Summary
Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.
Abstract
Viele Mikroorganismen wie Bakterien vermehren sich extrem schnell und die Populationen können hohe Zelldichten erreichen. Kleine Zellfraktionen in einer Population haben immer angesammelte Mutationen, die entweder schädlich oder vorteilhaft für die Zelle sind. Wenn der Fitnesseffekt einer Mutation der Subpopulation einen starken selektiven Wachstumsvorteil verschafft, können die Individuen dieser Subpopulation schnell überwettbewerben und sogar ihre unmittelbaren Mitmenschen vollständig eliminieren. So können kleine genetische Veränderungen und selektionsgesteuerte Anhäufung von Zellen, die vorteilhafte Mutationen erworben haben, zu einer vollständigen Verschiebung des Genotyps einer Zellpopulation führen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Überwachung der schnellen klonalen Expansion und Eliminierung von vorteilhaften bzw. schädlichen Mutationen in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit durch Kokultivierung von fluoreszierend markierten Individuen des Gram-positiven Modellbakteriums Bacillus subtilisvor. Die Methode ist einfach durchzuführen und sehr anschaulich, um intraartenWettbewerb unter den Individuen in einer bakteriellen Zellpopulation zu zeigen.
Introduction
Bodenbakterien sind in der Regel mit flexiblen regulatorischen Netzwerken und breiten stoffwechselnden Kapazitäten ausgestattet. Beide Eigenschaften ermöglichen es den Zellen, ihre katabolen und anabolen Bahnen anzupassen, um mit ihren Gefährten und anderen Mikroorganismen um die Nährstoffe zu konkurrieren, die in einer bestimmten ökologischen Nische verfügbar sind1. Wenn die Bakterien jedoch nicht in der Lage sind, sich an ihre Umgebung anzupassen, können andere Mechanismen für das Überleben einer Art verantwortlich sein. In der Tat, da viele Bakterien schnell vermehren und die Populationen hohe Zelldichten Subpopulationen erreichen können spontan angesammelt positive Mutationen, die die Zellen mit einem selektiven Wachstumsvorteil und damit ihre Fitness zu erhöhen. Darüber hinaus können Mutations-Hotspots und stressinduzierte adaptive Mutagenese die Entwicklung eines unangepassten Bakteriums2,3erleichtern. So ist die Anhäufung von Mutationen und Wachstum unter kontinuierlicher Selektion der Ursprung für die enorme mikrobielle Vielfalt, selbst innerhalb derselben Gattung4,5. Wie in der Natur findet auch die Formgebung bakterieller Genome im Labor aufgrund der kontinuierlichen Kultivierung unter Auswahl statt. Ein Beispiel dafür ist die Domestizierung des Gram-positiven Bakteriums B. subtilis, das weltweit in der Grundlagenforschung und in der Industrie eingesetzt wird. In den 1940er Jahren wurde B. subtilis mit DNA-schädigenden Röntgenstrahlen behandelt, gefolgt von der Kultivierung unter einer spezifischen Wachstumsbedingung6. Die Mutationen, die sich in den Bakterien während ihrer Domestizierung angesammelt haben, sind für den Verlust vieler Wachstumsmerkmale verantwortlich, d.h. der Laborstamm 168 von B. subtilis verlor die Fähigkeit, komplexe Kolonien zu bilden7,8.
Für die am besten untersuchten Modellbakterien Escherichia coli und B. subtilissteht heute eine Vielzahl leistungsstarker Werkzeuge zur Verfügung, um ihre Genome genetisch zu manipulieren, um spezifische wissenschaftliche Fragen zu beantworten. Manchmal verursacht die Inaktivierung eines Gens von Interesse einen schweren Wachstumsfehler, der dann auf dem Standardwachstumsmedium9deutlich sichtbar ist. Im Gegensatz dazu werden Mutationen, die einen schwachen Wachstumsfehler verursachen und damit nur geringfügig die Fitness der Sorte beeinträchtigen, oft ignoriert. In beiden Fällen führen jedoch eine längere Inkubation und Passage der mutierten Stämme für mehrere Generationen in der Regel zur Anhäufung von Suppressormutanten, die den Phänotyp des Elternstamms2,9wiederhergestellt haben. Die Charakterisierung von Suppressormutanten und die Identifizierung der Mutationen, die den Wachstumsdefekt des Stammstamms wiederhergestellt haben, ist ein sehr hilfreicher Ansatz, der eine Aufklärung wichtiger und oft neuartiger zellulärer Prozesse ermöglicht10,11.
