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Bioengineering

Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51202

Summary

Presentiamo la sintesi di un idrogel split-mediata da inteina proteina. Le componenti di questo idrogel sono due copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Miscelazione dei due copolimeri proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide che autoassembla in un idrogel. Questo idrogel è altamente pH e temperatura stabile, compatibile con solventi organici, e facilmente incorpora proteine ​​globulari funzionali.

Abstract

Presentiamo la sintesi di una proteina idrogel altamente stabile mediata da uno split-inteina catalizzata reazione proteina trans-splicing. Le componenti di questo idrogel sono due blocchi copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Una bobina casuale altamente idrofila viene inserito in uno dei blocchi copolimeri per la ritenzione idrica. Miscelazione dei due copolimeri a blocchi proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide con reticolanti alle due estremità che rapidamente auto-assembla in un idrogel. Questo idrogel è molto stabile sia in condizioni acide o basiche, a temperature fino a 50 ° C, e in solventi organici. L'idrogel rapidamente riforme dopo la rottura shear-indotta. Costituzione di una "docking station peptide" in blocco dell'edificio idrogel permette conveniente incorporazione di "aggancio proteina"-tagged proteine ​​bersaglio.L'idrogel è compatibile con mezzi di crescita di coltura tissutale, supporta la diffusione di molecole 20 kDa, e consente l'immobilizzazione di proteine ​​globulari bioattivi. L'applicazione del idrogel proteine ​​mediata da inteina come biocatalizzatore compatibile organico-solvente è stato dimostrato incapsulando l'enzima perossidasi di rafano e corroborare la sua attività.

Introduction

Gli idrogel interamente in proteine ​​portano il potenziale per far avanzare in modo significativo campi diversi come l'ingegneria dei tessuti, somministrazione di farmaci e biofabrication 1. Essi offrono vantaggi rispetto ai tradizionali idrogel polimerici sintetici, tra cui biocompatibilità e la possibilità di sostenere in modo non invasivo l'incorporazione di proteine ​​globulari bioattive.

In questo lavoro, si descrive lo sviluppo di una proteina idrogel romanzo formata tramite split-mediata da inteina reazione proteina trans-splicing e la sua applicazione come impalcatura immobilizzazione di proteine ​​(Figura 1). Gli elementi fondamentali per questo idrogel sono due blocchi copolimeri proteine ​​comprendenti ciascuno il frammento N-o C-terminale di una inteina suddivisa (IN e IC) e una subunità di una proteina multimerica reticolante. Il DnaE inteina da Nostoc punctiforme (Npu) è stato utilizzato come inteina suddivisa 2,3 e una piccola proteina trimeric (12 kDa) Cuta da Pyrococcus horikoshii </ Em> è stato utilizzato come 4,5 proteina reticolante. Diversi reticolanti sono uniti attraverso inteina reazione catalizzata trans-splicing, che porta alla formazione di una rete di proteine ​​altamente reticolato (idrogel). Npu inteina è stato scelto per le sue cinetica di reazione rapida (t 1/2 = 63 sec) e ad alto rendimento trans-splicing (vicino al 80%) 2,3. La proteina Cuta stato scelto come reticolante grazie alla sua elevata stabilità. Trimeri Cuta hanno una temperatura di denaturazione di prossimità 150 ° C e mantenere la struttura quaternaria trimeric in soluzioni contenenti fino al 5 M guanidina cloridrato 4,6. Dal momento che lo scambio tra le diverse subunità crosslinkers è un importante contributo della idrogel fisica superficie di erosione 7, molto forte interazione tra subunità in Cuta dovrebbe scoraggiare tali scambi subunità, portando ad un idrogel più stabile. Uno di questi blocchi contiene anche un peptide altamente idrofilo S-frammento come mid-block per facilitare acquaritenzione 8.

Miscelazione dei due blocchi idrogel inizio a una reazione trans-splicing tra IN e IC inteina frammenti, generando una catena polipeptidica più con reticolanti a entrambi i terminali. Reticolanti da più tali unità molecolari interagiscono tra loro, formando una rete idrogel altamente reticolato (Figura 1A). Una specifica "docking station peptide" (DSP) è incorporato in uno dei blocchi di idrogel per facilitare immobilizzazione stabile di un "aggancio proteina" (DP)-tag proteina bersaglio in idrogel. L'uso di una inteina suddivisa per mediare il montaggio idrogel non solo fornisce una maggiore flessibilità per la sintesi proteica idrogel, ma permette anche ad alta densità, il caricamento uniforme della proteina bersaglio nell'intero idrogel, come le proteine ​​target vengono caricati prima della formazione idrogel.

