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Bioengineering

Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51202
Automatic Translation
1, 1,2
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, College Station, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, Texas A&M Health Science Center, Texas A&M University, College Station

Summary

Wir stellen die Synthese eines Split-Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Copolymeren, die jeweils eine Protein-Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Das Mischen der beiden Protein-Copolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit, die Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist stark pH-und temperaturstabil mit organischen Lösungsmitteln kompatibel sind und leicht integriert funktionellen globulären Proteinen.

Abstract

Wir präsentieren die Synthese eines hochstabilen Protein-Hydrogel von einem Split-Intein-katalysierte Protein Transspleißreaktion vermittelt. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Protein-Blockcopolymere jeweils eine Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Ein stark hydrophiler Zufallsspule in einem der Blockcopolymere für die Wasserrückhaltung eingesetzt. Mischen der beiden Protein-Blockcopolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid mit Vernetzern Einheit an jedem Ende, die schnell Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist sehr stabil unter sauren und basischen Bedingungen bei Temperaturen bis zu 50 ° C, und in organischen Lösungsmitteln. Das Hydrogel rasch Reformen nach scherinduzierten Bruch. Einbau einer "Dockingstation Peptid" in das Hydrogel Baustein ermöglicht die komfortable Einbindung von Tagged-Zielproteine ​​"Docking-Protein".Das Hydrogel wird mit Gewebekulturwachstumsmedium kompatibel ist, unterstützt die Diffusion von 20 kDa Moleküle und ermöglicht die Immobilisierung von bioaktiven globulären Proteinen. Die Anwendung der Intein-vermittelten Protein-Hydrogel nach einem organischem Lösungsmittel kompatibel Biokatalysator wurde durch Einkapseln des Meerrettich-Peroxidase-Enzym und erhärten seine Aktivität nachgewiesen.

Introduction

Hydrogele ganz aus Proteinen tragen das Potenzial, die so unterschiedlichen Bereichen wie Tissue Engineering, Drug Delivery und biofabrication ein deutlich voranzubringen. Sie bieten Vorteile gegenüber herkömmlichen synthetischen Polymer Hydrogele einschließlich Biokompatibilität und das Potenzial, nicht-invasiv unterstützt den Einbau von Kugelstern bioaktiven Proteinen.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Entwicklung einer neuen Protein-Hydrogel über eine Split-Intein-vermittelten Protein Transspleißreaktion und seine Anwendung als ein Protein Immobilisierung Gerüst (1) ausgebildet ist. Die Bausteine ​​für diese Protein-Hydrogel zwei Blockcopolymeren, die jeweils den N-oder C-terminales Fragment eines getrennten Inteins (IN und IC) und einer Untereinheit eines multimeren Proteins Vernetzer. Die DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu) wurde als Splitinteins 2,3 und einem kleinen trimere Protein (12 kDa) CUTA aus Pyrococcus horikoshii <verwendet/ Em> wurde als Vernetzer Protein 4,5 verwendet. Verschiedene Vernetzer werden durch Intein katalysiert Transspleißreaktion verbunden, was zur Bildung eines stark vernetzten Proteinnetzwerk (Hydrogel). Npu Intein wurde wegen seiner schnellen Reaktionskinetik (t 1/2 = 63 sec) und hohe trans-Spleißen Ausbeute (fast 80%) 2,3 gewählt. Die CUTA Protein wurde als Vernetzungsmittel aufgrund seiner hohen Stabilität ausgewählt. CUTA Trimere eine Denaturierungstemperatur in der Nähe von 150 ° C und halten trimeren Quartärstruktur in Lösungen, die bis zu 5 M Guanidin-Hydrochlorid 4,6. Da Wechseleinheit zwischen verschiedenen Vernetzer ist ein wesentlicher Faktor der physischen Hydrogel Oberflächenerosion 7, sollte die sehr starke Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten in CUTA wie Börsen-Untereinheit abhalten, was zu einer stabileren Hydrogel. Einer dieser Bausteine ​​enthält auch eine stark hydrophile Peptid S-Fragment als Mittelblock, um Wasser zu erleichternRetention 8.

Das Mischen der beiden Hydrogel Bausteine ​​initiiert eine trans-Spleißen Reaktion zwischen dem IN-und IC-Intein-Fragmente, wodurch eine längere Polypeptidkette mit Vernetzer in beiden Terminals. Vernetzer aus mehreren solchen Moleküleinheiten miteinander interagieren, wodurch eine hochvernetzte Hydrogel-Netzwerk (1A). Ein spezifisches "Dockingstation Peptid" (DSP) in einem der Hydrogel-Bausteine ​​enthalten, um stabile Immobilisierung einer markierten Target-Protein in das Hydrogel "Docking-Protein" (DP) zu erleichtern. Die Verwendung eines getrennten Inteins zum Hydrogel Anordnung vermitteln stellt nicht nur zusätzliche Flexibilität für die Protein-Hydrogel-Synthese, sondern ermöglicht auch hoher Dichte, gleichmäßige Belastung des Zielproteins während des gesamten Hydrogel, da die Zielproteine ​​vor der Hydrogelbildung geladen.

