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Biology

अनुकूलन और की उपयोगिता Published: April 19, 2014 doi: 10.3791/51204
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

Summary

Agrobacteria (तंबाकू मोज़ेक वायरस आधारित) टीका एंटीजन और चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक तेजी से और आर्थिक दृष्टिकोण है लांच वैक्टर ले जाने के साथ वैक्यूम घुसपैठ पर आधारित निकोटियाना पौधों में क्षणिक प्रोटीन उत्पादन. हम प्रक्रिया सरल और, बैक्टीरिया की खेती की शर्तों के अनुकूलन मेजबान प्रजातियों का चयन, और आरएनए मुंह बंद दमन सह शुरू करने से लक्ष्य संचय सुधार हुआ.

Abstract

पौधों में Agrobacterium की मध्यस्थता क्षणिक प्रोटीन उत्पादन समय की एक छोटी अवधि के भीतर टीका एंटीजन और चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है. हालांकि, इस तकनीक केवल अभी उबरने की जा रही हैं पैमाने पर करने के लिए बड़े पैमाने पर उत्पादन के रूप में कई तकनीकी बाधाओं को लागू करने के लिए शुरुआत है. यहाँ, हम Agrobacteria लांच वैक्टर ले जाने के साथ निकोटियाना पौधों की वैक्यूम घुसपैठ पर आधारित औद्योगिक पैमाने पर क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का प्रदर्शन. अटल बिहारी माध्यम में Agrobacterium खेती का अनुकूलन घुसपैठ की प्रक्रिया को सरल बनाने, मिल्ली क्यू पानी में जीवाणु संस्कृति का प्रत्यक्ष कमजोर पड़ने की अनुमति देता है. निकोटियाना, एन के तीन परीक्षण किया प्रजातियों में excelsiana (एन एक्सेलसियर × एन benthamiana) की वजह से घुसपैठ की आसानी के लिए सबसे होनहार मेजबान के रूप में चयनित किया गया था, उच्च संवाददाता प्रोटीन के उत्पादन का स्तर, और के बारे में दो चनियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत पुराने उच्च बायोमास उत्पादन. Agrobacterium ऐसे acetosyringone और मोनोसैकराइड के रूप में रसायनों का उपयोग pBID4-GFP (तंबाकू मोज़ेक वायरस आधारित) को शरण देने की प्रेरण प्रोटीन के उत्पादन स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा. 30 या 60 सेकंड के लिए 50 से 100 एम्बार तहत घुसपैठ संयंत्र संयंत्र पत्ता ऊतकों के बारे में 95% घुसपैठ में हुई. Agrobacterium प्रयोगशाला तनाव GV3101 साथ घुसपैठ Agrobacteria प्रयोगशाला उपभेदों LBA4404 और C58C1 और जंगली प्रकार Agrobacteria at77 और ए 4, at10, at6 उपभेदों की तुलना में सबसे अधिक प्रोटीन उत्पादन दिखाया. एन में एक विषाणु आरएनए मुंह बंद शमन, P23 या p19, सह अभिव्यक्ति benthamiana लक्ष्य प्रोटीन (इन्फ्लूएंजा वायरस hemagglutinin) के पूर्व संचय और उत्पादन में वृद्धि (15-25%) में हुई.

Introduction

पौधों अब heterologous पुनः संयोजक biopharmaceuticals और औद्योगिक प्रोटीन 1-3 उत्पादन के लिए एक सुरक्षित, विश्वसनीय, स्केलेबल और सस्ती मंच के रूप में मान्यता प्राप्त है और माइक्रोबियल और पशु सेल अभिव्यक्ति सिस्टम पर 4 महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं. संयंत्रों इकट्ठे multimeric एंटीबॉडी 5-7 सहित बाद translational संशोधनों के साथ सही ढंग से मुड़ा हुआ प्रोटीन व्यक्त करने में सक्षम हैं. कई संयंत्र व्युत्पन्न पुनः संयोजक दवा प्रोटीन नैदानिक ​​मूल्यांकन 8 दौर से गुजर रहे हैं. ये गैर Hodgkin लिंफोमा 9, hemagglutinin आधारित महामारी और मौसमी फ्लू के टीके के उम्मीदवारों 10,11 (कमिंग्स एट अल., वैक्सीन के लिए प्रस्तुत), विरोधी स्ट्रेप्टोकोकस सतह प्रतिजन मैं के इलाज के लिए रोगी विशेष पुनः संयोजक idiotype टीके (scFv) शामिल / दंत क्षय 12 के उपचार, और मधुमेह 13 के उपचार के लिए मानव इंसुलिन के लिए द्वितीय एंटीबॉडी. इसके अलावा, मानव सिफारिशGaucher रोग के साथ रोगियों में एंजाइम रिप्लेसमेंट थेरेपी के लिए mbinant glucocerebrosidase इजरायल और अमेरिका में अनुमोदित किया गया है और अमेरिका 14,15 के बाहर विस्तारित प्रवेश कार्यक्रम के तहत प्रदान की जाती है.

Heterologous प्रोटीन stably तब्दील (ट्रांसजेनिक या transplastomic) या क्षणिक तब्दील संयंत्रों में उत्पादन किया जा सकता है. क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन अभिव्यक्ति और संचय 16 को प्राप्त करने के लिए कम समय सीमा सहित ट्रांसजेनिक पौधों में उत्पादन पर कई लाभ प्रदान करता है, और संयंत्र के ऊतकों 4 में बैक्टीरियल द्विआधारी वैक्टर या पुनः संयोजक संयंत्र वायरल वैक्टर शुरू करने से प्राप्त किया जा सकता है. सबसे उन्नत क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली संयंत्र वायरस और बाइनरी plasmids के घटक गठबंधन, और agroinfiltration 17,18 द्वारा वितरित कर रहे हैं कि 'लांच वैक्टर' के उपयोग पर आधारित है. तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) पर आधारित एक लांच वेक्टर के Agroinfiltration सफलतापूर्वक प्रयोगशाला में लागू किया गया हैइस तरह के मानव पैपिलोमा वायरस 19, Yersinia pestis के रूप में 20 रोगजनकों के खिलाफ टीका एंटीजन का उत्पादन करने के लिए पैमाने, इन्फ्लूएंजा ए 21,22, बेसिलस anthracis 23 वायरस, और एन में चेचक वायरस 24 benthamiana छोड़ देता है. Agrobacterium की मध्यस्थता क्षणिक अभिव्यक्ति भी कई प्रोटीन 2,25-27 के एक साथ उत्पादन के लिए एक आशाजनक तरीका है. उदाहरण के लिए, संयंत्र क्षणिक अभिव्यक्ति सिस्टम ट्यूमर विशेष पुनः संयोजक एंटीबॉडी 28,29, epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 30 के खिलाफ एक ग्लाइकोसिलेटेड पुनः संयोजक एंटीबॉडी, और एंथ्रेक्स सुरक्षात्मक प्रतिजन 31,32 के लिए विशिष्ट एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक लक्ष्य जीन और बढ़ाया लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति 33,34 में जीन मुंह बंद परिणामों की एक शमन के साथ निकोटियाना benthamiana पौधों की सह घुसपैठ.

Agroinfiltration समान रूप से introdu के लिए एक आम तरीका हैसंयंत्र में ब्याज की एक जीन को शरण देने cing बैक्टीरिया 35-37 ऊतकों. बरकरार संयंत्र में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति के पत्तों के लिए Agrobacterium का वैक्यूम घुसपैठ ट्रांसजेनिक पौधों 38-41 उत्पन्न करने के लिए आवश्यकता के बिना विदेशी प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक तेजी से स्केलेबल, और उपयोगी तरीका है. वैक्यूम agroinfiltration के दौरान, पौधों उल्टा रूप से फ़्लिप हैं और हवाई भागों Agrobacterium निलंबन में डूबे हुए. तो वैक्यूम गैसों रंध्र के माध्यम से पत्ती कहनेवाला रिक्त स्थान से खाली करने के कारण लागू की गई है. पत्ती में Agrobacterium निलंबन के निषेचन में वैक्यूम परिणाम की तेजी से फिर से दबाव निम्न रिलीज. Agrobacteria के निर्वात घुसपैठ के बाद, पौधों आगे खेती की जाती है और लक्ष्य अभिव्यक्ति नजर रखी है. लक्ष्य अभिव्यक्ति के उच्चतम स्तर आम तौर पर 2-3 दिनों के बाद जो अभिव्यक्ति के स्तर आम तौर पर decrea एक लांच वेक्टर साथ एक द्विआधारी वेक्टर और 4-7 डीपीआई, साथ घुसपैठ (डीपीआई) पोस्ट मनाया जाता हैSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक संयंत्र में ब्याज की एक जीन पहुंचाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल वाहन है. Agroinfiltration एन में असाधारण अच्छी तरह से काम करता है benthamiana लेकिन अपेक्षाकृत खराब Arabidopsis thaliana 46 सहित अन्य अधिकांश पौधों में.

