Summary
ヒト骨格筋内の血管は、再生アプリケーションに最適ですいくつかの多系列前駆体集団を保有する。内膜から筋原内皮細胞、培地から周皮細胞、および外膜から外膜細胞：この分離法は、血管の三つの構造層からそれぞれ3多能性前駆細胞集団の同時精製を可能にする。
Abstract
間葉系幹/間質細胞（MSC）の発見以来、ネイティブのアイデンティティおよびMSCの局在は、培養中の彼らの回顧分離によって隠されています。最近では、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて、われわれおよび他の研究者が前向きにヒト骨格筋の血管系に関連付けられた多能性前駆細胞の三亜集団を同定および精製された。これらの3つの細胞集団：内膜、メディア、および外膜：筋原内皮細胞（のMEC）、周皮細胞（パソコン）、および外膜細胞（ACS）は、血管の3の構造層のそれぞれに局在している。すべてのこれらのヒト血管由来幹細胞（hBVSC）集団は古典のMSCマーカーを発現するだけでなく、典型的なのMSCに類似した中胚葉の発達ポテンシャルを有していないだけの。以前は、のMEC、PC、およびACSは別個のプロトコルを使用して単離され、その後独立した研究で特徴づけられている。現在の分離PROTocol、選択的な細胞表面マーカーの分離プロセスへの修正や調整を通じて、私たちは同時に単一のヒト筋生検からFACSによる3つのすべてのhBVSC亜集団を精製することができます。この新しい方法は、複数のBVSC亜集団の単離を効率化するだけでなく、明確な治療目的のためのhBVSCsの将来の臨床応用が容易になるだけでなく、。
Introduction
ヒト骨格筋の幹/前駆細胞の臨床的に魅力的な供給源と考えられてきた。骨格筋は、コミットされた筋原前駆細胞、骨格筋芽細胞だけでなく、衛星細胞や筋肉由来幹細胞（MDSCを）1を含むプリミティブ筋原幹細胞だけでなく、含まれています。ヒト筋肉由来の幹/前駆細胞、自己または同種異系の使用は、再生医療において広範に前臨床動物モデルおよび臨床試験で検討されている。筋肉幹細胞/前駆細胞の再生アプリケーションは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）患者におけるジストロフィー再生筋肉から心臓発作の患者で負傷心臓を修復するまでの範囲である。
骨髄由来多能性成体前駆細胞（MAPCを）および脂肪由来幹細胞（ADSCの）、成体幹/を含む間葉系幹/間質細胞（MSC）と他の多能性前駆細胞集団の発見以来、前駆細胞は、広範囲の日付1-9に研究されてきた。それにもかかわらず、 その場での母国のアイデンティティと局在は遡及的単離法によって隠されています。最近では、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用して、私たちは他のグループは、将来に向かって特定されてきた血液ヒト骨格筋内の血管や他のいくつかの器官から精製された3多能前駆細胞集団：筋原内皮細胞（のMEC）、周皮細胞（パソコン）、および外膜細胞（ACS）10。内膜、中膜、および外膜：ヒト血液·血管由来幹細胞（hBVSCs）これらの3つの亜集団は、それぞれの血管の3の構造層で見つけることができます。 ACSは、より大きな動脈および静脈の外膜層に局在しながらより具体的には、のMECとPCは、微小血管および毛細血管で検出される。のMEC（C：各前駆細胞サブセットは、細胞表面抗原の独特な組合せを表すD34 + / 56 + / 144 + / 45 - ）、パソコン（CD146 + / 34 - / 45 - / 56 - ）、およびACS（CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 - ）。
これらhBVSCサブセットのさらなる特徴付けは、すべての3つの前駆細胞集団は、骨格筋、骨、軟骨、および脂肪生成を含む典型的なMSCは、中胚葉に類似発達ポテンシャルを有することが明らかになった。すべてhBVSCサブセットはまた、CD44、CD73、CD90、およびCD105、たてや文化などの古典的なMSCのマーカーを呈する。集合的証拠のこれらの作品は、MSCの血管起源を支持した。また、のMEC、パソコン、およびACSの治療能力は、最近独立した研究で実証されている。成人の筋肉生検から選別のMECは、負傷したとジストロフィー骨格筋や修理負傷した心筋よりも効率的に骨格筋芽細胞と血管エンドを再生成することが示されたthelial細胞（EC）。