La proteina idrogel mediata da inteina è altamente stazioneBLE in soluzione acquosa con poco a nessuna erosione rilevabile dopo 3 mesi a temperatura ambiente. La stabilità è mantenuto in una vasta gamma di pH (6-10) e temperature (4-50 ° C), e l'idrogel è anche compatibile con solventi organici. Questo idrogel viene utilizzato per l'immobilizzazione di due proteine ​​globulari: la proteina fluorescente verde (GFP) e la perossidasi di rafano (HRP). Idrogel intrappolare quest'ultima proteina viene utilizzato per eseguire biocatalysis in un solvente organico.

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Protocol

1. Plasmide Costruzioni

NOTA: Tutti i geni sono stati amplificati in reazioni di PCR standard utilizzando Phusion-High Fidelity DNA Polymerase secondo le specifiche del produttore. Primer utilizzati per il clonaggio sono stati descritti in precedenza 9. Tutti i costrutti sono elencati nella Tabella 1.

  1. Per generare Cuta-NpuN (N, Tabella 1):
    1. PCR amplifica Cuta e NpuN geni da plasmidi PET30-Cuta-Tip1 10 e kanr-IntRBS-NpuNC-CFN 11, rispettivamente, utilizzando i primer appropriati.
    2. Digerire questi frammenti con gli appropriati enzimi di restrizione e sequenzialmente inserire questi frammenti nel vettore pET26b tra il promotore T7 e un tag 6xHistidine C-terminale per generare N (Figura 2A).
  2. Per generare NpuC-S-Cuta (C, tabella 1):
    1. PCR amplificare NpuC, Cuta e S frammentazionet [AG 3 (PEG)] 10 dal plasmide kanr-IntRBS-NpuNC-CFN 11, PET30-Cuta-Tip1 10 e pQE9 AC 10 ATRP 12, rispettivamente, utilizzando i primer appropriati.
    2. Digerire questi frammenti con gli appropriati enzimi di restrizione e sequenzialmente inserire questi frammenti nel vettore pET26b tra promotore T7 e un 6xHistidine C-terminale per generare C (Figura 2B).
  3. Per generare NpuC-S-SH3 lig-Cuta (C-SH3 lig, Tabella 1):
    1. PCR Amplificazione Cuta utilizzando primer contenenti un lig SH3 (PPPALPPKRRR) ed un linker flessibile (GGGGS) 2 per generare frammento SH3 lig-Cuta.
    2. Sostituire il gene Cuta da C con frammento SH3 lig-Cuta.
  4. Per generare SH3-GFP (Tabella 1):
    1. Amplificare il gene SH3 dal plasmide pJD757 13 utilizzando ilprimer appropriati.
    2. Fondere questo frammento di gene GFP e inserirlo nel vettore pET26b tra il promotore T7 (Figura 2C) e un tag 6xHistidine C-terminale.

2. Protein Expression

  1. Trasformare 50 ml di chimicamente competenti di Escherichia coli BL21 (DE3) con il plasmide di espressione appropriato.
  2. Dopo la trasformazione, serialmente diluire queste cellule, e piatto su Luria-Bertani (LB) / piastre di agar contenenti 50 ug / ml kanamicina.
  3. Incubare le piastre contenenti cellule trasformate a 37 ° C per ~ 15 ore.
  4. Dopo l'incubazione, scegliere la piastra contenente 50-100 colonie e risospendere tutte le colonie in 5 ml di brodo LB.
  5. Sospensione Trasferimento a 1 L di brodo LB contenente kanamicina (50 mcg / ml) e crescere le cellule a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. Monitorare l'assorbanza a 600 nm (OD 600). Far crescere la cultura fino OD 600 ~ 0.8.
    1. Per C e C-SH3 lig, indurre l'espressione della proteina aggiungendo isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) alla coltura (1 mM concentrazione finale) e incubare la coltura a 37 ° C per 4 ore sotto agitazione a 250 rpm.
    2. Per N e SH3-GFP, raffreddare la cultura a ~ 18 ° C immergendo il pallone di coltura in un bagno di acqua ghiacciata per ~ 5 min. Indurre l'espressione di proteine ​​con l'aggiunta di IPTG alla cultura (concentrazione finale 1 mM) e incubare la coltura a 18 ° C per 14-18 ore agitando a 250 rpm.
  6. Dopo l'espressione della proteina, centrifugare la cultura a 6.000 xg per 20 min a 4 ° C per raccogliere il pellet. Pellet cellulare conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.

