Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Syntes av ett intein medierad Artificiell Protein Hydrogel

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51202

Summary

Vi presenterar syntesen av en split-intein-medierad protein hydrogel. Byggstenarna i denna hydrogel är två protein sampolymerer vardera innehållande en subenhet av en trimer protein som fungerar som ett tvärbindningsmedel och en halv av ett delat intein. Blandning av de två protein sampolymerer utlöser ett intein transsplitsreaktionen, vilket ger en polypeptid-enhet som själv monterar in i en hydrogel. Denna hydrogel är starkt pH-och temperaturstabila, kompatibla med organiska lösningsmedel och lätt inkorporerar funktionella globulära proteiner.

Abstract

Vi presenterar syntes av en mycket stabil protein hydrogel förmedlas av en split-intein-katalyserad protein transsplitsreaktion. Byggstenarna i denna hydrogel är två protein segmentsampolymerer vardera innehållande en subenhet av en trimer protein som fungerar som ett tvärbindningsmedel och en halv av ett delat intein. En starkt hydrofil slumpmässig spole är införd i en av de block-sampolymerer för vätskeansamling. Blandning av de två protein segmentsampolymerer utlöser ett intein transsplitsreaktionen, vilket ger en polypeptid enhet med tvärbindningsmedel vid varje ände som snabbt själv monterar in i en hydrogel. Denna hydrogel är mycket stabil under både sura och basiska förhållanden, vid temperaturer upp till 50 ° C, och i organiska lösningsmedel. Den hydrogel snabbt reformer efter skjuvning-inducerad bristning. Införande av en "dockningsstation peptid" i hydrogel byggsten möjliggör bekväm inkorporering av "dockningsprotein"-märkta målproteiner.Hydrogelen är kompatibelt med vävnadsodlingstillväxtmedium, stödjer diffusionen av 20 kDa molekyler och möjliggör immobilisering av bioaktiva globulära proteiner. Tillämpningen av det införmedlade protein hydrogel som ett organiskt lösningsmedel som passar biokatalysator demonstrerades genom inkapsling av pepparrotsperoxidas-enzym och bekräftande dess aktivitet.

Introduction

Hydrogeler helt i proteiner bär potential att avsevärt avancera så skilda områden som vävnadsteknik, drug delivery och biofabrication 1. De erbjuder fördelar jämfört med traditionella syntetiska polymer hydrogel inklusive biokompatibilitet och potential att noninvasively stödja införlivandet av bioaktiva klotformiga proteiner.

I detta arbete beskriver vi utvecklingen av ett nytt protein hydrogel som bildas via en split-intein-medierad protein transsplitsreaktionen och dess tillämpning som ett protein immobilisering byggnadsställning (figur 1). Byggstenarna för denna hydrogel är två protein segmentsampolymerer vardera innefattande den N-eller C-terminalt fragment av ett delat intein (IN och IC) och en underenhet av ett multimert tvärbindningsprotein. Den DnaE intein från Nostoc punctiforme (NPU) användes som den delat intein 2,3 och en liten trimer-proteinet (12 kDa) CutA från Pyrococcus horikoshii </ Em> användes som tvärbindningsprotein 4,5. Olika tvärbindningsmedel är förenade genom intein katalyserad transsplitsreaktionen, vilket leder till bildandet av en högt tvärbundet proteinnätverk (hydrogel). NPU intein valdes på grund av dess snabba reaktionskinetik (t 1/2 = 63 sek) och hög trans-splits avkastning (nära 80%) 2,3. Den CutA proteinet valdes som tvärbindare grund av dess höga stabilitet. CutA trimerer ha en denatureringstemperatur av nära 150 ° C och behålla trimera kvaternär struktur i lösningar innehållande så mycket som 5 M guanidinhydroklorid 4,6. Eftersom subenhet utbyte mellan olika tvärbindnings är en viktig bidragsgivare i den fysiska hydrogel yterosion 7, bör den mycket starka bland subenheten interaktion i CutA avskräcka sådana subenheten börser, vilket leder till en mer stabil hydrogel. En av dessa byggstenar innehåller också en starkt hydrofil peptid S-fragment som mitten av blocket för att underlätta vattenretentionstid 8.

Blandning av två hydrogel byggblock initierar en transsplitsreaktionen mellan IN och IC intein fragment, generera en längre polypeptidkedja med tvärbindningsmedel vid båda terminalerna. Tvärbindningsmedel från flera sådana molekylära enheter interagerar med varandra, bildar en mycket tvärbunden hydrogel nätverk (Figur 1A). En specifik "dockningsstation peptid" (DSP) är inkorporerad i en av de hydrogel byggstenar för att underlätta stabil immobilisering av en "dockningsprotein" (DP)-märkt målproteinet i hydrogelen. Användningen av ett delat intein mediera hydrogelen aggregatet inte bara ger ytterligare flexibilitet med avseende på protein hydrogel syntes, utan möjliggör även hög densitet, likformig belastning av målproteinet genom hela hydrogelen, som målproteinerna lastas före hydrogel-bildning.

