Summary
כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.
Abstract
מאז הגילוי של תאי גזע mesenchymal / סטרומה (MSCs), הזהות והלוקליזציה של MSCs ילידים טושטשו על ידי הבידוד רטרוספקטיבית שלהם בתרבות. לאחרונה, באמצעות מיון הקרינה המופעל תא (FACS), אנחנו וחוקרים אחרים מכאן ולהבא מזוהים ומטוהרים שלוש אוכלוסיות של תאי מבשר multipotent הקשורים לכלי הדם של שריר שלד אנושי. שלוש אוכלוסיות אלה תא: תאי myogenic אנדותל (MECs), pericytes (מחשבים), ותאי adventitial (ACS), הם מקומיים בהתאמה לשלוש שכבות המבניות של כלי דם: אינטימה, מדיה, וadventitia. כל תא אלה האדם נגזר כלי דם הגזע (hBVSC) אוכלוסיות לא רק להביע את סמני MSC קלאסיים אבל גם בעלי פוטנציאל התפתחותי mesodermal דומה לMSCs הטיפוסי. בעבר, היו מבודדים MECs, מחשבים, ומזגנים באמצעות פרוטוקולים שונים ומאופיין לאחר מכן במחקרים נפרדים. Prot הבידוד הנוכחיocol, באמצעות שינויים לתהליך הבידוד והתאמות בסמנים פני תא בררניים, מאפשר לנו לטהר בו זמנית בכל שלוש hBVSC האוכלוסיות ידי FACS מביופסיה של שריר אנושי אחת. שיטה חדשה זה לא רק לייעל את הבידוד של אוכלוסיות BVSc מרובות, אלא גם להקל על יישומים קליניים עתידיים של hBVSCs למטרות טיפוליות שונות.
Introduction
שרירי שלד אנושיים כבר נחשב מקור קליני אטרקטיבי של תאי גזע / אב. שרירי שלד מכיל לא ביצעו רק אבות myogenic, myoblasts שלד, אלא גם תאי גזע myogenic פרימיטיביים, כוללים תאי לווין ותאי שמקורם בשרירי גזע (MDSCs) 1. השימוש בתאים אנושיים שמקורם בשרירי גזע / אב, אוטולוגי או אלוגנאית, ברפואת רגנרטיבית נחקר בהרחבה במודלים של בעלי חיים טרום קליניים וניסויים קליניים. יישומי ההתחדשות של תאי גזע / אב שריר נעים בין התחדשות שריר dystrophic בניוון השרירים דושן חולים (DMD) לתיקון הלב הפגוע בחולים עם התקף לב.
מאז גילויו של גזע תאי mesenchymal / סטרומה (MSCs) ואוכלוסיות תאי מבשר multipotent אחרות, כוללים תאי עצם המופק ממח multipotent אב המבוגר (MAPCs) ותאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs), גזע בוגרים /תאי אב נחקרו בהרחבה עד כה 1-9. עם זאת, זהותם ילידים ולוקליזציה באתר טושטשו על ידי שיטות בידוד למפרע. לאחרונה, באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS), אנו וקבוצות אחרות מכאן ולהבא מזוהים ושלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent מטוהרים מכלי דם בתוך שרירי שלד אנושיים וכמה איברים אחרים: תאי האנדותל myogenic (MECs), pericytes (מחשבים), ותאי adventitial (ACS) 10. ניתן למצוא שלוש תת אוכלוסיות אלו של תאים אנושיים דם המופק מכלי גזע (hBVSCs) בהתאמה בשלוש שכבות המבניות של כלי דם: אינטימה Tunica, תקשורת Tunica, וadventitia Tunica. באופן ספציפי יותר, MECs ומחשבים מזוהים בmicrovessels ונימים תוך מזגנים מותאמים לשפה מקומיים בשכבת adventitia של עורקים וורידים גדולים יותר. כל תת תא מבשר מבטא שילוב ייחודי של אנטיגנים פני תא: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), מחשבים (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), והמזגנים (CD34 + / 31 ב-- / 45 - / 56 - / 146 -).
