Summary
Los vasos sanguíneos dentro del puerto músculo esquelético varias poblaciones precursoras de múltiples linajes humanos que son ideales para aplicaciones regenerativas. Este método de aislamiento permite la purificación simultánea de tres poblaciones de células precursoras multipotentes, respectivamente, de tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: las células endoteliales de miogénicos íntima, pericitos de los medios de comunicación y células adventicias de la adventicia.
Abstract
Desde el descubrimiento de las células madre / estromales mesenquimales (MSC), la identidad nativa y la localización de las MSCs han sido oscurecida por su aislamiento retrospectiva en cultivo. Recientemente, utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), nosotros y otros investigadores identificaron prospectivamente y purificado tres subpoblaciones de células precursoras multipotentes asociados con la vasculatura del músculo esquelético humano. Estas tres poblaciones de células: células endoteliales miogénicos (MEC), pericitos (PC), y células adventicias (ACS), se localizan, respectivamente, a las tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: íntima, media y adventicia. Todas estas células madre derivadas de la sangre-vaso humano (hBVSC) poblaciones no sólo expresan marcadores MSC clásicos pero también poseen potencialidades del desarrollo mesodérmico similares a las MSC típicos. Anteriormente, MEC, PC y CCAA se han aislado a través de protocolos distintos y posteriormente caracterizado en estudios separados. El prot actual aislamientoOcol, a través de modificaciones en el proceso de aislamiento y ajustes en los marcadores de superficie celular selectiva, nos permite purificar simultáneamente las tres subpoblaciones hBVSC por FACS de una biopsia de músculo humano individual. Este nuevo método no sólo agilizará el aislamiento de varias subpoblaciones BVSC sino también facilitar futuras aplicaciones clínicas de hBVSCs con fines terapéuticos distintos.
Introduction
Músculo esquelético humano se ha considerado una fuente clínicamente atractiva de células madre / progenitoras. El músculo esquelético no sólo contiene comprometido progenitores miogénicas, mioblastos esqueléticos, sino también las células madre primitivas miogénicas, incluyendo células satélite y células madre derivadas de músculo (MDSC) 1. El uso de células humanas derivadas de músculo madre / progenitoras, autólogo o alogénico, en medicina regenerativa se ha investigado extensamente en modelos animales preclínicos y ensayos clínicos. Las aplicaciones de regeneración de músculo células madre / progenitoras van desde la regeneración del músculo distrófico en distrofia muscular de Duchenne (DMD) para reparar el corazón dañado en pacientes con ataque al corazón.
Desde el descubrimiento de las células mesenquimales / madre del estroma (MSC) y otras poblaciones de células precursoras multipotentes, incluyendo células óseas derivadas de médula progenitoras adultas multipotentes (MAPC) y células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC), madre adultas /células progenitoras han sido ampliamente investigado hasta la fecha 1-9. No obstante, su identidad y localización nativa in situ han sido oscurecida por los métodos de aislamiento retrospectivos. Recientemente, el uso de células activadas por fluorescencia (FACS), nosotros y otros grupos han identificado de forma prospectiva y tres poblaciones de células precursoras multipotentes purificados de los vasos sanguíneos dentro del músculo esquelético humano y otros órganos: células endoteliales miogénicos (MEC), los pericitos (PCs), y células adventicias (CCAA) 10. Estas tres subpoblaciones de células madre humanas de los vasos sanguíneos derivados (hBVSCs) se pueden encontrar respectivamente en las tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: túnica íntima, túnica media y adventicia. Más específicamente, MEC y PCs se detectan en los microvasos y capilares, mientras que ACS se localizan en la capa adventicia de las arterias y venas más grandes. Cada subconjunto de células precursoras expresa una combinación única de antígenos de superficie celular: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), y ACS (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).