Den inteinförmedlade protein hydrogelen är mycket staligt i vattenlösning med lite till ingen detekterbar erosion efter 3 månader vid rumstemperatur. Stabilitet kvarhålles i en mängd olika pH-värden (6-10) och temperaturer (4-50 ° C), och hydrogelen är också kompatibla med organiska lösningsmedel. Denna hydrogel används för immobilisering av två globulära proteiner: det grönt fluorescerande protein (GFP) och pepparrotsperoxidas (HRP). Hydrogel infånga det senare proteinet används för att utföra biokatalys i ett organiskt lösningsmedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmidkonstruktion

OBS: Alla gener förstärktes under standardiserade PCR-reaktioner som använder Phusion High-Fidelity DNA-polymeras enligt tillverkarens specifikationer. Primrar som användes för kloning har beskrivits tidigare 9. Alla konstruktioner är listade i tabell 1.

  1. För att generera CutA-NpuN (N, tabell 1):
    1. PCR-amplifiera CutA och NpuN gener från plasmider pET30-CutA-Tip1 10 och KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respektive, med användning av lämpliga primrar.
    2. Digerera dessa fragment med de lämpliga restriktionsenzymerna och sekventiellt infoga dessa fragment in i pET26b vektorn mellan T7-promotorn och en C-terminal 6xHistidine tagg för att generera N (Figur 2A).
  2. För att generera NpuC-S-CutA (C, tabell 1):
    1. PCR Amplify NpuC, CutA och S-fragmenteringt [AG 3 (PEG)] 10 från plasmid KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-CutA-Tip1 10 och pQE9 AC 10 ATRP 12, respektive, med användning av lämpliga primrar.
    2. Digerera dessa fragment med de lämpliga restriktionsenzymerna och sekventiellt infoga dessa fragment in i pET26b vektorn mellan T7-promotorn och en C-terminal 6xHistidine att generera C (Figur 2B).
  3. För att generera NpuC-S-SH3 lig-CutA (C-SH3 lig, Tabell 1):
    1. PCR Amplify CutA använda primers innehåller en SH3 LIG (PPPALPPKRRR) och en flexibel linker (GGGGS) 2 för att generera fragment SH3 lig-CutA.
    2. Byt CutA genen från C med fragment SH3 lig-CutA.
  4. För att generera SH3-GFP (tabell 1):
    1. Förstärka SH3-genen från plasmid pJD757 13 med hjälp avlämpliga primrar.
    2. Säkring detta fragment till GFP-genen och sätt in den i pET26b vektorn mellan T7-promotorn (figur 2C) och en C-terminal 6xHistidine tag.

2. Protein Expression

  1. Omvandla 50 pl av kemiskt kompetent Escherichia coli BL21 (DE3) med den lämpliga expressionsplasmiden.
  2. Efter transformation seriellt späda dessa celler, och plattan dem på Luria-Bertani (LB) /-agarplattor innehållande 50 | ig / ml kanamycin.
  3. Inkubera plattor som innehåller transformerade cellerna vid 37 ° C under ~ 15 timmar.
  4. Efter inkubation, plocka en platta som innehåller 50-100 kolonier och slamma alla kolonier i 5 ml LB-buljong.
  5. Överför suspensionen till en L LB-buljong innehållande kanamycin (50 pg / ml) och odla cellerna vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm. Övervaka absorbansen vid 600 nm (OD 600). Odla kulturen tills OD 600 ~ 0,8.
    1. För C och C-SH3-LIG, inducera proteinexpression genom tillsats av isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) till kulturen (1 mM slutkoncentration) och inkubera kulturen vid 37 ° C under 4 h under skakning vid 250 rpm.
    2. För N-och SH3-GFP kyldes kulturen till ~ 18 ° C genom nedsänkning av odlingskolv i ett is-vattenbad i ~ 5 min. Inducera proteinexpression genom tillsats av IPTG till kulturen (1 mM slutkoncentration) och inkubera kulturen vid 18 ° C under 14-18 h under skakning vid 250 rpm.
  6. Efter proteinuttryck, centrifugera kulturen vid 6000 xg under 20 minuter vid 4 ° C för uppsamling av pelleten. Butikscellpellet vid -80 ° C fram till användning.

