convenção é descrever a morfologia em hpf, microscopia atrasa um pouco o crescimento do peixe-zebra em comparação com embriões semelhante encenadas cultivadas em uma incubadora de 28,5 ° C. Por exemplo, depois de 19 horas de microscopia, a distância entre o olho ea orelha de um tipo selvagem embrião trabalhada foi de aproximadamente 81,7 mM, ea distância média olho-ouvido para dois embriões irmãos fotografada logo depois foi de 71 mM. Portanto, os embriões são susceptíveis de ser ligeiramente menor do que a série de teste 27.

Estes movimentos morfogenéticos são muito perturbado em mutantes smo. Como descrito anteriormente, os mutantes de peixe-zebra smo não conseguem formar uma condensação maxilar do primeiro arco, e por 48 hpf o primeiro arco faríngeo é completamente caudal para o olho 2. Movimentos arco posterior também são interrompidos 10. O arco faríngeo 3 º deixa de mover medial do arco faríngeo 2 ª, e Movie 2 º arco faríngeo não migram rostralmente a sobrepor-se com mais arcos anteriores por 48 hpf.

Zebrafish mutantes B1100 smad5 têm inúmeros defeitos craniofaciais, incluindo uma perda quase completa do esqueleto palatal e fusões ventral entre a 2 ª, 3 ª, e às vezes 4 º da faringe elementos arco esquelético 15, sugerindo que pode haver defeitos para faríngeo arco morfogênese . Na verdade, a imagem confocal estática demonstrou fusões nos domínios ventral do 2 º e 3 º arcos são aparentes em 32 hpf (Figura 2). Usando a microscopia confocal time-lapse, analisamos a morfogênese dos arcos faríngeos em mutantes smad5. Nas análises de lapso de tempo, fusões entre o 2 º e 3 arcos aparecem em primeiro lugar com 32 hpf, consistente com a análise estática (Filme 3, Figura 3). Adicionalmente,mutantes smad5 interromperam conseqüência do primeiro arco faríngeo (Filme 3). Em 30 hpf, o comprimento anterior / posterior do primeiro arco faríngeo (186,8 mM) é mais de 35% mais tempo do que no tipo selvagem, e é 2,5 vezes o dorsal / ventral altura do primeiro arco da faringe num mutante smad5. No entanto, como o bordo posterior se move rostral, o comprimento anterior / posterior do primeiro arco faríngeo diminui quase 40 um entre 30-39 hpf e, em seguida, recupera este comprimento por 48 HPF. O dorsal / ventral altura do primeiro arco faríngeo diminui progressivamente para 62,3 mM 30-48 hpf. Falha de extensão anterior durante este tempo está reflectido no domínio da maxila, o que é excepcionalmente longa (85 mM) em 30 hpf comparação com o tipo selvagem. Comprimento maxilar diminui a uma taxa aproximada por regressão linear de 4,4 mM / h (r 2 = 0,9032) 30-36 hpf, e fica bastante consistente depois. Aqui, a imagem time-lapse mostra ti únicassue movimentos que podem ser responsáveis ​​pela perda do esqueleto palatino observados em mutantes smad5.

Enquanto a expressão de membros da família de PDGF e sugere que pode ser amplamente envolvido na faringe arco morfogénese, o movimento dos arcos posteriores parece normal nos mutantes PDGFRA. É morfogênese do primeiro arco faríngeo que aparece especificamente interrompido (Filme 4). O tamanho total do primeiro arco faríngeo é reduzida relativamente ao tipo selvagem, e o domínio maxilar parece altamente plástico, com células de condensação e retirada ao longo do tempo. Isto resulta numa falha de alongamento maxilar, que culmina em cerca de 39 hpf 56,5 mM. Aos 48 hpf, as medidas de domínio maxilares apenas 44,1 mM. Coletivamente, esses resultados mostram que as análises de lapso de tempo cuidadosa pode fornecer detalhes de morfogênese potencialmente perdidos em análises estáticas.

Figura 1 Figura 1. Esquema de construção lamela em ponte e embrião de montagem para microscopia confocal.

Figura 2
. Figura 2 O segundo e terceiro arcos fundir em mutantes smad5 (A, B) fatias Z Único de um (A) FLI1: EGFP e (B) FLI1: egfp; smad5 embrião mutante B1100.. (A) Em embriões de tipo selvagem para smad5, células da crista neural, no segundo e terceiro arco são separados pela segunda bolsa faríngea (ponta de seta). (B) As células da crista neural no limite ventral do secoarcos ª e terceiros se misturam em mutantes smad5 (cabeça de seta). Arcos faríngeos são numerados. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3
Figura 3. Perda da função resulta em smad5 interrompido faríngeo arco morfogênese. (A, B, painéis superiores) Projeções e (painéis inferiores) vistas ortogonais de fusão arco em filme 3. Fusão de dois e três arcos é evidente, seta. Arcos faríngeos são numerados. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Filme 1. Desenvolvimento da faringearcos em um tipo selvagem (FLI1: egfp) embrião 30-48 hpf. Anterior à esquerda, dorsal para o topo. Clique aqui para ver filme.