Wir sind an der Kontrolle der Glutamathomöostase in B. subtilis12interessiert. Ähnlich wie E. colireagiert B. subtilis auf die Störung der Glutamathomöostase(d.h.Block im Glutamatabbau2) durch die Anhäufung von Suppressormutanten. Die genomischen Veränderungen in diesen Suppressormutanten, die durch spontane Mutation erworben wurden, erwiesen sich schnell wieder GlutamatHomöostase9,13. Daher ist es nicht verwunderlich, dass sich die Anpassung von B. subtilis an einen spezifischen Wachstumszustand während der Domestizierung des Bakteriums in der Enzymsynthese und in den entwickelten enzymatischen Aktivitäten widerspiegelt, die am Glutamatstoffwechsel beteiligt sind12. Es wurde vermutet, dass der Mangel an exogenem Glutamat im Wachstumsmedium während des Domestizierungsprozesses die treibende Kraft für die Entstehung und Fixierung des kryptischen Glutamatdehydrogenase (GDH) gudBCR-Gens im Laborstamm 1682,14war. Diese Hypothese wird durch unsere Beobachtung gestützt, dass die reduzierte Menge an GDH-Aktivität im Laborstamm den Bakterien einen selektiven Wachstumsvorteil verschafft, wenn exogenes Glutamat knapp ist2. Darüber hinaus führt die Kultivierung eines B. subtilis-Stamms, die die GDH GudB synthetisiert, in Ermangelung von exogenem Glutamat zur Anhäufung von Suppressormutanten, die das gudB-Gen inaktivierthaben 2 . Offensichtlich ist das Vorhandensein eines katabolisch aktiven GDH für die Zelle nachteilig, da endogen produziertes Glutamat, das sonst für Anabolismus verwendet werden könnte, zu Ammonium und 2-Oxoglutarat degradiert wird (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu hat ein B. subtilis-Stamm, der mit hoher GDH-Aktivität ausgestattet ist, einen selektiven Wachstumsvorteil gegenüber einer Sorte, die nur einen funktionellen GDH synthetisiert. Es ist davon auszugehen, dass die hohe GDH-Aktivität es den Bakterien ermöglicht, Glutamat als zweite Kohlenstoffquelle zusätzlich zu anderen Kohlenstoffquellen zu nutzen, die vom Medium2 bereitgestellt werden (siehe Abbildung 1). So, GDH-Aktivität stark beeinflusst die Fitness von Bakterien, abhängig von der Verfügbarkeit von exogenen Glutamat.
Hier stellen wir eine sehr anschauliche Methode zur Überwachung und Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz zwischen zwei B. subtilis-Stämmen vor, die sich in einem einzigen Ort auf dem Chromosom unterscheiden (Abbildung 2). Die beiden Stämme wurden mit den Yfp- und cfp-Genen beschriftet, die die Fluorophore YFP und CFP kodieren, und unter verschiedenen Ernährungsbedingungen kokultiviert. Durch Probenahmen im Laufe der Zeit und durch Das aufgeeignete Verdünnungen auf Agarplatten konnten die Überlebenden in jeder der Kulturen leicht mit einem gemeinsamen Stereofluoreszenzmikroskop überwacht werden. Das in diesem Papier beschriebene Verfahren ist einfach durchzuführen und geeignet, die schnelle klonale Expansion und Eliminierung von vorteilhaften bzw. schädlichen Mutationen in einer Zellpopulation im Laufe der Zeit zu visualisieren.
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Protocol
1. Herstellung von Agar-Platten, Kulturmedien, Kryostocks und Vorkulturen
- Bereiten Sie Wachstumsmedien und erforderliche Reagenzien vor (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien).