3. Proteinrening

  1. Rening av N (denaturerande betingelser)
    1. Återsuspendera cellpelletarna i Buffert A (Tabell 2) vid 10 ml / g våt pellet.
    2. Immerse pelleten suspensionen i ett is-vattenbad och störa cellerna genom sonikering (Amp 10, med en sek puls och 6 sekunders paus för en minut).
    3. Centrifugera lysatet vid 16.000 x g under 20 min vid 4 ° C.
    4. Kasta bort supernatanten. Återsuspendera pelleten i buffert DA (innehållande 8 M urea) och centrifugera suspensionen vid 16.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
    5. Passera supernatanten genom en kolonn 5 ml Ni-nitrilotriättiksyra (NTA) tidigare jämviktad med buffert DA.
    6. Tvätta kolonnen med 30 ml buffert DA kompletterat med 45 mM imidazol. Eluera renat protein med hjälp av 20 ml av buffert DA kompletterad med 150 mM imidazol.
    7. Minska ureakoncentrationen i proteinprovet till <1 mM av antingen en av följande metoder som beskrivs i 3.1.7.1 eller 3.1.7.2:
      1. Dialysera protein i DPBS buffert (tabell 2) vid 4 ° C över natten med hjälp av rör med <20 kDa cutoff.
      2. Centrifugera renat protein i en 30 & #160; kDa ultrafiltreringsspinnkolonn vid 2800 x g, 4 ° C till dess att volymen är mindre än 1 ml. Lägg 14 ml DPBS buffert till kolonnen för att späda provet proteinet. Upprepa centrifuger / utspädning steg tre gånger.
    8. Efter buffertbyte, till ditiotreitol (DTT) för det renade proteinet (slutlig 2 mM) och koncentrera proteinet till ~ 100 mg / ml genom centrifugering genom en 30 kDa ultrafiltreringsspinnkolonn vid 2800 xg, 4 ° C.
    9. Alikvotera den koncentrerade protein och förvara vid -80 ° C fram till användning.
  2. Rening av C-och C-SH3 lig (native skick)
    1. Återsuspendera cellpelletarna i Buffert B (pH 6,0) (Tabell 2) supplementerat med 1x proteasinhibitorcocktail vid 10 ml / g våt pellet. Använd sur buffert för att minimera proteolytisk nedbrytning av målproteinet.
    2. Störa cellsuspension genom ultraljudsbehandling som beskrivs i 3.1.2. Centrifugera lysåt vid 16.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C och behåll supernatanten.
    3. Passera det lösliga lysatet genom en 5 ml Ni-NTA-kolonn tidigare jämviktad med buffert B.
    4. Tvätta kolonnen med buffert B kompletterad med 45 mM imidazol, och eluera målproteinet i 20 ml av buffert B kompletterad med 150 mM imidazol.
    5. För C, vidare till steg 3.2.6. För C-SH3 lig, genomföra ytterligare jonbyte reningssteg för att avlägsna delvis nedbrutet protein som ges i steg 3.2.5.1 till 3.2.5.3
      1. Minska NaCl-koncentration i C-SH3-LIG till <1 mM genom att följa förfarandet som beskrivs i 3.1.7.
      2. Fyll på målproteinet på en 5 ml anjonbytare beaded agarosmatris kolonn tidigare jämviktad med natriumfosfatbuffert (50 mM, pH 7,0).
      3. Eluera målproteinet från kolonnen genom att köra en gradient från en lösning innehållande 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer till en lösning innehållande samma buffert kompletterad med 1 M NaCl. Ta prover under eluering av protein och pool prover med högsta renhet baserat på natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE).
    6. Buffertbyte det renade proteinet i DPBS buffert, såsom beskrivits i 3.1.7.
    7. Lägg DTT till det renade proteinet (slutlig koncentration 2 mM) och koncentrera proteinet till ~ 100 mg / ml med användning av en 30 kDa ultrafiltreringsspinnkolonn såsom beskrivits i 3.1.8. Fördela och lagra koncentrerade proteinet vid -80 ° C fram till användning.
  3. Rening av SH3-GFP
    1. Resuspendera cellpellets med användning av buffert A vid 10 ml / g våt pellet.
    2. Störa pellets fjädring genom ultraljudsbehandling som beskrivs i 3.1.2.
    3. Centrifugera lysatet vid 16.000 x g under 20 min vid 4 ° C, och samla upp supernatanten.
    4. Passera supernatanten (löslig lysat) genom en 5 ml Ni-NTA-kolonn tidigare jämviktad medBuffert A.
    5. Tvätta kolonnen med 30 ml buffert A kompletterad med 45 mM imidazol. Eluera renade proteinet med användning av 20 ml av buffert A kompletterad med 150 mM imidazol.
    6. Buffertbyte det renade proteinet i DPBS buffert med användning av ett tillvägagångssätt som liknar det som beskrivs i 3.1.7 och koncentrera proteinet till ~ 150 mg / ml med användning av en 30 kDa ultrafiltreringsspinnkolonn såsom beskrivits i 3.1.8.
    7. Fördela och lagra renat protein vid -80 ° C fram till användning.
  4. SDS-PAGE-analys av renade prover innehållande CutA
    1. Späd ut varje renat protein i dubbeldestillerat vatten för att reducera koncentrationen av NaCl till ~ 1 mM. Vid denna NaCl-koncentration, de flesta av de CutA trimera proteiner körda som monomerer på SDS-PAGE-geler.
    2. Blanda proverna med 2x SDS-provbuffert (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glycerol, 10% vikt / volym SDS, 0,1% vikt / vol brom-fenolblått, 2% β-merkaptoetanol), inkuberades vid 95 ° C under 5 min.
    3. Ladda sampel på en 12% SDS-PAGE-gel. Utför elektrofores vid en konstant spänning av 200 V under ca 50 min.
    4. Beakta proteinet i gelerna genom färgning med Coomassie brilliant blue R250 följa standardprotokoll (Figur 1C).

