Stretching celle micropatterned su una membrana PDMS

Summary

Questo manoscritto presenta una tecnica per applicare o liberare forze su cellule o tessuti aderenti usando allungamento unidirezionale.

Abstract

Forze meccaniche esercitate sulle cellule e / o tessuti svolgono un ruolo importante in numerosi processi. Abbiamo sviluppato un dispositivo di allungare le cellule placcato su un polidimetilsilossano (PDMS) membrana, compatibile con le immagini. Questa tecnica è riproducibile e versatile. La membrana PDMS può essere micropatterned al fine di limitare cellule o tessuti di una geometria specifica. Il primo passo è stampare microdisegnature sulla membrana PDMS con una tecnica UV profondo. La membrana PDMS è poi montato su un telaio meccanico. Una camera è vincolata in cima alla membrana con grasso biocompatibile per consentire scivolare durante l'allungamento. Le cellule vengono seminate e ha permesso di diffondere per diverse ore sui microdisegnature. Il campione può essere allungato e non deformato più volte con l'uso di una vite micrometrica. Ci vuole meno di un minuto per applicare il tratto per tutta la sua estensione (circa il 30%). La tecnica qui presentata non include un dispositivo motorizzato, che è necessario per unapplying cicli tratto ripetuti rapidamente e / o computer controllato stretching, ma questo può essere attuato. Stretching di cellule o di tessuto può essere di interesse per le questioni relative alle forze cellulari, risposta cellulare allo stress meccanico o morfogenesi dei tessuti. Questa presentazione video mostra come evitare i problemi tipici che potrebbero sorgere quando si fa questo tipo di apparentemente semplice esperimento.

Introduction

Le cellule che compongono un tessuto in organismi superiori sono soggetti a tensioni meccaniche e forze traenti o provenienti dall'ambiente esterno o da cellule circostanti ^1,2. Cellule devono adattarsi e resistere a queste forze al fine di mantenere l'integrità del tessuto. Tali forze sono importanti anche per i tessuti morfogenesi durante lo sviluppo ^3,4. Applicando forze meccaniche su cellule coltivate è un modo di imitare ciò che potrebbe accadere in un tessuto, ma con un controllo quantitativo e indipendente di forma delle cellule e deformazione cella ^5,6. Per questo, possono essere utilizzate diverse tecniche. Si può premere sulle cellule (cellula intera o parte di essa), ad esempio utilizzando AFM o derivati ^​​7,8 o allungare il substrato le cellule crescono su.

Il metodo descritto in questo documento dimostra come allungare un substrato piano placcato con cellule. Questa tecnica è stato originariamente sviluppato per valutare il ruolo delle forze esercitate su mcellule di mammifero itotic ^9. Le cellule mitotiche rimanere connessi al substrato attraverso le fibre di retrazione e stretching membrana esercitata una forza su quelle fibre, che a loro volta hanno provocato la rotazione del fuso mitotico. L'interesse di combinare microdisegnature adesivi e stretching è quello di raggiungere un controllo indipendente delle forze e forma delle singole celle. E 'per esempio possibile allungare una cella ovoidale in una forma rotonda perfettamente isotropa, mentre è applicata tratto monoassiale. Se le cellule non sono intrecciata su microdisegnature, stiramento uniassiale risultati in allungamento cellulare, con la maggior parte delle cellule avente un asse longitudinale allineato con l'asse tratto. È poi difficile separare l'effetto dell'allineamento asse lungo e l'effetto del tratto applicata alle cellule.