- Streifen Sie die B. subtilis Stämme (z.B. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) und BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) aus, die ein bzw. zwei aktive GDHs ausdrücken)2, die im Wettbewerbsexperiment auf SP-Medium-Agarplatten verwendet werden, um einzelne Kolonien zu erhalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Nehmen Sie einzelne Kolonien und impfen sterile Kulturröhrchen mit 4 ml LB flüssiges Medium. Wachsen Sie die Bakterien über Nacht bei 28 °C und 220 Rpm.
- Wachsen Sie Übernachtkulturen bei 28 °C, um zu vermeiden, dass die Zellen lyse oder sporulate.
- Messen Sie die optische Dichte der Kulturen bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600) mit einem Standardspektralphotometer.
- Wenn die Kulturen eine OD600 von 2,0 erreicht haben, mischen Sie 0,75 ml der Kulturen mit 0,75 ml einer sterilen 50%-Glyzerinlösung in 1,5 ml Reaktionsröhrchen. Die endgültige OD600 sollte 1,0 sein, um Kryostocks mit etwa 108 Zellen/ml zu erhalten.
- Bewahren Sie die Rohre bei -80 °C auf.
- Machen Sie drei Vorkulturen jeder Sorte, die mit den cfp- und yfp-kodierenden Fluorophorgenen gekennzeichnet sind. Impfen Sie die Präkulturen (sterile Kulturröhrchen mit 4 ml LB flüssigem Medium) mit 1 l Zellen aus -80 °C Kryostocks. Die Kulturen über Nacht bei 28 °C und 220 Rpm bebrüten.
2. Kokultivierung von Bakterien, Probenentnahme und Probenlagerung
- 100 ml C-Glc und CE-Glc minimal enparieren (siehe Tabelle mit Reagenzien und Materialien) und 20 ml jedes Mediums in sterile 100 ml Schüttelkolben übertragen.
- Nehmen Sie 0,1 ml der Übernacht angebauten Vorkulturen, verdünnen Sie sie mit 0,9 ml LB-Medium in einer 1,5 ml Küvette und bestimmen Sie die OD600.
- Nehmen Sie für das Wettbewerbsexperiment die Vorkulturen der verschiedenen Stämme, die eine ähnliche OD600 zwischen 1.0-1.5 aufweisen.
- Um gemischte Zellpopulationen zu erhalten, verdünnen Sie die Zellen der Vorkulturen, die die entsprechende OD600 auf eine OD600 von 0,05 in 20 ml C-Glc und CE-Glc Minimalmedium in 100 ml Schüttelkolben ergänzt hatten. Für das Wettkampfexperiment sollten die beiden Stämme im Verhältnis 1:1 gemischt werden.
- 10 ml Proben aus den Kolben nehmen, in 15 ml Kunststoffröhrchen übertragen, die Zellen durch Zentrifugieren 10 min bei 4.000 x g in einer Standardtischzentrifuge ernten und den Überstand entsorgen.
- Setzen Sie die Zellen in 0,5 ml frischem LB-Medium aus und übertragen Sie die Zellen in einen sterilen 1,5 ml Reaktionsbecher. 0,5 ml 50 % steriles Glycerin hinzufügen, die Suspension durch rigoroses Wirbeln mischen und die Proben bis zur weiteren Behandlung in einem Gefrierschrank von -80 °C lagern.
- Inkubieren Sie die Zellen, die in den Schüttelkolben für bis zu 24 Stunden bei 37 °C und 220 U/min übrig bleiben. Halten Sie die Schüttelkolben im Dunkeln, um ein Photobleichmittel der Fluorophore zu verhindern.
- Nehmen Sie weitere Proben von 0,1 ml nach 7 Stunden und 24 Stunden Wachstum. Messen und beachten Sie die OD600 von 1:10 Verdünnungen (in C-Glc oder CE-Glc minimal medium) der Proben.
- Nehmen Sie die entsprechende Menge an Zellen aus jeder Kultur, um Kryostocks herzustellen, die eine OD600 von 1,0 haben. Bewahren Sie die Proben bis zur weiteren Behandlung bei -80 °C auf.