Filme 2. Movimentos medial do arcos faríngeos falhar em mutantes smo (FLI1: EGFP; SMOB 577) anterior à esquerda, dorsal para o topo.. 30-48 hpf. Clique aqui para ver filme.

Filme 3. Os 2 º e 3 º arcos fundir em mutantes smad5 (FLI1: egfp; B1100 smad5) anterior à esquerda, dorsal para o topo.. Série de projeções de (A), 30-48 hpf, e (B) fatias Z individuais, 30-40 hpf. Clique aqui para ver filme.

filme 4. Alongamento da região maxilar falha em mutantes PDGFRA (FLI1: EGFP; b1059 PDGFRA) anterior à esquerda, dorsal para o topo.. 30-48 hpf. Clique aqui para ver filme.

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Discussion

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Microscopia confocal Time-lapse é uma ferramenta poderosa para a análise do desenvolvimento. Aqui, nós demonstramos a utilidade do método no estudo da faringe arco morfogênese no peixe-zebra, que são mutantes por vias de sinalização importantes usando um transgênico que rotula células da crista neural. Além do nível de tecido análises, análises de lapso de tempo também são aplicáveis ​​para análises de uma escala celular 28. Muitos métodos de peixe-zebra amplamente utilizados também podem ser incorporados em experimentos de microscopia de lapso de tempo, incluindo a microinjecção de morfolinos, mRNAs, ou construções transgénicas, bem como transplantes entre embriões. Análise de múltiplos tecidos em desenvolvimento é limitada apenas pela capacidade de os tecidos da etiqueta fluorescente e pela capacidade de um microscópio confocal para detectar o número desejado de fluoróforos diferentes, sem interferência. O número de indivíduos que podem ser visualizados a partir de uma embreagem de embriões de peixe-zebra é severamente restringida, mas técnicas avançadaspermitir imagens automatizada de vários embriões no mesmo período de tempo. Isto é especialmente útil quando se pretende realizar uma análise de lapso de tempo de um mutante que não é facilmente identificado em momentos iniciais.

Ao realizar medições de time-lapse imagens confocal, é importante considerar que algum atraso de desenvolvimento é causada pelo processo. Atrasos no desenvolvimento não são incomuns em embriões mutantes, bem como, de modo de imagem de irmão controles é necessário que ambos os embriões mutantes / manipulados, bem como os controles do tipo selvagem. Mesmo depois de controlado para o estadiamento, a medição comparativa das estruturas marcados com fluorescência é difícil. A intensidade de fluorescência podem ser altamente variáveis ​​entre indivíduos e entre as partes separadas da mesma estrutura. Assim, medições quantitativas nondiscrete têm um grau de subjetividade, e recomendamos que mais de um indivíduo realizar medições para assegurar a consistência. Os investigadores também deve ser disciplinado na orientação embriõespara medição comparativa de forma consistente, como não fazê-lo vai causar o aparecimento de diferenças morfológicas onde pode haver nenhum. Movimentos de embriões de amostras pode outright arruinar uma experiência, e nós achamos que a adição de anestésico após a agarose as microondas foi autorizado a engrossar reduz sua eficácia em sedativo embriões.

Embora difícil de adquirir, os dados de microscopia de lapso de tempo tem vantagens óbvias sobre imagens estáticas em comparação morfogênese qualitativamente. As imagens estáticas, muitas vezes, permitem fácil medição de estruturas em um determinado ponto do tempo, mas não dão nenhuma indicação de comportamentos de tecido que antecederam ou após essa fase. Essa informação é crucial quando se estuda as interações de dois ou mais tecidos diferentes submetidos a morfogênese. A fim de obter a melhor caracterização geral da morfogénese, é benéfico para executar ambas as análises de tempo decorrido-estática e de melhor utilizar as vantagens de cada método. No tempo decorrido analise, os comportamentos de células e tecido dinâmico pode ser analisada e, em análises estáticas, grandes números de embriões podem ser examinados para obter a melhor compreensão da variabilidade. O crescente número de linhagens transgênicas de peixe-zebra e avanço de outras técnicas fará microscopia confocal de lapso de tempo de vários tecidos comuns, como em tempo real de dados vivo torna-se o padrão-ouro entre os pesquisadores morfogênese.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos Melissa Griffin e Jenna Rozacky para seu especialista em cuidados de peixe. PDM graças EGN para escrever assistência, generosidade e paciência. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR R01DE020884 para JKE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 lb Test monofilament line Cortland Line Company SLB16
Agarose I Amresco 0710
Argon laser LASOS Lasertechnik GmbH LGN 3001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID FHC 30-31-0
Clove oil Hilltech Canada, Inc. HB-102
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator Fisher Scientific 2050FS
Laser scanning microscope Carl Zeiss AG LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific 12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1 Fisher Scientific 12-545-M
Potassium chloride Fisher Scientific M-11321
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Sodium chloride Fisher Scientific M-11624
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907
TempController 2000-2 PeCon GmbH
Tricaine-S Western Chemical, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal
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McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).More

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).

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