אפיון נוסף של תת hBVSC אלה גילה כי כל שלוש אוכלוסיות תאי מבשר יש פוטנציאל ההתפתחותי mesodermal דומה לMSCs הטיפוסי, כולל myogenesis שלד, osteogenesis, chondrogenesis, וadipogenesis. כל תת hBVSC גם תערוכת סמני MSC קלאסיים, כולל CD44, CD73, CD90, וCD105, טרי ובתרבות. באופן קולקטיבי חתיכות של ראיות אלה תמכו במוצא כלי הדם של MSCs. יתר על כן, היכולות הטיפוליות של MECs, מחשבים, ומזגנים לאחרונה הודגמו במחקרים נפרדים. MECs מסודרים מביופסיות שריר אדם בוגרות הוצג להתחדש שרירים פגועים וdystrophic שלד ושריר לב תיקון נפצע בצורה יעילה יותר מאשר myoblasts השלד ואנדו וסקולריתתאי thelial (EC). מחשבים מטוהרים מאיברים אנושיים שונים גם הוכחו כדי לתקן / להתחדש שרירי שלד פצועים וdystrophic ולתרום לבריכת תא לווין 13-16. ממש לאחרונה, יש לנו הראינו כי מחשבים הנגזרים משרירי שלד אדם ביעילות לתקן את שריר לב infarcted דרך השפעה אוטוקריני עקיפה ואינטראקציות הסלולר ישירות 17. מזגנים, מצד שני, היו גם מבודד ישירות מכלי דם explanted או מטוהר על ידי FACS מרקמת שומן אנושי ושרירי שלד. השפעה פרו angiogenic בולטת של מזגנים הודגמה במודל איסכמיה האחורית גפת עכבר 19. יתר על כן, מזגנים יש גם הוכחו כדי לתקן שריר לב infarcted יעילות רבה יותר מאשר MSCs הקונבנציונלי, המציין את הפוטנציאל הטיפולי החזקה של ACS בתיקון רקמות איסכמי 20.
המענקים הנוכחיים פרוטוקול טיהור בו זמנית, הטיהור פוטנציאלי של MECs, מחשבים, ומזגנים מכלי הדם של ביופסיה של שריר בודד אנושית שלד. זה מאפשר לנו ללמוד ו / או לבחור תת אוכלוסיות hBVSC אופטימליות למטרות טיפוליות שונות. בנוסף, טכניקה חדשה זו מרחיבה את הרפרטואר של תאי גזע / אב שניתן להפיק משריר שלד אנושי, מה שהופך את המקור אידיאלי של תאי מבשר multipotent לרפואת רגנרטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 שריר הביופסיה עיבוד
- לשמר ביופסיה של שריר שלד אנושי על קרח בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 5% שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S) במהלך הובלה.
- לאחר קבלת הביופסיה של השריר, להסיר את הדגימה ממכל התחבורה ולשטוף אותו פעמיים בפוספט שנאגרו מלוח (PBS) בתוספת 2% פתרון לאנטיביוטיקה נגד פטריות (/) בתנאים סטריליים.
- הסר את השומן המצורף ורקמת חיבור עם מספריים סטריליים ומלקחי DMEM בתוספת 2% /.
- הסר כלי דם גדולים תחת מיקרוסקופ לנתיחה, ולאחר מכן לחתוך את דגימת השריר לחתיכות קטנות (<1 סנטימטר 2 בגודל).
- לשמר פיסות שריר לחתוך (<5 גרם) ב20 מ"ל בינוני שימור (PM; DMEM בתוספת 10 FBS% לבין 1% P / S) בשעה 4 ℃ עד 5 ימים.
.2 שרירים Dissociatיון ובידוד תא
- ביום של בידוד תא, להסיר את חתיכות שריר מPM ולשטוף פעמיים בPBS בתוספת 2% P / S. כדי להפוך את הפתרון לעיכול, להוסיף סוג-I, סוג II, וcollagenases הסוג-IV (100 מ"ג / מ"ל) טרי לPM.
- קוצצים דק ומכאני בררו בחתיכות שריר עם מספריים ומלקחיים סטריליות בצלחת פטרי, עם כמות קטנה של אחר הצהריים עד לפתרון עובר פיפטה סרולוגית 10 מ"ל ללא קרישה. הסר את השומן שיורית ורקמת חיבור במהלך תהליך זה. השתמש לפחות 8-10 גרם של שריר למבוגרים או 2 גרם של שריר עוברי לכל תא בידוד.
