Summary
We presenteren de synthese van een split-inteïne gemedieerde proteïne hydrogel. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten copolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Menging van de twee copolymeren eiwit activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid die zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer pH-en temperatuur-stabiele compatibel met organische oplosmiddelen en gemakkelijk bevat functionele globulaire eiwitten.
Abstract
We presenteren de synthese van zeer stabiele eiwit hydrogel gemedieerd door een split-inteïne gekatalyseerde eiwit trans-splicing reactie. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten blokcopolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Een sterk hydrofiel willekeurige spoel wordt ingebracht in een van de blok-copolymeren voor waterretentie. Menging van de twee eiwitten blokcopolymeren activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid met verknopingsmiddelen aan beide uiteinden die snel zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer stabiel onder zowel zure als basische omstandigheden, bij temperaturen tot 50 ° C en in organische oplosmiddelen. De hydrogel snel hervormingen na-afschuiving veroorzaakte breuk. Oprichting van een "docking station peptide" in de hydrogel bouwsteen maakt handig integreren van "docking eiwit"-gelabeld doelwit eiwitten.De hydrogel is compatibel met weefselgroei kweekmedia, ondersteunt de diffusie van 20 kDa moleculen en maakt de immobilisatie van biologisch actieve globulaire eiwitten. De toepassing van het inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel als een organisch-oplosmiddel-compatibele biokatalysator werd gedemonstreerd door inkapseling van het mierikswortel peroxidase enzym en bevestigende zijn activiteit.
Introduction
Hydrogelen geheel gemaakt van eiwitten dragen het potentieel om uiteenlopende gebieden als tissue engineering, drug delivery en biofabrication 1 aanzienlijke vooruitgang. Zij bieden voordelen ten opzichte van traditionele synthetische polymeren hydrogels zoals biocompatibiliteit en potentieel invasief ondersteunen de opname van bioactieve globulaire eiwitten.
In dit werk beschrijven we de ontwikkeling van een nieuw eiwit hydrogel gevormd via een split-inteïne-eiwit gemedieerde trans-splicing reactie en de toepassing ervan als een eiwit immobilisatie steiger (figuur 1). De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten blokcopolymeren die elk de N-of C-terminale fragment van een split inteïne (IN en IC) en een subeenheid van een multimeer proteïne crosslinker. De inteïne DnaE van Nostoc punctiforme (NPU) werd gebruikt als de splitsing intein 2,3 en een kleine trimere eiwit (12 kDa) Cuta van Pyrococcus horikoshii </ Em> werd als crosslinker eiwit 4,5. Verschillende verknopingsmiddelen zijn verbonden door intein gekatalyseerde trans-splicing reactie leidt tot de vorming van een sterk verknoopte proteïnenetwerk (hydrogel). NPU intein werd gekozen vanwege de snelle reactiekinetiek (t1 / 2 = 63 sec) en hoge trans-splicing opbrengst (bijna 80%) 2,3. De Cuta eiwit werd gekozen als crosslinker vanwege zijn hoge stabiliteit. Cuta trimeren een denaturatie temperatuur dichtbij 150 ° C en bewaar trimere quaternaire structuur in oplossingen die zoveel 5 M guanidine hydrochloride 4,6. Aangezien subeenheid uitwisseling tussen verschillende verknopingsmiddelen is een belangrijke bijdrage van de oppervlakte fysieke hydrogel erosie 7, dient de sterke inter-subeenheid interactie Cuta dergelijke subeenheid uitwisseling ontmoedigen, waardoor een stabielere hydrogel. Een van deze bouwstenen bevat ook een sterk hydrofiel peptide S-fragment als het midden-blok naar water gemakkelijkretentie 8.
Menging van de twee hydrogel bouwstenen initieert een trans-splicing reactie tussen de IN en IC intein fragmenten, waardoor een langere polypeptideketen met verknopingsmiddelen aan beide terminals. Crosslinkers van meerdere dergelijke moleculaire eenheden met elkaar, waarbij een zeer verknoopte hydrogel netwerk (figuur 1A). Een specifiek "docking station peptide" (DSP) is opgenomen in een van de hydrogel bouwstenen stabiele immobilisatie van een "docking eiwit" (DP)-gemerkt doeleiwit in de hydrogel vergemakkelijken. Het gebruik van een split inteïne de hydrogel samenstel bemiddelen niet alleen extra flexibiliteit hydrogel proteïne synthese, maar ook zorgt voor een hoge dichtheid, gelijkmatige belasting van het doeleiwit de gehele hydrogel, als doeleiwitten worden geladen voordat hydrogelvorming.
De intein gemedieerde proteïne hydrogel zeer staBLE in waterige oplossing met weinig tot geen detecteerbare erosie na 3 maanden bij kamertemperatuur. Stabiliteit wordt vastgehouden in een breed scala van pH (6-10) en temperatuur (4-50 ° C), en de hydrogel is ook compatibel met organische oplosmiddelen. Deze hydrogel wordt gebruikt voor de immobilisatie van twee globulaire eiwitten: green fluorescent protein (GFP) en mierikswortelperoxidase (HRP). Hydrogel invangen deze proteïne om biokatalyse uitgevoerd in een organisch oplosmiddel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmideconstructie
OPMERKING: Alle genen werden geamplificeerd onder standaard PCR-reacties gebruik Phusion High-Fidelity DNA Polymerase per specificaties van de fabrikant. Primers gebruikt voor klonering zijn eerder 9 beschreven. Alle constructen zijn vermeld in tabel 1.
- Om Cuta-NpuN (N, tabel 1) te genereren:
- PCR versterken Cuta en NpuN genen van plasmiden pET30-Cuta-Tip1 10 en KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respectievelijk, met de juiste primers.
- Digest deze fragmenten met de geschikte restrictie-enzymen en invoegen deze fragmenten achtereenvolgens in de pET26b vector tussen de T7 promotor en een C-terminaal tag 6xHistidine N (figuur 2A) genereren.
- Genereren NpuC-S-Cuta (C, tabel 1):
- PCR Amplify NpuC, Cuta en S fragmentatiet [AG 3 (PEG)] 10 van plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-Cuta-Tip1 10 en pQE9 AC 10 ATRP 12, respectievelijk, met de juiste primers.
- Digest deze fragmenten met de geschikte restrictie-enzymen en na elkaar plaats deze fragmenten in de vector pET26b tussen T7-promoter en een C-terminale naar C 6xHistidine (figuur 2B) genereren.
- : Tot NpuC-S-SH3 lig-Cuta (C-SH3 lig, tabel 1) genereren
- PCR Amplify Cuta behulp van primers die een SH3 lig (PPPALPPKRRR) en een flexibele linker (GGGGS) 2 tot fragment SH3 lig-Cuta genereren.
- Vervang de Cuta gen uit C met fragment SH3 lig-Cuta.
- Om SH3-GFP (Tabel 1) genereren:
- Versterken het SH3-gen uit plasmide pJD757 13 via degeschikte primers.
- Strijk dit fragment aan het GFP-gen en steek deze in de pET26b vector tussen de T7 promoter (figuur 2C) en een C-terminale 6xHistidine tag.
2. Eiwitexpressie
- Transformeren 50 pl chemisch competente Escherichia coli BL21 (DE3) met het geschikte expressieplasmide.
- Na transformatie, serieel verdunnen deze cellen en plaat ze op Luria-Bertani (LB) / agarplaten die 50 ug / ml kanamycine.
- Incubeer de platen die getransformeerde cellen bij 37 ° C voor ~ 15 uur.
- Na incubatie, kies een plaat die 50-100 kolonies bevat en resuspendeer alle kolonies in 5 ml LB-bouillon.
- Transfer suspensie 1 L LB-bouillon die kanamycine (50 ug / ml) en cellen groeien bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm. Bewaken van de absorptie bij 600 nm (OD 600). Grow cultuur tot OD 600 ~ 0.8.
- Voor C-en C-SH3 LIG, induceren eiwitexpressie door toevoeging isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan de kweek (1 mM eindconcentratie) en incubeer de kweek bij 37 ° C gedurende 4 uur onder schudden bij 250 rpm.
- Voor N en SH3-GFP Koel de cultuur ~ 18 ° C door onderdompeling van de kolf in een ijs-waterbad ~ 5 minuten. Induceren eiwit expressie door IPTG toe te voegen aan de cultuur (1 mM eindconcentratie) en incubeer de cultuur bij 18 ° C gedurende 14-18 uur onder schudden bij 250 rpm.
- Na eiwitexpressie centrifugeer de kweken bij 6000 g gedurende 20 min bij 4 ° C om de pellet te verzamelen. WINKEL celpellet bij -80 ° C tot gebruik.
3. Protein Purification
- Zuivering van N (denaturerende omstandigheden)
- Resuspendeer celpellets in buffer A (Tabel 2) en 10 ml / g nat pellet.
- Immerse de pellet suspensie in een ijs-waterbad en verstoren cellen door sonicatie (Amp 10, met 1 sec puls en 6 sec pauze gedurende 1 minuut).
- Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in buffer DA (bevattende 8 M ureum) en de suspensie gecentrifugeerd bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Passeren de bovenstaande vloeistof op een 5 ml Ni-nitrilotriazijnzuur (NTA) kolom vooraf in evenwicht met buffer DA.
- Waskolom met 30 mi buffer DA gesupplementeerd met 45 mM imidazool. Elueer gezuiverde eiwit met 20 mi buffer DA aangevuld met 150 mM imidazool.
- Verlaag de ureumconcentratie in het proteïne monster <1 mM van een van de volgende methoden aangegeven in 3.1.7.1 of 3.1.7.2:
- Dialyze eiwit in DPBS buffer (tabel 2) bij 4 ° C geïncubeerd met buizen met <20 kDa.
- Centrifuge gezuiverd eiwit in een 30 & #160; kDa ultrafiltratie kolom centrifugeren op 2800 x g, 4 ° C totdat het volume kleiner dan 1 ml. Voeg 14 ml DPBS buffer aan de kolom om het eiwit monster te verdunnen. Herhaal het centrifugeren / verdunningsstappen nog drie keer.
- Na bufferuitwisseling, voeg dithiothreitol (DTT) het gezuiverde eiwit (laatste 2 mM) en concentreer eiwit ~ 100 mg / ml door centrifugeren door een 30 kDa ultrafiltratie kolom centrifugeren op 2800 x g, 4 ° C.
- Aliquot de geconcentreerde proteïneoplossing en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
- Zuivering van C en C-SH3 lig (native voorwaarde)
- Resuspendeer celpellets in buffer B (pH 6,0) (Tabel 2) aangevuld met 1 x proteaseremmer cocktail aan 10 ml / g nat pellet. Gebruik zure buffer om proteolytische afbraak van het doeleiwit minimaliseren.
- Verstoren celsuspensie door sonicatie zoals beschreven in 3.1.2. Centrifugeer de lysaten bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en bewaar het supernatant.
- Pass oplosbare lysaat through 5 ml column Ni-NTA eerder geëquilibreerd met buffer B.
- Was de kolom met buffer B gesupplementeerd met 45 mM imidazool, en elueer het doeleiwit in 20 ml buffer B aangevuld met 150 mM imidazool.
- Voor C, doorgaan naar stap 3.2.6. Voor C-SH3 lig, het uitvoeren van een aanvullende ionenwisseling zuiveringsstap om gedeeltelijk afgebroken eiwit te verwijderen zoals aangegeven in stappen 3.2.5.1 naar 3.2.5.3
- Verminder NaCl-concentratie in C-SH3 lig tot <1 mM volgens de in 3.1.7 beschreven procedure.
- Laad het doeleiwit op een 5 ml anionenwisselaar kralen agarosematrix kolom vooraf geëquilibreerd met natriumfosfaatbuffer (50 mM, pH 7.0).
- Elueer doeleiwit uit de kolom door het uitvoeren van een gradiënt van een oplossing die 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer een oplossing met dezelfde buffer aangevuld met 1 M NaCl. Neem monsters tijdens eiwitelutie en zwembad monsters met de hoogste zuiverheid gebaseerd op natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE).
- Bufferuitwisseling het gezuiverde eiwit in DPBS buffer, zoals beschreven in 3.1.7.
- Voeg DTT aan het gezuiverde eiwit (eindconcentratie 2 mM) en concentreer het eiwit -100 mg / ml met een 30 kDa ultrafiltratie spin-kolom zoals beschreven in 3.1.8. Aliquot en bewaar geconcentreerd eiwit bij -80 ° C tot gebruik.
- Zuivering van SH3-GFP
- Resuspendeer celpellets behulp Buffer A bij 10 ml / g nat pellet.
- Verstoren pellet schorsing door sonicatie zoals beschreven in 3.1.2.
- Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof.
- Passeer de supernatant (oplosbare lysaat) door middel van een 5-ml-kolom Ni-NTA vooraf in evenwicht metBuffer A.
- Waskolom met 30 ml Buffer A, aangevuld met 45 mM imidazool. Elueer gezuiverde eiwit met 20 ml Buffer A, aangevuld met 150 mM imidazool.
- Bufferuitwisseling het gezuiverde eiwit in DPBS buffer met behulp van een aanpak vergelijkbaar met die in 3.1.7 beschreven en concentreer het eiwit ~ 150 mg / ml met behulp van een 30 kDa ultrafiltratie spinkolom zoals beschreven in 3.1.8.
- Aliquot en bewaar gezuiverd eiwit bij -80 ° C tot gebruik.
- SDS-PAGE-analyse van gezuiverde monsters die Cuta
- Verdun elk gezuiverd eiwit in tweemaal gedestilleerd water om de concentratie van NaCl tot ~ 1 mM verminderen. Op dit NaCl concentratie meeste Cuta trimeer eiwitten lopen als monomeren op SDS-PAGE gels.
- Meng monsters met 2x SDS-monsterbuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% Glycerol, 10% w / v SDS, 0,1% w / v broom-fenol blauw, 2% β-mercaptoethanol), geïncubeerd bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Laad de samselen op een 12% SDS-PAGE gel. Voer elektroforese bij een constante spanning van 200 V ~ 50 minuten.
- Let op eiwit in de gels door kleuring met Coomassie brilliant blue R250 na de standaard protocollen (figuur 1C).
4. Hydrogel Vorming
Opmerking: het monster hydrogels in deze studie bevatten 1,6 mM van elk hydrogel bouwsteen tenzij anders vermeld. De eiwitconcentratie levert een zachte en stabiele hydrogel. VOORZICHTIG: Natriumazide (NaN3) wordt de hydrogel toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% w / v om bacteriële contaminatie te voorkomen. NaN 3 is zeer giftig en moet met uiterste zorg worden behandeld zoals aangegeven in het Material Safety Data Sheet.
- Bereken het volume van elk van de geconcentreerde eiwitten die nodig zijn om een eindconcentratie van 1,6 mM bereiken in een 100 ui monster hydrogel. Bijvoorbeeld:
Concentratie van N:100 mg / ml
Moleculair gewicht van N: 26,3 kDa (zie tabel 1)
Gewenste Volume: 100 pl gewenste concentratie: 1,6 mm
- Een 100 pl hydrogel (1,6 mM), meng C (x pi volume berekend volgens 4.1) met 5% NaN3 (10 pi), 100 mM DTT (5 ui) en N (y ui volume berekend volgens 4.1) in een 2 ml glazen flacon.
- Voeg DPBS buffer ((85 - x - y) pi) aan de flacon om een eindvolume van 100 pl te bereiken en alle componenten door een wervelende beweging met een pipetpunt handmatig mengen. Opmerking: De oplossing wordt zeer viskeus na mengen.
- Centrifugeer het mengsel gedurende 2 min bij 8000 xg om de luchtbellen te verwijderen.
- Incubeer het mengsel bij kamergedurende een nacht om de intein trans-splicing reactie tot voltooiing te komen. Bevestig hydrogel formatie door te draaien buis ondersteboven. De eiwitten zullen stromen als een hydrogel wordt gevormd.
- Schat de intein trans-splicing opbrengst door eerst monsters (0,5 pi elk) vóór stap na stap 4.2 en 4.5 op een SDS-PAGE gel verzameld, zoals beschreven in 3.4 (figuur 1C).
5. Immobilisatie van GFP via Docking Protein (DP) en Docking Station Peptide (DSP) Interaction
- Om een 50 ul-GFP gefunctionaliseerde hydrogel (1.2 mM) te maken, combineer C-SH3 lig (x pi, berekend volgens 4.1) en SH3-GFP (y pi, berekend volgens 4.1) op 1:1 molverhouding in een 1,7 ml microcentrifugebuis en incuberen van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Voeg 5% NaN3 (5 pi), 100 mM DTT (2,5 pl), (42.5 - x - <em> y) gl DPBS dezelfde buis. Add N (y pi, berekend volgens 4.1) naar een 1:1 molverhouding van N-en C-SH3 lig te bereiken. Meng het monster met behulp van een pipet met een wervelende beweging.
- Centrifugeer het mengsel bij 8000 xg gedurende 2 minuten en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur overnacht in het donker. Een hydrogel inkapselen SH3-GFP vormen tijdens incubatie.
6. Het gebruik van 1,6 mM Hydrogel als immobilisatie matrix voor enzymatische reactie in Organic Solvent
- Gebruik HRP als model enzym. Bereid een voorraad oplossing van HRP (28 mg / ml of 0,63 mM) in DPBS.
- Om een 30 ul hydrogel (1,6 mm) insluiten van HRP maken, combineren C (x pi, berekend volgens 4.1) met HRP (2 pi), 5% NaN 3 (3 pl) en DTT (1,5 pi van 100 mM) in een 1.7 ml centrifugebuis.
- Add N (y </ Em> ul, berekend volgens 4.1) en DPBS (23.5 - x - y) ul. Meng met een pipet tip met een wervelende beweging.
- Centrifugeer het mengsel bij 8000 xg gedurende 2 minuten en incubeer bij kamertemperatuur gedurende een nacht.
LET OP: de regenten gebruikt voor de volgende activiteit test zijn zeer giftig. Gebruik specifieke veiligheidsaanbevelingen door de bijbehorende Material Safety Data Sheets. - Voor enzymatische reactie onderdompelen hydrogel in 1 ml reactiecoctail die N, N-dimethyl-p-fenyleendiamine (5,8 mM), fenol (5.8 mM) en tert-butylhydroperoxide (2,9 mM) in n-heptaan 14. Handmatig verstoren de gel met behulp van een pipet om het contactoppervlak van de hydrogel en het oplosmiddel verhogen.
- Detect HRP product, een indofenol type kleurstof, door de optische absorptie van monsters op verschillende tijdstippen bij 546 nm in een plaatlezer (Figuur 5). </ Ol>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schema voor inteïne-gemedieerde eiwit hydrogelvorming is weergegeven in figuur 1A. De bouwstenen van de hydrogel zijn de eiwit-copolymeren Cuta NpuN (N) en NpuC-S-Cuta (C) (Figuur 1A, tabel 1). NpuN / C zijn de N-/C-fragments van de natuurlijk splitsen DnaE inteïne uit Nostoc punctiforme (NPU). Cuta is een stabiele trimeric eiwit uit Pyrococcus horikoshii 4,5. Menging van gezuiverde N en C in aanwezigheid van het reductiemiddel DTT induceert de vorming van een derde eiwit - het geligeerde product (J: Cuta-S-Cuta) (Figuren 1A en 1C). Individueel, de hydrogel bouwstenen N en C bestaan als viskeuze vloeistoffen (figuur 1B). Menging van N en C levert een transparante semi-vast materiaal dat op de bodem van een glazen flesje blijft na inversie, indicatief voor de vorming van een hydrogel 15,16 (Figuur 1B) 18,19.
Dit inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel (1,6 mm) vertoont een hoge stabiliteit van de oplossing. Er is weinig tot geen verlies van verknoopte hydrogel scaffold na 21 dagen bij 22 ° C in DPBS buffer, de totale hoeveelheid afgegeven eiwit in de buffer DPBS slechts iets hoger dan de theoretische hoeveelheid van de gesplitste inteïne van de hydrogel (uitgaande van 100 % intein trans-splicing efficiëntie) (Figuur 3A). Densitometrie bleek dat tijdens hydrogelvorming, trans-splicing reacties waren ~ 80% efficiënt (figuur 1C). SDS-PAGE-gel-analyse toonde aan dat slechts sporen van het trans-gesplitste producten in het hydrogel van omringende buffer (Figuur 3B, band J) waren bevestigd dat het verlies van de verknoopte hydrogel scaffold erosie minimaal. De belangrijkste eiwit aanwezig is in omliggende buffer de hydrogel is het gesplitst uit inteïne. Geen zichtbare tekenen van erosie waargenomen bijongestoord hydrogel ondergedompeld in waterige oplossing bij kamertemperatuur gedurende meer dan 3 maanden (Figuur 3A inlaat). De hydrogel is ook zeer stabiel bij 37 ° C (figuur 3C) en met zowel zure en basische buffers (Figuur 3D).
Om eiwitimmobilisatie vergemakkelijken een paar eiwit en het peptide ligand werd gebruikt om eiwitten van belang dok in de hydrogel schavot. We kozen voor de SH3 eiwit, een Src homologie 3 domein van de adapter eiwit CRK, zoals de docking eiwit (DP) voor fusie aan een eiwit van interesse, en zijn ligand (SH3 LIG) als het docking station peptide (DSP) voor inbouw in de hydrogel schavot. Deze interactie pair werd gekozen vanwege de relatief kleine molecuulgrootte (56 bis voor SH3 en 11 aa voor SH3 LIG) en hoge affiniteit (kd = 0,1 uM) 17,18. SH3 lig werd tussen NpuC en Cuta ingebracht om C-SH3 lig vormen(Tabel 1). De SH3 eiwit werd gefuseerd aan de N-terminus van een model-doel globulair eiwit, groen fluorescerend eiwit (GFP) tot SH3-GFP vormen. De in het protocol (hoofdstuk 5, figuur 4A) beschreven werkwijze levert een hydrogel met 1,2 mM trans-gesplitste hydrogel backbone bouwstenen en 1,2 mM GFP. Het GFP-bevattende hydrogel vertoonden een vergelijkbaar stabiliteit aan de hydrogel ontbreekt GFP (Figuur 4B) met ~ 35% totaal eiwit verlies na 21 dagen in DPBS buffer. De meeste in de erosie buffer proteïnen de gesplitste inteins. De uitloging van SH3-GFP uit een hydrogel die het SH3 lig is ~ 30% na 3 weken, aanzienlijk kleiner dan die van een hydrogel zonder het SH3 lig (> 70% eiwitverlies in dezelfde periode, figuur 4C). Het geïmmobiliseerde SH3-GFP in de hydrogel gloeit onder UV-licht. Zoals getoond in figuur 4D, hydrogel die het dokstation Peptide SH3 lig behoudt het grootste deel van de GFP-fluorescentie na 3 weken, terwijl de hydrogel ontbreekt SH3 lig wordt in wezen niet-fluorescerende. Verwacht wordt dat het gebruik van een hogere affiniteit DP / DSP paar de uitloging van het geïmmobiliseerde eiwit verder kunnen verlagen.
In dit experiment werd GFP gebruikt als doelwit eiwit, maar kan elk DP-gelabeld eiwit gemakkelijk worden geïmmobiliseerd in de hydrogel. Aldus zullen inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel algemene matrix voor eiwitimmobilisatie leveren. De dichtheid van geïmmobiliseerde GFP demonstreren dit werk ~ 33 mol% van het hydrogel. Een hogere dichtheid immobilisatie kan mogelijk worden bereikt wanneer meerdere DSP worden opgenomen in de hydrogel bouwsteen.
Vervolgens werd het HRP enzym opgenomen in het eiwit hydrogel zijn vermogen om biokatalyse ondersteunen in organische oplosmiddelen tonen. De enzymactiviteit werd gemeten door het volgen van de oxidatieve koppeling van
_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
Figuur 1. Inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel. (A) Schema van inteïne trans-splicing reactie die de vorming van een verlengd eiwit keten (J) met crosslinker eiwitten aan beide uiteinden triggers. Verknopende proteïnen uit meerdere J eiwitketens covalent associëren en upon intein gemedieerde eiwit ligatie, induceren de vorming van een sterk verknoopte proteïnenetwerk met hydrogel eigenschappen. NpuN / C: inteïne N-/C-fragment. (B) mengen van gezuiverde N en C (8,3% w / v) leidt tot de vorming van een sterk verknoopte hydrogel netwerk (1,6 mM J). (C) SDS-PAGE-analyse van gezuiverde N en C bouwstenen vóór en na het mengen. "N + C" overeen met een monster direct uit een 1,6 mM hydrogel. "*" Duidt een inteïne C-eindstandige splitsing side reactieproduct. Intensiteit van elke band werd gekwantificeerd met behulp van de 'trace module in de "Quantity One"-software. Bandintensiteit werd gedeeld door het eiwit molecuulgewicht de molequivalent. Trans-splicing efficiëntie (~ 80%) werd berekend uit de hoeveelheid product en onomgezette J N / C in dezelfde rijstrook verkrijgen. Overgenomen met toestemming van Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Plasmide kaarten van eiwitconstructen. (A) Cuta-NpuN, (B) NpuC-S-Cuta en (C) SH3-GFP (<strong> Tabel 1) werden gekloond in pET26b vector onder de controle van de T7 promoter. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Stabiliteit van inteïne-gemedieerde eiwit hydrogels in DPBS. (A) Erosie profiel van een 1,6 mM hydrogel bij 22 ° C. Stippellijn geeft de theoretische massa van het gesplitst inteins. De inlaat toont een ongestoorde hydrogel in DPBS na 3 maanden bij kamertemperatuur. (B) SDS-PAGE analyse van omringende buffer hydrogel is. Alle monsters van de buffer waarin de hydrogel werd ondergedompeld in (A) werden samengevoegd (totaal 7,5 ml) en geconcentreerd 75-voudig via ultrafiltratie door een 10 kDeen membraan voorafgaand aan het laden van gel J:. inteïne trans-gesplitst product N:.. gereageerde Cuta-NpuN NpuN: gesplitst uit N-inteïne fragment. Niet gereageerd C en gesplitst uit NpuC niet zichtbaar in de gel als gevolg van de kleine hoeveelheid en klein formaat (4 kDa), respectievelijk. Het sterretje duidt ongeïdentificeerde bands. (C) Erosie profiel hydrogel geïncubeerd bij verschillende temperaturen. (D) Erosie profiel van hydrogelen geïncubeerd bij twee verschillende pH's. Overgenomen met toestemming van Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Inteïne-gemedieerde hydrogel ondersteunt de immobilisatie van functionele globulaire eiwitten. (A) Schematische eiwit immobilisatie met GFP als model globulair eiwit. De DSP-bevattende hydrogel bouwsteen wordt eerst gemengd met DP-gefuseerde doelproteïne voor doelproteïne belading in het bouwblok. De complementaire inteïne-fragment dat hydrogel bouwsteen wordt toegevoegd aan het mengsel waardoor een hydrogel met geïmmobiliseerde GFP. (B) Totaal eiwit erosie profiel van hydrogel met 1:01 molverhouding van SH3-GFP. Stippellijn geeft de theoretische massa van het gesplitste uit inteins. De foutbalken geven de standaarddeviatie van 2 onafhankelijke experimenten. (C) Uitloging profiel van SH3-GFP van hydrogel met en zonder de DSP. (D) Afbeeldingen van GFP bevatten hydrogelen onder UV-belichting onmiddellijk na hydrogel vorming en na 21 dagen. Overgenomen met toestemming van Journal of American Chemical Society (doi:. 10.1021/ja401075s) Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 5. Mierikswortelperoxidase (HRP)-ingesloten inteïne-geactiveerd proteïne hydrogel faciliteert HRP-gekatalyseerde reactie in organisch oplosmiddel n-heptaan. (A) Model reactie gekatalyseerd door HRP in organische oplosmiddelen. (B) Foto van hydrogels die ingekapselde HRP na verstoord in kleine fragmenten en geïncubeerd in een reactie cocktail voor 10 min en 30 min (links) en de controleproef met dezelfde hoeveelheid geïmmobiliseerde HRP in DPBS buffer (rechts). (C) Productvorming werd gevolgd door absorptie bij 546 nm. Aangepast met toestemming van Journal of Amerikan Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Klik hier voor grotere afbeelding.
Tabel 1. Eiwit constructen gebruikt in deze studie.
| Korte naam | Protein Sequence | MW (kDa) |
| Cuta-NpuN (N) | Cuta-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH | 26.3 |
| NpuC-S-Cuta (C) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C UTA- HHHHHH | 26.1 |
| NpuC-S-SH3 lig - Cuta (C-SH3 lig) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-Cuta-HHHHHH | 28.3 |
| SH3-GFP | SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH | 34.5 |
Overgenomen met toestemming van Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).
Tabel 2. Buffer samenstellingen.
| Buffer A | 500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 |
| Buffer DA | 500 mM NaCl, 8 M ureum, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 |
| Buffer B | 500 mM NaCl, 50 mM NaPOi, pH 6,0 |
| DPBS | Dulbecco's PBS, 137,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2PO 4, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4 |
Overgenomen met toestemming van Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk hebben we aangetoond de synthese van een zeer stabiele inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel. Gebruik van een split intein kan de hydrogel voorwaardelijk worden gevormd als reactie op het mengen van twee vloeibare-fasecomponenten. Met name de splitsing intein covalent twee vloeibare fasen bouwstenen via een trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid geflankeerd door verknoping eenheden die weer zelf assembleert een hydrogel. Het mengen geïnduceerde vorming van de hydrogel omzeilt technische moeilijkheden bij de synthese van eendelige eiwit hydrogelen waar-gel gemedieerde verstopping van chromatografische zuivering kolommen voorkomen. Bovendien is de hydrogel vormen onder fysiologische omstandigheden zonder de noodzaak van externe chemische induceerders en / of fysieke triggers.
De intein gemedieerde hydrogel behoudt hoge stabiliteit in zowel zure en basische buffers en bij fysiologische temperatuur. Hydrogels kunnen wi vormenTh slechts 0,8 mM van elk bouwblok (gegevens niet getoond), maar hogere eiwitconcentraties (~ 1,6 mM) opbrengst hydrogels met betere mechanische stabiliteit. De hydrogel hoge stabiliteit wordt toegeschreven aan het gebruik van 1) een zeer stabiele trimere eiwit Cuta als crosslinker, en 2) intein covalent treden verschillende verknopingsmiddelen. Densitometrische analyse van SDS-PAGE gels toonde aan dat ongeveer 80% van de invoer eiwitten succes de split intein gekatalyseerde trans-splicing reactie onderging.
Voor hydrogelvorming, worden individuele bouwstenen eerst geconcentreerd tot ~ 100 mg / ml. Een reductiemiddel, zoals DTT, aanwezig te zijn tijdens de eiwitconcentratie stap naar de vorming van intermoleculaire disulfidebindingen te voorkomen. Aangezien reductiemiddel, kan geconcentreerd afzonderlijke hydrogel bouwsteen vormen soms hydrogel-materiaal. Echter, dit gelachtige materiaal lost snel wanneer ondergedompeld in een buffer en / of in aanwezigheidreductiemiddel.
Een hydrogel met de maximale stabiliteit te verkrijgen, is het belangrijk dat de molaire verhouding van de twee hydrogel bouwstenen 01:01. Een eventueel overschot bouwsteen zal niet worden verknoopt en kan invloed hebben op de hydrogel de mechanische eigenschappen. Geconcentreerde eiwit moet hoeveelheden verdeeld en afzonderlijk opgeslagen herhaalde vries-dooi cycli minimaliseren.
Wij toonden ook het gebruik van het inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel als een organisch oplosmiddel compatibel biokatalysator. Specifiek, hydrogelen waarin het enzym HRP werden ondergedompeld in n-heptaan bevattende substraat en succesvolle omzetting van substraat naar product waargenomen. Het eiwit hydrogel fungeert als een effectieve matrix voor biologische katalyse in organisch oplosmiddel waarschijnlijk te wijten aan de bescherming van organisch oplosmiddel gemedieerd denaturatie aangeboden door de sterk gehydrateerde omgeving van de hydrogel.
Een van de beperkingen van eis enzym immobilisatie technologie is de noodzaak doeleiwit fuseren met een docking peptide (DP). Deze wijziging kan de werking en de oplosbaarheid van sommige doeleiwit beïnvloeden en vereisen dus geval per geval optimalisatie van de DP-gelabeld eiwit constructen. Bovendien, een kleine hoeveelheid gemerkte eiwitten uitgeloogd van het docking station peptide (DSP)-bevattende hydrogel na 1 week. De stabiliteit van het geïmmobiliseerde eiwit wordt beïnvloed door de affiniteit van de DSP / DP paar. Om beter immobilisatie-efficiëntie, een hogere affiniteit DSP / DP paar nodig. Tot slot is deze hydrogel vertoont relatief zwakke mechanische eigenschappen te wijten aan het lage plateau opslagmodulus (100-200 kPa) 9. Het plateau opslagmodulus wordt beïnvloed door de structuur van zowel het verknopingsmiddel en het middenblok 19. In de huidige hydrogel werd een trimeer eiwit gebruikt als verknopingsmiddel. Het gebruik crosslinker eiwit met een hogere multimere toestand kan potentieel verhogen hydrogel plateau stOrage modulus en de mechanische eigenschappen.
Samengevat, melden wij de synthese en karakterisering van een nieuw eiwit hydrogel voorwaardelijk vormt op het mengen van twee vloeibare fasen eiwit bouwstenen, die elk een helft van een gespleten intein. Inteïne-gemedieerde eiwit hydrogels vormen een veelbelovende nieuwe materiaal met potentiële toepassingen in synthetische enzymatische reacties, organische synthese, injecteerbare drug delivery en tissue engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen concurrerende financiële belangen bestaan.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr David Tirrell (Caltech) erkennen voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, dr. Tom Muir (Princeton universiteit) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pET30-Cuta-Tip1 10, en Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pJD757 13 . Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation LOOPBAAN, US Air Force YIP en Norman Hackman Geavanceerde onderzoeksprogramma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs | M0530S |
|
| Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs | C2527I |
|
| Luria Bertani |
VWR | 90003-350 |
|
| Bacto Agar Media |
VWR | ||
Kanamycin sulfate |
VWR | ||
| IPTG |
VWR | EM-5820 |
|
| Imidazole |
VWR | EM-5720 |
|
| Urea |
VWR | EM-9510 |
|
| Dithiothreitol (DTT) |
Fisher | BP172-5 |
|
| Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science | 11836153001 |
|
| DPBS |
VWR | 82020-066 |
|
| Brilliant Blue R |
Acros Organics | A0297990 |
|
| Sodium Azide |
Fisher | AC190380050 |
Caution, highly toxic |
| Horseradish peroxidase |
Sigma | P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher | AC408460250 |
Caution, highly toxic |
| phenol |
Fisher | AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher | AC180340050 |
Caution, highly toxic |
| n-heptane |
Acros Organics | 120340010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker/Incubator |
Fisher Scientific | Max Q 6000 |
|
| Centrifuge |
Sorvall | RC 6 |
|
| Sonicator |
QSonica | Misonix 200 |
|
| Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra | UFC903024 |
|
| Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 |
|
| HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 |
|
| Plate reader |
Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