異なるヒト器官から精製されたパソコンにも/修復し、損傷したとジストロフィー骨格筋を再生し、衛星細胞プール13-16に寄与することが示されている。ごく最近、私たちはヒト骨格筋から得られたPCを効果的に間接的なパラクリン作用と直接的な細胞間相互作用17を介して梗塞心筋を修復することを実証した。 ACSは、一方で、直接外植された血管から単離されているかまたはヒト脂肪組織および骨格筋からFACSによって精製した。のACの顕著な血管新生促進効果は、マウス後肢虚血モデル19で実証された。また、ACSはまた、虚血性組織修復20で、ACSの堅牢な治療の可能性を示して、より効率的に、従来のMSCより梗塞心筋を修復することが示されている。
同時現在の精製プロトコルの助成金、のMECの将来の精製、PC、および単一のヒト骨格筋生検の血管系からのAC。これは、私たちは勉強し、および/または個別の治療目的のための最適なhBVSC亜集団を選択することができます。さらに、この新しい手法は、更に、その再生医療のための多能性前駆細胞の理想的な供給源作り、ヒト骨格筋に由来することができる幹細胞/前駆細胞のレパートリーを拡大する。
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Protocol
1筋生検の処理
- ダルベッコ改変イーグル培地、5％ウシ胎児血清（FBS）を補足し（DMEM）中で、氷上で、ヒト骨格筋生検を維持する1％ペニシリン - ストレプトマイシン輸送時（P / S）。
- 筋生検の受領後、輸送容器から検体を除去し、無菌条件下で、2％抗生物質 - 抗真菌溶液（A / A）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で二回洗浄する。
- 2％A / Aを添加したDMEM中の無菌のハサミとピンセットで付属脂肪および結合組織を除去します。
- 解剖顕微鏡下で大血管を削除し、その後に小さな断片に筋肉標本をカット（<サイズが1cm 2）。
- 20ミリリットル保存培地におけるカット筋片（<5グラム）を維持（PMを、DMEM、10％FBSおよび1％P / Sを補充した）、5日間まで4℃で。
2マッスルDissociatイオンと細胞単離
- 細胞単離の日に、PMから筋肉片を除去し、PBSで2回洗って、2％P / Sを補充した。消化溶液を作るために、新鮮に、PMにI型、II型、及びIV型コラゲナーゼ（100 mg / mlの）を追加します。
- 細かくみじん切りにし、機械的に解決策のない凝固で10mlの血清学的ピペットを通過するまで、PM少量のペトリ皿中の滅菌ハサミや鉗子で筋肉の部分をミンチ。このプロセスの間に残留脂肪および結合組織を除去します。大人の筋肉の少なくとも8〜10グラムまたは各細胞を単離するための胎児の筋肉の2グラムを使用してください。
- 10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて消化溶液ofthe（10ミリリットル中にまたはミンチ胎児筋の2グラム）20mlに刻んだ大人の筋肉4-5グラムの転送します。 80rpmで - 70のオービタルシェーカー上で37℃で60分間 - 50のためのダイジェスト。それに応じて量に基づいて、消化時間および/または撹拌速度を調整することにより、細胞収量および表面抗原の保存を最適化組織の。濁りがほぼ透明になるまで消化の状態ごとに15〜20分を観察します。
- 激しく消化された組織を10ミリリットルの血清学的ピペットで3〜5回ピペット。反応を停止した後、4分間400×gで遠心分離するPMの等しい量を追加します。
- 注意深く上清を除去し;洗浄するために10ミリリットルのPMでペレットを再懸濁した後、100μmのセルストレーナーで濾過した。
- 4分間400×gで遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。赤血球溶解緩衝液（155 mMの塩化アンモニウム、10mMのKHCO 3、0,1mM EDTA）に再懸濁ペレットを、単一細胞懸濁液を得るために、70μmのセルストレーナーでろ過した後、室温で10分間インキュベートする。いずれの沈殿が観察された場合には、再度70-mセルストレーナーを通して濾過する。