Il dispositivo è adatto per qualsiasi imaging cellulare dal vivo, tra cui la microscopia a fluorescenza lasso di tempo, e la droga può essere aggiunto durante l'esperimento. Il metodo UV micropatterning profondo ¹⁰è stato descritto in dettaglio nel Azioune et al. ¹¹ patterning su PDMS è stata descritta in Azioune et al. ¹² La presente allungamento protocollo è una versione video di Carpi et al. ¹³

Protocol

1. Passivazione del PDMS

1. Tagliare un pezzo di PDMS circa 35 mm x 20 mm da una lamiera pre fatta (per esempio, GelPak, come elencato nella tabella dei materiali).
2. Rimuovere la parte superiore e gli strati protettivi peggiori di plastica (se necessario) e usare pinzette per posizionare i PDMS in plastica (non COLTURA CELLULARE trattati) piastra Petri.
3. Lavare le PDMS con etanolo al 70% per 5 minuti su un agitatore a 30 oscillazioni / min.
4. Asciugare la superficie scorre aria su di esso.
5. Illuminare con profondo UV (λ = 180 nm) per 5 minuti a una distanza dalle lampade UV di circa 5 cm (vedi scheda Materiali per riferimento lampada; parametri variano per lampade diverse).
6. Preparare 200 ml di soluzione di EDC / NHS per ogni pezzo PDMS (deve essere preparata poco prima dell'uso perché la reattività della soluzione decade in pochi hr). Per 1 ml di 0,05 M MES + 0,5 tampone M NaCl a pH 6,0, aggiungere 11,5 mg di Sulfo-SSN e 19,2 mg di EDC.
7. Trasferire ilPDMS fogli dal capsula di Petri al coperchio della scatola di Petri, che non è stata illuminata. Questo farà sì che i dintorni di PDMS sono molto idrofobiche e facilitare il passaggio successivo.
8. Aggiungere la soluzione di EDC / NHS e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
9. Sciacquare EDC / NHS con acqua.
10. Aggiungere la soluzione PLL-g-PEG (0,5 mg / ml in HEPES 10 mM pH 8,6) e incubare dal 3 ore durante la notte a temperatura ambiente.
11. Sciacquare il PLL-g-PEG con acqua. PDMS passivato (funzionalizzati con PLL-g-PEG) possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C.

2. Patterning del PDMS

1. Prendete un foglio PDMS e posizionarlo su una fotomaschera quarzo sintetico recante la microfeatures per patterning (vedi Figura 1). Posizionare il lato PDMS recante il PLL-g-PEG di fronte al lato di cromo del fotomaschera.
2. Illuminare per 7 min attraverso la fotomaschera ad una distanza dalle lampade UV di circa 5 cm.
3. Aggiungere acqua sulla maschera + PDMS e sbucciare le PDMS lentamente la maschera.
4. Incubare con soluzione fibronectina a 50 mg / ml in tampone HEPES a pH 8,6 per 1 ora a temperatura ambiente. E 'possibile utilizzare altri proteine ​​ECM, ma questi non sono stati testati con questo protocollo.
5. Risciacquare con PBS.

3. Montaggio del dispositivo

1. Montare i PDMS precedenza passivate sul dispositivo di stretching (vedi la discussione per la risoluzione dei problemi).
   1. Attaccare un lato delle PDMS alla parte fissa della barella.
   2. Fissare l'altro lato per la parte mobile della barella senza bloccaggio troppo del foglio PDMS.
2. Tagliare un rettangolo di PDMS (22 mm x 19 mm) in una spessa PDMS stab e tagliare un altro rettangolo interno in modo da avere una piscina (o frame) che manterrà le cellule e supporti (vedere Figura 2).
3. Aggiungere grasso al silicone sotto questo PDMS piscina e posizionarlo sulla parte superiore del foglio PDMS per creare un medium mantenendo piscina. Il grasso permetterà lo scorrimento della piscina sopra il foglio PDMS nella filatura.

4. Patterning celle

1. Staccare le cellule da una confluenza pallone di coltura 50% con Versene.
2. Contare le cellule e risospendere alla concentrazione di 200.000 cellule / ml.
3. Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in piscina (vedi la discussione per ulteriori dettagli).
4. Lasciate che le cellule si legano ai modelli per 10-30 min (a seconda del tipo di cellula, RPE-1 le cellule avranno 10 min e cellule HeLa 20 min).
5. Lavare delicatamente le cellule galleggianti con medio equilibrato (equilibrare medio in incubatrice).
6. Lasciate che le cellule sparse per qualche ora sui modelli (RPE-1 avrà bisogno di almeno 2 ore; cellule HeLa avranno bisogno di 3 ore).
7. Aggiungere un coprioggetto sulla parte superiore della piscina per evitare l'evaporazione e medie perdite nel caso in cui PDMS pause.
8. Mettere il dispositivo su un microscopio invertito e iniziare imaging. Evitare l'uso di immersione in olio objectives in quanto non funziona a causa di problemi di messa a fuoco.