4. Hydrogel Bildning

OBSERVERA: exempel hydrogeler framställda i denna studie innehåller 1,6 mM av vardera hydrogel byggsten inget annat anges. Denna proteinkoncentration ger en mjuk och stabil hydrogel. VARNING: Natriumazid (NaN3) tillsätts till hydrogelen till en slutlig koncentration av 0,5% vikt / volym för att förhindra bakteriell kontamination. NaN3 är mycket giftigt och måste hanteras med stor försiktighet som anges i säkerhetsdatabladet.

  1. Beräkna volymen för var och en av de koncentrerade proteiner som behövs för att uppnå en slutlig koncentration av 1,6 mM i en 100 ^ il prov hydrogel. Till exempel:
    Koncentration av N:100 mg / ml
    Molekylvikt på N: 26,3 kDa (se Tabell 1)
    Önskad Volym: 100 l önskad koncentration: 1,6 mm
  2. För att göra en 100 | il hydrogel (1,6 mM), blanda K (x il, volym beräknas enligt 4,1) med 5% NaN3 (10 | il), och 100 mM DTT (5 | il) N (y ^ il, volym beräknas enligt 4,1) i en 2 ml glasampull.
  3. Lägg DPBS buffert ((85 - x - y) il) till ampullen för att uppnå en slutvolym av 100 | il, och manuellt blanda alla komponenter via en virvelrörelse med användning av en pipettspets. OBS: Lösningen blir mycket trögflytande vid blandning.
  4. Centrifugera blandningen under 2 min vid 8000 x g för att avlägsna luftbubblor.
  5. Inkubera blandningen vid rums-temperatur över natten för att tillåta intein transsplitsreaktionen att nå fullbordan. Bekräfta hydrogel bildas genom att vända röret upp och ner. De proteiner som inte kommer att flyta om en hydrogel bildas.
  6. Uppskatta inet trans skarvning avkastning genom att kontrollera prover (0,5 l vardera) som samlats in före steg 4.2 och efter steg 4,5 på en SDS-PAGE-gel, som beskrivs i 3.4 (Figur 1C).

5. Immobilisering av GFP via docknings Protein (DP) och Dockningsstation peptid (DSP) Interaktion

  1. För att göra en 50 ^ GFP-funktionalis hydrogel (1,2 mM), kombinera C-SH3 lig (x l, beräknad enligt 4.1) och SH3-GFP (y pl, beräknad enligt 4.1) på 1:01 molförhållandet i en 1,7 ml mikrocentrifugrör och inkubera blandningen vid rumstemperatur under 30 min.
  2. Lägg 5% NaN3 (5 | il), (2,5 | il) 100 mM DTT (42,5 - x - <em> y) il DPBS till samma rör. Lägg till N (y pl, beräknad enligt 4.1) för att uppnå en 1:1 molförhållande av N-och C-SH3 lig. Blanda provet genom användning av en pipettspets med en virvelrörelse.
  3. Centrifugera blandningen vid 8000 x g under 2 min och inkubera blandningen vid rumstemperatur över natten i mörker. En hydrogel inkapsling SH3-GFP former under inkubationstiden.