- העבר 4-5 גרם של שריר למבוגרים טחון ל20 מ"ל (או 2 גרם של שריר בעובר טחון ל10 מ"ל) הצטברו פתרון עיכול עם טפטפת סרולוגיות 10 מ"ל. לעכל ל50 - 60 דקות ב 37 ℃ על שייקר מסלולית ב70 - 80 סל"ד. לייעל תשואת תא ושימור אנטיגן פני השטח על ידי התאמת זמן העיכול ו / או מהירות תסיסה בהתאם על בסיס הסכוםשל רקמה. שים לב למצב העיכול כל דקות 15-20 עד העכירות כמעט מנקה.
- במרץ פיפטה הרקמה מתעכל 3-5 פעמים עם טפטפת סרולוגיות 10 מ"ל. להוסיף כמות שווה של PM כדי לעצור את התגובה ואז צנטריפוגות ב XG 400 למשך 4 דקות.
- להסיר את supernatant בזהירות; resuspend גלולה עם 10 PM מ"ל לשטוף, ולאחר מכן מסונן דרך מסננת תא 100 מיקרומטר.
- צנטריפוגה ב XG 400 למשך 4 דקות ולהסיר את supernatant בזהירות. כדורים גלולים במאגר תמוגה כדורית אדומה (155 מ"מ NH 4 Cl, 10mm KHCO 3, 0,1mM EDTA), לסנן דרך מסננת 70 מיקרומטר תא לקבל השעיה תא בודדת, ולאחר מכן דגירה של 10 דקות ב RT. לסנן דרך מסננת תא 70-m שוב אם כל משקעים שנצפו.
- צנטריפוגה ב XG 400 למשך 4 דקות וresuspend התא גלולה ב0.5 מ"ל PBS. לספור את מספר התאים. להשיג כולל של לפחות 5 מיליון תאים למיון תא. לדלל את singlהשעיה תא דואר בפחות מ 5 מיליון תאים לכל מ"ל עם PBS עבור מכתים. להוציא 50-100 μl של ההשעיה התא ופוצל ל11 צינורות לstainings שליטה (שליטה בלא כתם, בקרות שליליות, ואחת בצבע בקרות חיוביות).
.3 תיוג תא ומיון
- דגירה ההשעיה התא בודדת ל10 דקות ב 4 ℃ בסרום עכבר (בדילול 1:10 ב PBS) לחסימת מטרה במקרה צורך.
- הוספת CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, וCD146-FITC (כל 1: 100) לתוך ההשעיה התא בודדת ודגירה של 20 דקות ב 4 ℃. לבקרה שלילית, להוסיף ריכוזים מקבילים של APC-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE-, ונוגדנים IgG אלוטיפ FITC- מצומדות ודגירה של 20 דקות ב 4 ℃. לבקרות חיוביות יחיד צבע, להוסיף ריכוזים מקבילים של CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, וCD146-FITC בנפרד לתוך צינור כל דגירה של 20 דקות ב 4 ℃.
- לאחר דגירה, צנטריפוגות ב XG 400 למשך 4 דקות לשטוף. Resuspend התא גלולה ב 1 - 2 מ"ל DMEM בתוספת 5% FBS ו -1% P / S. הריכוז הסופי של ההשעיה התא צריך להיות פחות מ -5 מיליון תאים לכל מ"ל. להוסיף 7-AAD (1: 100) ו דגירה של 15 דקות ב RT להדרת תא מת. לביקורת שלילית וביקורת חיובית אחת בצבע, כדורי תא גלול ב0.5 מ"ל DMEM בתוספת 5% FBS ו -1% P / S.
- העבר את כל השעיות התא לזרימת קלקר מסביב לתחתית cytometry צינורות. הכן צינורות אוסף תאים (צינור אחד הוא מראש מלא ב500 μl של מדיום התרבות המתאים: MPM לMECs; EGM-2 למחשבים; בינוני AC עבור ACS). השעיות תא תחבורה על קרח לסדרן התא.