Además de la caracterización de estos subconjuntos hBVSC reveló que las tres poblaciones de células precursoras mesodérmicas poseen potenciales de desarrollo similares a las MSC típicas, incluyendo la miogénesis esquelético, osteogénesis, condrogénesis, y la adipogénesis. Todos los subgrupos hBVSC también exhiben marcadores MSC clásicos, como CD44, CD73, CD90, CD105 y, recientemente y en la cultura. En conjunto, estas piezas de evidencia apoyan el origen vascular de las CMM. Por otra parte, las capacidades terapéuticas de MEC, PC y CCAA recientemente se han demostrado en estudios separados. MEC ordenados a partir de biopsias musculares humanos adultos, se mostró a regenerar los músculos lesionados y distróficas esqueléticos y reparación heridos miocardio más eficiente que los mioblastos esqueléticos y endo vascularcélulas telial (ECS). PC purificada a partir de diferentes órganos humanos también se han demostrado para reparar / regenerar los músculos esqueléticos lesionados y distróficas y contribuir a la piscina de células satélite 13-16. Muy recientemente, hemos demostrado que los PC derivadas de músculo esquelético humano reparar eficazmente el miocardio infartado a través del efecto paracrino indirecta y las interacciones celulares directos 17. CCAA, por otro lado, han sido ya sea directamente aisladas de vasos sanguíneos explantados o purificados por FACS a partir de tejido adiposo humano y músculo esquelético. Un efecto pro-angiogénico notable de las CCAA se demostró en un miembro trasero modelo de isquemia del ratón 19. Además, ACS también se ha demostrado que la reparación del miocardio infartado más eficientemente que las MSC convencionales, lo que indica el potencial terapéutico robusta de SCA en la reparación de tejido isquémico 20.
Las actuales subvenciones del protocolo de purificación simultánea, purificación prospectivo de MEC, PCs, yCCAA de la vasculatura de una biopsia de músculo esquelético humano individual. Esto nos permite estudiar y / o elegimos la subpoblación hBVSC óptimo para fines terapéuticos distintos. Además, esta nueva técnica se expande aún más el repertorio de células madre / progenitoras que se pueden derivar a partir de músculo esquelético humano, por lo que es una fuente ideal de células precursoras multipotentes para la medicina regenerativa.
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Protocol
1. Muscle Procesamiento Biopsia
- Preservar biopsia de músculo esquelético humano en hielo en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) durante el transporte.
- Después de la recepción de la biopsia muscular, retirar la muestra del contenedor de transporte y lavar dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con solución de antibiótico antifúngico 2% (A / A) en condiciones estériles.
- Retire el adiposo adjunta y el tejido conectivo con tijeras y pinzas estériles en DMEM suplementado con 2% A / A.
- Eliminar grandes vasos sanguíneos bajo el microscopio de disección y posteriormente cortar el espécimen musculares en trozos pequeños (<1 cm 2 de tamaño).
- Preservar piezas musculares cortadas (<5 gramos) en 20 ml de medio de conservación (PM; DMEM suplementado con 10% de SFB y el 1% P / S) a 4 ℃ hasta por 5 días.
2. Muscle Dissociationes y aislamiento de células
- En el día del aislamiento de células, eliminar piezas musculares de PM y lavar dos veces en PBS suplementado con 2% P / S. Para hacer que la solución de digestión, añadir de tipo I, de tipo II, y colagenasas de tipo IV (100 mg / ml) recién en PM.
- Picar y picar mecánicamente piezas musculares con tijeras y pinzas estériles en una placa de Petri con una pequeña cantidad de PM hasta que la solución pasa 10 ml pipeta serológica sin coagulación. Quitar el tejido adiposo y el tejido conectivo residual durante este proceso. Utilice por lo menos 8 a 10 gramos de músculo adulto o 2 gramos de músculo fetal para cada celda de aislamiento.
- Transferencia de 4-5 gramos de músculo adulto picada a 20 ml (o 2 gramos de músculo fetal picado en 10 ml) Ofthe solución de digestión con una pipeta serológica de 10 ml. Digerir durante 50 - 60 minutos a 37 ℃ en un agitador orbital a 70-80 rpm. Optimizar el rendimiento de células y preservación antígeno de superficie mediante el ajuste del tiempo de digestión y / o la velocidad de agitación en consecuencia sobre la base de la cantidadde tejido. Observe el estado de la digestión cada 15-20 minutos hasta que la turbidez casi borra.
- Vigorosamente pipetear el tejido digerido 3-5 veces con 10 ml pipeta serológica. Añadir la misma cantidad de PM para detener la reacción y luego centrifugar a 400 xg durante 4 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante; resuspender el precipitado con 10 ml PM para lavar, y después se filtró a través de un filtro de células de 100 micras.
- Se centrifuga a 400 g durante 4 min y retirar con cuidado el sobrenadante. Pellets de resuspender en tampón de lisis de eritrocitos (155 mM NH 4 Cl, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mm), se filtra a través de un filtro de 70 micras de células para obtener una suspensión de células individuales y, a continuación incubar durante 10 min a TA. Filtrar con un filtro de células de 70 m de nuevo si no se observa ninguna precipitación.