3. Probenbehandlung, Beschichtung und Inkubation für quantitative Analysen
- Nach dem Sammeln aller Proben die Kryostocks auftauen und die Zellen in einer 0,9%igen Salinlösung (siehe Tabelle mit Reagenzien und Materialien) bis zu 10-3verdünnen.
- Platte 0,1 ml der 10-3 Verdünnungen auf SP-Mittelagarplatten und verteilen die Zellen mit sterilen Glaspipetten.
- Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C im Dunkeln, bis einzelne Kolonien entstanden sind.
4. Zählen der Überlebenden durch Stereo Fluoreszenzmikroskopie für die quantitative Analyse
- Teilen Sie den Boden der Agarplatte mit einem schwarzen Stift in vier Teile für eine bessere Orientierung, während die Überlebenden unter dem Stereofluoreszenzmikroskop gezählt werden.
- Stellen Sie die Platte kopfüber unter das Mikroskop und bringen Sie die Kolonien mit der Kaltlichtquelle in den Fokus.
- Sobald die Kolonien im Fokus sind, wechseln Sie zum entsprechenden Filtersatz für CFP, um die überlebenden Zellen des cfp-markiertenStammes zu visualisieren. Zählen Sie die Überlebenden dieser Sorte, indem Sie die Kolonien mit einem Stift beschriften und notieren Sie die Zahl.
- Entfernen Sie die Etiketten mit Ethanol, und wechseln Sie zum YFP-Filtersatz, um die verbleibenden Zellen des yfp-markiertenStammes zu visualisieren. Zählen Sie die Überlebenden erneut, indem Sie die Kolonien mit einem Stift beschriften und die Zahl notieren.
5. Probenbehandlung und Mikroskopie für semiquantitative Analysen
- Zur Veranschaulichung der Abbildungen erkennen Sie 10 l der Verdünnung von 10-4 (ca. 100 Zellen) aus Schritt 3.1 auf einer SP-Agarplatte (siehe Abbildung 3).
- Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C im Dunkeln, bis einzelne Kolonien entstanden sind.
- Stellen Sie die Petrischale ohne Deckel unter das Mikroskop und bringen Sie den Punkt mit der Kaltlichtquelle in den Fokus.
- Machen Sie Fotos von den Spots für illustrative Figuren. Wählen Sie eine geeignete Belichtungszeit, um die Bilder der Kolonien mit der Kaltlichtquelle zu machen.
- Ohne die Platte zu bewegen, wechseln Sie zum CFP-Filtersatz, passen Sie die Belichtungszeit an und machen Sie ein Bild. Tun Sie das gleiche mit dem YFP-Filtersatz und speichern Sie die Bilder für weitere Analysen.
6. Datenanalyse
- Verwenden Sie Software wie Excel für die quantitativen Datenanalysen. Berechnen Sie anhand der gezählten Kolonien den prozentualen Anteil der gelben und blauen Kolonien in Bezug auf die gesamte Anzahl der Kolonien, die auf 100% festgelegt sind.
- Verwenden Sie die berechneten Zahlen, um ein gestapeltes Balkendiagramm zu erstellen (siehe Abbildung 4 und Abbildung 5). Verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm wie Adobe Photoshop, um zusammengeführte Bilder der Bilder zu erstellen, die von den verschiedenen Spots aufgenommen wurden. Alternativ kann die frei verfügbare Software ImageJ, die von http://rsbweb.nih.gov/ij/ herunterladbar ist, für die Bildverarbeitung verwendet werden.
- Öffnen Sie die Bilder von einer Stelle, die mit dem CFP-Filtersatz und dem YFP-Filtersatz aufgenommen wurden. Optimieren Sie den Kontrast und die Helligkeit, um die Hintergrundfluoreszenz von den Medien zu reduzieren.
- Gehen Sie zu einem der Bilder und wählen Sie alle aus. Kopieren Sie das Bild, und fügen Sie es in das andere Bild ein.