Die Intein-vermittelten Protein-Hydrogel ist sehr staBLE in wässriger Lösung mit wenig bis gar keinem nachweisbaren Erosion nach 3 Monaten bei Raumtemperatur. Stabilität in einem weiten pH-Bereich (6-10) und Temperaturen (4-50 ° C) gehalten wird, und das Hydrogel auch mit organischen Lösungsmitteln kompatibel. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und Meerrettich-Peroxidase (HRP): Dieses Hydrogel wird zur Immobilisierung von zwei globulären Proteinen verwendet. Hydrogel Einschließen des letzteren Proteins verwendet wird, um die Biokatalyse in einem organischen Lösungsmittel durchzuführen.

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Protocol

1. Plasmid-Bau

HINWEIS: Alle Gene wurden unter Standard-PCR-Reaktionen mit Phusion High-Fidelity DNA Polymerase pro Angaben des Herstellers amplifiziert. Primer für die Klonierung verwendet wurden zuvor 9 beschrieben. Alle Konstrukte sind in Tabelle 1 aufgeführt.

  1. Um CUTA-NpuN (N, Tabelle 1) zu generieren:
    1. PCR verstärken CUTA und NpuN Gene von Plasmiden pET30-CUTA-Tip1 10 und KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, jeweils mit den entsprechenden Primer.
    2. Verdauen diese Fragmente mit den geeigneten Restriktionsenzymen und sequentiell diese Fragmente in den Vektor pET26b zwischen dem T7-Promotor und ein C-terminales Tag 6xHistidine N (2A) zu erzeugen, einzufügen.
  2. Um NpuC-S-CUTA (C, Tabelle 1) zu generieren:
    1. PCR Amplify NpuC, CUTA-und S-Fragmentierungt [AG 3 (PEG)] 10 von Plasmid-KanR IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-CUTA Tip1-10 und AC 10 pQE9 ATRP 12, jeweils mit den entsprechenden Primer.
    2. Digest diese Fragmente mit den entsprechenden Restriktionsenzymen und nacheinander diese Fragmente in den Vektor pET26b zwischen T7-Promotor und einem C-terminalen 6xHistidine zu erzeugen C (2B) einfügen.
  3. : Um NpuC-S-SH 3-Liga CUTA (C-SH3-lig, Tabelle 1) zu erzeugen
    1. PCR Amplify CUTA Verwendung von Primern, die eine SH3 lig (PPPALPPKRRR) und einen flexiblen Linker (GGGGS) 2-Fragment, SH 3-Liga CUTA generieren.
    2. Ersetzen Sie die CUTA Gen aus C mit Fragment SH3-Liga CUTA.
  4. Um SH3-GFP (Tabelle 1) zu generieren:
    1. Erhöhen der SH3-Gen aus dem Plasmid pJD757 13 unter Verwendung dergeeigneten Primer.
    2. Fuse Dieses Fragment auf das GFP-Gen und legen Sie sie in das pET26b Vektor zwischen dem T7-Promotor (2C) und eine C-terminale 6xHistidine-Tag.

2. Protein Expression

  1. Transformation 50 ul chemisch kompetente Escherichia coli BL21 (DE3) mit dem entsprechenden Expressionsplasmid.
  2. Nach der Transformation dieser Zellen seriell verdünnt, und diese Platte auf Luria-Bertani (LB) / Agar-Platten, die 50 ug / ml Kanamycin.
  3. Inkubieren Platten, die transformierten Zellen bei 37 ° C für ~ 15 Stunden.
  4. Nach der Inkubation, wählen Sie eine Platte, die 50 bis 100 Kolonien enthält und resuspendieren alle Kolonien in 5 ml LB-Brühe.
  5. Übertragungs Suspension auf 1 l LB-Medium mit Kanamycin (50 ug / ml) wachsen und Zellen bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 UpM. Überwachung der Absorption bei 600 nm (OD 600). Kultur wachsen, bis OD 600 ~ 0,8.
    1. Für C und C-SH3-Liga induzieren Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu der Kultur (1 mM Endkonzentration) und Inkubieren der Kultur bei 37 ° C für 4 Stunden unter Schütteln bei 250 UpM.
    2. Für N-und SH3-GFP, kühlen die Kultur auf ~ 18 ° C durch Eintauchen des Kulturkolben in einem Eiswasserbad für ~ 5 min. Induzieren Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zur Kultur (1 mM Endkonzentration) und Inkubieren der Kultur bei 18 ° C für 14-18 Stunden unter Schütteln bei 250 UpM.
  6. Nach Proteinexpression Zentrifugation der Kultur bei 6000 × g für 20 min bei 4 ° C, um das Pellet zu sammeln. Speicher Zellpellet bei -80 ° C bis zur Verwendung.