- 4分間400×gで遠心し、0.5 mlのPBS中に細胞ペレットを再懸濁します。セルの数をカウントします。細胞選別のために少なくとも5万個の細胞の総数を取得します。 SINGLを希釈染色のためPBSで1mlあたり5未満百万個の細胞に電子細胞懸濁液。対照染色（非染色コントロール、ネガティブコントロール、および単一色陽性対照）のための11のチューブに細胞懸濁液とスプリットの50〜100μLを取り出します。
3細胞標識およびソート
- 必要に応じて目的を阻止するためのマウス血清（PBS中に希釈1:10）での4℃で10分間の単一細胞懸濁液をインキュベートする。
- 単一細胞懸濁液にし、4℃で20分間インキュベート：CD34-APC、CD45-APC-Cy7で、CD56-PE-Cy7で、CD144-PE、およびCD146-FITC（100すべて1）を追加します。ネガティブコントロールのために、APC-、APC-Cy7-、PE-Cy7-、PE-およびFITC結合アイソタイプのIgG抗体の同等の濃度を追加し、4℃で20分間インキュベートする。単色陽性対照のために、個別に各チューブに、CD34-APC、CD45-APC-Cy7で、CD56-PE-Cy7で、CD144-PE、およびCD146-FITCと同等の濃度を追加し、4℃で20分間インキュベートする。
- インキュベーション後、4分間400×gで遠心分離器は、洗浄する。 5％FBSおよび1％P / Sを補充した2mlのDMEM中1 - で細胞ペレットを再懸濁する。細胞懸濁液の最終濃度は、1ml当たり5未満万細胞であるべきである。 7-AAD（1：100）を追加し、死細胞の排除のために室温で15分間インキュベートする。陰性対照および単一色陽性対照のために0.5mlのDMEMで再懸濁した細胞ペレットを、5％FBSおよび1％P / Sを補充した。
- 試験管フローサイトメトリーの丸底ポリスチレンフローにすべての細胞懸濁液を転送します。細胞収集チューブを準備し（：ACSの交流媒体のMECのためのMPM; EGM-2 PC用それぞれのチューブは、適切な培養液500μlで予め充填されている）。セルソーターに氷上で細胞懸濁液を輸送する。
- 非染色対照、陰性対照、単一色の陽性対照、および主細胞懸濁液の順にセルソーター上で実行細胞懸濁液セルpを最大にするために厳密にゲーティングレーザー強度、チャネル補償、および細胞集団を調整しながらurity（フローサイトメトリーの詳細についてはJoveの及びその他の学術誌によって発表された論文を参照してください）。
- 適切な採血管において所望の細胞集団を収集します。 4℃で保存収集された細胞はすぐに播種されていない場合。
4。後の仕分け細胞培養
- I型コラーゲンでプレコートしたプレート上にMPMイン/ cm 2で<10,000細胞たてのソートのMEC（P0）をシード。のMECのその後の継代のために、3,500シード-でプレコーティングプレート/フラスコ上にMPMに4,000細胞/ cm 2の I型コラーゲン。
- たて0.2％ゼラチンでコーティングしたプレート上にEGM-2の<20,000細胞/ cm 2でのたてソートのPC（P0）をシード。 PC培地中で3比P2まで定期的なポリスチレン培養プレート上に（20％のFBSおよび1％P / Sを補充したDMEM）：パソコンのその後の継代のために、1で細胞を分割する。 P3から以降は、種子細胞における6,500 -正規ポリスチレン培養プレート/フラスコ上にPC培地中7,000細胞/ cm 2。
- 定期的なポリスチレン培養プレート上に（20％のFBSおよび1％P / Sを補充したDMEM）AC培地中で<20,000細胞/ cm 2で新たにソートのAC（P0）をシードする。定期的なポリスチレン培養プレート/フラスコの上にAC培地中7,000細胞/ cm 2 - 6,500で、後続のACの継代、種子細胞について。
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Representative Results
FACSパラメータは、最初の未染色対照、陰性対照、及び単色陽性対照から得られたデータに基づいて補正される。死細胞を除外した後、蛍光標識された細胞懸濁液は、負および正の細胞表面マーカーの一連の選択に供される。まず、CD45 +細胞は、CD56 +前にゲートされており、CD56 -フラクション-細胞がCD45から分離される。 CD56 +画分は、さらに、CD34-CD144の選択に供した場合のみ、CD34 + / CD144 +（デュアル陽性）細胞のMECとしてマークされている（CD34 + / 56 + / 144 + / 45 - ）、続いて収集された（ 図1）。同様に、CD56 -画分は、さらに、CD34-CD146の選択に供した場合のみ、CD34 - / CD146 +のPCとしてマークされている細胞（CD146 + / 34 - / 45 - / 56 - ）、続いて収集された（