6. Användning av 1,6 mM hydrogel som Immobilisering Scaffold för enzymatisk reaktion i organiskt lösningsmedel

  1. Använd HRP som modell enzym. Bered en stamlösning av HRP (28 mg / ml eller 0,63 mM) i DPBS.
  2. För att göra en 30 pl hydrogel (1,6 mM) inneslutning HRP, kombinera C (x l, beräknad enligt 4.1) med HRP (2 pl), 5% NaN3 (3 l) och DTT (1,5 pl av 100 mM) i en 1,7 ml centrifugrör.
  3. Lägg till N (y </ Em> l, beräknad enligt 4.1) och DPBS (23,5 - x - y) pl. Blanda med en pipettspets med en virvelrörelse.
  4. Centrifugera blandningen vid 8000 x g under 2 min och inkubera vid rumstemperatur över natten.
    VARNING: de regenter som används för följande aktivitetsanalysen är mycket giftiga. Använd specifika säkerhetsrekommendationer med motsvarande säkerhetsdatabladen.
  5. För enzymatisk reaktion, dränka hydrogelen i en ml av reaktionscocktail innehållande N, N-dimetyl-p-fenylendiamin (5,8 mM), fenol (5,8 mM) och tert-butylhydroperoxid (2,9 mM) i n-heptan 14. Störa manuellt gelén med användning av en pipettspets för att öka kontaktytan av hydrogelen och lösningsmedlet.
  6. Identifiera HRP produkt, en indofenol-typ färgämne, genom att mäta den optiska absorptionen av prov tagna vid olika tidpunkter vid 546 nm i en plattläsare (Figur 5).
  7. </ Ol>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En schematisk för införmedlade protein hydrogel bildning presenteras i Figur 1A. Byggstenarna i hydrogelen är proteinet sampolymerer CutA-NpuN (N) och NpuC-S-CutA (C) (Figur 1A, Tabell 1). NpuN / C är de N-/C-fragments av den naturligt uppdelad DnaE intein från Nostoc punctiforme (NPU). CutA är en stabil trimert protein från Pyrococcus horikoshii 4,5. Blandning av renad N och C i närvaro av reduktionsmedlet DTT inducerar bildningen av ett tredje protein - den ligerade produkten (J: CutA-S-CutA) (fig. 1A och 1C). Individuellt, de hydrogel byggstenar N och C existerar som viskösa vätskor (Figur 1B). Blandning av N och C ger en transparent halvfast material, som hålls kvar på botten av en glasflaska efter invertering, som indikerar bildning av en hydrogel 15,16 (Figur 1B) 18,19.

Detta införmedlade protein hydrogel (1,6 mM) uppvisar hög stabilitet lösning. Det finns inte mycket-till-ingen förlust av tvärbunden hydrogel schavotten efter 21 dagar vid 22 ° C i DPBS buffert, eftersom den totala mängden protein som släpps ut i DPBS buffert än bara något det teoretiska beloppet för den skarvade intein från hydrogel (förutsatt 100 % intein transsplits effektivitet) (Figur 3A). Densitometri visade att, under hydrogel bildning, trans-splits reaktioner var ~ 80% effektiv (Figur 1C). SDS-PAGE-gel-analys visade att endast spårmängder av det transsplitsade produkten var närvarande i hydrogelen s omgivande buffert (figur 3B, band J), vilket bekräftar att förlusten av den tvärbundna hydrogelen scaffold för erosion är minimal. Den viktigaste protein som finns i hydrogel s omgivande bufferten är skarvas ut intein. Inga synliga tecken på erosion observerades ien ostörd hydrogel nedsänkt i vattenlösning vid rumstemperatur i mer än 3 månader (Figur 3A inlopp). Hydrogelen är också mycket stabil vid 37 ° C (figur 3C) och i både sura och basiska buffertar (figur 3D).

För att underlätta proteinimmobilisering ades ett par av proteinet och dess peptidligand används för att docka proteiner av intresse i hydrogelen scaffold. Vi valde SH3 protein, en Src-homologi 3 domänen från adapterprotein CRK som dockningsprotein (DP) för fusion med ett protein av intresse, och dess ligand (SH3-LIG) såsom dockningsstationen peptid (DSP) för införlivande i hydrogelen ställningen. Denna interaktion par valdes på grund av den relativt lilla molekylstorlek (56 aa för SH3 och 11 aa för SH3 lig) och hög affinitet (Kd = 0,1 M) 17,18. SH3-LIG infördes mellan NpuC och CutA för att bilda C-SH3-LIG(Tabell 1). Den SH3 protein fuserades till N-terminalen av en modell mål globulära proteinet, grönt fluorescerande protein (GFP) under bildning av SH3-GFP. Processen beskrivs i protokollet (Avsnitt 5, figur 4A) ger en hydrogel innehållande 1.2 mM trans skarvade hydrogel ryggraden byggstenar och 1,2 mM GFP. GFP-innehållande hydrogel uppvisade en liknande stabilitet till hydrogel saknar GFP (Figur 4B) med ~ 35% totala proteinförlust efter 21 dagar i DPBS buffert. De flesta av de proteiner som är närvarande i en urholkning buffert var de kluvna inteiner. Den urlakning av SH3-GFP från en hydrogel som innehåller SH3 LIG är ~ 30% efter 3 veckor, betydligt mindre än från en hydrogel saknar SH3 LIG (> 70% proteinförlust under samma tidsperiod, figur 4C). Den immobiliserade SH3-GFP i hydrogel lyser under UV-ljus. Såsom kan ses i fig. 4D, hydrogel innehållande stationen Pepti dockningde SH3 lig behåller det mesta av GFP fluorescens efter 3 veckor medan hydrogel saknar SH3 LIG blir i huvudsak icke-fluorescerande. Det förväntas att användning av en högre affinitet DP / DSP par ytterligare kan reducera urlakning av det immobiliserade proteinet.

I detta experiment var GFP användes som målprotein, men kan någon DP-taggade proteinet lämpligen immobiliserat i denna hydrogel. Sålunda bör den införmedlade protein hydrogel ge en allmän byggnadsställning för proteinimmobilisering. Densiteten av immobiliserad GFP demonstrera i detta arbete är ~ 33 mol% av hydrogelen. En högre immobilisering densitet kan eventuellt uppnås när flertal DSP införlivas i hydrogelen byggblock.