इस अध्ययन में, हम 5-6 सप्ताह पुराने एन में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक सरल, कुशल, और किफायती तरीका विकसित benthamiana ए का उपयोग घुसपैठ tumefaciens. agroinfiltration तकनीक के औद्योगिक स्केलिंग की बड़ी खामी 'काटा बैक्टीरिया और 4'-हाइड्रोक्सी 3 युक्त मध्यम में बैक्टीरिया गोली के मेजबान के centrifugation है, 5'-dimethoxyacetophenone (acetosyringone), मोनोसैक्राइडों, और 2 - (एन morpholino) -ethanesulfonic एसिड (एमईएस) वीर जीन की प्रेरण के लिए बफर. हम Agrobacterium अनुकूलन द्वारा इन समस्याओं को दूर करने में सक्षम है एन में लक्ष्य प्रोटीन के उत्पादन की तुलना में है benthamiana और एन एक्सेलसियर, साथ ही संकर एन में excelsiana.

Protocol

1. संयंत्र बढ़ते

बाद में agroinfiltration के लिए हम दो प्रकार के जंगली Nicotiana प्रजातियों इनडोर सुविधाओं में Rockwool पर हाइड्रोपोनिकली बड़े हो (एन benthamiana और एन एक्सेलसियर) और एक संकर (एन excelsiana) का मूल्यांकन किया.

  1. एक संयंत्र उर्वरक समाधान में Rockwool स्लैब भिगोएँ.
  2. जंगली प्रकार एन के बीज बोना benthamiana, एन ऊँचे और एन पोषक तत्वों पर excelsiana (एन एक्सेलसियर × एन benthamiana की संकर) Rockwool सतह लथपथ.
  3. के लिए नियंत्रित परिस्थितियों (24 डिग्री सेल्सियस और 40-65% सापेक्ष आर्द्रता) के तहत बीज से पौधों और (130-150 μE मीटर की रोशनी के साथ 14 घंटा प्रकाश और 10 घंटे अंधेरे, -2 सेकंड -1) एक लंबे समय से दिन photoperiod बढ़ो एन के लिए 4-5 सप्ताह benthamiana और एन excelsiana, और एन के लिए 5-6 सप्ताह एक्सेलसियर.

Agroinfiltrat के लिए वैक्टर 2. निर्माणआयन

  1. इन्फ्लूएंजा वायरस (HAC1) की A/California/04/2009 तनाव से एक सिंथेटिक रिपोर्टर जीन (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP]), पूर्ण लंबाई hemagglutinin (हेक्टेयर) डालें, और फिर से इंजीनियर lichenase एंजाइम (LicKM) 18 अलग में लांच वेक्टर pBID4 GFP, pBID4-HAC1 और क्रमशः pBID4-LicKM, 18,32,41,47 प्राप्त करने के लिए 18 (TMV आधारित वेक्टर) pBID4.
  2. ए के electrocompetent कोशिकाओं में 10-50 GFP ले जाने pBID4 की एनजी या HAC1 का परिचय ए के electrocompetent कोशिकाओं में तनाव GV3101 और LicKM tumefaciens tumefaciens जीन MicroPulser electroporator साथ GV3101, C58C1, GLA4404, At06, At10, At77 और ए 4 उपभेदों.
  3. जब तक अन्यथा नोट घुसपैठ प्रयोगों के लिए बदल Agrobacteria का प्रयोग करें.

3. निकोटियाना संयंत्रों में Agrobacterium की घुसपैठ वैक्यूम

  1. ए बढ़ो tumefaciens लेग मध्यम, YEB मेड में (ओ / एन) रातोंरात उपभेदोंIUM या अटल बिहारी मध्यम 200-250 rpm पर झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर kanamycin की 50 मिलीग्राम / एल के साथ पूरक.
  2. 4,000 × पर लेग या YEB या एबी में उगाई 0.5 या अपकेंद्रित्र Agrobacterium कोशिकाओं की 600 एनएम पर एक ऑप्टिकल घनत्व (ए 600) मिल्ली क्यू पानी में Agrobacteria पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए जी, 0.5 का एक 600 के लिए प्रेरण मध्यम (1x एमएस नमक, 10 मिमी एमईएस, 200 माइक्रोन acetosyringone, 2% sucrose [एमएमए]) में फिर से निलंबित, और 1-3 के लिए कमरे के तापमान पर हलचल घंटा, जब तक अन्यथा नोट.
  3. Agrobacterium निलंबन में निकोटियाना संयंत्र हवाई ऊतकों submerging और 30 या 60 सेकंड के लिए एक 50-400 एम्बार वैक्यूम लगाने से एक निर्वात चैम्बर में पौधों घुसपैठ. इष्टतम घुसपैठ नियमित 60 सेकंड के लिए 50-100 एम्बार पर लागू किया जाता है.
  4. निर्वात टूट गया है एक बार,, निर्वात चैम्बर से पौधों को दूर पानी में कुल्ला, और पूर्व घुसपैठ के विकास के लिए इस्तेमाल किया वही विकास शर्तों के तहत 5-7 दिनों के लिए विकसित.
  5. प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिएAgrobacterium वीर जीन, acetosyringone के विभिन्न सांद्रता (0, 100, 200 या 400 माइक्रोन) उत्प्रेरण रसायनों घुसपैठ बफर में निलंबित Agrobacteria (1x एमएस, 10 मिमी एमईएस, 2% ग्लूकोज) को जोड़ा गया है. वीर जीन, ग्लूकोज (0, 1, 2 या 4%) अलग प्रतिशत के शामिल होने पर मोनोसैकराइड के प्रभाव के लिए घुसपैठ बफर (1x एमएस, 10 मिमी एमईएस, 200 माइक्रोन acetosyringone) में निलंबित Agrobacteria जोड़ा गया था. एन कदम 3.3 और 3.4) में उपरोक्त के रूप में benthamiana पौधों में घुसपैठ कर रहे थे.
  6. Agrobacterium प्रयोगशाला ए 600 0.5 की. एन को मिल्ली क्यू पानी में पतला थे GV3101, C58C1 और LBA4404 और जंगली प्रकार उपभेदों ए 4, At06, At10, और At77 pBID4-LicKM वेक्टर शरण उपभेदों benthamiana पौधों चरणों 3.3 और 3.4 में उपरोक्त के रूप में प्रत्येक विशेष तनाव के साथ घुसपैठ कर रहे थे.

वायरल मुंह बंद शमन के लिए 4. सह agroinfiltration प्रक्रिया

  1. एमनौवीं 1:01 पर GFP जीन और टमाटर जंगली स्टंट वायरस (TBSV) के वायरल मुंह बंद शमन p19 ले जाने मिल्ली क्यू पानी में पतला Agrobacterium GV3101 संस्कृतियों, 2:1, 3:1 और 4:1 के अनुपात. एन घुसपैठ जैसा कि ऊपर वर्णित benthamiana पौधों.
  2. एन घुसपैठ दो मिल्ली क्यू पानी में पतला Agrobacterium GV3101 संस्कृतियों का मिश्रण के साथ benthamiana पौधों: pBID4-HAC1 प्लाज्मिड ले जाने के पहले और मुंह बंद दमन में से एक ले जाने दूसरा - TBSV या खट्टे tristeza वायरस की P23 के p19, pCassp प्लाज्मिड में ( pCassp19) और 35S प्रमोटर अनुपात 4:1 में क्रमशः (PGR-P23), के तहत PgR बाइनरी प्लाज्मिड में.

5. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. एन से यादृच्छिक पत्ता नमूने एकत्र benthamiana, एन छीलन या एन excelsiana 4-7 डीपीआई पर पौधों और एक ठीक पाउडर के लिए तरल नाइट्रोजन में तबाह करना.
  2. ट्राइटन 0.5% से युक्त 1x पीबीएस बफर के तीन खंडों में जोड़ेंएक्स 100 प्रत्येक नमूने लिए.
  3. धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए निकाले गए नमूने हिला
  4. 5 मिनट के लिए निकालने स्पिन और एक साफ Eppendorf ट्यूब में कुल घुलनशील प्रोटीन इकट्ठा.
  5. 1x पीबीएस निष्कर्षण बफर में एक उपयुक्त कमजोर पड़ने (1:50 1:100) को अर्क पतला, और 5 × नमूना बफर (250 मिमी Tris-एचसीएल [पीएच 6.8], 10% एसडीएस, नीले 0.5% bromophenol, 50% ग्लिसरॉल जोड़ने एक अंतिम 1 × एकाग्रता के लिए वी / वी, और 500 मिमी डीटीटी).
  6. 5 मिनट के लिए उबाल लें नमूनों.
  7. 10% एसडीएस पृष्ठ से अलग प्रोटीन, Immobilon पी हस्तांतरण झिल्ली पर स्थानांतरित कर, और 0.5% मैं ब्लॉक से ब्लॉक.
  8. 1:5,000 में खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी GFP सीरमरोधी का उपयोग और HAC1 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में 1:1,000 पर माउस विरोधी पाली हिस्टडीन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग GFP का पता लगाने.
  9. प्राथमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के बाद, 10 मिनट 1 × PBST-20 के साथ प्रत्येक के लिए झिल्ली तीन बार धोना और 1:5,000 में संयुग्मित एक हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) विरोधी खरगोश एंटीबॉडी या एक एचआरपी संयुग्म साथ सेते1 GFP और HAC1 का पता लगाने के लिए मानव संसाधन,, क्रमशः के लिए 1:10,000 पर डी विरोधी माउस एंटीबॉडी.
  10. SuperSignal पश्चिम पिको chemiluminescent सब्सट्रेट का उपयोग पश्चिमी blots प्रक्रिया.
  11. प्रोटीन का बैंड तीव्रता का विश्लेषण और बैंड calibrated मात्रा प्राप्त करने के लिए GeneTools सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.

प्रोटीन के उत्पादन: (नमूना के कैलिब्रेटेड मात्रा एक्स कमजोर पड़ने) / भरी हुई नमूना की राशि) = 4 मिलीग्राम / किग्रा एक्स.
समीकरण: प्रोटीन के उत्पादन (पी), कैलिब्रेटेड मात्रा (सी), नमूना (डी) के कमजोर पड़ने और भरी हुई नमूना की राशि (एस).

6. Zymogram परख

  1. लीजिए pBID4-LicKM घुसपैठ एन benthamiana यादृच्छिक ऊतकों के नमूनों.
  2. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए ऊपर वर्णित एक ही तरीके का उपयोग प्रोटीन निकालने और फिर 0.1% lichenan साथ 10% एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण जैल में शामिल थे.
  3. वैद्युतकणसंचलन के बाद, 100 मिमी Tris-एचसीएल [पीएच 8.0] और 0.1% ट्राइटन X (धोने बफर में 10 मिनट प्रत्येक के लिए जैल दो बार धोने-100) और उसके बाद 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर धोने बफर में सेते हैं.
  4. ऊष्मायन के बाद, धोने बफर त्यागें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.5% कांगो लाल के साथ जैल दाग.
  5. 10 मिनट प्रत्येक के लिए मिल्ली क्यू पानी में जैल तीन बार कुल्ला, और lichenase गतिविधि कल्पना करने के लिए 1 एम NaCl जोड़ें. शुद्ध बैक्टीरियल lichenase प्रोटीन एंजाइम की गतिविधि के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

7. GFP इमेजिंग

  1. एक हाथ से आयोजित की लंबी तरंग दैर्ध्य यूवी लैंप का उपयोग पूरे क्षणिक तब्दील पौधों में GFP प्रतिदीप्ति के दृश्य का पता लगाने प्रदर्शन करना.
  2. तस्वीर transiently एक पीला 8 के माध्यम से एक डिजिटल कैमरा के साथ पौधों तब्दील, 52 फिल्टर (जोखिम समय, 15 सेकंड) तों.
  3. वेस्टर्न ब्लॉट से छवियों को प्राप्त एक GeneGnome पर GeneSnap सॉफ्टवेयर का उपयोग और शुद्ध किया GFP मानक पर आधारित एक अंशांकन वक्र के साथ, GeneTools सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणाम यों का विश्लेषण करती है.
  4. Purifi पर आधारित एक अंशांकन वक्र का उपयोग HAC1 प्रोटीन योंइन्फ्लूएंजा वायरस के A/Indonesia/05/05 तनाव से एड HAC प्रोटीन मानक.
  5. 3-4 मतलब मूल्यों की गणना सभी प्रयोगों के लिए replicates.

Representative Results

पौधों की वृद्धि के लिए पोषक तत्व आवश्यकताओं. हाइड्रोपोनिक पौधों की वृद्धि मध्यम (Rockwool) और पोषक तत्व समाधान का उपयोग एन की एकरूपता सुनिश्चित करता है benthamiana विकास और समाप्त जटिलताओं (यांत्रिक, विनियामक और दक्षता) पौधों की खेती के लिए मिट्टी का उपयोग कर के साथ जुड़े. हम एन बढ़ी benthamiana पौधों की वृद्धि और बायोमास संचय के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उर्वरकों में भिगो Rockwool स्लैब पर. हम 95-100% बीज अंकुरण मनाया. हम फास्फोरस की कमी पोषक तत्व समाधान अंकुरण और एन के विकास का समर्थन करने में विफल पाया कि क्योंकि एक, फास्फोरस सहित अंकुरण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें चाहिए benthamiana बीज (चित्रा 1 ए).

Agrobacterium विकास और पादप स्वास्थ्य और प्रोटीन के उत्पादन पर घुसपैठ मीडिया के प्रभाव. हम टी की दक्षता का अनुकूलन करने के लिए कई मीडिया शर्तों का परीक्षण कियाबड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए वह agroinfiltration तकनीक. बैक्टीरिया (ए GV3101 तनाव tumefaciens) pBID4-GFP निर्माण शरण विभिन्न मीडिया शर्तों (YEB, लेग या एबी) में ओ / एन की खेती की जाती है, और centrifuged और 1 × Murashige एवं युक्त प्रेरण मध्यम (एमएमए) (में फिर से निलंबित या तो गया Skoog [एमएस] बेसल नमक मिश्रण, 10 मिमी एमईएस पीएच 5.6, 20 जी / एल sucrose और 200 माइक्रोन acetosyringone) या संयंत्र घुसपैठ के लिए उपयोग करने से पहले 0.5 की 600 मिल्ली क्यू पानी में पतला. हम पानी में पतला बैक्टीरिया के साथ पौधों का वैक्यूम घुसपैठ पिछली रिपोर्टों 42,48 में किसी भी घुसपैठ मीडिया के साथ प्राप्त उन लोगों के बराबर प्रोटीन के उत्पादन के परिणामस्वरूप मनाया. इसके विपरीत, YEB या लेग मीडिया में उगाई undiluted Agrobacteria साथ घुसपैठ एन की पूरी कारण कमजोर पड़ में हुई अटल बिहारी मध्यम में उगाई undiluted Agrobacteria घुसपैठ पौधों के स्वास्थ्य पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जबकि benthamiana DAT (कम से कम 24 घंटे बाद घुसपैठ में पत्तेएक) नहीं दिखाया गया है. चित्रा 1 बी में सचित्र के रूप में, पौधों YEB, लेग या अटल बिहारी मीडिया में वृद्धि हुई है और मिल्ली क्यू पानी (1:5, एक 600 0.6-0.8 की या 1:10, ए 600 0.3-0.4 से) से पता चला है साथ पतला Agrobacterium संस्कृतियों के साथ घुसपैठ कोई लक्षण नहीं है और क्रमश: 1645, 1520 और 1839, के एक औसत GFP उत्पादन का प्रदर्शन किया. Agrobacteria (एमएमए) सीधे मिल्ली क्यू पानी में पतला Agrobacteria (की तुलना में प्रोटीन के उत्पादन में लक्षण और कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया centrifuged और प्रेरण मध्यम में फिर से निलंबित क्रमश: 1671 ± 102 और 1667 ± 131 मिलीग्राम / किग्रा). इसलिए, मिल्ली क्यू पानी संयंत्र घुसपैठ के लिए Agrobacterium संस्कृतियों गिराए लिए सिफारिश की है और नियमित तौर पर 0.5 की एक ए 600 को प्राप्त करने के लिए हमारे बाद के प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था.