5. Allungamento

1. Ruotare la vite micrometrica correggendo la posizione di fase del x-, y-e z-asse (principalmente x). La posizione di fase deve essere corretta per contrastare l'allargamento delle PDMS e la perdita di concentrazione. (Vedere "Durante il tratto" paragrafo nella discussione).

Representative Results

La tecnica presentata in questo protocollo video consentiva l'applicazione di forze sulle fibre di retrazione di cellule di mammifero mitotiche. Infatti, durante la divisione cellulare, allo stadio mitotico, cellule di mammifero ritraggono a prendere la forma di una sfera e di lasciarsi alle spalle i cavi di actina sottili circondate da una membrana che sono attaccati al substrato. Questi cavi (fibre di retrazione), sono la memoria della geometria della cella prima di andare in divisione. Fare microdisegnature con UV profondo attraverso una fotomaschera su PDMS film sottile (Figura 1) consentiva il controllo geometrico di adesione cellulare. Stirando il substrato al momento della comparsa di metafase, alcune di queste fibre di retrazione sono stati estratti dal corpo cellulare, con un conseguente forze meccaniche applicate sulla corteccia della cellula mitotica (Figura 3). Queste forze sono stati mostrati per governare l'orientamento dell'asse mandrino ^9.

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Figura 1. Sintetico quarzo Photomask cuscinetto microdisegnature caratteristiche.   A) photomask tipico utilizzato per la profonda patterning UV. Si tratta di un 10 centimetri x 10 centimetri maschera binaria e le caratteristiche sono tipicamente di circa 20 micron di larghezza per patterning singola cella, con una risoluzione inferiore al micron. Squares visibili a occhio nudo sono le dimensioni di un campo microscopio obiettivo 10X di vista. L'ingrandimento mostra le caratteristiche corrispondenti ai modelli a cella singola (qui dischi). Caratteristiche sono trasparenti per consentire UV profondi attraversano. B) Il PDMS è applicato sulla fotomaschera evitando accuratamente la formazione di bolle. Il lato PDMS passivato è in contatto con la parte metallica della fotomaschera. Le microdisegnature saranno stampati in tutto il PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2. La piscina.   Una piscina PDMS è applicato sul foglio PDMS. Grasso sta coprendo il perimetro fondo della piscina. La capacità della vasca è di circa 2 ml di media. La piscina è riempita con terreno di coltura (qui l'acqua con fluoresceina appare in giallo). Per evitare l'evaporazione, un vetrino può essere aggiunto in cima. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

A) Prima di stretching. La cella è placcato su una sagoma ovale. Per raggiungere questo obiettivo, il patterning è effettuata con le PDMS essere allungato durante l'impressione di modelli circolari attraverso la fotomaschera. Un fotomaschera ripartiti viene utilizzato (il pezzo di maschera è di circa 1,5 cm di diametro). Per evitare di rompersi una maschera, utilizzare un modello ovale sul photomask e stamparlo su un foglio PDMS non deformato. B) Dopo lo stretching. Il substrato è allungato come il modello diventa un cerchio. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

Sebbene questa tecnica è stata utilizzata numerose volte e viene accuratamente testato, ci sono diversi passaggi critici che possono portare ad un esperimento fallito.

Circa il PDMS:

Per questo lavoro, GelPak, un foglio sottile PDMS disponibile in commercio, è stato utilizzato. In alternativa, i fogli di PDMS possono essere lanciate direttamente dalla miscela PDMS. Si consiglia di utilizzare GelPak perché è più riproducibile, ed è meno probabilità di rottura rispetto al PDMS su misura.