Därefter HRP-enzymet införlivas i protein hydrogel för att visa sin förmåga att stödja biokatalys i organiska lösningsmedel. Enzymaktiviteten mättes genom att övervaka oxidativ koppling av N, N-dimetyl-p-fenylendiamin och fenol med tert-butylhydroperoxid över tiden 14. Hypotesen var att den hydratiserade miljö av hydrogelen kommer att skydda det bifogade enzym från den denaturerande effekten av det organiska lösningsmedlet. Hydrogel innehållande 0,042 mM HRP nedsänktes i n-heptan innehållande substraten. Efter nedsänkning i organiskt lösningsmedel, var HRP-innehållande hydrogel manuellt störs i små kluster för att öka den hydrofila-hydrofoba gränssnittet (Figur 5B). Hydrogel-bildat HRP effektivt katalyseras den snabba oxidationsreaktionen, vilket ger upphov till en kolorimetrisk produkt (figur 5C, trianglar). Produkten ansamling följer en linjär lutning, vilket indikerar liten till ingen enzyminaktivering under experimentet. Kontroll reaktion med HRP löst direkt i den organiska reaktions cocktail uppvisade försumbar katalytisk aktivitet på grund av enzymdenaturering (data inte visad). HRP upplöst i DPBS först följt av tillsats till det organiska lösningsmedlet kunde katalysera omvandlingen men med en hastighet mycket reducerad reaktion (figur 5C, cirklar). Den låga omvandlingsfrekvens av enzymer lösta i DPBS är sannolikt på grund av den lilla gränsområdet mellan DPBS och det organiska lösningsmedlet, vilket begränsar graden av substrat / produkt diffusion. Inkorporering av den starkt hydrofil S-fragmentet i hydrogelen ryggrad, som effektivt "låser" Vattnet inuti hydrogelen och förhindrar att det organiska lösningsmedlet för att komma till hydrogelen inre, gör det möjligt för hydrogelen att motstå denatureringseffekten av organiskt lösningsmedel. Dessa resultat indikerar att införmedlade protein hydrogelen kan vara en effektiv stödstruktur för enzymatiska reaktioner i organiska lösningsmedel.

_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
Figur 1. Intein-förmedlad protein hydrogel. (A) Schematics av intein transsplitsreaktion som utlöser bildandet av en utsträckt proteinkedja (J) med tvärbindande proteiner vid båda terminalerna. Tvärbindare proteiner från flera J proteinkedjor icke-kovalent förbunden och, på införmedlade proteinligation, inducera bildningen av ett starkt tvärbundet proteinnätverk med hydrogel-egenskaper. NpuN / C: intein N-/C-fragment. (B) Blandning av renad N och C (8,3% vikt / volym) leder till bildandet av en högt tvärbunden hydrogel nätverk (1,6 mM J). (C) SDS-PAGE-analys av renade N-och C-byggblock före och efter blandning. "N + C" motsvarar ett prov tas direkt från en 1,6 mM hydrogel. "*" Betecknar en intein C-terminal klyvning side reaktionsprodukten. Intensiteten i varje band kvantifierades med hjälp av "spårmodulen i" Antal One "programvara. Band intensitet dividerades med proteinmolekylvikt för att erhålla den molära ekvivalenten. Trans-splitsningseffektivitet (~ 80%) beräknades från den mängd av produkten J och den oreagerade N / C i samma körfält. Omtryckt med tillstånd från Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. Plasmid kartor över proteinkonstruktioner. (A) CutA-NpuN, (B) NpuC-S-CutA och (C) SH3-GFP (<strong> Tabell 1) klonades in pET26b vektor under kontroll av T7-promotorn. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Stabilitet av intein-förmedlade protein hydrogeler i DPBS. (A) Erosion profilen av en 1,6 mM hydrogel vid 22 ° C. Den streckade linjen representerar den teoretiska massan av de kluvna inteiner. Inloppet visar en ostörd hydrogel i DPBS efter 3 månader vid rumstemperatur. (B) SDS-PAGE-analys av hydrogel ter omgivande bufferten. Samtliga prover av den buffert i vilken hydrogelen nedsänktes i (A) poolades (totalt 7,5 ml) och koncentrerades 75-faldigt genom ultrafiltrering genom ett 10 kDett membran före gel lastning J:.. oreagerad CutA-NpuN NpuN:: intein trans skarvad produkt N. skarvas ut N-intein fragment. Oreagerad C och splitsas ut NpuC är inte synliga i gelén på grund av det lilla antal och ringa storlek (4 kDa), respektive. Asterisken anger oidentifierade band. (C) Erosion Profil av hydrogelen inkuberades vid olika temperaturer. (D) Erosion Profil av hydrogeler inkuberade vid två olika pH. Omtryckt med tillstånd från Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4
Figur 4. Intein-medierad hydrogel stöder immobilisering av funktionella klotformiga proteiner. (A) Schematisk bild av protein immobilisering med hjälp av GFP som en modell globulärt protein. DSP-innehållande hydrogel byggsten först blandas med DP-fuserad målprotein för målproteinet lastning på byggblocket. Den kompletterande inet fragment innehållande hydrogel byggsten läggs till blandningen ger en hydrogel med immobiliserade GFP. (B) Totalt protein erosionsprofilen för hydrogel innehållande 01:01 molförhållandet SH3-GFP. Streckade linjen representerar den teoretiska massan för de skarvade ut inteiner. Felstaplarna representerar standardavvikelsen av två oberoende experiment. (C) Urlakning profilen av SH3-GFP från hydrogel med och utan DSP. (D) Bilder av GFP som innehåller hydrogel under UV exponering omedelbart efter hydrogel bildning och efter 21 dagar. Omtryckt med tillstånd från Journal of American Chemical Society (doi:. 10.1021/ja401075s) Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5
Figur 5. Pepparrotsperoxidas (HRP)-infångat intein triggad protein hydrogel underlättar HRP-katalyserade reaktionen i organiskt lösningsmedel n-heptan. (A) Modell reaktion katalyserad av HRP i organiska lösningsmedel. (B) Fotografi av hydrogel som innehåller inkapslade HRP efter att ha blivit störd i små fragment och inkuberas i en reaktion cocktail i 10 min och 30 min (till vänster) och kontrollexperiment med samma mängd nonimmobilized HRP i DPBS buffert (höger). (C) Produktbildningen följdes genom absorbans vid 546 nm. Anpassad med tillstånd från Journal of Amerikan Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Klicka här för att visa en större bild.