लक्ष्य अभिव्यक्ति पर Agrobacterium निलंबन सेल घनत्व और समय निश्चित रूप से प्रभाव. हम अगले जांच अगर बैक्टीरिया कोशिका घनत्वघुसपैठ और लक्ष्य अभिव्यक्ति के स्तर की क्षमता को प्रभावित करता. इस प्रयोजन के लिए, हम pBID4 GFP, 1.0 का एक 600, 0.5, 0.1 और 0.05 ले जाने Agrobacterium के चार अलग अलग सेल निलंबन घनत्व का आकलन किया. निम्नलिखित घुसपैठ, एन benthamiana पौधों 4, 7 और 10 डीपीआई पर नमूने इकट्ठा करके दिखाई लक्षण विकास और लक्ष्य अभिव्यक्ति के समय के पाठ्यक्रम के लिए निगरानी की गई. 4 डीपीआई पर, हम Agrobacterium के विभिन्न सेल निलंबन घनत्व के साथ घुसपैठ पौधों के बीच GFP प्रतिदीप्ति में नजर मतभेद (कोई GFP अभिव्यक्ति 0.05 की एक 600 में मनाया गया) मनाया. 7 डीपीआई पर, GFP प्रतिदीप्ति एक 600 1.0, 0.5 और 0.1 की सेल निलंबन घनत्व में घुसपैठ पौधों में समान था, लेकिन 0.05 की एक ए 600 में घुसपैठ पौधों में कम थी. चित्रा 1C में दिखाया गया है, इन आंकड़ों पश्चिमी धब्बा द्वारा पुष्टि की गई एक 600 पर बहुत कम प्रोटीन उत्पादन दिखा 4 डीपीआई पर एकत्र नमूनों का विश्लेषण करती है 600 में उच्चतम यूबी>. 0.05 की एक 600 कम GFP उत्पादन (1199 मिलीग्राम / किग्रा) से पता चला है, जबकि 7 डीपीआई पर, पौधों, (क्रमश: 1,662, 1,870 और 1,890,) 1.0, 0.5 और 0.1 का एक 600 का अनुमान GFP उत्पादन में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाया. इसके विपरीत, 10 डीपीआई पर GFP उत्पादन में कोई मतभेद चार सेल निलंबन घनत्व (1,218, 1,181, 1,197 और 1,304) में से किसी के साथ घुसपैठ पौधों के बीच मनाया गया.

Agrobacterium के वैकल्पिक उपभेदों के साथ घुसपैठ. क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपलब्ध Agrobacterium उपभेदों की विविधता बढ़ाने के लिए, हम जंगली प्रकार आइसोलेट्स परीक्षण किया. प्राकृतिक सेनाओं का ताज पित्त से अलग इन उपभेदों, कृपया डॉ. Gelvin (पर्ड्यू विश्वविद्यालय, पश्चिम Lafayette, इंडियाना) द्वारा प्रदान किया गया. क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन में उनकी उपयोगिता की जांच करने के लिए, हम एन घुसपैठ निम्नलिखित उपभेदों कैर साथ benthamianaयिंग pBID4-LicKM 18: ए rhizogenes (ए 4) और ए जंगली प्रकार नेस्टर A348, A208, और A281 उपभेदों (At6, At10 नाम है, और At77, क्रमशः), और साथ ही ए के इंजीनियर प्रयोगशाला उपभेदों tumefaciens tumefaciens GV3101, C58C1, और LBA4404. घुसपैठ की पत्तियों 7 डीपीआई पर एकत्र किए गए थे और LicKM अभिव्यक्ति के स्तर पर पश्चिमी धब्बा परख द्वारा अनुमान लगाया गया था. , चित्रा 2A, LicKM उत्पादन के उच्चतम स्तर में दिखाया गया है उपभेदों GV3101, ए 4 और LBA4404 (~ 1750 ± 163, 1650 ± 26 और 1,450 ± 117 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) मामूली अंतर के साथ, के साथ प्राप्त किया जा सकता है अभिव्यक्ति के निम्नतम स्तर C58C1 साथ (~ 900 ± 102 मिलीग्राम / किग्रा); और (क्रमशः ~ 1250 ± 19, 1100 ± 42 और 1200 ± 111 मिलीग्राम / किग्रा) At6, At10 और At77 साथ मध्यवर्ती उत्पादन. lichenase enzymatic गतिविधि Zymogram परख का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. चित्रा 2B से किसी का उपयोग घुसपैठ संयंत्र के ऊतकों में lichenase उत्पादित पता चलता है किAgrobacterium उपभेदों enzymatically सक्रिय था. At10 साथ लक्षण हल्के थे तनाव, जबकि एक भी रोग के लक्षणों (stunting, डंठल बढ़ाव और कर्लिंग, और पत्ती कर्लिंग) दिखाया ए 4 और At77 उपभेदों के साथ घुसपैठ की कि एन benthamiana पौधों को ध्यान देना चाहिए. कोई लक्षण प्रयोगशाला तनाव GV3101 (चित्रा -2) के साथ घुसपैठ एन benthamiana पौधों में मनाया गया.

वैकल्पिक Nicotiana प्रजातियों की घुसपैठ. हम निकोटियाना जीनस (एन benthamiana और एन एक्सेलसियर) के और एक संकर प्रजातियों, एन में दो प्रकार के जंगली प्रजातियों में बायोमास पीढ़ी और प्रोटीन के उत्पादन की दर की तुलना में excelsiana (एन एक्सेलसियर × एन benthamiana). परीक्षण किया प्रजातियों, एन benthamiana, Agrobacterium के आधार पर या वायरल आधारित अभिव्यक्ति सिस्टम 2,34,4 का उपयोग क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मेजबान9, अंकुरण के 4-5 सप्ताह के भीतर घुसपैठ तत्परता तक पहुँचता है. बायोमास के इष्टतम स्तर उत्पन्न करने के लिए आवश्यक विकास की अवधि भी एन के लिए 4-5 सप्ताह है excelsiana लेकिन एन के लिए (6-7 सप्ताह) रह गया है एक्सेलसियर. इसके अलावा, संयंत्र internodes एन के लिए अपेक्षाकृत कम कर रहे हैं एक्सेलसियर अन्य Nicotiana प्रजातियों की तुलना में.

इसके अलावा, हम एन की कि वैक्यूम घुसपैठ मनाया benthamiana और एन 60 सेकंड के लिए 50-250 एम्बार पर excelsiana, पूरे पत्ते की agroinfiltration के लिए अत्यधिक कुशल है, जबकि एन एक्सेलसियर एक निर्वात ऐसे Sillwet-77 या S240 के रूप में गैर ईओण surfactants की उपस्थिति में 1 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार आवेदन किया था, तब भी जब कारण उनके कम चंदवा और चमड़े के पत्तों को घुसपैठ करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, एन के अंकुरण दर excelsiana और एन एक्सेलसियर बीज ~ 40-50% थी; 90-100% तक अंकुरण दर को बढ़ाने के लिए, बीज 10% blea के साथ इलाज किया जाना चाहिएबोने से पहले 1 घंटे के लिए चर्चा. वही विकास की स्थिति, एन से उत्पन्न हो सकता है कि उच्चतम पत्ती बायोमास के तहत excelsiana एन के साथ तुलना में लगभग उच्चतर दो गुना है benthamiana (1 टेबल).

