Summary
Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.
Abstract
Seit der Entdeckung von mesenchymalen Stammzellen / Stromazellen (MSCs), haben die einheimische Identität und Lokalisation von MSCs durch ihre Retrospektive Isolation in Kultur verdeckt worden. Kürzlich wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), haben wir und andere Forscher prospektiv identifiziert und gereinigt drei Subpopulationen von multipotenten Vorläuferzellen mit dem Gefäßsystem des menschlichen Skelettmuskel verbunden. Diese drei Zellpopulationen: Intima, Media und Adventitia: myogenen Endothelzellen (MEC), Perizyten (PCs) und Adventitia-Zellen (ACS), sind jeweils mit den drei Strukturschichten von Blutgefäßen lokalisiert. Alle diese menschliche Blutgefäßstammzellen (hBVSC) Populationen nicht nur klassische MSC Marker auszudrücken, sondern auch Entwicklungspotenziale mesodermalen ähnlich typischen MSCs besitzen. Bisher haben MEC, PCs und ACs durch verschiedene Protokolle isoliert und anschließend in separaten Studien aus. Die aktuelle Isolations ProtOcol, durch Änderungen an der Isolierungsverfahren und Anpassungen in den selektiven Zelloberflächenmarker, ermöglicht es uns, gleichzeitig reinigen alle drei Subpopulationen hBVSC durch FACS aus einer menschlichen Muskelbiopsie. Dieses neue Verfahren wird nicht nur rationalisieren die Isolierung von mehreren BVSC Subpopulationen sondern erleichtern auch die zukünftige klinische Anwendungen der hBVSCs für verschiedene therapeutische Zwecke.
Introduction
Menschlichen Skelettmuskel wurde als klinisch attraktive Quelle für Stammzellen / Vorläuferzellen. Skelettmuskulatur enthält nicht nur verpflichtet myogenen Vorläuferzellen, Skelett-Myoblasten, aber auch primitive myogenen Stammzellen, einschließlich Satellitenzellen und Muskelstammzellen (MDSCs) 1. Die Verwendung von menschlichen Muskel-abgeleitete Stammzellen / Vorläuferzellen, autologen oder allogenen, in der regenerativen Medizin ist weitgehend in präklinischen Tiermodellen und klinischen Studien untersucht. Die regenerative Anwendungen von Muskelstammzellen / Vorläuferzellen reichen von Regeneration des dystrophischen Muskel in Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) Patienten auf die Reparatur des verletzten Herzens bei Patienten mit Herzinfarkt.
Seit der Entdeckung von mesenchymalen Stammzellen / Stromazellen (MSCs) und anderen multiVorläuferZellPopulationen, einschließlich Knochenmark stammenden multipotente adulte Vorläuferzellen (MAPCs) und Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), adulte Stammzellen /Vorläuferzellen sind umfassend auf den neuesten Stand 1-9 untersucht. Dennoch haben ihre Mutter Identität und Lokalisation in situ durch die Retrospektive Isolationsverfahren verdunkelt. Kürzlich wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), haben wir und andere Gruppen haben prospektiv identifiziert und gereinigt drei multiVorläuferZellPopulationen aus den Blutgefäßen im menschlichen Skelettmuskel und verschiedene andere Organe: myogenen Endothelzellen (MEC), Perizyten (PCs), und Adventitia-Zellen (ACS) 10. Intima, Tunica media und Adventitia: Diese drei Subpopulationen von menschlichen Blutgefäßstammzellen (hBVSCs) jeweils in den drei Strukturschichten der Blutgefäße gefunden werden. Genauer gesagt, MEC und PCs sind in Mikrogefäßen und Kapillaren nachgewiesen während ACS sind in der Adventitia Schicht von größeren Arterien und Venen lokalisiert. Jeder Vorläuferzellenteilsatz drückt eine einzigartige Kombination von Zelloberflächenantigenen: MEC (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), und ACS (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).