3. Protein Purification

  1. Reinigung von N (denaturierende Bedingungen)
    1. Resuspendieren Zellpellets in Puffer A (Tabelle 2) bei 10 ml / g nasses Pellet.
    2. Immerse die Pellet-Suspension in einem Eis-Wasser-Bad und stören die Zellen durch Ultraschallbehandlung (Amp 10, wobei 1 sec Puls und 6 sec Pause für 1 min).
    3. Zentrifugieren des Lysats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
    4. Überstand verwerfen. Das Pellet in Puffer DA (enthaltend 8 M Harnstoff) und Zentrifugieren der Suspension bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
    5. Die überstehende, durch eine 5 ml Ni-Nitrilotriessigsäure (NTA)-Säule zuvor mit Puffer äquilibriert DA.
    6. Mit 30 ml Puffer DA mit 45 mM Imidazol-Waschkolonne ergänzt. Eluiere gereinigtes Protein mit 20 ml Puffer DA mit 150 mM Imidazol ergänzt.
    7. Verringerung der Harnstoffkonzentration in der Proteinprobe auf <1 mM durch eines der folgenden Verfahren in 3.1.7.1 oder 3.1.7.2 angegeben:
      1. Dialysieren Protein in DPBS-Puffer (Tabelle 2) bei 4 ° C über Nacht unter Verwendung von Hülsen mit <20 kDa Cutoff.
      2. Zentrifuge gereinigtes Protein in einem 30 & #160; kDa Ultrafiltrations Spin-Säule bei 2.800 × g, 4 ° C, bis das Volumen weniger als 1 ml beträgt. In 14 ml DPBS-Puffer auf die Säule, um die Proteinprobe zu verdünnen. Wiederholen Sie die Zentrifugation / Verdünnungsstufen drei weitere Male.
    8. Nach dem Pufferaustausch, fügen Dithiothreitol (DTT), um das gereinigte Protein (final 2 mM) und konzentriert Protein auf ~ 100 mg / ml durch Zentrifugation durch ein 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule bei 2.800 × g, 4 ° C
    9. Aliquot des konzentrierten Protein und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  2. Reinigung von C-und C-SH3 lig (native Zustand)
    1. Resuspendieren Zellpellets in Puffer B (pH 6,0) (Tabelle 2) mit 1x-Protease-Inhibitor-Cocktail, ergänzt mit 10 ml / g nasses Pellet. Verwenden sauren Puffer proteolytischen Abbau des Zielproteins zu minimieren.
    2. Stören Zellsuspension durch Beschallung wie in 3.1.2 beschrieben. Zentrifugieren Sie die lysaß bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C und halten Sie den Überstand.
    3. Übergeben Sie die lösliche Lysat durch eine 5-ml-Ni-NTA-Säule zuvor mit Puffer B äquilibriert
    4. Waschsäule mit Puffer B, ergänzt mit 45 mM Imidazol, eluiert und das Zielprotein in 20 ml Puffer B mit 150 mM Imidazol ergänzt.
    5. Für C, weiter mit Schritt 3.2.6. Für C-SH3-lig, führen Sie eine zusätzliche Ionenaustausch-Reinigungsschritt teilweise abgebauten Protein zu entfernen wie in den Schritten gegeben 3.2.5.1 bis 3.2.5.3
      1. Reduzieren NaCl-Konzentration in C-SH3-lig auf <1 mM nach dem in 3.1.7 beschriebenen Verfahren.
      2. Laden des Zielproteins auf eine 5 ml Anionenaustauscher-Agarose-Perlen Matrixspalte vorher mit Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) äquilibriert.
      3. Eluat Zielproteins von der Säule, indem eine Steigung von einer Lösung, die 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Buffer zu einer Lösung, die den gleichen Puffer mit 1 M NaCl ergänzt. Proben zu entnehmen, während Protein-Elution und Pool-Proben mit der höchsten Reinheit, basierend auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
    6. Puffer des gereinigten Protein austauschen in DPBS-Puffer, wie in 3.1.7 beschrieben.
    7. Hinzufügen DTT zu dem gereinigten Protein (Endkonzentration 2 mM) und konzentriere das Protein auf ~ 100 mg / ml unter Verwendung einer 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule wie in 3.1.8 beschrieben. Aliquot und speichern konzentrierte Protein bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  3. Reinigung von SH3-GFP
    1. Resuspendieren Zellpellets unter Verwendung von Puffer A auf 10 ml / g nasses Pellet.
    2. Stören Pellet-Suspension durch Beschallung wie in 3.1.2 beschrieben.
    3. Zentrifugieren des Lysats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstands.
    4. Führen Sie den Überstand (lösliche Lysat) durch eine 5-ml-Ni-NTA-Säule zuvor mit ins GleichgewichtPuffer A.
    5. Waschen Säule mit 30 ml Puffer A, ergänzt mit 45 mM Imidazol. Eluens Protein unter Verwendung von 20 ml Puffer A, ergänzt mit 150 mM Imidazol.
    6. Pufferaustausch des gereinigten Proteins in DPBS-Puffer mit einem ähnlichen Ansatz wie in 3.1.7 beschrieben, und das Protein zu konzentrieren, um ~ 150 mg / ml unter Verwendung einer 30 kDa Ultrafiltrations Spin-Säule wie in 3.1.8 beschrieben.
    7. Aliquot und speichern gereinigte Protein bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  4. SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proben, die CUTA
    1. Verdünnen jedes gereinigte Protein in doppelt destilliertem Wasser, um die Konzentration von NaCl auf ca. 1 mm zu reduzieren. An dieser NaCl-Konzentration, führen die meisten der CUTA Trimer Proteine ​​als Monomere auf den SDS-PAGE-Gelen.
    2. Mischungsproben mit 2x SDS-Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% Glycerin, 10% w / v SDS, 0,1% w / v Bromphenol blau, 2% β-Mercaptoethanol) bei 95 ° C inkubiert, für 5 min.
    3. Laden Sie das samsätze auf ein 12% SDS-PAGE-Gel. Durchführung der Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 200 V für ~ 50 min.
    4. Beachten Protein in den Gelen durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue R250 nach den Standardprotokollen (Abbildung 1C).

4. Hydrogelierung

HINWEIS: Die Probe Hydrogele in dieser Studie beruhen 1,6 mM jedes Hydrogel Baustein sofern nicht anders angegeben. Diese Proteinkonzentration ergibt ein weiches und stabiles Hydrogel. VORSICHT: Natriumazid (NaN 3) mit dem Hydrogel in einer Endkonzentration von 0,5% w / v zugegeben, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. NaN 3 ist hochgiftig und muss mit äußerster Sorgfalt behandelt, wie im Sicherheitsdatenblatt angegeben werden.

  1. Berechne das Volumen für jede der konzentrierten Proteine ​​benötigt, um eine Endkonzentration von 1,6 mM in einem 100 &mgr; l-Probe Hydrogel zu erreichen. Zum Beispiel:
    Konzentration von N:100 mg / ml
    Molekulargewicht von N: 26,3 kDa (siehe Tabelle 1)
    Wunsch Volumen: 100 ul Wunsch Konzentration: 1,6 mM
  2. Um eine 100 &mgr; l-Hydrogel (1,6 mm) zu machen, mischen C (x &mgr; l, entsprechend 4.1 berechnete Volumen) mit 5% NaN 3 (10 &mgr; l), entsprechend 100 mM DTT (5 &mgr; l) und N (y &mgr; l Volumen berechnet 4.1) in einem 2 ml-Glasfläschchen.
  3. Hinzufügen DPBS-Puffer ((85 - x - y) ul) in das Fläschchen, um ein Endvolumen von 100 &mgr; l zu erreichen, und alle Komponenten über eine Wirbelbewegung mit einer Pipettenspitze von Hand zu mischen. Anmerkung: Die Lösung sehr viskos beim Mischen.
  4. Zentrifugieren der Mischung für 2 min bei 8.000 × g, um die Luftblasen zu entfernen.
  5. Inkubieren der Mischung bei RaumTemperatur über Nacht, damit der Intein-trans-Spleißen Reaktion zum Abschluss zu erreichen. Bestätigen Hydrogelbildung durch Drehen Rohr auf den Kopf. Die Proteine ​​nicht fließen, wenn ein Hydrogel gebildet wird.
  6. Schätzen Sie die Intein-trans-Spleißen Ausbeute, indem Proben (0,5 ul jeweils) vor dem Schritt nach Schritt 4.2 und 4.5 auf einem SDS-PAGE-Gel gesammelt, wie in 3.4 (Abbildung 1C) beschrieben.

5. Immobilisierung von GFP über Docking Protein (DP) und Peptid-Docking Station (DSP) Wechselwirkung

  1. Um eine 50 ul GFP-funktionalisierten Hydrogel (1,2 mm), kombinieren C-SH3 lig (x ul, nach 4.1 berechnet) und SH3-GFP (y ul, nach 4.1 berechnet) bei molaren Verhältnis von 1:1 in einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min.
  2. In 5% NaN 3 (5 ul), 100 mM DTT (2,5 ul), (42.5 - x - <em> y) ul DPBS auf die gleiche Röhre. Add N (y ul, entsprechend 4,1 berechnet) zu einem 1:1-Molverhältnis von N-und C-SH3-Liga erzielen. Die Probe durch mit einer Pipettenspitze von einem Wirbelbewegung.
  3. Zentrifugieren des Gemisches bei 8000 × g für 2 min und Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln. Ein Hydrogel Verkapselung SH3-GFP Formen während der Inkubation.

6. Die Verwendung von 1,6 mM Hydrogel als Gerüst für die Immobilisierung enzymatischen Reaktion in einem organischen Lösungsmittel

  1. Verwenden Sie die HRP als Modell-Enzym. Bereiten Sie eine Stammlösung von HRP (28 mg / ml oder 0,63 mM) in DPBS.
  2. , Um eine 30 &mgr; l-Hydrogel (1,6 mM) Einschließen HRP, kombinieren C (x ul, entsprechend 4,1 berechnet) mit HRP (2 &mgr; l), 5% NaN 3 (3 &mgr; l) und DTT (1,5 ul 100 mM) in einen 1,7 ml-Zentrifugenröhrchen.
  3. In N (y </ Em> ul, nach 4.1 berechnet) und DPBS (23,5 - x - y) ul. Mischen Sie mit einer Pipettenspitze mit einer Wirbelbewegung.
  4. Zentrifugieren des Gemisches bei 8000 × g für 2 min und bei Raumtemperatur über Nacht.
    ACHTUNG: die für die folgenden Aktivitätstest verwendet Regenten sind hochgiftig. Verwenden Sie spezifische Sicherheitsempfehlungen durch die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter.
  5. Für die enzymatische Reaktion, tauchen das Hydrogel in 1 ml Reaktionscocktail, der N, N-Dimethyl-p-Phenylendiamin (5,8 mM), Phenol (5,8 mM) und tert-Butylhydroperoxid (2,9 mM) in n-Heptan 14. Manuelles stören das Gel mit einer Pipettenspitze, um die Kontaktfläche des Hydrogels und das Lösungsmittel zu erhöhen.
  6. Erkennen HRP Produkt, ein Indophenol-Farbstoff, durch Messung der optischen Extinktion der Proben zu verschiedenen Zeiten bei 546 nm in einem Plattenlesegerät (Fig. 5) aufgenommen.
    7. </ Ol>