新たに選別された細胞は、さらなる拡張またはin vivo実験のためにすぐに使用するためのプロトコルで指定された培養条件で播種することができる。 hBVSCサブセットのクローン性増殖は、FACSアリアautocloneシステムまたは限界希釈法13、21により達成することができる。典型的なヘテロジニアスのMSCとは異なり、hBVSCサブセットの培養はあっても、長期的な拡張後の均質性を維持する。の筋肉生検から精製された培養されたhBVSCサブセットの代表的な形態は、単一ドナーは、 図2に示されている典型的なMSCおよび精製hBVSCサブセット間の比較は、 表1にまとめる。
単一のヒト骨格筋生検からのヒト血管由来の3つのサブセット幹細胞（hBVSCs）の図1。代表のソート。各ソートされた細胞集団の純度は、さらに後のソート分析により確認されています。 見るにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
3 hBVSC亜集団。図は、均質に振り分け、（c）に明確な形態を示した（左から右）ulture：筋原内皮細胞（MEC）、周皮細胞（PC）、および外膜細胞（AC）は（通路4、スケールバー= 100ミリメートルで）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| MSCは | のMEC | パソコン | のAC | |
| 純度 | 異種の | 同種の | 同種の | 同種の |
| 精製のための細胞表面抗原プロファイル | N / A | CD34 + CD45 - CD56 + CD144 + | CD31- CD34 + CD45 - CD146- | |
| 培養中のMSCマーカー発現 | CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + |
| 多分化 | 筋形成（+）脂肪生成（+）骨形成（+）軟骨（+） | 筋形成（+）脂肪生成（+）骨形成（+）軟骨（+） | 筋形成（+）脂肪生成（+）骨形成（+）軟骨（+） | 筋形成（N / A）脂肪生成（+）骨形成（+）軟骨（+） |
| 潜在的なアプリケーション | Skeletomuscular修理/再生：骨、軟骨、腱、靭帯、および骨格筋;心臓修復;血管修復;創傷治癒;免疫調整 | 心臓修復;骨格筋の修復/再生;骨/軟骨修復/再生 | 心臓修復;血管修復/再生;骨格筋の修復/再生;骨再生 | 心臓修復;血管修復/再生;骨再生 |
| その場での解剖学的局在 | N / A | 血管内膜 | 血管メディア | 血管外膜 |
典型的なMSCおよび多能hBVSC亜集団の表1の比較。
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Discussion
hBVSC亜集団の同定および精製は、MSC個体発生の理解における大きな進歩を表している。 MSCの血管周囲起源および組織特異的前駆細胞および血管22-25の間の関連性を示す証拠が増えている。また、hBVSCsの均質な亜集団を単離するための能力は、さらに、MSCの不均一性および血管細胞生物学26の理解を助ける。
過去数年間で、のMEC、PC、およびACSは、個別に独立した研究での明確なプロトコルを使用して同定され、単離されている。しかし、試みは組織解離手順と全くのMEC、PC、およびACSを特定する選択的な細胞系統マーカーの組み合わせを最適化することにより、困難にヒト骨格筋から同時に3つのすべてのhBVSCサブセットを精製するなされていない。ここでは、同時purifを可能にする新しい細胞単離プロトコルを説明した組織解離プロセスを変更し、選択的な細胞表面マーカー（ 図1）の新たな組み合わせを適用することによって、単一のヒト筋生検からのMEC、PCなどのACのication。最高の成果のために、追加の注意を必要とする現在のプロトコルの重要なステップは次のとおりです。1。鮮度と組織標本の保存を。細胞収率および慎重な消化プロセスの監視および組織解離時間を調整することにより表面抗原の保存の2の最適化; 6色フローサイトメトリーの3正確なキャリブレーション。これらのパラメータは、その具体的な供給/機器のセットアップに応じて個別の研究室によって決定されるべきである。