- Verwenden Sie entweder die Funktion "Color Dodge", um die Bilder zusammenzuführen, oder überlagern Sie die fluoreszierenden Bilder über die Registerkarte Kanäle. Zusammengeführte Bilder der Kolonien aus verschiedenen Medien und unterschiedlichen Zeitpunkten stellen das Wachstum der verschiedenen Stämme innerhalb der flüssigen Kultur dar.
7. Spezifische Tipps: Farbstoffschalter-Experiment und Kokultivierung von isogenen Stämmen, die mit cfp und yfp gekennzeichnet sind
Die Expression eines der beiden fluorophorkodierenden Gene in B. subtilis könnte die Fitness und damit die Wachstumsrate der Bakterien beeinflussen. Daher wird empfohlen, die folgenden Experimente durchzuführen, um auszuschließen, dass die Eliminierung eines KonkurrierendenStamms aus der Zellpopulation während des Anbaus einfach auf eine negative Wirkung des Fluorophors zurückzuführen ist:
- Wiederholen Sie das ganze Experiment und kokultiv beschriftete Stämme(z.B. wird der frühere cfp-markierteStamm nun mit dem yfp-Gen beschriftet und umgekehrt). Obwohl inverse, sollten die erhaltenen Ergebnisse mit der vorherigen Beobachtung vergleichbar sein, dass ein Stamm einen selektiven Wachstumsvorteil gegenüber dem anderen Stamm hat.
- Wiederholen Sie das gesamte Experiment und kokultivieren Sie isogene Stämme mit yfp und cfp (z.B. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) und BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Schätzen Sie die negativen Auswirkungen eines der beiden Fluorophore auf die Fitness der Bakterien, indem Sie die Zusammensetzung der Zellpopulation im Laufe der Zeit verfolgen.
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Representative Results
Die hier beschriebene Methode wurde erfolgreich angewandt, um den Wettbewerb innerhalb von Arten in einer Zellpopulation zu visualisieren, die aus B. subtilis-Stämmen besteht, die mit den cfp- und yfp-Genen gekennzeichnet wurden, die die Fluorophore CFP bzw. YFP kodieren. Wie in Abbildung 3dargestellt, kann die Methode verwendet werden, um den Wettbewerb innerhalb der Spezies sehr anschaulich zu visualisieren. Durch das Aufspüren der Proben auf kleinen Flächen wurde die klonale Zusammensetzung der Zellpopulation auf einen Blick sichtbar. Obwohl dieser Ansatz für quantitative Analysen nicht geeignet ist, ist er nützlich, um die Auswirkungen verschiedener Wachstumsparameter(d. h.Stickstoffquelle) auf die Entwicklung einer Zellpopulation, die ursprünglich beide Stämme in gleichen Mengen enthielt, grob zu schätzen (Abbildung 3). Darüber hinaus kann in einem kleinen Ansatz die Eignung verschiedener B. Subtilis-Stämme, die unter dem gleichen Wachstumszustand kultiviert wurden, mit einer einzigen Agarplatte getestet werden. Für quantitative Analysen wird empfohlen, die Proben über die gesamte Oberfläche einer Agarplatte zu vermehren. Dies wird eine Überlagerung der Kolonien verhindern und somit die eindeutige Identifizierung und Anzahl von Kolonien ermöglicht, die aus einzelnen Zellen entstanden sind. Durch das Plattieren geeigneter Verdünnungen auf Agarplatten kann die klonale Zusammensetzung einer Zellpopulation im Laufe der Zeit präzise bestimmt werden, indem einfach die gelben und blauen Fluoreszenzkolonien gezählt werden (siehe Abbildung 4). Wie wir bereits berichtet haben, GDH-Aktivität