3. Protein Purification

  1. Purificazione di N (condizioni denaturanti)
    1. Risospendere pellet cellulari in tampone A (Tabella 2) a 10 ml / g di pellet bagnato.
    2. Immersposta la sospensione pellet in un bagno di ghiaccio-acqua e distruggere le cellule mediante sonicazione (Amp 10, con 1 sec impulso e 6 sec pausa di 1 min).
    3. Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C.
    4. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in Buffer DA (contenente 8 M urea) e centrifugare la sospensione a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C.
    5. Passare il surnatante con una colonna di 5 ml di acido Ni-nitrilotriacetico (NTA) precedentemente equilibrata con tampone DA.
    6. Lavare colonna con 30 ml di tampone DA integrato con imidazolo 45 mM. Eluire proteina purificata utilizzando 20 ml di tampone DA integrato con imidazolo 150 mM.
    7. Ridurre la concentrazione di urea nel campione ad <1 mM da uno tra i seguenti metodi indicati in 3.1.7.1 o 3.1.7.2:
      1. Dializzare proteina in tampone DPBS (Tabella 2) a 4 ° C per una notte usando tubi con <20 kDa cutoff.
      2. Centrifugare purificato proteina in un 30 & #160; kDa ultra-filtrazione centrifuga colonna a 2.800 xg, a 4 ° C fino a quando il volume è inferiore a 1 ml. Aggiungere 14 ml tampone DPBS alla colonna di diluire il campione di proteine. Ripetere la centrifugazione / diluizione passaggi da altre tre volte.
    8. Dopo lo scambio di tamponi, aggiungere ditiotreitolo (DTT) per la proteina purificata (finale 2 mM) e concentrato proteico di ~ 100 mg / ml mediante centrifugazione attraverso un ultra-filtrazione centrifuga colonna 30 kDa a 2800 xg, a 4 ° C.
    9. Aliquotare proteica concentrata e conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.
  2. Purificazione di C e C-SH3 lig (condizione nativo)
    1. Risospendere pellet cellulari in tampone B (pH 6,0) (Tabella 2) supplementato con 1x cocktail di inibitori delle proteasi a 10 ml / g di pellet bagnato. Utilizzare tampone acido a minimizzare la degradazione proteolitica della proteina bersaglio.
    2. Perturbare sospensione cellulare mediante sonicazione come descritto in 3.1.2. Centrifugare del Lysmangiato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C e conservare il surnatante.
    3. Passare il lisato solubile attraverso una colonna 5 ml Ni-NTA precedentemente equilibrata con tampone B.
    4. Lavare colonna con tampone B supplementato con imidazolo 45 mM, ed eluire la proteina bersaglio in 20 ml di tampone B supplementato con imidazolo 150 mM.
    5. Per la C, passare al punto 3.2.6. Per la C-SH3 lig, effettuare una purificazione a scambio ionico ulteriore passo per rimuovere proteine ​​parzialmente degradata come indicato nei punti 3.2.5.1 alla 3.2.5.3
      1. Ridurre la concentrazione di NaCl in C-SH3 lig a <1 mm seguendo la procedura descritta in 3.1.7.
      2. Caricare la proteina bersaglio su un ml scambiatore anionico perline agarosio colonna 5 matrice precedentemente equilibrata con tampone sodio fosfato (50 mM, pH 7,0).
      3. Eluire obiettivo della proteina dalla colonna eseguendo un gradiente da una soluzione contenente 10 mM Tris-HCl pH 8.0 buffer per una soluzione contenente lo stesso tampone supplementato con 1 M NaCl. Prelevare campioni durante proteine ​​eluizione e campioni piscina con la massima purezza basato su sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE).
    6. Buffer scambiare la proteina purificata in tampone DPBS, come descritto in 3.1.7.
    7. Aggiungere DTT alla proteina purificata (concentrazione finale 2 mM) e concentrare la proteina di ~ 100 mg / ml usando un ultra-filtrazione colonnine 30 kDa come descritto in 3.1.8. Aliquotare e conservare concentrate proteine ​​a -80 ° C fino all'utilizzo.
  3. Purificazione di SH3-GFP
    1. Pellet cellulari Risospendere con tampone A a 10 ml / g di pellet bagnato.
    2. Disrupt sospensione pellet mediante ultrasuoni come descritto in 3.1.2.
    3. Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante.
    4. Passare il surnatante (lisato solubile) attraverso una colonna 5 ml Ni-NTA precedentemente equilibrata conBuffer A.
    5. Lavare colonna con 30 ml di tampone A completato con imidazolo 45 mM. Eluire proteina purificata utilizzando 20 ml di tampone A, completata con imidazolo 150 mM.
    6. Buffer scambiare la proteina purificata nel buffer DPBS utilizzando un approccio simile a quello descritto in 3.1.7 e concentrare la proteina di ~ 150 mg / ml utilizzando un ultra-filtrazione colonnine 30 kDa come descritto in 3.1.8.
    7. Aliquotare e deposito proteico purificato a -80 ° C fino all'utilizzo.
  4. SDS-PAGE analisi di campioni purificati contenenti Cuta
    1. Diluire ogni proteina purificata in acqua bidistillata per ridurre la concentrazione di NaCl a ~ 1 mM. A questa concentrazione di NaCl, la maggior parte delle proteine ​​Cuta Trimer gestita come monomeri su gel SDS-PAGE.
    2. Mescolare campioni con tampone campione SDS 2x (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glicerolo, 10% w / v SDS, 0.1% w / v bromo-fenolo blu, 2% β-mercaptoetanolo), incubato a 95 ° C per 5 min.
    3. Caricare il samcipi su un gel SDS-PAGE 12%. Effettuare elettroforesi ad una tensione costante di 200 V per ~ 50 min.
    4. Osservare proteine ​​in gel mediante colorazione con blu brillante Coomassie R250 seguendo i protocolli standard (Figura 1C).

4. Idrogel Formazione

NOTA: i idrogel campione eseguite in questo studio contengono 1,6 mm di ogni blocco di idrogel salvo diversa indicazione. Questa concentrazione proteica produce un idrogel morbida e stabile. ATTENZIONE: Sodio azide (NaN 3) è aggiunto l'idrogel ad una concentrazione finale di 0,5% w / v per prevenire la contaminazione batterica. NaN 3 è altamente tossico e deve essere maneggiata con estrema cura, come indicato nella scheda di dati di sicurezza del materiale.

  1. Calcolare il volume per ciascuna delle proteine ​​concentrate necessari per ottenere una concentrazione finale di 1,6 mM in un idrogel campione 100 microlitri. Per esempio:
    Concentrazione di N:100 mg / ml
    Peso molecolare di N: 26.3 kDa (vedi Tabella 1)
    Concentrazione 100 microlitri desiderata:: volume desiderato 1,6 mm
  2. Per effettuare una microlitri idrogel 100 (1,6 mM), mescolare C (x ml, volume calcolato secondo 4.1) con 5% NaN 3 (10 ml), DTT 100 mM (5 ml) e N (y microlitri, volume calcolato secondo 4.1) in una fiala di vetro da 2 ml.
  3. Aggiungi il tampone di DPBS ((85 - x - y) microlitri) per flaconcino per ottenere un volume finale di 100 ml e mescolare manualmente tutti i componenti attraverso un movimento rotatorio con un puntale. Nota: La soluzione diventa molto viscoso con la miscelazione.
  4. Centrifugare la miscela per 2 minuti a 8000 xg per rimuovere le bolle d'aria.
  5. Incubare la miscela a temperatura ambientetemperatura durante la notte per permettere la reazione inteina trans-splicing per raggiungere il completamento. Confermare la formazione di idrogel girando il tubo a testa in giù. Le proteine ​​non affluiranno se si forma un idrogel.
  6. Stima della resa inteina trans-splicing controllando campioni (0,5 microlitri ciascuno) raccolti prima fase 4.2 e 4.5 dopo passo su un gel SDS-PAGE, come descritto in 3.4 (Figura 1C).

5. Immobilizzazione della GFP via Docking Protein (DP) e Docking Station Peptide (DSP) Interazione

  1. Per fare un 50 microlitri GFP-funzionalizzato idrogel (1,2 mM), combinare C-SH3 lig (x microlitri, calcolato secondo 4.1) e SH3-GFP (y microlitri, calcolato secondo 4.1) in rapporto molare 1:1 in 1.7 ml provetta e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Aggiungere 5% NaN 3 (5 ml), DTT 100 mm (2,5 ml), (42.5 - x - <em> y) DPBS microlitri allo stesso tubo. Aggiungere N (y microlitri, calcolato secondo 4.1) per ottenere un rapporto 1:1 molare di N e C-SH3 lig. Mescolare il campione utilizzando un puntale da un moto vorticoso.
  3. Centrifugare la miscela a 8.000 xg per 2 minuti e incubare la miscela a temperatura ambiente per una notte al buio. Un idrogel incapsulando forme SH3-GFP durante l'incubazione.

6. L'uso di 1.6 Hydrogel mM come impalcatura immobilizzazione per reazione enzimatica in solvente organico

  1. Utilizzare l'HRP come modello enzima. Preparare una soluzione stock di HRP (28 mg / ml o 0,63 mm) a DPBS.
  2. Per effettuare una microlitri idrogel 30 (1.6 mM) entrapping HRP, unire C (x microlitri, calcolato secondo 4.1) con HRP (2 ml), 5% NaN 3 (3 ml) e DTT (1,5 ml di 100 mM) all'interno di un 1,7 ml provetta da centrifuga.
  3. Aggiungi N (y </ Em> microlitri, calcolato secondo 4.1) e DPBS (23.5 - x - y) microlitri. Mescolare con un puntale con un movimento vorticoso.
  4. Centrifugare la miscela a 8.000 xg per 2 minuti e incubare a temperatura ambiente per una notte.
    ATTENZIONE: i reggenti utilizzati per il seguente saggio di attività sono altamente tossici. Utilizzare raccomandazioni di sicurezza specifiche per le corrispondenti Schede Dati di Sicurezza.
  5. Per reazione enzimatica, immergere l'idrogel in 1 ml di cocktail di reazione contenenti N, diammina N-dimetil-p-fenilene (5,8 mM), fenolo (5,8 mM) e tert-butil idroperossido (2,9 mM) in n-eptano 14. Interrompere manualmente il gel utilizzando un puntale per aumentare la superficie di contatto di idrogel e il solvente.
  6. Controllo prodotto HRP, un indofenolo tipo dye, misurando l'assorbanza ottica di campioni prelevati in tempi diversi a 546 nm in un lettore di piastre (Figura 5).
  7. </ Ol>

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Representative Results

Uno schema per mediata da inteina formazione proteica idrogel è presentato nella Figura 1A. Gli elementi costitutivi del idrogel sono la proteina copolimeri Cuta-NpuN (N) e NpuC-S-Cuta (C) (Figura 1A, Tabella 1). NpuN / C sono i N-/C-fragments del DnaE naturalmente inteina suddivisa da Nostoc punctiforme (Npu). Cuta è una proteina trimeric stabile da Pyrococcus horikoshii 4,5. Miscelazione di purificato N e C in presenza dell'agente riducente DTT induce la formazione di una terza proteina - il prodotto ligato (J: Cuta-S-cuta) (Figure 1A e 1C). Individualmente, i mattoni idrogel N e C esistono fluidi viscosi come (Figura 1B). Miscelazione di N e C produce un materiale semi-solido trasparente che viene mantenuta sul fondo di una fiala di vetro dopo inversione, indicativa della formazione di un idrogel 15,16 (Figura 1B) 18,19.

Questo idrogel proteina mediata da inteina (1.6 mM) presenta una elevata stabilità della soluzione. C'è poco da nessuna perdita di reticolato idrogel scaffold dopo 21 giorni a 22 ° C in tampone DPBS, come la quantità totale di proteina rilasciata nel buffer DPBS supera di poco la quantità teorica del impiombato inteina dal idrogel (supponendo 100 % inteina efficienza trans-splicing) (Figura 3A). Densitometria ha rivelato che, durante la formazione di idrogel, reazioni trans-splicing sono ~ 80% di efficienza (Figura 1C). SDS-PAGE analisi gel mostrato che solo tracce di prodotto trans-impiombato erano presenti in tampone circostante del idrogel (figura 3B, gruppo J), confermando che la perdita di idrogel patibolo reticolato all'erosione è minima. La principale proteina presente nel tampone che circonda l'idrogel è il impiombato fuori inteina. Segni visibili di erosione sono stati osservati inun idrogel indisturbato immerso in soluzione acquosa a temperatura ambiente per oltre 3 mesi (Figura 3A ingresso). L'idrogel è anche altamente stabile a 37 ° C (Figura 3C), in entrambi i buffer acide e di base (Figura 3D).

Per facilitare immobilizzazione di proteine, una coppia di proteine ​​e il suo ligando peptidico è stato usato per ancorare proteine ​​di interesse nella scaffold idrogel. Abbiamo scelto la proteina SH3, un dominio Src di omologia 3 dal CRK proteina adattatore, come docking proteina (DP) per la fusione di una proteina di interesse, e il suo ligando (SH3 lig) come il peptide docking station (DSP) per incorporazione in l'impalcatura idrogel. Questa coppia interazione è stato scelto per la dimensione molecolare relativamente piccolo (56 aa per SH3 e 11 aa per SH3 lig) e alta affinità (K d = 0,1 mM) 17,18. SH3 lig è stato inserito tra NpuC e Cuta per formare C-SH3 lig(Tabella 1). La proteina SH3 stata fusa all'N-terminale di una proteina globulare modello target, proteina fluorescente verde (GFP) per formare SH3-GFP. Il processo descritto nel protocollo (sezione 5, figura 4A) produce un idrogel contenente 1,2 mm trans-splicing blocchi dorsali idrogel e 1.2 GFP mm. L'idrogel-GFP contenenti mostrato una stabilità simile a idrogel privo GFP (Figura 4B) con ~ 35% di perdita totale di proteine ​​dopo 21 giorni in tampone DPBS. La maggior parte delle proteine ​​presenti nel buffer erosione erano i inteine ​​clivati. Il tasso di lisciviazione SH3-GFP da un idrogel contenente la lig SH3 è ~ 30% dopo 3 settimane, significativamente inferiore a quella di un idrogel manca il lig SH3 (> 70% perdita di proteine ​​nello stesso periodo di tempo, Figura 4C). Il SH3-GFP immobilizzato in idrogel si illumina sotto la luce UV. Come si vede nella Figura 4D, idrogel contenente stazione Pepti agganciode SH3 lig conserva la maggior parte della fluorescenza GFP dopo 3 settimane mentre l'idrogel manca SH3 lig diventa essenzialmente non fluorescente. Si prevede che l'uso di una affinità DP / pair DSP superiore può ridurre ulteriormente il tasso di lisciviazione della proteina immobilizzata.

In questo esperimento, GFP è stata usata come proteina bersaglio, tuttavia, qualsiasi proteina DP-tag può essere comodamente immobilizzato in questo idrogel. Così, l'idrogel proteine ​​mediata da inteina dovrebbe fornire un'impalcatura generale per immobilizzazione di proteine. La densità di GFP immobilizzato dimostrano in questo lavoro è ~ 33% molare del idrogel. Una densità immobilizzazione superiore può potenzialmente essere raggiunto quando DSP multipli sono incorporati nel blocco dell'edificio idrogel.

Successivamente, l'enzima HRP è stato incorporato nel idrogel proteina di dimostrare la sua capacità di supportare biocatalysis in solventi organici. L'attività enzimatica è stata misurata monitorando l'accoppiamento ossidativo dei N-dimetil-p-fenilendiammina e fenolo con tert-butil idroperossido nel tempo 14. L'ipotesi è che l'ambiente idratato dell'idrogel proteggerà l'enzima divisoria dall'effetto denaturazione del solvente organico. Idrogel contenente 0,042 mM HRP è stato immerso in n-eptano contenente i substrati. Dopo l'immersione in solvente organico, l'idrogel contenente HRP-stato interrotto manualmente in piccoli cluster per aumentare l'area di interfaccia idrofilo-idrofobo (Figura 5B). Idrogel incorporato HRP efficacemente catalizzata reazione rapida ossidazione, dando origine ad un prodotto colorimetrico (Figura 5C, triangoli). L'accumulo prodotto segue una pendenza lineare, indicando scarsa a nessuna inattivazione enzimatica durante l'esperimento. La reazione di controllo con HRP disciolto direttamente nel cocktail reazione organica esibito attività catalitica trascurabile dovuta alla denaturazione di enzimi (dati non mostrato). HRP disciolto in DPBS prima seguita da aggiunta al solvente organico è stato in grado di catalizzare la conversione ma ad una velocità di reazione molto ridotto (Figura 5C, cerchi). Il tasso di conversione basso di enzimi disciolti in DPBS è probabilmente dovuto alla piccola area interfacciale tra il DPBS e il solvente organico, che limita la velocità di diffusione substrato / prodotto. Incorporazione del frammento S altamente idrofilo nel backbone idrogel, che blocca efficacemente '' L'acqua all'interno della idrogel e impedisce il solvente organico per accedere al idrogel interno, consente l'idrogel di resistere agli effetti denaturazione del solvente organico. Questi risultati indicano che l'idrogel proteina mediata da inteina può essere una impalcatura efficace per reazioni enzimatiche in solvente organico.

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Figura 1. Mediata da inteina idrogel proteina. (A) Schema di inteina reazione di trans-splicing che determina la formazione di una catena proteica estesa (J) con le proteine ​​reticolanti sia a termini. Proteine ​​reticolante da più catene proteiche J non covalente associato e, su mediata da inteina proteina legatura, inducono la formazione di una rete proteina altamente reticolato con proprietà idrogel. NpuN / C: intein N-/C-fragment. (B) Miscelazione purificato N e C (8,3% w / v) porta alla formazione di una rete idrogel altamente reticolato (J 1.6 mM). Analisi (C) SDS-PAGE di purificati N e C blocchi prima e dopo la miscelazione. "N + C" corrisponde ad un campione prelevato direttamente da un idrogel 1,6 mM. "*" Indica una inteina C-terminale clivaggio SIprodotto di reazione de. Intensità di ciascuna banda è stato quantificato utilizzando il 'modulo traccia nel software "Quantity One". Intensità della banda è stato diviso per il peso molecolare della proteina per ottenere l'equivalente molare. Efficienza Trans-splicing (~ 80%) è stata calcolata dalla quantità di prodotto J e il non reagito N / C nella stessa corsia. Ristampato con il permesso dal Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Mappe plasmidi di costrutti proteici. (A) Cuta-NpuN, (B) NpuC-S-Cuta e (C) SH3-GFP (<strong> Tabella 1) sono stati clonati nel vettore pET26b sotto il controllo del promotore T7. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Stabilità di idrogel proteine ​​mediata da inteina in DPBS. (A) profilo erosione di un idrogel 1,6 mM a 22 ° C. La linea tratteggiata rappresenta la massa teorica dei inteine ​​spaccati. L'ingresso mostra un idrogel indisturbato in DPBS dopo 3 mesi a temperatura ambiente. (B) analisi SDS-PAGE di tampone circostante di idrogel. Tutti i campioni del buffer in cui l'idrogel è stato immerso in (A) sono stati riuniti (totale 7,5 ml) e concentrati 75 volte mediante ultrafiltrazione a 10 kDuna membrana prima del caricamento del gel J:. inteina prodotto trans-impiombato N:.. reagito Cuta-NpuN NpuN: impiombato su frammento N-intein. Reagito C e assemblati su NpuC non sono visibili nel gel a causa della piccola quantità e dimensioni ridotte (4 kDa), rispettivamente. L'asterisco indica le bande non identificati. (C) profilo Erosione di idrogel incubate a temperature diverse. (D) profilo erosione degli idrogel incubate a due pH diversi. Ristampato con il permesso dal Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4
Figura 4. Inteinaidrogel mediata supporta l'immobilizzazione di proteine ​​globulari funzionali. (A) Schema di immobilizzazione di proteine ​​usando GFP come una proteina globulare modello. Il building block idrogel-DSP che contiene viene prima mescolato con DP-fuso proteina bersaglio per le proteine ​​bersaglio il carico sul blocco dell'edificio. Il complementare inteina building block idrogel-frammento contenente è aggiunto alla miscela ottenendo un idrogel con GFP immobilizzato. (B) profilo proteico erosione totale di idrogel contenente rapporto 1:1 molare di SH3-GFP. La linea tratteggiata rappresenta la massa teorica dei inteine ​​giuntate fuori. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di 2 esperimenti indipendenti. (C) La lisciviazione profilo di SH3-GFP idrogel con e senza il DSP. (D) Le immagini delle GFP contenenti idrogel sotto l'esposizione ai raggi UV subito dopo la formazione di idrogel e dopo 21 giorni. Ristampato con il permesso dal Journal of American Chemical Society (doi:. 10.1021/ja401075s) clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 5
Figura 5. Perossidasi di rafano (HRP) intrappolato idrogel proteina inteina innescata facilita reazione HRP-catalizzata in solvente organico n-eptano. (A) Modello reazione catalizzata dalla HRP in solventi organici. (B) fotografico idrogel contenenti HRP incapsulato dopo l'interruzione del flusso in piccoli frammenti e incubate in un cocktail di reazione per 10 min e 30 min (a sinistra) e esperimento di controllo con la stessa quantità di HRP nonimmobilized in tampone DPBS (destra). (C) la formazione del prodotto è stata monitorata mediante assorbimento a 546 nm. Adattato con il permesso ufficiale Ameripuò Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Tabella 1. Costrutti proteici usate in questo studio.

Nome breve Protein Sequence MW (kDa)
Cuta-NpuN (N) Cuta-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH 26.3
NpuC-S-Cuta (C) NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C utA-
HHHHHH
26.1
NpuC-S-SH3 lig -
Cuta (C-SH3 lig)
NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS-
PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-Cuta-HHHHHH
28.3
SH3-GFP SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH 34.5

Ristampato con il permesso dal Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

Tabella 2. Composizioni tampone.

Tampone A NaCl 500 mM, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0
Buffer DA NaCl 500 mM, 8 M urea, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0
Buffer B NaCl 500 mM, 50 NaPOi mM, pH 6.0
DPBS Dulbecco PBS, 137,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8.1 mM Na 2 HPO 4, pH 7.4

Ristampato con il permesso dal Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

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Discussion

In questo lavoro, abbiamo dimostrato la sintesi di un altamente stabile mediata da inteina idrogel proteina. L'uso di una scissione consente inteina l'idrogel essere condizionale formata in risposta alla miscelazione dei due componenti in fase liquida. In particolare, la scissione collega inteina covalentemente due blocchi in fase liquida tramite una reazione di trans-splicing, producendo una unità polipeptide fiancheggiato da reticolazione unità che a sua volta sé ​​assembla in un idrogel. La formazione miscelazione indotta dell'idrogel bypassa difficoltà tecniche di sintesi di singolo componente proteica idrogel cui può verificarsi gel-mediata intasamento colonne purificazione cromatografica. Inoltre, le forme di idrogel in condizioni fisiologiche, senza la necessità di induttori chimici estranei e / o trigger fisici.

L'idrogel mediata da inteina mantiene elevata stabilità nei buffer sia acidi e basici, ed a temperatura fisiologica. Gli idrogel possono formare with appena 0,8 mM di ogni blocco individuali (dati non mostrati), ma concentrazioni più elevate di proteine ​​(~ 1,6 mM) idrogel con rendimento migliore stabilità meccanica. Alta stabilità del idrogel è dovuta all'uso di 1) una proteina trimeric molto stabile, Cuta, come reticolante, e 2) inteina aderire covalentemente diversi reticolanti. Analisi densitometrica dei gel SDS-PAGE ha mostrato che ~ 80% delle proteine ​​ingresso subito con successo l'inteina suddivisa catalizzata reazione trans-splicing.

Per la formazione di idrogel, blocchi individuali vengono prima concentrate a ~ 100 mg / ml. Un agente riducente, come DTT, deve essere presente durante la fase di concentrazione di proteine ​​per prevenire la formazione di legami disolfuro intermolecolari. In assenza di agente riducente, building block idrogel individuo concentrato volte può formare idrogel simile. Tuttavia, questo materiale simile a gel discioglie rapidamente quando immerso in un tampone e / o in presenzadi agente riducente.

Per ottenere un idrogel con la massima stabilità, è importante garantire che il rapporto molare dei due blocchi idrogel è 1:1. Qualsiasi elemento in eccesso non sarà reticolato e può influenzare le proprietà meccaniche del idrogel. Concentrato di proteine ​​deve essere aliquotare e conservare singolarmente per ridurre al minimo ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.

Abbiamo dimostrato l'uso della proteina idrogel mediata da inteina come biocatalizzatore compatibile con solventi organici. In particolare, è stato osservato idrogel contenenti l'enzima HRP sono stati immersi in n-eptano contenente il substrato e la conversione di successo di substrato al prodotto. L'idrogel proteina funge da impalcatura efficace per biocatalisi in solvente organico probabilmente dovuto alla protezione da denaturazione biologica-solvente-mediata offerto dall'ambiente altamente idratati del idrogel.

Uno dei limiti di thè la tecnologia immobilizzazione dell'enzima è la necessità di fondere proteina bersaglio con un aggancio peptide (DP). Questa modifica può influenzare l'attività e la solubilità di alcune proteine ​​bersaglio e quindi richiedono l'ottimizzazione caso per caso dei costrutti proteici DP-taggate. Inoltre, una piccola quantità di proteine ​​marcate colato fuori del peptide docking station (DSP) contenenti idrogel dopo 1 settimana. La stabilità della proteina immobilizzata è influenzato dalla affinità della coppia DSP / DP. Per ottenere una migliore efficienza immobilizzazione, sarà necessaria una affinità DSP / DP coppia più alta. Infine, questo espone idrogel relativamente deboli proprietà meccaniche dovute al modulo di memorizzazione a bassa plateau (100-200 kPa) 9. Il modulo di accumulo plateau è influenzata dalle strutture sia del reticolante e il midblock 19. Nel idrogel corrente, una proteina trimero è stato utilizzato come reticolante. L'uso di proteine ​​reticolante con uno stato multimerico superiore può potenzialmente aumentare l'altopiano idrogel storage modulo e la sua struttura meccanica.

In sintesi, riportiamo la sintesi e la caratterizzazione di una nuova proteina che forma idrogel condizionalmente sulla miscelazione di due blocchi di proteine ​​in fase liquida, contenenti ciascuna una metà di una inteina suddivisa. Idrogel proteina mediata da inteina rappresentano un nuovo materiale promettente con potenziali applicazioni in reazioni di sintesi enzimatiche, sintesi organica, la somministrazione di farmaci iniettabili e ingegneria dei tessuti.

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Disclosures

Non esistono interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. David Tirrell (Caltech) per la sua gentile dono del plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, il Dr. Tom Muir (Princeton University) per la sua gentile dono del plasmide kanr-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Giappone) per la sua gentile dono del plasmide PET30-Cuta-Tip1 10, e il Dr. Jay D. Keasling (UC Berkley) per la sua gentile dono del plasmide pJD757 13 . Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation CARRIERA, US Air Force YIP e Norman Hackman Programma di ricerca avanzata.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Phusion High Fidelity DNA polymerase

New England BioLabs

M0530S

Competent Escherichia coli BL21 (DE3)

New England BioLabs

C2527I

Luria Bertani

VWR

90003-350

Bacto Agar Media

VWR

Kanamycin sulfate

VWR

IPTG

VWR

EM-5820

Imidazole

VWR

EM-5720

Urea

VWR

EM-9510

Dithiothreitol (DTT)

Fisher

BP172-5

Protease Inhibitor cocktail

Roche Applied Science

11836153001

DPBS

VWR

82020-066

Brilliant Blue R

Acros Organics

A0297990

Sodium Azide

Fisher

AC190380050

Caution, highly toxic

Horseradish peroxidase

Sigma

P8125-5KU

N,N-dimethyl-p-phenylene diamine

Fisher

AC408460250

Caution, highly toxic

phenol

Fisher

AC149340500

Caution, highly toxic

tert-butyl hydroperoxide

Fisher

AC180340050

Caution, highly toxic

n-heptane

Acros Organics

120340010

Name Company Catalog Number Comments

Shaker/Incubator

Fisher Scientific

Max Q 6000

Centrifuge

Sorvall

RC 6

Sonicator

QSonica

Misonix 200

Ultrafiltration Tubes

Amicon Ultra

UFC903024

 Ni Sepharose High Performance HisTrap column

GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column

GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plate reader

Molecular Devices

SpectraMax Gemini EM

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References

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Bioingegneria Numero 83 split-inteina auto-assemblaggio shear-assottigliamento enzimi immobilizzazione sintesi organica
Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel
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Ramirez, M. A., Chen, Z. Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel. J. Vis. Exp. (83), e51202, doi:10.3791/51202 (2014).

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