प्रोटीन के उत्पादन एन में जांच की गई थी benthamiana, एन ऊँचे और एन excelsiana pBID4-GFP शरण Agrobacterium तनाव GV3101 के साथ घुसपैठ की. GFP संचय पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बाद पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग पूरी घुसपैठ की पत्तियों में 7 डीपीआई पर मूल्यांकन किया गया था. चित्रा 3 ए एन में GFP का भी वितरण से पता चलता है benthamiana और एन excelsiana और एन में असमान वितरण एक्सेलसियर (कारण एन एक्सेलसियर की एक पूरी पत्ती क्षेत्र में घुसपैठ की एक कठिनाई के लिए). 3B चित्रा 7 डीपीआई पर तीन Nicotiana प्रजातियों से एकत्र घुसपैठ की पत्तियों में यूवी प्रकाश रोशनी से अनुमान लगाया GFP उत्पादन के स्तर को दर्शाता है. GFP accumuआबादी स्तर एन में अधिक था एन में से benthamiana (~ 2.23 ग्राम / किग्रा) excelsiana और एन एक्सेलसियर (क्रमशः ~ 1.89 और 1.54 ग्राम / किलो,). एन में प्रोटीन के उत्पादन का स्तर कम एक्सेलसियर असमान घुसपैठ और एकत्र पत्ती में संचित GFP के वितरण की वजह से है.

हम सीधे प्रकाश के संपर्क में ऊपरी पत्ते अक्सर मंडप के नीचे पत्तों से (2-4 डीपीआई पर) क्षणिक GFP संचय की जल्द से जल्द और उच्चतम स्तर है कि प्रदर्शन मनाया. हालांकि, हमारे अध्ययन में, GFP संचय 7 डीपीआई पर सबसे ज्यादा था और कोई GFP संचय दिखा जो uninfiltrated नव बढ़ रही पत्तियों को छोड़कर अधिकांश पत्ते भर में समान रूप से वितरित किया गया.

क्षणिक प्रोटीन उत्पादन. वैक्यूम घुसपैठ पर वैक्यूम दबाव और अवधि का प्रभाव काफी एक needleless सिरिंज 42 के साथ हाथ इंजेक्शन से लागू करने के लिए दबाव की तुलना क्षणिक अभिव्यक्ति का स्तर बढ़ता है. एक के आवेदनवैक्यूम रंध्र के माध्यम से पत्ते जलमग्न संयंत्र से खाली करने के लिए गैसों का कारण बनता है. वैक्यूम टूटी हुई है और दबाव तेजी से बढ़ जाती है, जब Agrobacterium के निलंबन खाली गैसों 50 की जगह की पत्तियों में संचालित है.

एन के पत्तों पर वैक्यूम दबाव के प्रभाव का परीक्षण benthamiana, हम 30 या 60 सेकंड के लिए विभिन्न निर्वात दबाव (50-400 एम्बार) के तहत pBID4-GFP शरण Agrobacterium तनाव GV3101 के साथ पौधों में घुसपैठ की. यह (50 एम्बार नीचे) मजबूत वैक्यूम शीघ्र ही घुसपैठ (24-48 घंटे) के बाद ऊतक कारण कमजोर पड़ गया और संयंत्र मौत के लिए अग्रणी, घुसपैठ की पत्तियों के यांत्रिक क्षति में 30 या 60 सेकंड के परिणाम के लिए आवेदन किया है कि प्रदर्शन किया गया. केवल 50 पत्ती क्षेत्र का% और GFP उत्पादन (303 ± 90 मिलीग्राम / किग्रा) (चित्रा -4 ए) की एक कम स्तर की घुसपैठ में मामूली निर्वात (400 एम्बार) परिणामों की दूसरी ओर, आवेदन पर. महत्वपूर्ण बात, हम 50, 10 के तहत GFP उत्पादन में कोई मतभेद मनाया0 और 200 एम्बार (1,651 ± 107, 1688 ± 40, 1594 ± 26 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) (चित्रा -4 ए) और हल्के नहीं, पादप स्वास्थ्य पर हानिकारक प्रभावों 50-200 एम्बार से निर्वात दबाव के 30 या 60 के लिए लागू किया गया जब सेक. इसलिए, वैक्यूम दबाव के 50-100 एम्बार घुसपैठ प्रयोगों के लिए सिफारिश की है.

लक्ष्य अभिव्यक्ति पर निर्वात की अवधि के प्रभाव एन के एक फ्लैट में घुसपैठ द्वारा मूल्यांकन किया गया था benthamiana पौधों pBID4 शरण GV3101 के 0.5 से एक ए 600 के साथ हर घंटे -. एक ही Agrobacterium संस्कृति में 8 घंटे के लिए GFP 4B चित्रा GFP उत्पादन का स्तर समान सभी समय सुझाव, 8 घंटा तक अंक ऊपर था कि पता चलता है कि इस पर समय की अवधि Agrobacterium एक एकल असहाय डीएनए लांच करने की क्षमता रखता है.

प्रोटीन के उत्पादन पर रासायनिक प्रेरण का प्रभाव. कुछ संयंत्र phenolic मेटाबोलाइट्स और शक्कर इंडस्ट्रीज़ कर सकते हैंए के UCE डाह जीन 1,52 tumefaciens. एक परिणाम के रूप में, कई रसायनों और monosaccharaides विभिन्न प्रजातियों के पौधे में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है. Acetosyringone सबसे अधिक ए की संस्कृतियों में जोड़ा जाता है agroinfiltration 40,53-57 पहले वीर operon प्रेरित करने के लिए tumefaciens.

हम एन में क्षणिक GFP प्रोटीन के उत्पादन पर acetosyringone के विभिन्न सांद्रता (0, 100, 200 और 400 माइक्रोन) और ग्लूकोज (0-4%) के प्रभाव का आकलन किया है GFP - benthamiana Agrobacterium तनाव GV3101 pBID4 को शरण देने के साथ घुसपैठ की. इस प्रयोजन के लिए, हम घुसपैठ से पहले 1-3 घंटे के लिए acetosyringone और ग्लूकोज के विभिन्न एकाग्रता युक्त एमएमए प्रेरण मीडिया में Agrobacterium कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया. दोनों दृश्य अवलोकन (डेटा) नहीं दिखाया और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्रा 4C), परीक्षण किया एकाग्रता से कोई भी के परिणामों के अनुसारइन यौगिकों की प्रेरण मीडिया में कोई acetosyringone या ग्लूकोज निहित जहां नियंत्रण के साथ तुलना में GFP प्रतिदीप्ति या प्रोटीन के उत्पादन में उल्लेखनीय वृद्धि प्रेरित किया.

एन में GFP और HAC1 जीन की क्षणिक उत्पादन पर एक मुंह बंद शमन के सह घुसपैठ का प्रभाव benthamiana छोड़ देता है. यह पहले संवाददाता प्रोटीन 34 का बढ़ाया उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप, एक मुंह बंद शमन (टमाटर जंगली स्टंट वायरस की p19 [TBSV]) के बाद transcriptional जीन मुंह (PTGS) के साथ हस्तक्षेप की कि सह अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया.

हम एन के सह घुसपैठ के प्रभाव का मूल्यांकन किया है GFP रिपोर्टर जीन (pBID4 GFP) और p19 ले जाने लांच वेक्टर साथ benthamiana. ए के पहले घुसपैठ करने के लिए, एक ए 600 0.5 की dilutions pBID4-GFP और p19 शरण tumefaciens GV3101 संस्कृतियों क्रमशः 1:1, 2:1, 3:1 और 4:1. एक्सप्रेस के अनुपात में मिलाया गयामुंह बंद करने का शमन करने के आयन फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर द्वारा नियंत्रित किया गया था. 7 डीपीआई (चित्रा 5A) पर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के परिणामों से संकेत दिया है, p19 की उपस्थिति बढ़ाने के लिए या एन में GFP उत्पादन में कमी नहीं की थी benthamiana, दो Agrobacterium निलंबन के किसी भी अनुपात में.