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Representative Results

Ein Schema für Intein-vermittelten Protein-Hydrogel-Bildung ist in Fig. 1A dargestellt. Die Bausteine ​​des Hydrogels sind die Protein-Copolymere CUTA NpuN (N) und NpuC-S-CUTA (C) (Fig. 1A, Tabelle 1). NpuN / C sind die N-/C-fragments der natürlich aufgeteilt DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu). CUTA ist eine stabile trimere Protein aus Pyrococcus horikoshii 4,5. Mischen von gereinigtem N und C in Gegenwart des Reduktionsmittels DTT induziert die Bildung von einem dritten Protein - das ligierte Produkt (J: CUTA-S-CUTA) (1A und 1C). Einzeln, die Hydrogel-Bausteine ​​N und C vorhanden, wie viskose Flüssigkeiten (Abbildung 1B). Mischen der N-und C ergibt einen transparenten halbfesten Material, das auf dem Boden einer Glasampulle nach Inversion gehalten wird, welches die Bildung eines Hydrogels 15,16 (1B) 18,19.

Diese Intein-vermittelten Protein-Hydrogel (1,6 mm) eine hohe Stabilität der Lösung. Gibt es wenig bis gar keinem Verlust von vernetzten Hydrogels Gerüst nach 21 Tagen bei 22 º C in DPBS-Puffer, wie die Gesamtmenge des Proteins in den DPBS-Puffer freigegeben nur leicht die theoretische Menge des gespleißten Inteins aus dem Hydrogel (bei 100 übersteigt % Intein Transspleißeffizienz) (Abbildung 3A). Densitometrie zeigte, dass während Hydrogelbildung waren Transspleißreaktionen ~ 80% Wirkungsgrad (Abbildung 1C). SDS-PAGE-Gel-Analyse zeigte, daß lediglich Spuren des trans-gespleißten Produkts in das Hydrogel der umgebenden Puffer (3B, Band J) vorhanden waren, was bestätigt, dass der Verlust des vernetzten Hydrogels Gerüst Erosion ist minimal. Das Hauptprotein in Gegenwart des Hydrogels umgebenden Puffer wird das Intein gespleißt aus. Keine sichtbaren Zeichen der Erosion wurden beobachteteine ungestörte Hydrogel in wässriger Lösung bei Raumtemperatur über 3 Monate (3A Einlass) eingetaucht. Das Hydrogel ist auch bei 37 ° C (Fig. 3C) und in sauren und basischen Puffern (3D) sehr stabil.

Um die Immobilisierung von Proteinen erleichtern, wurde ein Paar von Protein und seine Peptid-Liganden verwendet werden, um Proteine ​​von Interesse in das Hydrogel Gerüst andocken. Wir wählten die SH3-Domäne, eine Src-Homologie-Domäne 3 von dem Adapterprotein CRK als Docking-Protein (DP) für die Fusion mit einem Protein von Interesse, und ihre Liganden (SH3 LIG) als Dockingstation Peptid (DSP) für den Einbau in das Hydrogel Schafott. Diese Interaktion Paar wurde wegen der relativ geringen Molekülgröße (56 aa für SH3 und 11 aa für SH3 lig) und eine hohe Affinität (k d = 0,1 uM) 17,18 gewählt. SH3 lig wurde zwischen NpuC und CUTA eingesetzt, um C-SH3 lig bilden(Tabelle 1). Die SH3-Domäne an den N-Terminus eines Zielmodell globulären Proteins, das grün fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert an SH3-GFP bilden. Die in dem Protokoll (§ 5, 4A) beschriebene Verfahren ergibt ein Hydrogel, das 1,2 mM Transspleißprodukte Hydrogel Rückgrat Bausteine ​​und 1,2 mM GFP. Das GFP-enthaltenden Hydrogel zeigten eine ähnliche Stabilität an das Hydrogel fehlt GFP (4B) mit ~ 35% Gesamtproteinverlust nach 21 Tagen in DPBS-Puffer. Die meisten der in der Erosion Puffer vorhandenen Proteine ​​gespalten waren die Inteine. Die Auslaugung Rate von SH3-GFP aus einem Hydrogel, das die SH3-lig ist ~ 30% nach 3 Wochen, deutlich kleiner als die von einem Hydrogel fehlt die SH3 lig (> 70% Proteinverlust in der gleichen Zeit, 4C). Die immobilisierte SH3-GFP in dem Hydrogel leuchtet unter UV-Licht. Wie in 4D, Hydrogel, das die Dockingstation Pepti gesehende SH3 lig behält die meisten der GFP-Fluoreszenz nach 3 Wochen, während das Hydrogel fehlt SH3 lig wird im Wesentlichen nicht-fluoreszierenden. Es wird erwartet, dass die Verwendung einer höheren Affinität DP / DSP-Paar kann ferner die Rate der Laugung des immobilisierten Proteins zu reduzieren.

In diesem Experiment wurde GFP als Zielprotein verwendet, jedoch kann jedes DP-markierte Protein bequem in diesem Hydrogel immobilisiert werden. Somit sollte der Intein-vermittelten Protein-Hydrogel ein allgemeines Gerüst für die Immobilisierung von Proteinen bereitzustellen. Die Dichte der immobilisierten GFP zeigen in dieser Arbeit ist ~ 33 Mol-% des Hydrogels. Eine höhere Dichte der Immobilisierung kann möglicherweise erzielt werden, wenn mehrere DSP in die Hydrogel-Baustein integriert werden.