- Centrifugar a 400 xg durante 4 min y resuspender el sedimento celular en 0,5 ml de PBS. Contar el número de células. Obtener un total de al menos 5 millones de células para la clasificación de células. Diluir la singlsuspensión e célula a menos de 5 millones de células por ml con PBS para la tinción. Sacar 50-100 l de la suspensión celular y se dividió en 11 tubos para tinciones de control (control sin teñir, controles negativos, y de un solo color de los controles positivos).
3. Etiquetado celular y clasificación
- Incubar la suspensión de células individuales durante 10 min a 4 ℃ en suero de ratón (diluido 1:10 en PBS) para bloquear propósito si es necesario.
- Añadir CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, y CD146-FITC (todos 1: 100) en la suspensión de células individuales y se incuba durante 20 min a 4 ℃. Para el control negativo, añadir concentraciones equivalentes de APC-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE, y anticuerpos IgG de isotipo conjugados con FITC y se incuba durante 20 min a 4 ℃. Para los controles positivos de un solo color, añadir concentraciones equivalentes de CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, y CD146-FITC individualmente en cada tubo y se incuba durante 20 min a 4 ℃.
- Después de la incubación, Se centrifuga a 400 g durante 4 min para lavar. Resuspender el sedimento celular en 1 - 2 ml de DMEM suplementado con 5% de FBS y 1% P / S. La concentración final de la suspensión de células debe ser inferior a 5 millones de células por ml. Añadir 7-AAD (1: 100) y se incuba durante 15 min a TA para la exclusión de células muertas. Para el control negativo y control positivo de un solo color, sedimentos de células se resuspende en 0,5 ml de DMEM suplementado con 5% de FBS y 1% P / S.
- Transferir todas las suspensiones celulares para flujo de poliestireno de fondo redondo de citometría de tubos. Preparar los tubos de recogida de células (cada tubo está precargada con 500 l de medio de cultivo apropiado: MPM para MEC; EGM-2 para PC; medio de CA para las CCAA). Suspensiones celulares de transporte en hielo al clasificador de células.
- Las suspensiones de células se ejecutan en el clasificador de células en el orden del control sin teñir, controles negativos, controles positivos de un solo color, y la suspensión celular principal mientras se ajusta la intensidad del láser, la compensación de canal, y la población de células gating estrictamente para maximizar celular pureza (por favor refiérase a los artículos publicados por Jove y otras revistas para los detalles de la citometría de flujo).
- Recoge las poblaciones de células deseadas en los tubos de recogida apropiados. Tienda células recogidas en 4 ℃ si no se siembra inmediatamente.
4. post-clasificación de cultivos celulares
- Semilla MEC recién ordenados (P0) a <10.000 células / cm 2 en MPM en placas pre-recubiertas con colágeno tipo I. Para la posterior pases del MEC para siembra 3500 - 4000 células / cm 2 en MPM en placas / frascos pre-recubiertas con colágeno tipo I.
- Semillas PCs recién ordenados (P0) a <20.000 células / cm 2 en EGM-2 en placas recién recubiertas con gelatina al 0,2%. Para la posterior pases de PCs, las células dividir en proporción 1: 3 en un medio de PC (DMEM suplementado con 20% de SFB y el 1% P / S) en placas de cultivo de poliestireno regulares hasta P2. De P3 en adelante, las células de semillas en 6500 - 7000 células / cm 2 en medio de PC en cultivo de poliestireno placas / frascos regulares.
- Semillas de ACS recién ordenados (P0) a <20.000 células / cm 2 en medio de CA (DMEM suplementado con 20% de SFB y el 1% P / S) en placas de cultivo de poliestireno regulares. Para la posterior pases de CCAA, células de semillas en 6500 - 7000 células / cm 2 en medio de CA en cultivo de poliestireno placas / frascos regulares.