Circa il dispositivo:

Il dispositivo allungamento utilizzato in questo protocollo è stato progettato "in casa", ma si può anche applicare la tecnica micropatterning su barelle disponibili in commercio come FlexCell. Opzioni su misura sono più versatili e molto più economico.

Montaggio del dispositivo:

Il montaggio dei PDMS può portare alla rottura. E 'anche facile da invertire e non c'è modo di dire da che parte stache. Se il PDMS è serrato troppo, diventa più corto e questo può portare a rottura (come la tensione sarà maggiore per la stessa distanza di stiramento). Assicurarsi che le viti siano ben serrati o il foglio PDMS slitteranno non appena il tratto inizia o successivamente durante l'esperimento.

Aggiunta di celle:

Staccano le cellule dal substrato cultura, è meglio usare EDTA 0,02% in PBS anziché tripsina. Utilizzando EDTA permetterà rilegatura più veloce delle cellule sui modelli. Quando le cellule vengono aggiunti ai PDMS, devono essere ben separati l'uno dall'altro in modo da ottenere singole celle vincolanti per il modello. Una volta che sono in sospensione, pipetta più volte con una punta di 200 microlitri, questo si romperà aggregati. Circa 200.000 cellule devono essere aggiunti sulla superficie 4 cm ² in modo da avere vincolante per ciascun modello. Utilizzare un piccolo volume così le cellule diminuiscono rapidamente sulla superficie. Se non ci sono abbastanza celle, meventuali modelli rimarranno vuoti. Le cellule non collegate devono essere lavata con asportazione dei media appena sufficiente di cellule vengono associati ai modelli. Il tempo prima che il filo può variare tra tipi cellulari ma 15 minuti è generalmente sufficiente per le cellule iniziano a collegare ai modelli. Se le cellule vengono lasciate attaccare troppo a lungo, disegni saranno occupate da 2 o più celle. Questo passaggio è descritto in ^13.

Durante il tratto:

Essere molto attenti, mentre si estende, per evitare di perdere la posizione della regione di interesse. Infatti, durante l'allungamento, il PDMS diventeranno più ampia, e la posizione di fase deve essere riaggiustato per compensare. Una combinazione di un dispositivo e software stiramento controllo motorizzato della fase può essere sviluppata per compensare automaticamente questo effetto ^14. La barella manuale semplice e versatile, qui presentato può essere aggiornato per realizzare tale compensazione automatizzata.

Il Po PDMSolo può fuoriuscire se il grasso siliconico non è stato montato correttamente attorno alla superficie. Assicurarsi che l'installazione sia correttamente sigillato mettendo PBS all'interno e guardando per eventuali perdite prima di placcatura cellule su di esso.

La nostra barella permette un tratto di circa 30%, ma barelle progettati su misura potrebbe consentire un grado di allungamento superiore. Fare attenzione quanto maggiore è la tensione, maggiore è il rischio di strato PDMS rottura.

Limitazioni:

Uno dei principali limiti della tecnica qui presentata è la mancanza di facile automatica allungamento / destretching utilizzando un motore. Tuttavia, è possibile adattare un attuatore anziché una vite micrometrica manuale. Questa implementazione, accoppiato con una specifica programmazione del controllo microscopio può consenta di compensare le spostamento campione durante stiramento.

Un altro svantaggio è la difficoltà di avere immagini ad alta risoluzione, perché usando obiettivi ad immersione in olioproduce movimenti del substrato morbido, quando l'obiettivo si muove troppo velocemente. Questo può essere risolto con acqua (ma l'evaporazione è un problema per gli esperimenti a lungo termine) o di olio molto fluido.

Modifiche e applicazioni future:

In collaborazione con Yanlan Mao e Nic Tapon dal Cancer Research Institute (Londra, UK), abbiamo sviluppato un'altra versione della barella che permette a due strati di PDMS uno sopra l'altro, con il campione essendo nel mezzo, in modo da pizzicare e allungare i tessuti interi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141