- השעיות תא לרוץ על סדרן התא בצו של השליטה בלא כתם, בקרות שליליות, בקרות חיוביות יחיד צבע, ואת ההשעיה התא העיקרית תוך התאמת עוצמת לייזר, פיצוי ערוץ, ואוכלוסיית תא gating קפדנות על מנת למקסם את p תאurity (עיין מאמרים שפורסמו על ידי יופיטר וכתבי עת אחרות לפרטים של זרימת cytometry).
- לאסוף אוכלוסיות תאים רצויות בצינורות האיסוף המתאימים. תאים שנאספו חנות ב 4 ℃ אם לא זריעה מייד.
.4 פוסט מיון תרבית תאים
- זרעי MECs טריים מסודרים (P0) בשעה <10,000 תאים / 2 סנטימטר בMPM לצלחות מראש מצופות עם סוג אני קולגן. לpassaging הבא של MECs, זרע 3,500 - 4,000 תאים / 2 סנטימטר בMPM על צלחות / צלוחיות מראש מצופות עם סוג אני קולגן.
- זרעי מחשבים טריים מסודרים (P0) בשעה <20,000 תאים / 2 סנטימטר בEGM-2 לצלחות טריות מצופות בג'לטין 0.2%. לpassaging הבא של מחשבים, לפצל תאים ב1: 3 יחס במדיום מחשב (DMEM בתוספת 20 FBS% לבין 1% P / S) על גבי צלחות תרבות קלקר רגילות עד P2. מP3 ואילך, תאי זרע ב6,500 - 7,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום מחשב לצלחות / צלוחיות תרבות קלקר רגילות.
- זרעי מזגנים טריים מסודרים (P0) בשעה <20,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום AC (DMEM בתוספת FBS 20% לבין 1% P / S) על גבי צלחות תרבות קלקר רגילות. לpassaging הבא של מזגנים, תאי זרע ב6,500 - 7,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום AC על צלחות / צלוחיות תרבות קלקר רגילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרמטרים FACS מתוקנים ראשון המבוססים על נתונים המתקבלים מהשליטה ללא רבב, בקרות שליליות, ובקרות חיוביות יחיד צבע. לאחר ההרחקה של תאים מתים, השעיה תא שכותרתו הקרינה היא נתון לסדרה של בחירות סמן פני תא שליליים וחיוביות. ראשית, תאי CD45 + הם מגודרים לפני CD56 + וCD56 - תאים מופרדים מCD45 - שבריר. CD56 + שבריר נתון נוסף לבחירת CD34-CD144 שבו רק CD34 + / CD144 + תאים (כפולים חיוביים) מסומנים כMECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -) ולאחר מכן נאסף (איור 1). באופן דומה, CD56 - שבריר נתון נוסף לבחירת CD34-CD146 שבו רק CD34 - / CD146 + תאים מסומנים כמחשבים אישיים (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) ולאחר מכן נאסף (
טרי יכולים להיות נזרעו תאים ממוינים בתנאי תרבות שצוינו בפרוטוקול להתרחבות נוספת או להשתמש בו מייד לניסויי in vivo. התרחבות משובט של תת hBVSC יכולה להיות מושגת על ידי מערכת autoclone FACS אריה או הגבלת שיטת דילול 13, 21. שלא כמו MSCs הטרוגנית האופייני, תרבויות של תת hBVSC יישארו הומוגנית גם לאחר התרחבות לטווח ארוך. מורפולוגיה נציג של תת hBVSC התרבותי, מטוהר מביופסיות שרירתורם יחיד, מוצג באיור 2. השוואות בין MSCs הטיפוסי ותת hBVSC המטוהר מסוכמות בטבלה 1.