Weitere Charakterisierung dieser hBVSC Untergruppen zeigte, dass alle drei Vorläuferzellpopulationen besitzen mesodermalen Entwicklungspotentiale ähnlich typischen MSCs, einschließlich Skelett myogenesis, Osteogenesis, Chondrogenese und Adipogenese. Alle hBVSC Teilmengen weisen auch klassische MSC Marker, einschließlich CD44, CD73, CD90, CD105 und frisch und in der Kultur. Gemeinsam diese Beweisstücke unterstützte die vaskulären Ursprungs von MSCs. Darüber hinaus haben die therapeutischen Kapazitäten von MEC, PCs, und ACS kürzlich in verschiedenen Studien nachgewiesen. MEC aus erwachsenen menschlichen Muskelbiopsien sortiert wurden gezeigt, um verletzte und dystrophischen Skelettmuskeln und Reparatur verletzt Myokard effizienter als Skelettmyoblasten und Gefäß endo regenerierenthelial Zellen (ECs). Gereinigten PCs aus verschiedenen menschlichen Organen haben auch gezeigt, um zu reparieren / regenerieren verletzten und dystrophischen Skelettmuskulatur und zur Satelliten-Zellpool 13-16. Erst vor kurzem haben wir gezeigt, dass PCs aus menschlichen Skelettmuskel abgeleitet das Myokard durch indirekte und direkte parakrine Wirkung zellulären Interaktionen 17 effektiv zu reparieren. ACs, auf der anderen Seite, entweder direkt aus explantierten Blutgefäße oder durch FACS isoliert aus humanem Fettgewebe und Skelettmuskel gereinigt. Eine bemerkenswerte pro-angiogene Wirkung von ACS wurde in einem Maus-Hinter Extremitäten-Ischämie-Modell 19 demonstriert. Weiterhin haben ACs auch gezeigt, Myokard effizienter als herkömmliche MSCs reparieren, was die stabile therapeutische Potenzial von ACS in ischämischen Gewebereparatur 20.
Die aktuellen Reinigungsprotokoll Zuschüsse gleichzeitige, Interessenten Reinigung von MEC, PCs undACs aus dem Gefäßsystem eines einzelnen menschlichen Skelettmuskelbiopsie. Dies ermöglicht es uns, zu studieren und / oder wählen Sie die optimale hBVSC Subpopulation für verschiedene therapeutische Zwecke. Darüber hinaus bietet diese neue Technik erweitert das Repertoire von Stammzellen / Vorläuferzellen, die aus menschlichem Skelettmuskel abgeleitet werden kann, so dass es eine ideale Quelle für multipotente Vorläuferzellen für die regenerative Medizin.
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Protocol
1. Muskelbiopsie Verarbeitung
- Erhaltung menschlichen Skelettmuskelbiopsie auf Eis in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt und 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) während des Transports.
- Nach dem Erhalt der Muskelbiopsie, entfernen Sie die Probe aus dem Transportbehälter und waschen Sie es zweimal in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2% Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung (A / A) unter sterilen Bedingungen zu ergänzen.
- Entfernen Sie den beigefügten Fettgewebe und Bindegewebe mit steriler Schere und Pinzette in DMEM mit 2% A / A ergänzt.
- Entfernen Sie den großen Blutgefäße unter Dissektionsmikroskop und anschließend schneiden die Muskelprobe in kleine Stücke (<1 cm 2 groß).
- Wahren Schnittmuskelstücke (<5 g) in 20 ml Erhaltungsmedium (PM, DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% P / S) bei 4 ℃ für bis zu 5 Tage.
2. Muskel DissociatIonen-und Zellisolation
- Am Tag der Zellisolation entfernen Muskelstücke aus PM und wasche zweimal in PBS, ergänzt mit 2% P / S. Um die Aufschlusslösung zu machen, fügen Typ-I, Typ-II-und Typ-IV Kollagenasen (100 mg / ml) frisch in Uhr.
- Fein hacken und Muskelstücke mit steriler Schere und Pinzette mechanisch Hackfleisch in einer Petrischale mit einer kleinen Menge von PM, bis die Lösung durchläuft 10 ml serologische Pipette ohne Blutgerinnung. Entfernen der Rest Fettgewebe und Bindegewebe während dieses Prozesses. Verwenden Sie mindestens 8-10 Gramm erwachsenen Muskel-oder 2 Gramm fetalen Muskel für jede Zelle Isolation.
- Übertragen 4-5 Gramm Hackfleisch erwachsenen Muskel zu 20 ml (oder 2 Gramm Hackfleisch fötalen Muskel in 10 ml) OFTHE Aufschlusslösung mit 10 ml serologische Pipette. Verdauen für 50-60 min bei 37 ℃ auf einem Orbitalschüttler bei 70 bis 80 Umdrehungen pro Minute. Optimierung der Zellausbeute und Oberflächenantigen Konservierung durch Einstellen der Kochzeit und / oder Bewegungsgeschwindigkeit entsprechend der Menge basierendGewebe. Beachten Sie die Verdauung Status alle 15-20 min, bis die Trübung fast löscht.
- Kräftig pipettieren Die verdaute Gewebe 3-5 mal mit einer 10 ml serologische Pipette. Hinzufügen gleiche Menge PM um die Reaktion abzubrechen, und dann bei 400 × g zentrifugieren für 4 min.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand; das Pellet mit 10 ml PM zu waschen, und dann durch ein 100 um Sieb filtriert Zelle.
- Zentrifuge bei 400 g für 4 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Resuspendieren Pellets in Erythrozyten Lysepuffer (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mm EDTA), filtriert durch ein 70 um Sieb Zelle um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und dann für 10 min bei RT inkubiert. Filtriert durch ein 70-m Zelle Sieb wieder, wenn eine Fällung beobachtet.
- Zentrifuge bei 400 × g für 4 min und Resuspendieren des Zellpellets in 0,5 ml PBS. Die Anzahl der Zellen. Abrufen einer Gesamtmenge von mindestens 5 Millionen Zellen für die Zellsortierung. Verdünnen Sie die einze Zellsuspension auf weniger als 5 Millionen Zellen pro ml mit PBS-Färbung. Nehmen Sie 50-100 ul der Zellsuspension und aufgeteilt in 11 Rohre für Steuer Färbungen (ungefärbten Kontrolle, Negativkontrollen und einfarbige positive Kontrollen).
3. Zellmarkierung und Sortieren
- Inkubieren der Einzelzellsuspension für 10 min bei 4 ℃ in Mausserum (verdünnt 1:10 in PBS) zur Blockierung Zweck, falls erforderlich.
- Fügen CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, und CD146-FITC (alle 1: 100) in den Einzelzellsuspension und Inkubation für 20 min bei 4 ℃. Für negative Kontrolle, fügen äquivalenten Konzentrationen von APC-APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE-und FITC-konjugierten Isotyp IgG-Antikörper und Inkubation für 20 min bei 4 ℃. Für einfarbige positive Kontrollen, fügen äquivalenten Konzentrationen von CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, und CD146-FITC individuell in jedes Röhrchen und Inkubation für 20 min bei 4 ℃.
- Nach Inkubation, Zentrifuge bei 400 g für 4 min zu waschen. Zellpellet in werden 1 - 2 ml DMEM mit 5% FBS und 1% P / S ergänzt. Die Endkonzentration der Zellsuspension sollte weniger als 5 Millionen Zellen pro ml sein. Hinzufügen 7-AAD (1: 100) und die Proben für 15 min bei RT tote Zelle Ausgrenzung. Für Negativkontrolle und Single-Farbpositivkontrollen, resuspendieren Zellpellets in 0,5 ml DMEM mit 5% FBS und 1% P / S ergänzt.
- Übertragen Sie alle Zellsuspensionen auf Polystyrol-Rundröhrchen für die Durchflusszytometrie. Bereiten Zellröhrchen (jedes Rohr ist vorgefüllt mit 500 ul der geeigneten Kulturmedium: MPM für MEC; EGM-2 für PC, AC-Medium für ACS). Transportzellsuspensionen auf Eis auf die Zellsortierer.
- Führen Zellsuspensionen auf der Zellsortierer in der Reihenfolge der ungefärbten Kontrolle, Negativkontrollen, einfarbig Positivkontrollen, und der Hauptzellsuspension während der Anpassung der Laserintensität, Kanalkompensation und Zellpopulation Gating stringent zu Zelle p maximierenurity (siehe Artikel beim Zeus und andere Fachzeitschriften für Details der Durchflusszytometrie veröffentlicht wurde).
- Sammeln gewünschten Zellpopulationen in den entsprechenden Sammelröhrchen. Shop gesammelten Zellen bei 4 ℃, wenn nicht sofort der Aussaat.
4. Post-Sortierzellkultur
- Saatgut frisch sortiert MEC (P0) auf <10.000 Zellen / cm 2 in MPM auf Platten mit vorge beschichtet Typ-I-Kollagen. Für die anschließende Passage von MEC, Saatgut 3500 - 4000 Zellen / cm 2 in MPM auf Platten / Flaschen mit Pre-beschichtet Typ-I-Kollagen.
- Saatgut neu geordnet PCs (P0) in <20.000 Zellen / cm 2 in EGM-2 auf Platten mit frisch 0,2% Gelatine beschichtet. 3-Verhältnis im PC-Medium (DMEM mit 20% FBS und 1% P / S ergänzt) auf regelmäßige Polystyrol-Kulturplatten bis P2: Für die anschließende Passage von PCs, bei 1 aufgeteilt Zellen. Von P3 Weiter, Samenzellen bei 6.500 - 7.000 Zellen / cm 2 in PC Medium auf regelmäßige Polystyrol-Kulturplatten / Kolben.
- Saatgut neu geordnet ACs (P0) in <20.000 Zellen / cm 2 in AC-Medium (DMEM mit 20% FBS und 1% P / S ergänzt) auf regelmäßige Polystyrol-Kulturplatten. Für die anschließende Passage von ACS, Samenzellen bei 6.500 - 7.000 Zellen / cm 2 in AC-Medium auf regelmäßige Polystyrol-Kulturplatten / Kolben.
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Representative Results
FACS-Parameter werden zunächst auf der Grundlage der von den nicht markierten Kontrolle, Negativkontrollen und Single-Farbpositivkontrollen gewonnenen Daten korrigiert. Nach Ausschluß von toten Zellen wird die Fluoreszenz-markierte Zellsuspension auf eine Reihe von negativen und positiven Zelloberflächenmarker Auswahl unterworfen. Zuerst werden die CD45 +-Zellen vor CD56 + und CD56 gated - Zellen aus CD45 getrennt - Fraktion. Die CD56 +-Fraktion wird weiter auf CD34-CD144-Selektion unterzogen, wo nur CD34 + / CD144 + (Dual-positive Zellen) als MEC markiert (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), und anschließend gesammelt (Abbildung 1). Auch die CD56 - Fraktion wird weiter auf CD34-CD146-Selektion unterzogen, wo nur CD34 - / CD146 + Zellen werden als PCs mit (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) und anschließend gesammelt (
Frisch sortierten Zellen können in in dem Protokoll für die weitere Expansion angegebenen Kulturbedingungen ausgesät oder unmittelbar für die in vivo-Experimente verwendet werden. Klonale Expansion hBVSC Teilmengen durch die FACS Arie Autoclone-System oder Grenzverdünnungsverfahren 13, 21 erreicht werden. Im Gegensatz zu den typischen heterogenen MSCs, Kulturen von Teilmengen hBVSC homogen bleiben auch nach langfristigen Ausbau. Vertreter Morphologie der kultivierten hBVSC Teilmengen, von Muskelbiopsien eines gereinigtenEinzelspender, ist in Abbildung 2 dargestellt. sind Vergleiche zwischen typischen MSCs und gereinigt hBVSC Teilmengen in Tabelle 1 zusammengefasst.
Abbildung 1. Sortierung der drei Teilmengen von menschlichen Blutgefäßstammzellen (hBVSCs) von einem einzigen menschlichen Skelettmuskelbiopsie. Reinheit jedes sortiert Zellpopulation wird durch Post-Art-Analyse bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine Ansicht Größere Version der Figur.
Abbildung 2. Die drei hBVSC Subpopulationen, sortiert, um die Homogenität, zeigten deutliche Morphologie in cultur (von links nach rechts): myogenen Endothelzellen (MEC), Perizyten (PC) und Adventitia Zelle (AC) (bei Passage 4, Maßstabsbalken = 100 mm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| MSCs | MEC | PCs | ACs | |
| Reinheit | Heterogen | Homogene | Homogene | Homogene |
| Zelloberflächenantigen Profils zur Reinigung | N / A | CD34 + CD56 + CD144 CD45- + | CD31 + CD34 CD45- CD146- | |
| MSC-Marker-Expression in Kultur | CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + |
| Multipotenz | Myogenese (+) Adipogenese (+) Osteogenesis (+) Chondrogenese (+) | Myogenese (+) Adipogenese (+) Osteogenesis (+) Chondrogenese (+) | Myogenese (+) Adipogenese (+) Osteogenesis (+) Chondrogenese (+) | Myogenese (N / A) Adipogenese (+) Osteogenesis (+) Chondrogenese (+) |
| Mögliche Anwendungen | Skeletomuscular Reparatur / Regenerierung: Knochen, Knorpel, Sehnen, Bänder und Skelettmuskulatur; Herzreparatur; Gefäßreparatur; Wundheilung; Immunregulation | Herzreparatur; Skelettmuskelreparatur / Regeneration; Knochen / Knorpel Reparatur / Regenerierung | Herzreparatur; Gefäßreparatur / Regeneration; Skelettmuskelreparatur / Regeneration; Knochenregeneration | Herzreparatur; Gefäßreparatur / Regeneration; Knochenregeneration |
| Anatomischen Lokalisation in situ | N / A | Blutgefäß Intima | Blutgefäß Medien | Blutgefäß Adventitia |
Tabelle 1. Vergleich von typischen MSCs und multi hBVSC Subpopulationen.
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Discussion
Identifizierung und Reinigung von hBVSC Subpopulationen stellen einen wesentlichen Fortschritt in das Verständnis der MSC Ontogenese. Es gibt zunehmend Hinweise, die den Ursprung der perivaskulären MSCs und die Verbindung zwischen Gewebe-spezifischen Vorläuferzellen und Blutgefäße 22-25. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, homogene Subpopulationen von hBVSCs weiter hilft dem Verständnis der MSC Heterogenität und Vaskuläre Zellbiologie 26 zu isolieren.
In den vergangenen Jahren haben die MEC, PCs und ACs individuell identifiziert und durch verschiedene Protokolle in separaten Studien isoliert. Jedoch wurde kein Versuch unternommen, alle drei Untergruppen hBVSC gleichzeitig aus menschlichem Skelettmuskel zu reinigen aufgrund der Schwierigkeiten, die Gewebedissoziation Verfahren und die Kombination der selektiven Zelllinie Marker identifiziert MEC, PC, und ACS insgesamt zu optimieren. Hier eine neue Zellisolierung Protokoll, das gleichzeitige purif ermöglicht haben wir beschrieben,ication von MEC, PCs und ACs aus einer menschlichen Muskelbiopsie durch Änderung der Gewebedissoziation Prozess und die Anwendung eines neuen Kombination aus selektiver Zelloberflächenmarker (Abbildung 1). Für das beste Ergebnis, die kritischen Schritte im aktuellen Protokoll, das zusätzliche Aufmerksamkeit erfordern, gehören: 1. Frische und Erhaltung der Gewebeprobe; 2. Optimierung der Zellausbeute und Oberflächenantigen Erhaltung durch sorgfältige Überwachung der Verdauung und das Einstellen der Gewebedissoziation Zeit; 3. Präzise Kalibrierung der Sechsfarben-Durchflusszytometrie. Diese Parameter sind von den einzelnen Labor nach seiner besonderen Versorgungs / Geräte-Setup ermittelt werden.
Mit der Umsetzung dieses neuen Protokolls, kann man nicht nur zur Straffung des Synchron Isolierung von mehreren hBVSC Subpopulationen sondern erleichtern auch die Nutzung von hBVSCs für Grundlagenforschung und translationale Anwendung, wie zB den Vergleich von Differentialzell Verhaltensweisen zwischen HBVsC Teilmengen und die Optimierung von einzelnen oder kombinatorische hBVSC Teilmenge (n) für verschiedene personalisierte therapeutische Anwendungen. Jedoch ist die gleichzeitige Trennung aller drei Teilmengen hBVSC derzeit den Skelettmuskel aufgrund der Tatsache, daß MEC nicht in anderen menschlichen Geweben identifiziert beschränkt. Außerdem ist es über die Begrenzung der aktuellen Protokoll, um den Übergang und / oder zelluläre Hierarchie zwischen diesen drei hBVSC Subpopulationen zu unterscheiden.
Charakterisierung von frisch isolierten und kultivierten MEC, PCs und ACs wurde separat in früheren Studien gezeigt, MEC in Kultur zu halten, die Expression der myogenen Marker CD56, aber nach und nach verlieren die Expression der Marker CD34 EG und CD144. An der klonalen Ebene MEC auszudrücken MSC Marker, einschließlich CD29, CD44, CD90, CD105 und, und zeigen mesenchymale Differenzierungspotenziale wie Chondrogenese, Osteogenesis, Adipogenese und myogenesis. Zusätzlich klonalen MEC ihre angiogen behaltenic Kapazität nach Langzeitkultur, Bildung kapillarartigen Netzwerke in Matrigel Kultur und die Teilnahme an Neovaskularisation in vivo 21.
PCs, frischen oder kultivierten, wurde gezeigt, dass nicht nur Ausdruck MSC Markern, einschließlich CD44, CD73, CD90, CD105 und, sondern weisen auch mesodermalen Entwicklungsmöglichkeiten, beispielsweise Skelett Myogenese, Osteogenese, Chondrogenese und Adipogenese 13. PCs robust sezernieren eine Reihe von Nahrungsfaktoren, auch unter Hypoxie, und dienen als Rückspeiseeinheiten durch ihre parakrine Funktion, Direkt Differenzierung und Zellinteraktion während der Reparatur von Gewebe / Regenerationsprozess ACs, ähnlich wie bei PCs, wurde gezeigt, dass klassische MSC Marker exprimieren und differenzieren sich in großen mesenchymalen Zelllinien 18. Zusammen mit PCs haben ACs auch als eine der Entwicklungs Ursprünge MSCs vorgeschlagen. Eine Zusammenfassung Vergleich der Zelloberflächenmarker-Expression, Differenzierungsfähigkeit und pÖGLICHE Translations Anwendungen typisch zwischen MSCs und hBVSCs ist in Tabelle 1 aufgeführt. Kürzlich Tang et al. identifiziert multi vaskuläre Stammzellen (MVSCs) aus der Tunica media der großen Blutgefäße in Ratte und Mensch 29. MVSCs nicht nur in die glatten Muskelzellen differenzieren, sondern auch vaskuläre Remodelling und neointimale Hyperplasie nach Gefäßverletzung 29 beitragen. Ob MVSCs teilen Entwicklungs Verbindungen mit BVSCs die sich in den Mikrogefäß und kleine Schiffe erfordert weitere Untersuchungen.
Das aktuelle Protokoll erfordert zeitnahe Zellisolierung aus frischen menschlichen Muskelbiopsie, die in Zeiten, darf nicht in den klinischen Einrichtungen zugänglich sein. Alternativ, auf der Basis eines modifizierten Satzes von selektiven Zelloberflächenmarker, ist es möglich, MEC und PCs von kryokonservierten menschlichen primären Skelettmuskelzellkulturen mittels Durchflusszytometrie 30 zu reinigen. Diese Methode ermöglicht es Interessenten purification von zwei Teilmengen aus hBVSC Steil menschlichen Skelettmuskelkultur zu therapeutischen Zwecken. Allerdings lassen sich aufgrund der fehlenden CD34-Expression in kultivierten menschlichen Muskelzellen, ist es nicht möglich, weiter zu trennen ACs mit diesem Protokoll.
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Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Alison Logar für ihre hervorragende technische Unterstützung bei der Durchflusszytometrie bedanken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (JH), der Henry J. Mankin Stiftungslehrstuhl (JH) und des Ministeriums für Bildung und Wissenschaft der Republik Kasachstan (AS) unterstützt. CWC wurde zum Teil von der American Heart Association Promotionsstipendium (11PRE7490001) unterstützt. M.Corselli wurde von der California Institute for Regenerative Medicine Ausbildungsförderung (TG2-01169) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACS Aria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 complete medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
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