Als nächstes wurde das HRP-Enzym in das Protein-Hydrogel eingearbeitet, um ihre Fähigkeit zur Biokatalyse in organischen Lösungsmitteln zeigen, unterstützen. Enzymaktivität wurde durch Überwachen der oxidativen Kupplung von Mess N-Dimethyl-p-phenylendiamin und Phenol mit tert-Butylhydroperoxid über die Zeit 14. Die Hypothese war, daß das hydratisierte Umgebung des Hydrogels wird das Enzym aus der beigefügten denaturierende Wirkung des organischen Lösungsmittels zu schützen. Hydrogel, enthaltend 0,042 mM HRP wurde in n-Heptan, enthaltend die Substrate eingetaucht. Nach dem Eintauchen in organischen Lösungsmitteln wurde die HRP-haltigen Hydrogel manuell in kleinen Gruppen aufgebrochen, um die hydrophilen-hydrophoben Grenzbereich (5B) zu erhöhen. Hydrogel eingearbeitet HRP katalysiert wirksam die rasche Oxidation, was zu einem kolorimetrischen Produkts (5C, Dreiecke). Das Produkt Akkumulation folgt eine lineare Steigung, die wenig bis keine Inaktivierung des Enzyms während des Experiments. Die Kontrollreaktion mit HRP direkt in der organischen Reaktions Cocktail aufgelöst ausgestellt vernachlässigbar katalytische Aktivität durch Denaturierung nicht enzym (Daten dargestellt). HRP in DPBS gelöst zunächst durch Zusatz zu dem organischen Lösungsmittel, gefolgt konnte die Umwandlung katalysieren, aber bei einer stark reduzierten Reaktionsgeschwindigkeit (5C, Kreise). Die niedrige Umwandlungsrate von Enzymen in DPBS gelöst ist wahrscheinlich aufgrund der geringen Grenzflächenbereich zwischen dem DPBS und das organische Lösungsmittel, die die Geschwindigkeit der Substrat / Produkt Diffusion begrenzt. Einbau der stark hydrophilen S-Fragment in der Hydrogel-Backbone, die effektiv "Sperren" das Wasser in dem Hydrogel und verhindert, dass das organische Lösungsmittel, das Hydrogel Innenraum zuzugreifen, ermöglicht das Hydrogel die denaturierende Wirkung des organischen Lösungsmittels widerstehen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Intein-vermittelten Protein-Hydrogel kann ein wirksames Gerüst für die enzymatischen Reaktionen in einem organischen Lösungsmittel sein.

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Fig. 1 ist. Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. (A) Schematische Darstellung der Intein Transspleißreaktion, die die Bildung eines erweiterten Proteinkette (J) mit Vernetzer-Proteine ​​an beiden Termini auslöst. Vernetzer Proteine ​​aus mehreren J-Protein-Ketten nicht-kovalent assoziierten und auf Intein-vermittelten Protein-Ligation, induziert die Bildung eines stark vernetzten Proteinnetzwerk mit Hydrogel-Eigenschaften. NpuN / C: Intein N-/C-fragment. (B) Mischen von gereinigtem N und C (8,3% w / v) zur Bildung einer hochvernetzten Hydrogel-Netzwerk (1,6 mM J). (C) SDS-PAGE-Analyse von gereinigtem N-und C-Bausteine ​​vor und nach dem Mischen. "N + C" entspricht einer Probe direkt aus einer 1,6 mM Hydrogel aufgenommen. "*" Bezeichnet eine Intein-C-terminale Spalt side Reaktionsprodukt. Intensität jeder Bande wurde mit der "Trace-Modul in der" Menge One "-Software quantifiziert. Bandenintensität wurde durch das Protein-Molekulargewicht dividiert, um das molare Äquivalent. Transspleißeffizienz (~ 80%) wurde aus der Menge des Produktes J und dem nicht umgesetzten N / C auf der gleichen Fahrspur berechnet zu erhalten. Mit Genehmigung von Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
2. Plasmid-Karten der Proteinkonstrukte. (A) CUTA-NpuN, (B) NpuC-S-kutaner und (C) SH3-GFP (<strong> Tabelle 1) wurden in pET26b-Vektor unter der Kontrolle des T7-Promotors kloniert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 3
3. Stabilität der Intein-vermittelten Protein-Hydrogele in DPBS. (A) Erosionsprofil eines Hydrogel 1,6 mM bei 22 ° C Die gestrichelte Linie stellt die theoretische Masse der Inteine ​​gespalten. Die Einlass zeigt einen ungestörten Hydrogel in DPBS nach 3 Monaten bei Raumtemperatur. (B) SDS-PAGE-Analyse des Hydrogels umgibt Puffer. Alle Proben des Puffers, in dem das Hydrogel wurde in (A) eingetaucht wurden vereinigt (insgesamt 7,5 ml) und 75-fach konzentriert durch Ultrafiltration durch eine 10 kDeine Membran vor dem Gel-Lade J:. Intein Transspleißprodukt N:.. nicht umgesetzten CUTA-NpuN NpuN: aus N-Inteinfragment gespleißt. Nicht umgesetzte C und gespleißt aus NpuC sind nicht sichtbar im Gel aufgrund der geringen Menge und der geringen Größe (4 kDa) auf. Das Sternchen bedeutet nicht identifizierten Bands. (C) Erosionsprofil des Hydrogels bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. (D) Erosionsprofil der Hydrogele bei zwei verschiedenen pH-Werten inkubiert. Mit Genehmigung von Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 4
4. Intein-vermittelte Hydrogel unterstützt die Immobilisierung von funktionellen kugelförmige Proteine. (A) Schematische Darstellung der Immobilisierung von Proteinen mit GFP als Modell globulären Proteins. Der DSP-haltigen Hydrogel Baustein wird zunächst mit DP-fusionierten Zielprotein für Zielprotein Verladen auf dem Baustein gemischt. Die komplementäre Inteinfragment enthaltenden Hydrogel-Baustein zu dem Gemisch ergab ein Hydrogel mit immobilisierten GFP gegeben. (B) Die Gesamtproteinerosionsprofil aus Hydrogel, die 1:1-Molverhältnis von SH3-GFP. Die gestrichelte Linie stellt die theoretische Masse der gespleißten aus Inteine. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 2 unabhängigen Experimenten. (C) Das Auslaugen Profil der SH3-GFP aus Hydrogel mit und ohne DSP. (D) Bilder von GFP enthält Hydrogele unter UV-Belastung unmittelbar nach Hydrogelbildung und nach 21 Tagen. Mit Genehmigung von Journal of American Chemical Society (doi Nachdruck:. 10.1021/ja401075s) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 5
5. Meerrettich-Peroxidase (HRP)-eingeschlossene Intein-Protein-Hydrogel ausgelöst erleichtert HRP-katalysierten Reaktion in einem organischen Lösungsmittel n-Heptan. (A) Model Reaktion von HRP in organischen Lösungsmitteln katalysiert. (B) Fotografie von Hydrogelen, die eingekapselt HRP nachdem sie in kleine Fragmente aufgebrochen und in einem Reaktionscocktail für 10 min und 30 min (links) und Kontrollexperiment mit der gleichen Menge an nicht-immobilisierten HRP in DPBS-Puffer (rechts) inkubiert. (C) Die Produktbildung wurde durch Absorption bei 546 nm überwacht. Mit Genehmigung von Blatt Ameri Angepasstkann Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Tabelle 1. Proteinkonstrukte in dieser Studie verwendet.

Kurzer Name Protein Sequence MW (kDa)
CUTA-NpuN (N) CUTA-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH 26,3
NpuC-S-CUTA (C) NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C Uta-
HHHHHH 		26,1
NpuC-S-SH 3 lig -
CUTA (C-SH3 lig) 		NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS-
PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-CUTA-HHHHHH 		28,3
SH3-GFP SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH 34,5

(: 10.1021/ja401075s doi) mit Genehmigung aus Journal of American Chemical Society.

Tabelle 2. Pufferzusammensetzungen.

Puffer A 500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0
Buffer DA 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0
Puffer B 500 mM NaCl, 50 mM NaPOi, pH 6,0
DPBS Dulbeccos PBS, 137,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH-Wert 7,4

(: 10.1021/ja401075s doi) mit Genehmigung aus Journal of American Chemical Society.

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Discussion

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, die Synthese eines hochstabilen Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Verwendung eines getrennten Inteins ermöglicht das Hydrogel bedingt in Antwort auf das Mischen von zwei Flüssigphasen-Komponenten gebildet werden. Insbesondere die Splitinteins kovalent verbindet zwei Flüssigphasen-Bausteine ​​über eine Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit durch Vernetzung von Einheiten, die wiederum selbst montiert in ein Hydrogel flankiert. Das Mischen induzierte Bildung des Hydrogels umgeht technische Schwierigkeiten bei der Synthese der Einzelkomponenten in dem Gel Hydrogele Protein-vermittelte Verstopfen der chromatographischen Reinigung Spalten auftreten können. Ferner sind die Hydrogel bildet sich unter physiologischen Bedingungen, ohne dass irgendwelche Fremd chemischen Induktoren und / oder physikalischen Auslösern.

Die Intein-vermittelte Hydrogel behält hohe Stabilität sowohl in sauren und basischen Puffer und bei physiologischer Temperatur. Hydrogele können wi bildenth weniger als 0,8 mM eines jeden Bausteins (Daten nicht gezeigt), aber höhere Proteinkonzentrationen (~ 1,6 mm) Ausbeute Hydrogele mit besseren mechanischen Stabilität. Hohe Stabilität des Hydrogels ist die Verwendung von 1) eine sehr stabile trimere Protein, kutaner, als Vernetzer zugeschrieben, und 2) kovalent verbinden Inteins verschiedener Vernetzer. Densitometrische Analyse von SDS-PAGE-Gelen zeigte, daß ca. 80% der eingesetzten Proteine, die getrennten Intein-katalysierte Transspleißreaktion erfolgreich unterzogen.

Zur Bildung von Hydrogelen sind die einzelnen Bausteine ​​zunächst auf ~ 100 mg / ml konzentriert. Ein Reduktionsmittel, wie DTT, muss während der Proteinkonzentrationsschritt vorhanden sein, um die Bildung von intermolekularen Disulfidbindungen zu verhindern. In Abwesenheit von Reduktionsmittel können konzentrierte einzelnen Hydrogel Baustein manchmal Hydrogel artiges Material zu bilden. Jedoch löst dieses gelartige Material schnell, wenn sie in einem Puffer und / oder in Gegenwart tauchtReduktionsmittel.

Bildung eines Hydrogels mit der maximalen Stabilität zu erreichen, ist es wichtig sicherzustellen, dass das molare Verhältnis der beiden Bausteine ​​Hydrogel 1:1. Überschüssiges Baustein nicht vernetzt sein und können die mechanischen Eigenschaften des Hydrogels beeinflussen. Konzentrierte Protein muss aufgeteilt und einzeln gespeichert werden, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu minimieren.

Wir zeigten auch die Verwendung der Intein-vermittelten Protein-Hydrogel nach einem organischem Lösungsmittel kompatibel Biokatalysator. Insbesondere Hydrogele das Enzym bein HRP wurden in n-Heptan eingetaucht, die das Substrat und die erfolgreiche Umwandlung von Substrat zu Produkt beobachtet. Die Protein-Hydrogel dient als Gerüst für effektive Biokatalyse in organischen Lösungsmittel wahrscheinlich auf den Schutz von organischem Lösungsmittel-vermittelte Denaturierung der hochhydratisierten Umgebung des Hydrogels angeboten.

Eine der Einschränkungen der thist Enzymimmobilisierung Technologie ist die Notwendigkeit, die Zielproteins mit einem Docking-Peptid (DP) fixieren. Diese Modifikation kann die Aktivität und Löslichkeit einiger Zielprotein beeinflussen und erfordern daher von Fall zu Fall die Optimierung der DP-markierte Proteinkonstrukte. Zusätzlich wird eine kleine Menge der markierten Proteine ​​aus der Dockingstation Peptid (DSP) enthaltenden Hydrogel nach 1 Woche ausgelaugt. Die Stabilität des immobilisierten Proteins wird durch die Affinität der DSP / DP Paar beeinflusst. Um eine bessere Immobilisierung Effizienz zu erreichen, wird eine höhere Affinität DSP / DP Paar benötigt. Schließlich kann diese Hydrogel Exponate relativ schwache mechanische Eigenschaft aufgrund der niedrigen Plateau Speichermodul (100-200 kPa) 9. Das Plateau-Speichermodul wird durch die Strukturen sowohl des Vernetzungsmittels und dem Mittelblock 19 beeinflußt. Im aktuellen Hydrogel wurde ein Protein-Trimer als Vernetzer verwendet. Die Verwendung von Vernetzer Protein mit einem höheren multimer Zustand kann potenziell erhöhen das Hydrogel Plateau storage Modul und seine mechanischen Eigenschaften.

Zusammenfassend haben wir über die Synthese und Charakterisierung eines neuen Protein-Hydrogel, die bedingt bildet beim Mischen von zwei flüssigen Phasenproteinbausteine, die jeweils eine Hälfte eines getrennten Inteins. Intein-vermittelten Protein-Hydrogele stellen eine vielversprechende neue Material mit möglichen Anwendungen in der synthetischen enzymatischen Reaktionen der organischen Synthese, injizierbaren Medikamentenabgabe und Tissue Engineering.

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Disclosures

Keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Dr. David Tirrell (Caltech) für die freundliche Gabe des Plasmid pQE9 AC 10 ATRP 12, Dr. Tom Muir (Princeton University) für seine freundliche Gabe des Plasmid-KanR IntRBS-NpuNC CFN-11 bestätigen, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) für die freundliche Gabe des Plasmid-pET30 CUTA-Tip1 10, und Dr. D. Jay Keasling (UC Berkley) für die freundliche Gabe des Plasmid pJD757 13 . Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Foundation KARRIERE, US Air Force YIPS und Norman Hackman Advanced Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Phusion High Fidelity DNA polymerase

 New England BioLabs

M0530S

Competent Escherichia coli BL21 (DE3)

 New England BioLabs

C2527I

Luria Bertani

 VWR

90003-350

Bacto Agar Media

 VWR

Kanamycin sulfate

 VWR

IPTG

 VWR

EM-5820

Imidazole

 VWR

EM-5720

Urea

 VWR

EM-9510

Dithiothreitol (DTT)

 Fisher

BP172-5

Protease Inhibitor cocktail

 Roche Applied Science

11836153001

DPBS

 VWR

82020-066

Brilliant Blue R

 Acros Organics

A0297990

Sodium Azide

 Fisher

AC190380050

Caution, highly toxic

Horseradish peroxidase

 Sigma

P8125-5KU

N,N-dimethyl-p-phenylene diamine

 Fisher

AC408460250

Caution, highly toxic

phenol

 Fisher

AC149340500

Caution, highly toxic

tert-butyl hydroperoxide

 Fisher

AC180340050

Caution, highly toxic

n-heptane

 Acros Organics

120340010

Name Company Catalog Number Comments

Shaker/Incubator

 Fisher Scientific

Max Q 6000

Centrifuge

 Sorvall

RC 6

Sonicator

 QSonica

Misonix 200

Ultrafiltration Tubes

 Amicon Ultra

UFC903024

 Ni Sepharose High Performance HisTrap column

 GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column

 GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plate reader

 Molecular Devices

SpectraMax Gemini EM

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References

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Bioengineering Split-Intein Selbstorganisation Scherverdünnung Enzym Immobilisierung organische Synthese
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Ramirez, M. A., Chen, Z. Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel. J. Vis. Exp. (83), e51202, doi:10.3791/51202 (2014).

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