איור 1 מיון נציג של שלוש תת קבוצות של תאי גזע שמקורם-כלי דם אנושיים (hBVSCs) מביופסיה של שריר בודד אנושית שלד. טוהר של כל אוכלוסיית תאים ממוינת הוא אישר עוד יותר על ידי ניתוח שלאחר sort-. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
שלוש אוכלוסיות איור 2 hBVSC, מסודרים להומוגניות, הציגו מורפולוגיה שונה בגulture (משמאל לימין): myogenic תא האנדותל (MEC), pericyte (PC), ותא adventitial (AC) (בקטע 4, ברים בקנה מידה = 100 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| MSCs | MECs | מחשבים | מזגנים | |
| טוהר | הטרוגניות | אחידים | אחידים | אחידים |
| פרופיל אנטיגן פני תא לטיהור | N / | CD34 + CD45- CD56 + CD144 + | CD31- CD34 + CD45- CD146- | |
| ביטוי סמן MSC בתרבות | CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + |
| Multipotency | Osteogenesis Myogenesis (+) Adipogenesis (+) (+) Chondrogenesis (+) | Osteogenesis Myogenesis (+) Adipogenesis (+) (+) Chondrogenesis (+) | Osteogenesis Myogenesis (+) Adipogenesis (+) (+) Chondrogenesis (+) | Myogenesis (N / A) Adipogenesis (+) Osteogenesis (+) Chondrogenesis (+) |
| יישומים פוטנציאליים | תיקון / התחדשות Skeletomuscular: עצם, סחוס, גיד, רצועה, ושרירי שלד; תיקון לב; תיקון כלי דם; ריפוי פצע; Immunoregulation | תיקון לב; תיקון שלד שריר / התחדשות; עצם / תיקון סחוס / התחדשות | תיקון לב; תיקון / התחדשות כלי דם; תיקון שלד שריר / התחדשות; התחדשות עצם | תיקון לב; תיקון / התחדשות כלי דם; התחדשות עצם |
| לוקליזציה אנטומי באתר | N / | אינטימה כלי דם | מדיה כלי דם | Adventitia כלי דם |
השוואת .1 טבלה של MSCs הטיפוסי ואוכלוסיות hBVSC multipotent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי וטיהור של אוכלוסיות hBVSC מייצגים התקדמות משמעותית בהבנה של ontogeny MSC. יש ראיות המצביעות על הגדלת מוצא perivascular של MSCs ואת הקשר בין תאי מבשר רקמות ספציפיות וכלי דם 22-25. בנוסף, היכולת לבודד אוכלוסיות הומוגניות של hBVSCs מסייעת ההבנה של ההטרוגניות MSC ותא וכלי דם ביולוגיה 26 נוספים.
בשנים האחרונות, MECs, מחשבים, ומזגנים זוהו בנפרד ומבודד באמצעות פרוטוקולים שונים במחקרים שונים. עם זאת, לא נעשה ניסיון לטהר את כל שלוש תת קבוצות hBVSC בו זמנית משרירי שלד אנושיים בשל הקשיים כדי לייעל את הליך ניתוק רקמה ושילוב של סמני שושלת תא סלקטיבית זיהוי MECs, מחשבים, ומזגנים לגמרי. כאן אנו תיארנו פרוטוקול בידוד תא חדש המאפשר מגעי תחנות בו זמניתication של MECs, מחשבים, ומזגנים מביופסיה של שריר אנושי אחת על ידי שינוי תהליך ניתוק הרקמות ויישום שילוב חדש של סמנים פני תא סלקטיבית (איור 1). לתוצאה הטובה ביותר, השלבים הקריטיים בפרוטוקול הנוכחי שדורשים תשומת לב נוספת כוללים: .1 טריות ושימור של דגימת הרקמות; 2 אופטימיזציה של תשואת תא ושימור אנטיגן פני השטח על ידי ניטור קפדני של תהליך העיכול והתאמת זמן ניתוק רקמות; .3 כיול מדויק של ששת הצבעים cytometry זרימה. פרמטרים אלה הם שייקבעו על ידי מעבדה פרט לפי התקנת אספקה / הציוד הספציפי שלה.
על ידי יישום פרוטוקול חדש זה, אחד יכול לא רק לייעל את בידוד סינכרוני של אוכלוסיות hBVSC מרובות, אלא גם להקל על ניצול של hBVSCs למחקר בסיסי ויישומי translational, כגון ההשוואה של התנהגויות סלולריות ההפרש בין hBVSתת C ואופטימיזציה של קבוצת משנה יחיד או קומבינטורית hBVSC (ים) עבור יישומים טיפוליים מותאמים אישית שונים. עם זאת, הבידוד בו הזמני של כל שלוש תת קבוצות hBVSC מוגבל כיום לשרירי שלד בשל העובדה שMECs לא זוהה ברקמות אנושיות אחרות. חוץ מזה, זה מעבר למגבלה של הפרוטוקול הנוכחי להבחין המעבר ו / או היררכיה סלולרית בין שלוש אוכלוסיות hBVSC אלה.