stark beeinflusst die Fitness von B. subtilis in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von exogenen Glutamat2. Offensichtlich ist in Ermangelung einer exogenen Glutamat-High-Level-GDH-Aktivität für die Bakterien nachteilig, da die Enzyme RocG und GudB Glutamat abbauen, das bei Anabolismus benötigt wird (siehe Abbildung 1 und Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu, wenn den Bakterien zur Verfügung gestellt, Glutamat kann als Amino-Gruppe Spender in Transaminationsreaktionen dienen. Darüber hinaus kann Glutamat in den Kohlenstoffstoffwechsel eingespeist und aufgrund des Vorhandenseins der katabolaktiven GDHs RocG und GudB als Energiequelle genutzt werden (Abbildung 1 und Abbildung 4B). Wie in den Abbildungen 4C und 4Ddargestellt, wurden ähnliche Ergebnisse in einem Farbschalterexperiment erzielt. Auch hier wurden Bakterien, die mit hoher GDH-Aktivität ausgestattet waren, von Zellen mit reduzierter GDH-Aktivität in Wachstumsmedien ohne Glutamat übertroffen. Im Gegensatz dazu wurden Bakterien, die nur einen aktiven GDH synthetisierten, aus der Kultur eliminiert, als das Medium mit Glutamat ergänzt wurde. Wie in den Abbildungen 5A und 5Bdargestellt, blieb die ausgangszusammensetzung der gemischten Zellpopulation im Laufe der Zeit nahezu konstant. So war die Beseitigung einer der beiden Stämme, die mit unterschiedlichen Mengen an GDH-Aktivität ausgestattet waren, im Wettbewerbsexperiment nicht auf einen durch die Fluorophoren verursachten Wachstumsfehler zurückzuführen (siehe Abbildung 4). Zusammengenommen ist die Verwendung von Fluorophoren ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung des Wettbewerbs innerhalb der Spezies in einer bakteriellen Zellpopulation.
Abbildung 1. Die Verbindung zwischen Kohlenstoff- und Stickstoffstoffwechsel in B. subtilis. Wenn Glutamat nicht vom Medium zur Verfügung gestellt wird, wird der wichtigste Aminospender, der für Anabolismus benötigt wird, durch die kombinierte Wirkung der Glutaminsynthetase (GS) und der Glutamatsynthase (GOGAT) aus Ammonium und 2-Oxoglutarat synthetisiert. Im Gegensatz dazu können in Gegenwart von exogenem Glutamat die katabolisch aktiven GDHs RocG und/oder GudB Glutamat zu Ammonium und 2-Oxoglutat abbauen, das dann als Kohlenstoffquelle dient.
Abbildung 2. Experimenteller Workflow. Die Dehnung 1 (mit yfpbeschriftet) und die Sorte 2 (mit cfpbeschriftet) unterscheiden sich in einem Ort voneinander. In dem hier vorgestellten Beispiel haben wir die Wirkung von exogenem Glutamat (Effektor) auf die genotypische Verschiebung der Zellpopulation verglichen, die ursprünglich 50% rocG+ gudB+ (Kodierung von zwei aktiven GDHs) und 50% rocG+ gudBCR (Kodierung einer aktiven GDH) Zellen enthielt. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Semiquantitativer Ansatz zur beschreibunglichen Visualisierung des arteninternen Wettbewerbs (siehe Abschnitt 5). Vor der Kokultivierung (0 Std.) und nach 7 Stunden und 24 Stunden Wachstumsverdünnungen (10-4) wurden Zellen auf SP-Agarplatten gesichtet. Die überlebenden Zellen, die nach 12 stunden Inkubation bei 37 °C Kolonien gebildet haben, wurden durch Stereofluoreszenzmikroskopie identifiziert. Belichtungszeit, 0,6 Sek.; Skalenstange, 1 mm. Diese Zahl wurde von Gunka et al.geändert. 20132.