Tabell 1. Protein konstrukt användes i denna studie.

Kortnamn Protein Sequence MW (kDa)
CutA-NpuN (N) CutA-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-hhhhhh 26,3
NpuC-S-CutA (C) NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C uta-
Hhhhhh
26,1
NpuC-S-SH3-LIG -
CutA (C-SH3-LIG)
NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS-
PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-CutA-hhhhhh
28,3
SH3-GFP SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-hhhhhh 34,5

Omtryckt med tillstånd från Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

Tabell 2. Buffert kompositioner.

Buffert A 500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0
Buffert DA 500 mM NaCl, 8 M urea, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0
Buffert B 500 mM NaCl, 50 mM NaPOi, pH 6,0
DPBS Dulbeccos PBS, 137,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4

Omtryckt med tillstånd från Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete visade vi syntesen av ett mycket stabilt införmedlade protein hydrogel. Användningen av ett delat möjliggör intein hydrogelen vara villkor bildad som svar på den blandning av två flytande-fas-komponenter. Specifikt uppdelningen länkar intein kovalent två flytande fas byggstenar via en transsplitsreaktion, vilket ger en polypeptid enhet flankerad av tvärbindning enheter som i sin tur själv monterar in i en hydrogel. Blandnings-inducerad bildning av hydrogelen kringgår tekniska svårigheter vid syntes av en enda komponent protein hydrogeler där gel-medierad tilltäppning av kromatografiska reningskolonner kan inträffa. Dessutom hydrogel former under fysiologiska förhållanden utan behov av alla främmande kemiska inducerare och / eller fysiska triggers.

Den intein-medierad hydrogel bibehåller hög stabilitet i både sura och basiska buffertar, och vid fysiologisk temperatur. Hydrogeler kan bilda with så lite som 0,8 mM av varje enskild byggsten (data visas inte), men högre proteinkoncentrationer (~ 1,6 mM) avkastnings hydrogel med bättre mekanisk stabilitet. Hydrogelen har hög stabilitet kan tillskrivas användningen av en) en mycket stabil trimera proteinet, CutA, som ett tvärbindningsmedel, och 2) intein att kovalent sammanfoga olika tvärbindare. Densitometrisk analys av SDS-PAGE-geler visade att ~ 80% av de ingående proteinerna framgångsrikt genomgick delat intein-katalyserad transsplitsreaktionen.

För hydrogel bildning, är enskilda byggstenar först koncentreras till ~ 100 mg / ml. Ett reduktionsmedel, såsom DTT, som behöver vara närvarande under steg proteinkoncentrationen för att förhindra bildning av intermolekylära disulfidbindningar. I frånvaro av reduktionsmedel, kan koncentrerad individuell hydrogel byggsten ibland bilda hydrogel-liknande material. Emellertid löser sig detta gelliknande material snabbt vid nedsänkning i en buffert och / eller i närvaroav reduktionsmedel.