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Representative Results
Parámetros de FACS se corrigieron primero basado en los datos obtenidos desde el control sin teñir, controles negativos, controles positivos y de un solo color. Después de la exclusión de células muertas, marcado con fluorescencia suspensión de células se somete a una serie de selecciones negativas y positivas marcador de superficie celular. Primero, las células CD45 + son una verja antes de CD56 + y CD56 - células se separan de la CD45 - fracción. El CD56 + fracción se somete adicionalmente a la selección de CD34-CD144 donde sólo CD34 + / CD144 + células (de doble positivas) se marcan como MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -) y posteriormente recogido (Figura 1). Del mismo modo, el CD56 - fracción se somete adicionalmente a la selección de CD34-CD146 donde sólo CD34 - / CD146 + células son marcados como PCs (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) y posteriormente recogido (
Recién células clasificadas pueden ser sembradas en condiciones de cultivo especificadas en el protocolo para una mayor expansión o utilizarse inmediatamente para los experimentos in vivo. La expansión clonal de subconjuntos hBVSC se puede lograr por el sistema autoclone FACS Aria o limitar método de dilución 13, 21. A diferencia de los típicos MSCs heterogéneos, cultivos de subconjuntos hBVSC permanecen homogéneos incluso después de la expansión a largo plazo. Morfología Representante de subconjuntos hBVSC cultivadas, purificada a partir de biopsias musculares de unsolo donante, se muestra en la Figura 2. Las comparaciones entre MSCs típicos y subconjuntos hBVSC purificados se resumen en la Tabla 1.
Figura 1. clasificación Representante de los tres subgrupos de células madre derivadas de la sangre de los vasos humanos (hBVSCs) de una biopsia de músculo esquelético humano individual. Pureza de cada población celular ordenada se ve confirmado por el análisis post-clase. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2 Los tres subpoblaciones hBVSC, ordenados a la homogeneidad, exhiben morfología distinta en culture (izquierda a derecha): miogénica de células endoteliales (MEC), pericitos (PC), y las células de la adventicia (AC) (en el paso 4, barras de escala = 100 mm). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| MSC | MEC | PCs | CCAA | |
| Pureza | Heterogénea | Homogénea | Homogénea | Homogénea |
| Perfil de antígeno de superficie de la célula para la purificación | N / A | CD34 + CD45 + CD56 + CD144 | CD31- CD34 + CD45 CD146- | |
| La expresión del marcador MSC en cultivo | CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + |
| Multipotencialidad | Miogénesis (+) Adipogénesis (+) La osteogénesis (+) Condrogénesis (+) | Miogénesis (+) Adipogénesis (+) La osteogénesis (+) Condrogénesis (+) | Miogénesis (+) Adipogénesis (+) La osteogénesis (+) Condrogénesis (+) | Miogénesis (N / A) Adipogénesis (+) La osteogénesis (+) Condrogénesis (+) |
| Las aplicaciones potenciales | Locomotor reparación / regeneración: hueso, cartílago, tendón, ligamento y músculo esquelético; Reparación cardíaca; Reparación vascular; La cicatrización de heridas; Inmunorregulación | Reparación cardíaca; La reparación del músculo esquelético / regeneración; Hueso / reparación del cartílago / regeneración | Reparación cardíaca; Vascular reparación / regeneración; La reparación del músculo esquelético / regeneración; Regeneración ósea | Reparación cardíaca; Vascular reparación / regeneración; Regeneración ósea |
| Localización anatómica in situ | N / A | Intima vasos sanguíneos | Los vasos sanguíneos de Medios | Adventicia de los vasos sanguíneos |
Tabla 1: Comparación de las MSC típicos y subpoblaciones hBVSC multipotentes.
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Discussion
Identificación y purificación de subpoblaciones hBVSC representan un avance importante en la comprensión de la ontogenia MSC. Cada vez hay más pruebas que indican el origen perivascular de MSC y la asociación entre las células precursoras específicas de tejido y los vasos sanguíneos 22-25. Además, la capacidad para aislar subpoblaciones homogéneas de hBVSCs SIDA aún más la comprensión de MSC heterogeneidad y la biología celular vascular 26.
En los últimos años, MEC, PC y CCAA se han identificado y aislado por medio de protocolos distintos en estudios separados individualmente. Sin embargo, no se ha intentado para purificar los tres subconjuntos hBVSC simultáneamente a partir de músculo esquelético humano debido a las dificultades para optimizar el procedimiento de disociación de tejidos y la combinación de marcadores de linaje celular selectiva identificar MECs, PC y ACs por completo. Aquí se describe un nuevo protocolo de aislamiento de células que permite purif concurrenteicación de MEC, PC y CCAA de una biopsia de músculo humano solo modificando el proceso de disociación del tejido y la aplicación de una nueva combinación de marcadores de superficie celular selectivos (Figura 1). Para el mejor resultado, los pasos críticos en el actual protocolo que requieren atención adicional incluyen: 1. Frescura y conservación de la muestra de tejido; 2. Optimización del rendimiento celular y preservación antígeno de superficie mediante un control estricto del proceso de la digestión y el ajuste del tiempo de disociación de tejidos; 3. calibración precisa del seis colores citometría de flujo. Estos parámetros deben ser determinados por el laboratorio individual según su configuración específica de suministro / equipo.
Mediante la implementación de este nuevo protocolo, uno no sólo puede agilizar el aislamiento sincrónica de múltiples subpoblaciones hBVSC sino también facilitar la utilización de hBVSCs para la investigación básica y la aplicación de la traducción, tales como la comparación de los comportamientos celulares diferenciales entre HBVsSubconjuntos C y la optimización de subconjunto hBVSC simple o combinatoria (s) para diversas aplicaciones terapéuticas personalizada. Sin embargo, el aislamiento simultáneo de los tres subconjuntos hBVSC se limita actualmente al músculo esquelético debido al hecho de que MECs no se han identificado en otros tejidos humanos. Además, es más allá de la limitación del protocolo actual para distinguir la transición y / o jerarquía celular entre estos tres subpoblaciones hBVSC.
Caracterización de recién aisladas y cultivadas MEC, PC y CCAA se ha demostrado por separado en estudios anteriores MEC en la cultura mantienen la expresión del CD56 marcador miogénica pero poco a poco pierden la expresión de los marcadores CD34 y CD144 CE. En el nivel clonal, MECs expresan marcadores MSC, incluyendo CD29, CD44, CD90, y CD105, y muestran potenciales de diferenciación mesenquimales tales como la condrogénesis, la osteogénesis, adipogénesis, y la miogénesis. Además, MECs clonales conservan su angiogencapacidad ic después del cultivo a largo plazo, formación de redes similares a capilares en cultivo Matrigel y participar en la neovascularización in vivo 21.
PCs, frescas o cultivadas, se ha demostrado que no sólo expresar marcadores MSC, incluyendo CD44, CD73, CD90, y CD105, pero también exhiben capacidades de desarrollo mesodérmicas, por ejemplo, la miogénesis esquelético, osteogénesis, condrogénesis, y la adipogénesis 13. PCs robustamente segregan una serie de factores tróficos, incluso en condiciones de hipoxia, y sirven como las unidades de regeneración a través de su función paracrina, la diferenciación directa, y la interacción celular durante la / proceso de regeneración reparación de tejidos CCAA, similar a PCs, llevaron a expresar marcadores clásicos MSC y diferenciarse en linajes de células mesenquimales principales 18. Junto con las PC, las CCAA también se han propuesto como uno de los orígenes del desarrollo de las CMM. Un resumen de la comparación de la expresión de los marcadores de superficie celular, la capacidad de diferenciación, y paplicaciones traslacionales osibles entre MSC típicos y hBVSCs ha sido incluido en la Tabla 1. Recientemente, las células Tang et al. identificaron multipotentes vasculares del tallo (MVSCs) de la túnica media de los vasos sanguíneos grandes en ratas y humanos 29. MVSCs no sólo se diferencian en células de músculo liso sino que también contribuyen a la remodelación vascular y la hiperplasia neointimal después de una lesión vascular 29. Ya sea MVSCs comparten conexiones desarrollo con BVSCs reside en los vasos microvasculatura y pequeñas requiere mayor investigación.
El protocolo actual requiere el aislamiento de células oportuna de biopsia muscular humana fresca, lo que, a veces, puede no ser accesible en los entornos clínicos. Alternativamente, basado en un conjunto modificado de marcadores de superficie celular selectiva, es factible para purificar MECs y PCs de cultivos de células musculares esqueléticas criopreservados humanos primarios por citometría de flujo 30. Este método permite prospectivo purificación de dos subconjuntos hBVSC a partir del cultivo de músculo esquelético humano depositado con fines terapéuticos. Sin embargo, debido a la falta de expresión de CD34 en las células musculares humanas cultivadas, no es posible separar más SCA con este protocolo particular.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Alison Logar por su excelente asistencia técnica con la citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Departamento de Defensa (JH), la Cátedra J. Mankin Henry (JH), y el Ministerio de Educación y Ciencia de la República de Kazajstán (AS). CWC fue financiada en parte por la beca predoctoral Asociación Americana del Corazón (11PRE7490001). M.Corselli fue apoyado por el Instituto de California para la beca de formación de Medicina Regenerativa (TG2-01169).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACS Aria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 complete medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
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