この新しいプロトコルを実装することで、人は複数のhBVSC亜集団の同期分離を効率化するだけでなく、基礎研究および翻訳アプリケーション用のhBVSCsの利用を容易にする、そのようなHBVS差の細胞の挙動の比較などができるだけでなく、C言語のサブセットと、さまざまなパーソナライズされた治療への適用のための単一または組み合わせhBVSCサブセット（複数可）の最適化。しかし、すべての3つのhBVSCサブセットの同時単離は、現在のMECは、他のヒト組織で同定されていないという事実による骨格筋に限定されている。また、それは、これら3つのhBVSC亜集団の間の遷移および/または細胞の階層を区別するために、現在のプロトコルの制限を超えている。
のキャラ新たに単離し、培養のMEC、PC、およびACSは、別途培養中の筋原性マーカーCD56の発現を維持するが、次第にECマーカーCD34およびCD144の発現を失う先行研究ののMECで実証されている。クローンのレベルでは、のMECはCD29、CD44、CD90、およびCD105を含む、MSCのマーカーを発現し、そのような軟骨形成、骨形成、脂肪生成および筋形成などの間葉系分化能を表示します。さらに、クローン性のMECは彼らangiogenを保持長期培養後にICの容量、マトリゲル培養で毛細管様のネットワークを形成し、 生体内での血管新生21に参加している。
新鮮なまたは培養のPCは、だけでなく、CD44、CD73、CD90、およびCD105を含む、MSCのマーカーを発現するだけでなく、例えば、骨格筋形成、骨形成、軟骨形成、および脂肪生成13のために、中胚葉発達能力を示すことが示されている。 PCは確実にあっても、低酸素下では、栄養因子の数を分泌し、組織修復/再生プロセスのPCと同様のAC、中にそれらのパラクリン機能、直接分化、および細胞の相互作用を介して、回生ユニットとして機能し、古典的なMSCのマーカーを発現することが示されたそして、主要な間葉系細胞系譜18に分化する。一緒にPCと、ACSはまた、MSCの発達起源の一つとして提案されている。細胞表面マーカー発現、分化能、およびpを比較する要約原因対処典型的なMSCおよびhBVSCsの間の翻訳アプリケーションは表1に記載されています。最近では、Tang らは 、ラットおよびヒト29の大きな血管の中膜から多能血管幹細胞（MVSCs）を同定した。 MVSCsは、平滑筋細胞に分化するだけでなく、血管損傷後29血管リモデリングおよび新内膜の過形成に寄与しない。 MVSCsは微小血管系内に存在するBVSCsと小血管との発達の接続を共有するかどうかは、さらなる調査が必要となります。
現在のプロトコルは常に、臨床現場ではアクセスできない場合があり、新鮮なヒト筋生検からのタイムリーな細胞単離を必要とします。代替的に、選択的な細胞表面マーカーの改変されたセットに基づいて、それは30フローサイトメトリーによって凍結保存ヒト初代骨格筋細胞培養物からのMECとPCを浄化することが可能である。この方法は、将来のpurifを許可治療目的のためにバンクヒト骨格筋培養物から二hBVSCサブセットのication。それにもかかわらず、培養ヒト筋肉細胞におけるCD34の発現の欠如のために、さらにこの特定のプロトコルでのACを分離することは不可能である。
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Acknowledgments
著者らは、フローサイトメトリーとの彼女の優れた技術支援のためのアリソンロガールに感謝したい。この作品は、カザフスタン共和国（AS）の国防総省（JH）、ヘンリー·J·マンキン寄附（JH）、および文部科学省科学からの助成金によってサポートされていました。 CWCは、米国心臓協会の博士号を取得する前のフェローシップ（11PRE7490001）によって部分的にサポートされていました。 M.Corselliは再生医療の訓練助成金のためのカリフォルニア工科大学（TG2-01169）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACS Aria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 complete medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
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