Abbildung 4. Quantifizierung des Artenwettbewerbs. Nach Probenverdünnung und Vermehrung der Zellen (siehe Schritte 3.1-3.3) auf SP-Medium wurden die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Gelbe und blaue Kolonien wurden wie in den Protokollen 4 und 6 beschrieben quantifiziert. Die schwarzen Fehlerbalken stellen Standardabweichungen für mindestens vier unabhängig wiederholte Experimente dar. Jede Agarplatte enthielt mindestens 100 zählbare Kolonien. (A) In Ermangelung eines exogenen Glutamats tritt der B. subtilis-Stamm BP40 (gelb) mit nur einem funktionellen GDH-Stamm bp54 (blau) ab, der beide Glutamatabbauende Enzyme RocG und GudB synthetisiert. (B) Im Gegensatz dazu ist die Synthese von zwei funktionellen GDHs für die Bakterien von Vorteil, wenn exogenes Glutamat verfügbar ist, da neben Glukose glutamat als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Wie in (C) und (D) dargestellt, wurden vergleichbare Ergebnisse in einem Farbstoffschalterexperiment erzielt. Diese Zahl wurde von Gunka et al.geändert. 20132. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Kontrollexperiment zur Bewertung der Wirkung der fluorophorkodierenden cfp- und yfp-Gene auf die Fitness der Bakterien. Gemischte Populationen der isogenen Stämme BP40 (rocG+ gudBCR amyE::yfp) und BP41 (rocG+ gudBCR amyE::cfp) oder BP52 (rocG+ gudB+ amyE::cfp) und BP156 (rocG+ gudB+ amyE::yfp) wurden in Abwesenheit (A) und in Anwesenheit (B) exogenes Glutamat angebaut. Die überlebenden Zellen wurden wie in den Protokollen 1-4 bzw. 6 beschrieben gezählt. Die Balken stellen Standardabweichungen für mindestens vier unabhängig wiederholte Experimente dar. Diese Zahl wurde von Gunka et al.geändert. 20132. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
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Discussion
Mehrere Methoden wurden entwickelt, um die Wettbewerbstauglichkeit von Bakterien zu analysieren16. In vielen Fällen wurden die Bakterien mit verschiedenen Antibiotika-Resistenzkassetten17gekennzeichnet. Ähnlich unserem Ansatz ermöglicht die Kennzeichnung der Zellen mit Antibiotikaresistenzkassetten die Beurteilung der Wettbewerbstauglichkeit der Bakterien während der Kokultivierung unter definierten Wachstumsbedingungen. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Wettbewerbstauglichkeit von Zellen zu bestimmen, die sich in einem bestimmten Ort auf dem Chromosom17voneinander unterscheiden. Es gibt jedoch einige Nachteile, indem Antibiotika-Resistenzkassetten verwendet werden, um die Wettbewerbstauglichkeit zu überwachen. Da die Expression der Resistenzgene hauptsächlich von Promotoren mit ungleicher Stärke angetrieben wird, werden die Enzyme, die Resistenzen gegen die Antibiotika verleihen, wahrscheinlich auf verschiedenen Ebenen produziert. Daher können schwache Fitnesseffekte mit diesem Ansatz nicht nachweisbar sein. In unserem Ansatz wurden beide Fluorophorgene mit dem gleichen Selektionsmarker integriert und ihre Expression wird von den gleichen Promotoren angetrieben2. Ein weiterer Nachteil, um die Wettbewerbstauglichkeit mit Antibiotika-Resistenz-Kassetten zu überwachen, könnte sein, dass der Ansatz mühsamer ist, da zwei Arten von Agarplatten, die mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt werden, für die Koloniezählung benötigt werden. Alternativ kann die Eignung von Bakterien durch einfache Überwachung der Wachstumsrate und durch die Berechnung eines sogenannten Fitnessindex16bestimmt werden. Offensichtlich ist dies der genaueste Ansatz, weil die Bakterien einzeln kultiviert werden und toxische Verbindungen, die durch einen Stamm mit einem bestimmten Genotyp produziert werden könnten, das Wachstum des konkurrierenden Stammes nicht beeinflussen. Darüber hinaus gibt es keine Notwendigkeit, Antibiotika zu verwenden, die das Wachstum der Zellen beeinflussen könnten. Beide Ansätze sind jedoch nicht sehr anschaulich, da die Zahlen, die die Wettbewerbstauglichkeit beschreiben, nur recht neutral dargestellt werden können.
Die Verwendung von Fluorophor-kodierenden Genen zur Überwachung und Quantifizierung des Wettbewerbs innerhalb von Arten hat gegenüber anderen Methoden mehrere Vorteile. Wenn beide Stämme die Fluorophor-Kodierungsgene durch doppelte homologe Rekombination in das Chromosom integriert haben, besteht keine Notwendigkeit, Antibiotika in einem der Kultivierungsschritte zu verwenden. Daher können Proben, die während des Anbaus aus der Kultur entnommen werden, auf demselben Wachstumsmedium analysiert werden und beide Stämme sind in der Lage zu wachsen. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung des arteninternen Wettbewerbs in einer sehr anschaulichen Weise. Darüber hinaus können mit diesem semiquantitativen Ansatz mehrere Wachstumsbedingungen gleichzeitig getestet und viele verschiedene Stämme parallel verglichen werden. Schließlich besteht keine Notwendigkeit für die Fixierung der Proben auf Mikroskopdias, da die Proben, die während der Kokultivierung aus der Bakterienkultur entnommen wurden, in einem Gefrierschrank18gelagert werden können. So können alle Proben und Replikationen gleichzeitig analysiert werden.
Zwei kritische Schritte in unserem Protokoll müssen erwähnt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kryostocks in der gleichen Wachstumsphase jedes Wettbewerberstamms die gleichen Mengen an Zellen enthalten sollten. Ein anfängliches Missverhältnis der Stämme in den Kryostocks und damit in den Schüttelkolben vor Beginn des Experiments wird einen starken Einfluss auf das Ergebnis des Wettbewerbsexperiments haben. Daher ist es ratsam, die Zusammensetzung der Kryostocks vor dem Experiment zu überprüfen. Darüber hinaus sollte eine angemessene Menge an Zellen gleichmäßig über die Platte propagiert werden. Sonst sind die entstandenen Kolonien zu nah beieinander und eine genaue Bestimmung der überlebenden Zellen wird schwierig.
Es gibt auch einige Einschränkungen und Nachteile des fluorophorbasierten Ansatzes. Die Kokultivierung in einem Multi-Well-Plattenleser und die gleichzeitige Detektion der CFP- und YFP-Signale ist nicht möglich, da die Anregungs- und Emissionsspektren der Fluorophore zu nah beieinander liegen. Dieses technische Problem könnte jedoch mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen umgangen werden, z. B. mit grünem und rotem Licht, das optimal auf dem gleichen Proteingerüst basiert. Ein weiterer Nachteil des fluorophorenbasierten Ansatzes könnte sein, dass einige Mutationen nur einen schwachen Wachstumsfehler der Bakterien verursachen. Wenn also der Wachstumsfehler, der durch eines der fluorophor-kodierenden Gene verursacht werden könnte, stärker ist als der Wachstumsfehler, der durch eine bestimmte Mutation verursacht wird, ist der fluorophor-basierte Ansatz nicht geeignet, den Wettbewerb innerhalb der Spezies zu analysieren. Daher wird empfohlen, vor dem Erstellen eines ganzen Satzes von Stämmen zuerst nur die übergeordnete Sorte mit beiden, cfp und yfp, zu kennzeichnen und die Stämme zu kokultivieren. Die Wachstumsexperimente werden zeigen, wie stark die Fluorophore die Fitness der Bakterien beeinflussen (siehe Abbildungen 5A und 5B).
In Zukunft wird es interessant sein zu testen, ob der fluorophorbasierte Ansatz zur Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs genauer und weniger mühsam sein wird, wenn die überlebenden Zellen mit Flusszytometrie gezählt werden. Kürzlich hat sich gezeigt, dass die Durchflusszytometrie ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um die Zusammensetzung von B. subtilis Biofilmen19zu analysieren. Darüber hinaus könnte es sinnvoller sein, schwache Fitnesseffekte zu analysieren, die die Wettbewerbsfähigkeit von Bakterien durch kontinuierliche Kokultivierung der fluorophor-markierten Bakterien in einem Fermenter beeinträchtigen. Im Gegensatz zu Schüttelkolben ermöglicht dieser Ansatz, die Wachstumsbedingungen konstant zu halten und somit den Wettbewerb innerhalb der Spezies über einen langen Zeitraum zu überwachen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Arbeit im Autorenlabor wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), dem Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) und dem Göttinger Zentrum für Molekularbiologie (GZMB). Die Autoren würdigen Jörg Stülke für hilfreiche Kommentare und die kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
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