P23and p19 - - HAC1 के लिए PTGS की रोकथाम पर हम भी दो वायरल जीन मुंह बंद दमन के प्रभाव की तुलना में है. लांच वेक्टर pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) और दो ​​वायरल मुंह बंद शमन plasmids के एक ले जाने Agrobacterium की संस्कृति क्रमशः 4:1, के अनुपात में मिलाया, 0.5 का एक ए 600 को पतला, और थे 4-5 सप्ताह पुराने एन में सह घुसपैठ benthamiana. ए के निलंबन pBID4 ले जाने tumefaciens - HAC1 अकेले एक नियंत्रण के रूप में घुसपैठ कर रहा था. घुसपैठ की पत्ती के नमूने 3 से 8 डीपीआई के लिए एकत्र किए गए थे. प्रयोग repe थाHAC1 अभिव्यक्ति की पैदा तीन बार और औसत स्तर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित की.

चित्रा 5 ब, एन के सह घुसपैठ में प्रदर्शन P23 या p19 साथ benthamiana (क्रमशः 642 ± 157 और 764 ± 108 मिलीग्राम / किग्रा) में 6 डीपीआई पर (क्रमशः लगभग 15-25%), कोई मुंह बंद शमन का उपयोग कर के साथ तुलना HAC1 उत्पादन में वृद्धि हुई. इस P23 और p19 हमारे सिस्टम में कुशल होते हैं. हालांकि, यह pBID4-HAC1 p19 साथ सह घुसपैठ की थी जब HAC1 का संचय एक दिन पहले हुआ है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इसलिए, हमारे परिणाम HAC1 पर मुंह बंद करने का शमन p19 और GFP संचय के प्रभाव क्षणिक अभिव्यक्ति और / या एन में कुछ प्रोटीन की स्थिरता के चुनिंदा वृद्धि, सुझाव है कि अलग अलग हैं का प्रदर्शन benthamiana.

हम यह भी कहा कि उपस्थिति में और एक मुंह बंद शमन HAC1 प्रोटीन उत्पादों के स्तर के अभाव में दोनोंuction 7 डीपीआई में गिरावट शुरू कर दिया. इस प्रक्षेपण वेक्टर साथ घुसपैठ एन benthamiana में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन में गिरावट के समय लक्ष्य विशिष्ट है कि इंगित करता है.

लांच वेक्टर शरण Agrobacterium की सेल बैंक लक्ष्य जीन स्थिरता, Agrobacterium व्यवहार्यता और प्रोटीन संचय के स्तर के लिए हर साल मूल्यांकन किया गया था. -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो गया था कि pBID4-HAC1 साथ बदल GV3101 तनाव की सेल बैंक की ग्लिसरॉल स्टॉक घुसपैठ एन में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के स्तर में बदलाव के बिना अधिक से अधिक तीन साल के लिए बहुत स्थिर होना दिखाया गया है benthamiana पौधों. चित्रा 5C 2010, 2011, 2012 और 2013 के वर्षों में पश्चिमी सोख्ता द्वारा अनुमानित HAC1 प्रोटीन के उत्पादन में क्रमश: 670, 685, 566 और 683 मिलीग्राम / किलो था, यह दर्शाता है कि. एन में औसत HAC1 उत्पादन benthamiana पौधों 651 ± 49.4 मिलीग्राम / किलो था.


तालिका 1. एन की तुलना benthamiana और एन excelsiana संयंत्र बायोमास उत्पादन.

चित्रा 1
चित्रा 1. एन में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण benthamiana. (ए) छह सप्ताह पुरानी एन benthamiana 1) 4.8% फास्फोरस युक्त उर्वरक समाधान में बढ़ती पौधों और 2) पौधों 0% फास्फोरस युक्त उर्वरक समाधान में बढ़ रहा है. ताजा पत्ती वजन बराबर की पच्चीस ग्राम लेन प्रति भरी हुई थी. GFP उत्पादन (बी) तुलना pBID साथ घुसपैठ पौधों निर्वात मेंतीन अलग अलग मीडिया में उगाई 4 GFP-शरण Agrobacterium GV3101 संस्कृति: YEB, एबी और लेग. GV3101 संस्कृतियों YEB में ओ / एन बड़ा हो या लेग मीडिया कम गति पर centrifuged थे और (एमएमए) (गलियों: एमएमए-1 और एमएमए-2, क्रमशः) प्रेरण माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया, या YEB में ओ / एन उगाई, लेग या अटल बिहारी मीडिया और सीधे 1:05 या मिल्ली क्यू पानी से 01:10 तक पतला (गलियों: YEB / 5 और YEB/10, एबी / 5 और AB/10, लेग / 5 और LB/10) (सी) तुलना. ए के विभिन्न सांद्रता (1.0 की 600, 0.5, 0.1 और 0.05) के साथ वैक्यूम घुसपैठ निम्नलिखित 4, 7 और 10 डीपीआई पर GFP अभिव्यक्ति की pBID4-GFP ले जाने GV3101 तनाव tumefaciens.

चित्रा 2
एन के चित्रा 2. क्षणिक lichenase उत्पादन और गतिविधि की तुलना निम्नलिखित वैक्यूम घुसपैठ diffe साथ benthamiana पौधोंAgrobacteria के उपभेदों किराया. Agrobacteria उपभेदों (GV3101, ए 4, At77, C58C1, At6, At10 और LBA4404) की संस्कृति pBID4-LicKM एन के पत्तों में व्यक्तिगत रूप से घुसपैठ कर रहे थे लांच वेक्टर शरण benthamiana. घुसपैठ की पत्तियों 7 डीपीआई पर एकत्र किए गए थे. पश्चिमी सोख्ता द्वारा मात्रा (ए) Lichenase उत्पादन. (बी) Zymogram परख enzymatic गतिविधि के माध्यम से lichenase उत्पादन का प्रदर्शन है. Agrobacterium (सी) प्रभाव (जंगली प्रकार के ए 4, At10, At77 और प्रयोगशाला तनाव GV3101) एन पर घुसपैठ 7 डीपीआई पर benthamiana संयंत्र स्वास्थ्य. ताजा पत्ती वजन बराबर की पच्चीस ग्राम लेन प्रति भरी हुई थी.

चित्रा 3
एन की पत्तियों में चित्रा 3. क्षणिक GFP अभिव्यक्ति benthamiaना, ए के साथ वैक्यूम घुसपैठ के बाद 7 डीपीआई पर एन excelsiana और एन एक्सेलसियर GFP - लांच वेक्टर pBID4 शरण tumefaciens. GFP संचय की पराबैंगनी प्रकाश के तहत GFP अभिव्यक्ति की (ए) दृश्य परीक्षा. (बी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण.

चित्रा 4
चित्रा 4. क्षणिक GFP अभिव्यक्ति और पादप स्वास्थ्य पर वैक्यूम दबाव के (ए) प्रभाव. एन benthamiana पौधों pBID4 साथ घुसपैठ कर रहे थे. - 400, 200, 100 या 50 एम्बार के निर्वात दबाव के तहत GFP, 30 या 60 सेकंड के निर्वात पकड़े समय में (बी) स्थिरता और ए के संक्रामकता एन में tumefaciens benthamiana Agrobacterium GV3101 pBID4-GFP एबी माध्यम में वृद्धि हुई है और 0.5 का एक ए 600 को पतला शरण देने के साथ घुसपैठ की. Agroinfiltration एन के एक फ्लैट में घुसपैठ द्वारा किया गया था GFP की क्षणिक अभिव्यक्ति पर acetosyringone और ग्लूकोज के विभिन्न सांद्रता का एक ही पतला Agrobacterium संस्कृति (गलियों 0-8). (सी) के प्रभाव में benthamiana पौधों हर घंटे. PBID4 शरण Agrobacterium तनाव GV3101 - GFP, YEB मीडिया में ओ / एन उगाया centrifuged और 200 युक्त 0, 100, 200 या 400 माइक्रोन पर acetosyringone साथ 2% ग्लूकोज युक्त एमएमए में, या एमएमए में या तो 0.5 का एक ए 600 को resuspended किया गया था 0 में ग्लूकोज के साथ माइक्रोन acetosyringone, 1, 2 या 4%. Agrobacterium निलंबन घुसपैठ से पहले कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए रखा गया था.

चित्रा 5
चित्रा 5. एन में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन पर मुंह बंद करने के दमन का प्रभाव benthamiana छोड़ देता है. (एPBID4-GFP के सह घुसपैठ और अलग अनुपात में p19 निम्नलिखित GFP प्रोटीन का) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. 7 डीपीआई (ताजा पत्ती वजन बराबर की 25 ग्राम लेन प्रति भरी हुई थी). (बी) pBID4-HAC1 ले जाने Agrobacterium की संस्कृति पर एकत्र नमूनों को व्यक्तिगत रूप से p19 या P23 मुंह बंद शमन ले जाने के एक संस्कृति के साथ 04:01 के अनुपात में मिलाया गया था plasmids. Agrobacterium संस्कृतियों के परिणामस्वरूप संयोजन वैक्यूम पौधों में घुसपैठ कर रहे थे. HAC1 की घुसपैठ ऊतकों पुनः संयोजक प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए 8 डीपीआई अप करने के लिए दैनिक एकत्र किए गए थे. Agrobacterium सेल बैंक (सी) स्थिरता. पौधे प्रोटीन संचय का मूल्यांकन करने के लिए हर साल Agrobacterium सेल बैंक के एक ही बैच के साथ घुसपैठ कर रहे थे. ताजा पत्ती वजन बराबर की पचास ग्राम लेन प्रति भरी हुई थी. वीं का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है.

Discussion

इस अध्ययन में, हम लांच वेक्टर ले जाने Agrobacterium उपभेदों का उपयोग कर चयनित Nicotiana प्रजातियों में नियमित क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक सरल agroinfiltration प्रोटोकॉल विकसित किया है. इसके अलावा, हम अपने क्षणिक संयंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली में उच्चतम पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन स्तर को प्राप्त करने के इष्टतम स्थितियों की पहचान की है.

पतला ए के वैक्यूम घुसपैठ एन में लांच वेक्टर pBID4 शरण तनाव GV3101 tumefaciens benthamiana, एन excelsiana और एन एक्सेलसियर ऐसे अल्फला मोज़ेक वायरस शरण GV3101 के साथ घुसपैठ की मटर के रूप में अन्य प्रजातियों के पौधे की तुलना में 7 डीपीआई के भीतर लक्ष्य प्रोटीन के उत्पादन के उच्च स्तर में हुई है - या ककड़ी मोज़ेक 35S प्रमोटर के तहत GFP रिपोर्टर जीन व्यक्त वायरस आधारित वैक्टर 41, या Lactuca Sativa, सोलेनम lycoए के C58C1 तनाव के साथ घुसपैठ persicum और Arabidopsis thaliana बीटा glucuronidase रिपोर्टर जीन 57. एन ले जाने tumefaciens benthamiana और एन excelsiana 90-95% घुसपैठ दक्षता के साथ, 30-60 सेकंड के लिए 50 एम्बार में घुसपैठ वैक्यूम करने के लिए आसान थे. पत्ती क्षेत्र की शेष 5-10% क्योंकि निर्वात के आवेदन के दौरान Agrobacterium निलंबन की सतह पर पत्तों के कुछ चल की घुसपैठ नहीं किया गया था. लांच वेक्टर सेल करने वाली सेल आंदोलन 18 के लिए क्षमता है के बाद से, क्षणिक प्रोटीन संचय 7 डीपीआई पर पूरे पत्ते के साथ ही petioles में होता है. PBID4 अभिव्यक्ति वेक्टर सेल से सेल को स्थानांतरित करने में सक्षम है लेकिन प्रणालीबद्ध 18 स्थानांतरित करने के लिए नहीं है क्योंकि 10 डीपीआई पर, अनुमानित GFP उत्पादन थोड़ा कम था; इसलिए, नव विकसित पत्तियों वेक्टर शामिल नहीं है और लक्ष्य के उत्पादन में योगदान नहीं है. इसके अलावा, पुनः संयोजक प्रोटीन की गिरावट से अधिक समय Mप्र 10 डीपीआई पर कम प्रोटीन के स्तर में योगदान. हमारे परिणाम बताते हैं ए की कि घुसपैठ से पता चला एन में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के tumefaciens तनाव GV3101 मध्यस्थता उच्च स्तर benthamiana. इसके अलावा, लक्ष्य प्रोटीन lichenase को एन टर्मिनल, सी टर्मिनल या आंतरिक fusions (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, क्लोस्ट्रीडियम thermocellum से एक थर्मास्टाइबल एंजाइम है और कई लक्ष्य को thermostability प्रदान के रूप में जो इंजीनियर हो सकता है प्रोटीन संलयन 18. एन की घुसपैठ ए के साथ benthamiana पत्ती कर्लिंग, डंठल बढ़ाव, और कर्लिंग: हल्के या गंभीर लक्षण हासिल ब्याज की जीन को शरण जंगली प्रकार उपभेदों (at6, at10 और at77) tumefaciens. कोई रोग लक्षण एन में मनाया गया कुछ जीन GV3101 उपभेदों pBID4 में डाला और प्रयोगशाला में तब्दील करते हुए benthamiana, खाली pBID4 वेक्टर शरण प्रयोगशाला तनाव GV3101 साथ घुसपैठ, C58C1 या LBA4404 हल्के परिगलित प्रतिक्रियाओं और पत्ती हासिलहरिद्रोग / पत्तों की घुसपैठ क्षेत्रों में लक्षण पीली. जंगली प्रकार Agrobacterium या solanaceous पौधों में निरस्त्र उपभेदों के कारण परिगलित लक्षण पहले से 56,57 सूचित किया गया है. परिगलित प्रतिक्रिया प्रकार III स्राव प्रणाली, प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली द्वारा संयंत्र सेल को हस्तांतरित बैक्टीरियल प्रोटीन, और / या flagellin 58-60 के प्रति संवेदनशीलता का विषैलापन कारकों से परिणाम सकता है. हम heterologous प्रोटीन की क्षणिक उत्पादन भी pathogenicity बटोर सकते हैं और घुसपैठ संयंत्र में एक अत्यंत अनुभुत प्रतिक्रिया छोड़ देता है कि मिल गया है. कई शोधकर्ताओं stably तब्दील पौधों 28,57 की तुलना में क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन के 5-20 गुना ज्यादा के स्तर तक का उत्पादन संयंत्र द्विआधारी वैक्टर के साथ विभिन्न प्रजातियों के पौधे की कि agroinfiltration की सूचना दी. हमारे डेटा से पता चलता है कि एन benthamiana GV3101 के लिए सूचना दी GFP उपज के समान है जो GFP, के pBID4-GFP transiently व्यक्त उच्च स्तर को शरण देने के साथ घुसपैठएन benthamiana Agrobacteria Pich-GFPSYS वायरल वेक्टर (कुल घुलनशील प्रोटीन के ऊपर से 80%) 44 ले जाने के साथ घुसपैठ की. अपने लांच के सदिश का उपयोग Agroinfiltration थर्मास्टाइबल प्रोटीन LicKM के उच्च उत्पादन के परिणामस्वरूप, एक मानक बाइनरी प्लाज्मिड 18 का उपयोग करते हुए कहा कि अधिक से अधिक 50 गुना.

ए की संक्रामकता परीक्षण करने के लिए tumefaciens और प्रक्षेपण वेक्टर की स्थिरता, हम एन के एक फ्लैट में घुसपैठ benthamiana pBID4-GFP प्लाज्मिड शरण GV3101 का एक ही मिल्ली क्यू पानी में पतला संस्कृति का उपयोग करने के लिए 8 घंटे के लिए हर घंटे. हमारे आंकड़े GV3101 तनाव कुशलता से कम से कम 8 घंटे और pBID4 (लांच सदिश) के लिए संक्रामक पता चला है कि 8 घंटा भर की घुसपैठ के दौरान बहुत स्थिर है.

-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत लांच वेक्टर pBID4-HAC1 (सेल बैंक) को शरण देने GV3101 तनाव की ग्लिसरॉल स्टॉक क्षणिक prote में बदलाव के बिना तीन साल के लिए बहुत स्थिर होना दिखाया गया हैघुसपैठ संयंत्रों में उत्पादन में.

इष्टतम स्थितियों और 35 के बीच और 42 दिनों के बाद बुआई के तहत हो एन benthamiana पौधों वैक्यूम घुसपैठ की मध्यस्थता क्षणिक जीन अभिव्यक्ति 40 के इष्टतम थे. (3-4 सप्ताह पुराने) युवा पौधों क्योंकि सेल निलंबन सतह और एक निर्वात लागू करने की यांत्रिक प्रभाव से ऊतकों को नुकसान पर चल पत्तियों की पूरी तरह से घुसपैठ नहीं किया जा सकता. 45 दिन, एन से अधिक पुराने संयंत्रों में benthamiana इस्तेमाल किया इष्टतम प्रकाश परिस्थितियों में, मंच पेंच, क्षणिक अभिव्यक्ति का स्तर कम है.

कम आणविक भार phenolic यौगिकों (acetosyringone) और monosaccharaides (ग्लूकोज) 55,61 tumefaciens ए में वीर जीन प्रेरित करने के लिए जाना जाता है. इसके अलावा, एन की घुसपैठ 50-600 माइक्रोन की सांद्रता में acetosyringone की उपस्थिति में द्विआधारी वेक्टर pCAMBIA (GFP) के साथ benthamiana थोड़ा क्षणिक वृद्धि दिखाया गयाजीन अभिव्यक्ति 40. हम 3 घंटे के लिए एमएमए में pBID4-GFP शरण GV3101 संस्कृतियों के लिए इन यौगिकों जोड़कर हमारे सिस्टम में acetosyringone और ग्लूकोज के विभिन्न सांद्रता के प्रभाव का अध्ययन किया, और GFP अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं पाया. दिलचस्प है, pBID4-GFP शरण देने और 0.5 का एक ए 600 को मिल्ली क्यू पानी में पतला और वीर जीन प्रेरण बिना घुसपैठ GV3101 संस्कृतियों प्रेरित संस्कृतियों के साथ घुसपैठ की उन के रूप में GFP की एक ही मात्रा में व्यक्त किया. ए tumefaciens वीर जीन (ओं) संभावित संयंत्र phenolic यौगिकों (acetosyringone और sinapinic एसिड) और पत्ता ऊतक में उपस्थित संयंत्र monosaccharaides (ग्लूकोज और फ्रुक्टोज) द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. इसलिए, हम एक्सोजेनस वीर जीन inducers की उपस्थिति या अनुपस्थिति में GFP अभिव्यक्ति के समान स्तर संयंत्र कोशिकाओं में GFP-व्यक्त लांच वेक्टर की प्रतिकृति के दौरान उपस्थित cytoplasmic वीर जीन inducers के प्रभाव की वजह से हो सकता है कि अटकलें.

एन benthamiana क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन में 49 के लिए एक मॉडल के मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, एन benthamiana की अपेक्षाकृत कम बायोमास उपज पुनः संयोजक प्रोटीन का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अपने आवेदन hinders. इष्टतम मेजबान क्षणिक अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तरीय, एक ग्रीन हाउस में आसान वृद्धि गठबंधन, और Agrobacterium घुसपैठ 2 के लिए अतिसंवेदनशील होना चाहिए. एक विकल्प के मेजबान का चयन करने के लिए, हम एक संकर एन निकोटियाना (एन benthamiana और एन छीलन) की दो अलग अलग प्रकार के जंगली प्रजातियों में घुसपैठ की और ए के साथ excelsiana (एन एक्सेलसियर × एन benthamiana) pBID4-GFP प्लाज्मिड शरण तनाव GV3101 tumefaciens. इन तीन प्रजातियों के बीच, GFP अभिव्यक्ति के स्तर एन में थोड़ा अधिक था benthamiana. एन ऊँचे पौधों की वजह से उनकी चमड़े के पत्तों को वैक्यूम agroinfiltration में कठिनाई से पता चला है, और एन excelsianaउत्पादन लगभग एक ही विकास शर्तों के तहत अधिक बायोमास दो गुना. 7 डीपीआई पर GFP की क्षणिक उत्पादन एन में अपेक्षाकृत समान है benthamiana और एन excelsiana. इसलिए, एन excelsiana पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक अधिक उपयुक्त मेजबान हो सकता है.

Agrobacterium की मध्यस्थता क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन जीन संयंत्र वायरस की उत्पत्ति 62 का दमन मुंह बंद के सह अभिव्यक्ति से दूर किया जा सकता है, जो PTGS 26, द्वारा सीमित है. क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन पहले से घुसपैठ ऊतकों 34 में PTGS रोकता है जो TBSV की p19 प्रोटीन, की उपस्थिति में 50 गुना बढ़ाया जा दिखाया गया है. हमारे अध्ययन में, हम अलग से लांच वेक्टर pBID4-HAC1 साथ सह घुसपैठ की दो वायरल मुंह बंद दमन (p19 और p23) के प्रभाव का आकलन किया. इन मुंह बंद दमन के सह घुसपैठ HAC1 में केवल एक मामूली वृद्धि के साथ, HAC1 की क्षणिक अभिव्यक्ति पर थोड़ा प्रभाव है प्रतीत होता हैसह घुसपैठ P23 या p19 की उपस्थिति में प्रोटीन संचय (15-25%). सकारात्मक प्रोटीन के उत्पादन को प्रभावित करने के लिए, मुंह बंद दमन विशेष रूप से लक्षित प्रजातियों के पौधे और वायरल वेक्टर 63 के लिए प्रभावी होने के लिए चयनित किए जाने की आवश्यकता हो सकती है. TMV helicase आरएनए मुंह बंद गतिविधि 64,65 के एक शमन है. PBID4-HAC1 साथ P23 या p19 के सह घुसपैठ GFP में कोई वृद्धि या क्षणिक HAC1 प्रोटीन के उत्पादन में मामूली वृद्धि के परिणामस्वरूप के रूप में हमारे आंकड़े इस अवलोकन की पुष्टि करें.

अंत में, हम संशोधित और अनुकूलित संयंत्र और Agrobacterium विकास की स्थिति और वैक्यूम घुसपैठ की दक्षता में सुधार हुआ है. यह तकनीक कुछ ही घंटों में संयंत्र सामग्री के किलोग्राम के सैकड़ों बढ़ने और घुसपैठ करने के लिए सक्षम होना चाहिए. हम सफलतापूर्वक वर्तमान अच्छा विनिर्माण पद्धतियों (cGMP) की शर्तों के तहत औद्योगिक तराजू पर उच्च throughput वैक्सीन उत्पादन के लिए संयंत्र क्षणिक अभिव्यक्ति तकनीक स्वचालित. ABO अधिक जानकारी के लिएकेन्द्र शासित प्रदेशों के स्वचालन और cGMP परिस्थितियों में सबयूनिट वैक्सीन उम्मीदवारों सहित पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए संयंत्र क्षणिक प्रोटीन उत्पादन प्रणाली, का उपयोग, पाठकों वेबसाइट में भेजा जाता है www.fhcmb.org/ .

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम आण्विक जैव प्रौद्योगिकी, iBio, इंक और रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (अनुदान # HDTRA1-07-C-0054) के लिए Fraunhofer अमरीका केंद्र द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों डीआरएस द्वारा उदार उपहार को स्वीकार करते हैं. जैव विज्ञान विभाग, पर्ड्यू विश्वविद्यालय (Agrobacterium उपभेदों tumefaciens) और बड़े पैमाने पर जीवविज्ञान कार्पोरेशन की वेन Fitzmaurice (एन excelsiana बीज), और साथ ही अमेरिका निकोटियाना संग्रह, उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय (एन एक्सेलसियर बीज की जेनिफर निकोल्सन के स्टैंटन Gelvin ). लेखकों पौधों और उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए मार्गरेट शिलिंगफोर्ड और क्रिस्टोफर हल धन्यवाद. लेखकों को भी डीआरएस धन्यवाद. संपादकीय सहायता के लिए स्टीफन Streatfield और नताशा Kushnir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

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प्लांट बायोलॉजी अंक 86 Agroinfiltration, क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन संयंत्र आधारित अभिव्यक्ति वायरल वेक्टर,
अनुकूलन और की उपयोगिता<em&gt; Agrobacterium</emमें&gt; मध्यस्थता क्षणिक प्रोटीन उत्पादन<em&gt; निकोटियाना</em
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Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V.,… More

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

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