אפיון מבודד טרי ותרבותי MECs, מחשבים, ומזגנים כבר הוכיחו בנפרד בMECs מחקרים הקודם בתרבות לשמור על הביטוי של CD56 סמן myogenic אבל מאבד את הביטוי של סמני EC CD34 וCD144 בהדרגה. ברמה המשובט, MECs להביע סמני MSC, כולל CD29, CD44, CD90, וCD105, ולהציג את פוטנציאל התמיינות mesenchymal כגון chondrogenesis, osteogenesis, adipogenesis, וmyogenesis. בנוסף, MECs המשובט לשמור angiogenקיבולת ic אחרי תרבות לטווח ארוך, ויצר רשתות כמו נימים-בתרבות Matrigel והשתתפות בneovascularization in vivo 21.
מחשבים, טריים או מתורבתים, הוכחו להביע לא רק סמני MSC, כולל CD44, CD73, CD90, וCD105, אלא גם להפגין יכולות התפתחותיות mesodermal, למשל, myogenesis שלד, osteogenesis, chondrogenesis, וadipogenesis 13. מחשבים וחסונה להפריש מספר גורמים תזונתיים, אפילו תחת היפוקסיה, ומשמשים כיחידות משובי באמצעות הפונקציה שלהם אוטוקריני, בידול ישיר, ואינטראקציה סלולרית בעת תיקון רקמות תהליך ההתחדשות / מזגנים, בדומה למחשבים, הוצגו להביע סמני MSC קלאסיים ולהתמיין לשושלות תאי מזנכימה גדולות 18. יחד עם מחשבים, מזגנים גם הוצעו כאחד מהמקורות ההתפתחותי של תאי גזע. סיכום השוואת ביטוי סמן פני תא, יכולת הבחנה, וpיישומי translational ossible בין MSCs וhBVSCs הטיפוסיים כבר מופיעים בטבלה 1. לאחרונה, טאנג et al. תאים מזוהים multipotent כלי דם גזע (MVSCs) מתקשורת Tunica של כלי דם גדולים בחולדה ו29 אנושיים. MVSCs לא מבדיל רק לתאי שריר חלק, אלא גם לתרום לשיפוץ של כלי דם והיפרפלזיה neointimal לאחר פציעה של כלי דם 29. בין אם MVSCs לשתף קשרים התפתחותיים עם BVSCs המתגורר בכלי microvasculature וקטנים דורש חקירה נוספת.
הפרוטוקול הנוכחי דורש בידוד תא בזמן מביופסיה טרי אנושית שריר, אשר, בזמנים, לא יכול להיות נגישה במסגרות הקליניות. לחלופין, מבוסס על סדרה שונה של סמנים פני תא סלקטיבית, זה אפשרי כדי לטהר MECs ומחשבים מתרבויות cryopreserved אנושיים ראשוניות שלד תא שריר על ידי cytometry זרימה 30. שיטה זו מאפשרת מגעי תחנות פוטנציאלייםication של שני תת hBVSC מתרבות פקידה אנושית שלד שריר למטרות טיפוליות. עם זאת, בשל חוסר ביטוי CD34 בתאי שריר אנושיים בתרבית, לא ניתן להפריד עוד יותר מזגנים עם פרוטוקול המסוים הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לאליסון Logar לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלה עם cytometry זרימה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד ההגנה (JH), הנרי ג 'מנקין נתרמו היו"ר (JH), ומשרד החינוך והמדע של הרפובליקה של קזחסטן (AS). CWC נתמך בחלקו על ידי המענק של איגוד לב האמריקאי predoctoral (11PRE7490001). M.Corselli נתמכה על ידי המכון בקליפורניה מענק הכשרת רפואת רגנרטיבית (TG2-01169).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACS Aria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 complete medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