För att erhålla en hydrogel med maximal stabilitet är det viktigt att se till att det molära förhållandet mellan de två hydrogel byggblock är 01:01. Eventuellt överskott av byggblocket inte kommer att vara tvärbundna och kan påverka den hydrogel mekaniska egenskaper. Koncentrerat protein bör alikvoteras och lagras individuellt för att minimera upprepade frysnings-upptiningscykler.

Vi visade även användningen av den inteinförmedlade protein hydrogel som ett organiskt lösningsmedel som passar biokatalysator. Specifikt hydrogeler som innehåller enzymet HRP nedsänktes i n-heptan innehållande substratet och lyckad omvandling av substrat till produkt observeras. Proteinet hydrogelen fungerar som ett effektivt scaffold för biokatalys i organiskt lösningsmedel, sannolikt på grund av det skydd från organiskt lösningsmedel medierad denaturering som erbjuds av den starkt hydratiserade miljö av hydrogelen.

En av begränsningarna av thär enzymimmobilisering tekniken är nödvändigheten att fusera målproteinet med en dockningspeptid (DP). Denna ändring kan påverka aktiviteten och lösligheten av vissa målprotein och kräver således från fall till fall optimering av DP-märkta proteinkonstruktioner. Dessutom kan en liten mängd av märkta proteiner lakas ut ur dockningsstationen peptid (DSP)-innehållande hydrogel efter en vecka. Stabiliteten hos det immobiliserade proteinet påverkas av affiniteten hos det integrerade DSP / DP-paret. För att uppnå bättre immobilisering effektivitet, kommer att behövas en högre affinitet DSP / DP par. Slutligen denna hydrogel uppvisar relativt svaga mekaniska egenskaper på grund av den låga platålagringsmodul (100-200 kPa) 9. Platån lagringsmodul påverkas av strukturerna för både tvärbindningsmedlet och mittsegmentet 19. I ström hydrogel, var en trimer-proteinet användes som tvärbindningsmedel. Användningen av tvärbindningsprotein med en högre multimerisk tillstånd kan potentiellt öka hydrogel platån storage modul och dess mekaniska egenskaper.

I sammanfattning, rapporterar vi syntesen och karakteriseringen av en ny protein hydrogel som villkor bildar på blandningen av två flytande-fas protein byggstenar, som vardera innehåller en halva av ett delat intein. Intein-medierade protein hydrogel representerar ett lovande nytt material med potentiella tillämpningar inom syntetiska enzymatiska reaktioner, organisk syntes, injicerbara läkemedelstillförsel och vävnadsteknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga konkurrerande ekonomiska intressen finns.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för Dr David Tirrell (Caltech) för hans vänliga gåva av plasmiden pQE9 AC 10 ATRP 12, Dr Tom Muir (Princeton University) för hans vänliga gåva av plasmiden KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) för hans vänliga gåva av plasmiden pET30-CutA-Tip1 10, och Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) för hans vänliga gåva av plasmiden pJD757 13 . Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation KARRIÄR, US Air force YIP och Norman Hackman Advanced Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Phusion High Fidelity DNA polymerase

New England BioLabs

M0530S

Competent Escherichia coli BL21 (DE3)

New England BioLabs

C2527I

Luria Bertani

VWR

90003-350

Bacto Agar Media

VWR

Kanamycin sulfate

VWR

IPTG

VWR

EM-5820

Imidazole

VWR

EM-5720

Urea

VWR

EM-9510

Dithiothreitol (DTT)

Fisher

BP172-5

Protease Inhibitor cocktail

Roche Applied Science

11836153001

DPBS

VWR

82020-066

Brilliant Blue R

Acros Organics

A0297990

Sodium Azide

Fisher

AC190380050

Caution, highly toxic

Horseradish peroxidase

Sigma

P8125-5KU

N,N-dimethyl-p-phenylene diamine

Fisher

AC408460250

Caution, highly toxic

phenol

Fisher

AC149340500

Caution, highly toxic

tert-butyl hydroperoxide

Fisher

AC180340050

Caution, highly toxic

n-heptane

Acros Organics

120340010

Name Company Catalog Number Comments

Shaker/Incubator

Fisher Scientific

Max Q 6000

Centrifuge

Sorvall

RC 6

Sonicator

QSonica

Misonix 200

Ultrafiltration Tubes

Amicon Ultra

UFC903024

 Ni Sepharose High Performance HisTrap column

GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column

GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plate reader

Molecular Devices

SpectraMax Gemini EM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
  2. Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
  3. Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
  4. Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
  5. Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
  6. Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
  7. Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
  8. McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
  9. Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
  10. Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
  11. Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
  12. Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
  13. Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
  14. Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
  15. Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
  16. Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
  17. Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
  18. Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
  19. Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).

Tags

Bioteknik split-intein självorganisering skjuvningsförtunnande enzym immobilisering organisk syntes
Syntes av ett intein medierad Artificiell Protein Hydrogel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramirez, M. A., Chen, Z. SynthesisMore

Ramirez, M. A., Chen, Z. Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel. J. Vis. Exp. (83), e51202, doi:10.3791/51202 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter