Summary
Vasos sanguíneos dentro do porto músculo esquelético várias populações precursoras multi-linhagem humana que são ideais para aplicações de regeneração. Este método de isolamento permite purificação simultânea de três populações de células multipotentes precursor, respectivamente, de três camadas estruturais de vasos sanguíneos: as células endoteliais de miogênica íntima, pericitos de mídia e células adventícias de adventícia.
Abstract
Desde a descoberta do tronco mesenquimais / células do estroma (CTM), a identidade nativa e localização de MSCs foram obscurecidos por seu isolamento retrospectiva na cultura. Recentemente, usando classificação de células activada por fluorescência (FACS), e que outros investigadores prospectivamente identificada e purificada três subpopulações de células precursoras pluripotentes associados à vasculatura do músculo esquelético humano. Estes três populações de células: células endoteliais miogênica (SAMU), pericitos (PCs) e células adventícias (SCA), estão localizadas, respectivamente, para as três camadas estruturais dos vasos sanguíneos: íntima, média e adventícia. Todas estas células-tronco derivadas de sangue-embarcação humana (hBVSC) populações não só expressam marcadores MSC clássicos, mas também possuem potenciais de desenvolvimento mesodérmicas semelhantes a MSCs típicas. Anteriormente, SAMU, PCs e ACs foram isolados através de protocolos distintos e, posteriormente caracterizada em estudos separados. A corrente de prot isolamentoocol, através de modificações no processo de isolamento e ajustes nos marcadores de superfície celular seletivos, nos permite purificar simultaneamente todas as três subpopulações hBVSC por FACS de uma única biópsia muscular humana. Este novo método não só irá agilizar o isolamento de várias subpopulações BVSC, mas também facilitar futuras aplicações clínicas de hBVSCs para fins terapêuticos distintos.
Introduction
Músculo-esquelético humano tem sido considerada uma fonte clinicamente atraente de células tronco / progenitoras. O músculo esquelético contém não só cometeu progenitores miogênicos, mioblastos esqueléticos, mas também células-tronco miogênicas primitivos, incluindo células satélites e células-tronco derivadas de músculos (MDSCs) 1. O uso de células humanas derivadas de músculos tronco / progenitoras, autólogo ou alogênico, em medicina regenerativa tem sido extensivamente estudada em modelos animais pré-clínicos e clínicos. As aplicações de regeneração de células musculares tronco / progenitoras variam de regenerar o músculo distrófico na distrofia muscular de Duchenne (DMD) para reparar o coração ferido em pacientes com ataque cardíaco.
Desde a descoberta da estaminais mesenquimais / células do estroma (MSCs) e outras populações de células multipotentes precursora, incluindo as células de osso derivadas de medula multipotentes progenitoras adultas (MAPCs) e células estaminais derivadas de tecido adiposo (ADSCs), estaminais adultas /células progenitoras têm sido amplamente estudados até o momento 1-9. No entanto, a sua identidade nativa e localização in situ foram obscurecidos pelos métodos de isolamento retrospectivos. Recentemente, utilizando células ativadas por fluorescência (FACS), nós e outros grupos identificados prospectivamente e três populações de células multipotentes precursor purificados de vasos sanguíneos dentro do músculo esquelético humano e vários outros órgãos: células endoteliais miogênica (SAMU), pericitos (PCs), e células adventícias (ACs) 10. Estes três subpopulações de células estaminais do sangue humanas derivadas de vasos (hBVSCs) podem ser encontradas, respectivamente, nas três camadas estruturais dos vasos sanguíneos: íntima, túnica, e túnica adventícia. Mais especificamente, MECs e PCs são detectados em microvasos e capilares enquanto ACs estão localizadas na camada adventícia de artérias e veias maiores. Cada subconjunto de células precursoras expressa uma única combinação de antigénios da superfície celular: CME (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PCs (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), e ACs (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).
A caracterização desses subconjuntos hBVSC revelou que as três populações de células precursor possuem potenciais de desenvolvimento mesodérmicas semelhantes a MSCs típicos, incluindo tecido muscular esquelético, osteogênese, chondrogenesis e adipogênese. Todos os subconjuntos hBVSC também exibem marcadores MSC clássicos, incluindo CD44, CD73, CD90 e CD105, na hora e na cultura. Coletivamente, esses elementos de prova apoiou a origem vascular de MSCs. Além disso, as capacidades terapêuticas de MECs, PCs e ACs recentemente têm sido demonstradas em estudos separados. MECs ordenados a partir de biópsias musculares humanos adultos foram mostrados para regenerar os músculos feridos e distróficos esqueléticos e reparação feridos miocárdio de forma mais eficiente do que os mioblastos esqueléticos e endo vascularcélulas Thelial (ECS). PCs purificada a partir de diferentes órgãos humanos também foram mostrados para reparar / regenerar músculos esqueléticos feridos e distróficos e contribuir para o pool de células satélite 13-16. Muito recentemente, demonstramos que PCs derivadas de músculo esquelético humano efetivamente reparar o miocárdio infartado por efeito parácrino indireta e interações celulares diretos 17. ACs, por outro lado, têm sido isolados, quer directamente a partir de vasos sanguíneos ou explantados purificado por FACS a partir de tecido adiposo humano e de músculo esquelético. Um efeito pró-angiogênico notável de ACs foi demonstrada em um mouse traseira de membros modelo de isquemia 19. Além disso, ACS também têm sido mostrados para reparar o miocárdio mais eficientemente do que as MSCs convencionais, indicando o potencial terapêutico de ACs robusta na reparação do tecido isquémico 20.
As atuais concessões protocolo de purificação simultâneas, purificação prospectivo de SAMU, PCs eACs a partir da vasculatura de um único biópsia do músculo esquelético humano. Isso nos permite estudar e / ou escolher a subpopulação hBVSC ideal para fins terapêuticos distintos. Além disso, esta nova técnica amplia ainda mais o repertório de células tronco / progenitoras que podem ser derivadas de músculo esquelético humano, tornando-se uma fonte ideal de células precursoras multipotentes para a medicina regenerativa.
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Protocol
1. Muscle Processing Biópsia
- Preservar biópsia do músculo esquelético humano em gelo em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (P / S) durante o transporte.
- Após a recepção da biópsia do músculo, remover a amostra do recipiente de transporte e de lavá-lo duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementado com solução de antibiótico-antifúngico 2% (A / D), sob condições estéreis.
- Remover o tecido adiposo e tecido conectivo anexado com tesouras e pinças estéreis em DMEM suplementado com 2% de A / D.
- Remover grandes vasos sanguíneos sob dissecção microscópio e posteriormente cortar a amostra do músculo em pedaços pequenos (<1 cm2 de tamanho).
- Preservar peças cortadas musculares (<5 gramas) em 20 ml de meio de preservação (PM; DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S) a 4 ℃ até 5 dias.
2. Muscle Dissociatião e Isolamento celular
- No dia do isolamento das células, remover pedaços de músculo de PM e lavar duas vezes em PBS suplementado com 2% P / S. Para fazer a solução de digestão, adicionar tipo I, tipo II, e colagenase tipo IV (100 mg / ml) em recém-AM.
- Pique e pique mecanicamente pedaços de músculo com tesouras e pinças esterilizadas, em uma placa de Petri com uma pequena quantidade de PM até que a solução passa 10 ml pipeta sorológica sem coagulação. Remover o tecido adiposo residual e tecido conjuntivo durante este processo. Use pelo menos 8-10 gramas de músculo adulto ou 2 gramas de músculo fetal para cada isolamento de células.
- Transferir 4-5 gramas de músculo adulto picada 20 ml (ou 2 gramas de músculo fetal picada em 10 ml) da solução de digestão com uma pipeta 10 ml sorológica. Digerir durante 50 - 60 min a 37 ℃ num agitador orbital, a 70 - 80 rpm. Optimizar o rendimento celular e preservação antigénio de superfície através do ajuste do tempo de digestão e / ou a velocidade de agitação de acordo com base na quantidadede tecido. Observe o estado digestão cada 15-20 minutos até que a turbidez quase limpa.
- Vigorosamente pipeta o tecido digerido 3-5 vezes com 10 ml de pipeta sorológica. Adicionar uma quantidade igual de PM para parar a reacção e, em seguida, centrifugar a 400 x g durante 4 min.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante; ressuspender o sedimento com 10 ml de AM para lavagem, e em seguida filtrada através de um filtro de células de 100 um.
- Centrifugar a 400 xg durante 4 minutos e retire cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender as peletes em tampão de lise de eritrócitos (155 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3, 0,1 mm de EDTA), filtrar através de um filtro de 70 um da célula para se obter uma suspensão de células isoladas, e, em seguida, incubar por 10 min em temperatura ambiente. Filtrar através de um filtro celular de 70 m novamente se observa qualquer precipitação.
- Centrifugar a 400 g durante 4 min e ressuspender o sedimento de células em 0,5 ml de PBS. Conte o número de células. Obtenha um total de pelo menos 5 milhões de células para separação de células. Dilui-se a L únie suspensão de células para menos de 5 milhões de células por ml, com PBS para a coloração. Retire 50-100 mL de suspensão de células e dividida em 11 tubos para colorações controle (controle sem mácula, controles negativos, e de uma só cor controles positivos).
3. marcação celular e Classificando
- Incubar a suspensão de células individuais por 10 min a 4 ℃ no soro de ratinho (diluído 1:10 em PBS) por fim, se necessário o bloqueio.
- Adicionar CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, e CD146-FITC (todos de 1: 100) para a suspensão de células individuais e incubar durante 20 min a 4 ℃. Para o controlo negativo, adicionar concentrações equivalentes de APC-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE, e os anticorpos IgG de isotipo conjugados com FITC e incubar durante 20 min a 4 ℃. Para controlos positivos de uma só cor, adicionar concentrações equivalentes de CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, e CD146-FITC, individualmente, em cada tubo e incubar durante 20 min a 4 ℃.
- Após incubação, Centrifugar a 400 xg durante 4 minutos para lavar. Ressuspender o sedimento de células em 1 - 2 ml de DMEM suplementado com 5% de FBS e 1% de P / S. A concentração final da suspensão de células deve ser inferior a 5 milhões de células por ml. Adicionar 7-AAD (1: 100) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente para a exclusão de células mortas. Para o controlo negativo e controlo positivo de uma só cor, os sedimentos celulares ressuspender em 0,5 mL de DMEM suplementado com 5% de FBS e 1% de P / S.
- Transferir todas as suspensões celulares para o fluxo de poliestireno de fundo redondo de citometria de tubos. Prepare tubos de coleta de células (cada tubo é preenchido com 500 mL de meio de cultura apropriado: MPM para MECs; EGM-2 para PCs; médio AC para ACs). As suspensões de células de transporte em gelo para o classificador de células.
- Suspensões de células executado no separador de células na ordem do controle sem mácula, controles negativos, controles positivos de uma só cor, ea suspensão de células principal enquanto ajusta a intensidade do laser, a compensação de canal, e população de células acopladas rigorosamente para maximizar a célula purity (consulte artigos publicados por Jove e outras revistas para detalhes da citometria de fluxo).
- Colete populações de células desejadas nos tubos de recolha apropriados. Armazenar células coletadas a 4 ℃ se não semear imediatamente.
4 Pós-ordenação Cultura de Células
- Semente MECs recém-ordenados (P0) em <10.000 células / cm 2 em MPM em placas pré-revestidas com colágeno tipo I. Para passaging subseqüente de MECs, semear 3.500 - 4.000 células / cm 2 em MPM em placas / frascos pré-revestidas com colágeno tipo I.
- Semente recentemente PCs ordenados (P0) em <20000 células / cm2 em EGM-2 em placas de recém-revestidos com 0,2% de gelatina. Para passaging subsequente de PCs, células dividida em 1: 3 em meio de PC (DMEM suplementado com 20% FBS e 1% de P / S) em placas de cultura de poliestireno regulares até P2. De P3 para a frente, as células de sementes em 6500 - 7.000 células / cm 2 em meio PC para regulares de cultura de poliestireno placas / frascos.
- Semente recentemente classificados ACs (P0) em <20000 células / cm2 em meio AC (DMEM suplementado com 20% FBS e 1% de P / S) em placas de cultura de poliestireno regulares. Para passaging subseqüente de ACs, as células de sementes em 6500 - 7.000 células / cm 2 em meio AC na regulares de cultura de poliestireno placas / frascos.
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Representative Results
Parâmetros de FACS são primeiro corrigido com base nos dados obtidos a partir do controlo não corado, controlos negativos, controlos positivos e com uma única cor. Após a exclusão de células mortas, a suspensão de células marcadas com fluorescência é submetido a uma série de marcadores de superfície celular selecções negativas e positivas. Primeiro, as células CD45 + são fechadas antes de CD56 + CD56 - as células são separadas da CD45 - fracção. O CD56 + fracção é submetido a selecção de CD34-CD144 + CD34, onde apenas / CD144 + células (dual-positivos) são marcadas como CME (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -) e posteriormente recolhido (Figura 1). Da mesma forma, o CD56 - fração é submetido a seleção CD34-CD146, onde apenas CD34 - / CD146 + células são marcadas como PCs (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) e, posteriormente, recolhido (
Recentemente células classificadas pode ser semeadas em condições de cultura especificados no protocolo para a expansão ou usado imediatamente para experiências in vivo. A expansão clonal dos subconjuntos hBVSC pode ser alcançado pelo sistema autoclone FACS Aria ou método de diluição limitante 13, 21. Ao contrário das MSCs típicos heterogêneos, culturas de subconjuntos hBVSC permanecer homogêneo, mesmo após a expansão a longo prazo. Morfologia representativa de subconjuntos hBVSC cultivadas, purificada a partir de biópsias musculares de umúnico doador, é mostrada na Figura 2. Comparações entre MSCs típicos e subconjuntos hBVSC purificadas encontram-se resumidos na Tabela 1.
Figura 1 classificação Representante dos três subgrupos de células-tronco derivadas de vasos sanguíneos humanos (hBVSCs) a partir de uma única biópsia de músculo esquelético humano. Pureza de cada população de células classificadas é ainda confirmada por análise pós-classificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Os três subpopulações hBVSC, escolhidas a homogeneidade, exibiram morfologia distinta em cultura (da esquerda para a direita): miogênica das células endoteliais (MEC), pericyte (PC) e célula adventícia (AC) (na passagem 4, barras de escala = 100 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| MSCs | MECs | PCs | ACs | |
| Pureza | Heterogêneo | Homogêneo | Homogêneo | Homogêneo |
| Perfil de antigénio de superfície celular para a purificação | N / D | CD34 + CD45- CD56 + CD144 + | CD31- CD34 + CD45- CD146- | |
| A expressão do marcador MSC em cultura | CD29 + CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD29 + CD44 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + | CD44 + CD73 + CD90 + CD105 + |
| Multipotency | Miogênese (+) Adipogênese (+) Osteogenesis (+) Condrogénese (+) | Miogênese (+) Adipogênese (+) Osteogenesis (+) Condrogénese (+) | Miogênese (+) Adipogênese (+) Osteogenesis (+) Condrogénese (+) | Miogênese (N / A) Adipogênese (+) Osteogenesis (+) Condrogénese (+) |
| As aplicações potenciais | Musculoesquelético reparação / regeneração: osso, cartilagem, tendões, ligamentos e músculo esquelético; Reparação cardíaca; Reparação Vascular; Cicatrização de feridas; Immunoregulation | Reparação cardíaca; Reparação do músculo esquelético / regeneração; Osso / reparação da cartilagem / regeneração | Reparação cardíaca; Vascular reparação / regeneração; Reparação do músculo esquelético / regeneração; A regeneração óssea | Reparação cardíaca; Vascular reparação / regeneração; A regeneração óssea |
| Localização anatômica in situ | N / D | Intima vaso sanguíneo | Vaso sanguíneo Mídia | Adventícia dos vasos sanguíneos |
Tabela 1: Comparação de MSCs típicas e subpopulações hBVSC multipotentes.
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Discussion
Identificação e purificação de subpopulações hBVSC representam um grande avanço na compreensão da MSC ontogenia. Há evidências crescentes, indicando a origem perivascular de MSCs ea associação entre células precursoras de tecidos específicos e vasos sanguíneos 22-25. Além disso, a capacidade para isolar sub-populações homogéneas de hBVSCs auxilia ainda mais a compreensão do MSC heterogeneidade e biologia celular vascular 26.
Nos últimos anos, MECs, PCs e ACs foram identificados e isolados através de protocolos distintos em estudos separados individualmente. No entanto, não foi feita nenhuma tentativa de purificar todos os três subgrupos hBVSC simultaneamente a partir de músculo esquelético humano, devido às dificuldades para otimizar o processo de dissociação do tecido e da combinação de marcadores de linhagem de células seletivas identificar MECs, PCs e ACs completamente. Aqui nós descrevemos um novo protocolo de isolamento de células que permite Purif concorrenteicação da CME, PCs e ACs de uma única biópsia muscular humana, modificando o processo de dissociação do tecido e aplicação de uma nova combinação de marcadores de superfície celular seletivos (Figura 1). Para o melhor resultado, as etapas críticas no protocolo atual que exigem uma atenção suplementar incluem: 1. Frescura e preservação da amostra de tecido; 2 Otimização de rendimento celular e preservação antígeno de superfície por uma monitorização cuidadosa do processo de digestão e ajustar o tempo de dissociação do tecido; 3. calibração precisa da seis cores citometria de fluxo. Esses parâmetros devem ser determinados pelo laboratório indivíduo de acordo com sua configuração específica de alimentação / equipamento.
Com a implementação deste novo protocolo, não se pode apenas simplificar o isolamento síncrona de várias subpopulações hBVSC mas também facilitar a utilização de hBVSCs para a pesquisa básica ea aplicação de translação, como a comparação dos comportamentos de celulares diferenciais entre hBVSSubconjuntos C ea otimização de subconjunto hBVSC único ou combinatória (s) para várias aplicações terapêuticas personalizadas. No entanto, o isolamento em simultâneo de todos os três sub-grupos hBVSC está actualmente limitada para o músculo esquelético, devido ao facto de CME não foram identificadas em outros tecidos humanos. Além disso, é além da limitação do actual protocolo de distinguir a transição e / ou hierarquia celular entre esses três subpopulações hBVSC.
Caracterização dos recém-isoladas e cultivadas MECs, PCs, e ACs foi demonstrada separadamente em estudos anteriores MECs em cultura manter a expressão do marcador CD56 miogênica mas perdem gradualmente a expressão dos marcadores CD34 e CD144 CE. No nível clonal, MECs expressam marcadores MSC, incluindo CD29, CD44, CD90 e CD105, e mostrar os potenciais de diferenciação mesenquimais como chondrogenesis, osteogênese, adipogênese e miogênese. Para além disso, conservar o seu MECs clonais angiogenic capacidade após a cultura de longo prazo, formando redes do tipo capilar em Matrigel cultura e participam na neovascularização in vivo 21.
PCs, frescos ou cultivadas, têm se mostrado não só expressam marcadores MSC, incluindo CD44, CD73, CD90 e CD105, mas também apresentam capacidades de desenvolvimento mesodérmicas, por exemplo, tecido muscular esquelético, osteogênese, chondrogenesis e adipogênese 13. PCs robustamente secretam uma série de fatores tróficos, mesmo em condições de hipoxia, e servem como unidades de regeneração através de sua função parácrina, diferenciação direta e interação celular durante o processo / regeneração reparação tecidual ACs, similar aos PCs, foram mostrados para expressar marcadores MSC clássicos e se diferenciar em linhagens de células mesenquimais principais 18. Juntamente com PCs, ACs também têm sido propostos como uma das origens do desenvolvimento de MSCs. Um resumo da comparação a expressão do marcador de superfície celular, a capacidade de diferenciação, e paplicações translacionais OSSÍVEIS entre MSCs e hBVSCs típicos foi listado na Tabela 1. Recentemente, Tang et al. células-tronco identificadas multipotentes vasculares (MVSCs) da túnica média dos grandes vasos sanguíneos em ratos e humanos 29. MVSCs não só se diferenciam em células musculares lisas, mas também contribuir para o remodelamento vascular e hiperplasia neointimal após a lesão vascular 29. Se MVSCs compartilhar conexões de desenvolvimento com BVSCs residente nos vasos microvasculatura e pequenas requer uma investigação mais aprofundada.
O protocolo atual requer o isolamento de células oportuna de biópsia muscular humana fresca, que, às vezes, podem não estar acessíveis nos ambientes clínicos. Alternativamente, com base em um conjunto modificado de marcadores de superfície celular selectiva, é possível purificar MECs e PCs de culturas primárias de células humanas do músculo esquelético criopreservadas por citometria de fluxo 30. Este método permite Purif prospectivoicação de dois subconjuntos hBVSC de cultura de músculo esquelético humano depositado para fins terapêuticos. No entanto, devido à falta de expressão de CD34 em células de músculo humanas de cultura, não é possível separar ainda mais ACs com este protocolo particular.
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Acknowledgments
Os autores agradecem a Alison Logar por sua assistência técnica de excelência com a citometria de fluxo. Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Defesa (JH), a Henry J. Mankin cadeira dotada (JH), e do Ministério da Educação e Ciência da República do Cazaquistão (AS). CWC foi apoiado em parte pela irmandade predoctoral American Heart Association (11PRE7490001). M.Corselli foi apoiado pelo California Institute for Regenerative Medicine bolsa de formação (TG2-01169).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACS Aria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 complete medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
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