Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optimizasyon ve Kullanımı Published: April 19, 2014 doi: 10.3791/51204
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

Summary

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Abstract

Bitkilerde Agrobacterium aracılı geçici protein üretim kısa bir süre içinde aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, bu teknoloji sadece şimdi üstesinden ediliyor büyütmek için büyük ölçekli üretim gibi birçok teknolojik engellerin uygulanacak başlıyor. Burada, Agrobacteria başlatmak vektörleri taşıyan Nicotiana bitkiler vakum infiltrasyon göre endüstriyel ölçekli geçici protein üretimi için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem ortaya koymaktadır. AB ortamı içinde Agrobacterium yetiştirme optimizasyonu sızma sürecinin basitleştirilmesi, Milli-Q su içinde bakteri kültürüne doğrudan seyreltme sağlar. Nicotiana, N., üç test edilmiş türler arasında, excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana) nedeniyle sızma kolaylığı en umut verici ev sahibi olarak seçildi, yüksek muhabiri protein üretimi düzeyi, ve yaklaşık iki-fkontrol edilen çevre koşulları altında eski yüksek biyokütle üretimi. Agrobacterium örneğin asetosiringon ve monosakkarit gibi kimyasal madde kullanarak pBID4-GFP (Tütün mozaik virüsü-esaslı) barındıran indüksiyonu protein üretim seviyesi üzerinde herhangi bir etkisi olmamıştır. 30 ya da 60 saniye için 50-100 mbar altında infiltratif bitki bitki yaprak dokularının yaklaşık% 95 infiltrasyonu ile sonuçlanmıştır. Agrobacterium GV3101 ırkına laboratuar ile infiltrasyon Agrobacteria laboratuar suşları ve LBA4404 C58C1 ve vahşi tip Agrobacteria at77 ve A4, AT10, AT6 suşları ile karşılaştırıldığında en yüksek protein üretimi göstermiştir. N. bir viral RNA susturma bastırıcı, p23 ya da p19, ve Co-sentezleme benthamiana hedef proteinin (influenza virüsü hemaglutinin) önceki birikimi ve üretim artışı (% 15-25) ile sonuçlanmıştır.

Introduction

Bitkiler şimdi heterolog rekombinant biyofarmasötikler ve endüstriyel proteinleri 1-3 üretmek için güvenli, güvenilir, ölçeklenebilir ve ucuz platformu olarak tanınan ve mikrobiyal ve hayvan hücre ekspresyon sistemleri üzerinde 4 önemli avantajlara sahiptir. Bitkiler monte Multimerik antikorlar 5-7 gibi translasyon sonrası modifikasyonlar, düzgün katlanmış proteinleri ifade edebiliyoruz. Çeşitli bitkisel kaynaklı rekombinant ilaç proteinlerinin klinik değerlendirme 8. geçiyor. Bu non-Hodgkin lenfoma 9, hemagglutinin bazlı pandemik ve mevsimsel influenza aşısı adayları 10,11 (Cummings ve diğerleri., Vaccine sunulan), anti-yüzey antijen Streptococcus I tedavisi için hastaya özgü rekombinant idiotip aşılar (scFv) gibi / diş çürüklerinin tedavisi 12, 13 ve diyabet tedavisi için insan insülini için II antikor. Bundan başka, insan recoGaucher hastalığında enzim replasman tedavisi için mbinant glikoserebrosidaz İsrail ve ABD'de onaylandı ve ABD 14,15 dışındaki Genişletilmiş Erişim Programı kapsamında sağlanır.

Heterolog proteinlerin kararlı şekilde dönüştürülmüş (Transjenik veya transplastomik) ya da geçici olarak transforme edilmiş bitkilerde üretilebilir. Geçici protein ifadesi ve üretimi birikimi 16 elde etmek için kısa bir zaman dilimi içeren transjenik bitkilerde, üretim üzerinde çeşitli avantajlar sunar ve bitki dokuları 4 içine bakteri ikili vektörler ya da rekombinant bitki viral vektörleri sokulması ile elde edilebilir. En gelişmiş geçici ekspresyon sistemi, bitki virüsleri ve ikili plazmid bileşenlere ve agroinfiltration 17,18 tarafından teslim 'başlatmak vektörleri' kullanımına dayanmaktadır. Tütün mozaik virüsü (TMV) dayalı bir fırlatma vektör Agroinfiltration başarıyla laboratuvarda uygulandı, insan papilloma virüsü 19, Yersinia pestis 20 gibi patojenlere karşı aşı antijenlerinin üretilmesi için büyütülebilir, influenza A 21,22, Bacillus anthracis 23 virüs ve N. çiçek hastalığı virüsü 24 benthamiana yaprak. Agrobacterium aracılı geçici sentezleme aynı zamanda birden fazla protein 2,25-27 eş zamanlı üretimi için gelecek vaat eden bir yöntemdir. Örneğin, bitki, geçici ifade sistemleri, tümör spesifik rekombinant antikor 28,29, epidermal büyüme faktörü reseptörü 30 karşı glikosile edilmiş bir rekombinant antikor ve şarbon koruyucu bir antijen 31,32 için özel bir monoklonal antikor üretmek için kullanılmıştır. Bir hedef genin ve gelişmiş hedef protein ekspresyonu 33,34 gen susturma sonuç süpresör Nicotiana benthamiana bitkilerinin Co-infiltrasyonu.

Agroinfiltration düzgün Introdu için yaygın bir yöntemdirbitkiye ilgi konusu bir geni barındıran cing bakteriler 35-37 dokular. Bozulmamış bitki içinde geçici gen ekspresyonu yaprak için Agrobacterium vakum infiltrasyonu transgenik bitkiler 38-41 oluşturmak için gerek kalmadan yabancı proteinlerin üretimi için hızlı, ölçeklenebilir ve kullanışlı bir yöntemdir. Vakum agroinfiltration sırasında, bitkiler baş aşağı çevirdi ve üstü kısımları Agrobacterium süspansiyon batık. Daha sonra vakum gazlar stoma yoluyla yaprak arası boşluklarından tahliye neden uygulanır. Yaprak içine Agrobacterium süspansiyonunun infüzyon vakum sonuç hızlı yeniden basınçlandırma aşağıdaki serbest bırakma. Agrobacteria'nın vakum infiltrasyonu sonra, bitkiler yetiştirilir ve hedef ekspresyon izlenir. Hedef en yüksek ifade seviyeleri tipik olarak 2-3 gün sonra ekspresyon seviyesi tipik olarak azaltarak üzerine bir başlangıç ​​vektörü ile bir ikili vektör ve 4-7 dpi ile infiltrasyon (dpi) sonrası gözlenenses 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens protein üretimi için bir bitkiye ilgi konusu bir genin sağlanması için en yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Agroinfiltration N. derece iyi çalıştığını benthamiana ama nispeten zayıf Arabidopsis thaliana 46 de dahil olmak üzere pek çok diğer bitkiler içinde.

Bu çalışmada, 5-6 haftalık N geçici protein üretimi için basit, etkin ve ekonomik bir yöntem geliştirdi benthamiana A kullanılarak infiltrasyonu Tumefaciens. Agroinfiltration tekniğin endüstriyel ölçekleme en büyük dezavantajı 'hasat bakteri ve 4'-hidroksi-3 ihtiva eden bir ortam içinde bakteri pelet yeniden süspansiyon santrifüj olup, 5'-dimetoksiasetofenon (asetosiringon), monosakkaritler, ve 2 - (N-morfolino) -etansülfonik asit (MES) vir genlerinin indüksiyonu için tampon. Biz Agrobakteriyi optimize ederek bu sorunların üstesinden gelmek mümkün olmuştur N. hedef protein üretimini karşılaştırmıştır ve N. benthamiana Excelsior, hem de melez N. excelsiana.

Protocol

1.. Bitki Yetiştirme

Sonraki agroinfiltration için biz iki vahşi-tip Nicotiana türleri kapalı tesislerde taşyünü üzerine hydroponically yetiştirilen (N. benthamiana ve N. yonga) ve melez (N. excelsiana) değerlendirildi.

  1. Bir bitki gübre çözeltisine taşyünü döşeme bekletin.
  2. Doğal tipte N. tohumları ekmek benthamiana, N. talaş ve N. besin excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana'nın melez) taşyünü yüzeyi ıslatılır.
  3. Için kontrol edilen koşullar altında (24 ° C ve% 40-65 bağıl nem) altında tohumlardan bitkilerin ve (130-150 μE m aydınlatılması ile 14 saat ışık ve 10 saat karanlık, -2 sec-1) uzun bir gün değerindeki fotoperiod büyümek N. 4-5 hafta ve N. benthamiana excelsiana ve N. 5-6 hafta excelsior.

Agroinfiltrat için Vektörlerin 2. İnşaatıiyon

  1. Influenza virüsü (HAC1) en A/California/04/2009 suşundan sentetik bir raportör geni (yeşil flüoresan protein [GFP]), tam uzunlukta hemagglutinin (HA) ekleyin ve yeniden tasarlanmış likenaz enzim (LicKM) 18 ayrı olarak içine başlatmak vektör pBID4-GFP, pBID4-HAC1 sırasıyla pBID4-LicKM, 18,32,41,47 elde etmek 18 (TMV-tabanlı vektör) pBID4.
  2. A. elektro hücrelerine 10-50 GFP taşıma pBID4 arasında ng veya HAC1 tanıtılması A. elektro hücrelerine GV3101 ırkına ve LicKM tumefaciens turnefaciens gen MicroPulser elektroporatörü ile GV3101, C58C1, GLA4404, At06, AT10, At77 ve A4 suşları.
  3. Aksi belirtilmedikçe, infiltrasyon deneyleri için dönüştürülmüş Agrobacteria'yı kullanın.

3.. Nicotiana Bitkiler içine Agrobakterinin İnfiltrasyon Vakum

  1. A. büyüyecek tumefaciens LB ortamı, YEB Med (O / N), gece boyunca suşlarıamonyum ya da AB ortamı 200-250 rpm'de çalkalanarak 28 ° C'de Kanamisin 50 mg / L ile takviye edilmiştir.
  2. 4.000 × LB veya YEB ya da AB yetiştirilen 0,5 veya santrifüj Agrobacterium hücreleri, 600 nm'de bir optik yoğunluğa (600) için Milli-Q su içinde Agrobacteria'yı seyreltin 4 ° C'de 10 dakika boyunca g, 0.5 A 600 indüksiyon ortamına (1x MS tuzu, 10 mM MES, 200 uM asetosiringon,% 2 sukroz [MMA]) içinde yeniden askıya ve 1-3 için oda sıcaklığında karışmaya hr, aksi kaydetti.
  3. Agrobacterium süspansiyonu içinde hava Nicotiana bitki dokuları daldırılması ve 30 ya da 60 saniye boyunca bir 50-400 mbar vakum uygulanarak bir vakum odası içinde bitkiler sızmak. Optimal infiltrasyon rutin olarak 60 saniye boyunca 50-100 mbar'da uygulanır.
  4. Vakum bozuldu sonra, vakum odasından bitkiler kaldırmak su içinde durulama ve önceden infiltrasyon büyüme için kullanılan aynı yetiştirme koşulları altında 5-7 gün için büyümeye.
  5. Etkinliğini test etmek içinAgrobacterium vir geni, asetosiringon, farklı konsantrasyonlarda (0, 100, 200 ya da 400 uM) indükleyici kimyasal sızma tampon maddesi içinde süspansiyon haline getirildi Agrobacteria (1x MS, 10 mM MES,% 2 glukoz) çözeltisine ilave edildi. Vir geni, glukoz (0, 1, 2 veya% 4), farklı yüzdelerde indüksiyonu üzerinde monosakkaridin etki için nüfuz etme tampon maddesi (1x MS, 10 mM MES, 200 uM asetosiringon) içinde süspansiyon haline getirilmiş Agrobacterium ilave edildi. N. adım 3.3 ve 3.4), yukarıda belirtildiği gibi benthamiana bitkileri infiltre edilmiştir.
  6. Agrobacterium laboratuar A 600 0.5. N'ye Milli-Q su içinde seyreltilmiştir GV3101, C58C1 ve LBA4404 ve vahşi tip soyları A4, At06, AT10 ve At77 pBID4-LicKM vektörü barındıran suşları benthamiana bitkileri adımları 3.3 ve 3.4 'de, yukarıda belirtildiği gibi, her bir suş ile infiltre edilmiştir.

Viral susturma Bastırıcı boyunca 4. Co-agroinfiltration Prosedür

  1. Mix 01:01 de GFP geni ve domates çalılık büyümeyi durdurucu virüs (TBSV) viral susturma bastırıcı P19 taşıyan Milli-Q su içinde sulandırılmış GV3101 Agrobacterium kültürleri, 02:01, 03:01 ve 04:01 oranları. N. sızmak yukarıda tarif edildiği gibi benthamiana bitkileri.
  2. N. sızmak İki Milli-Q su ile seyreltilmiş Agrobacterium GV3101 kültürlerin bir karışımı ile benthamiana bitkileri: pBID4-HAC1 plazmid taşıyan birinci ve susturma baskılayıcılar birini taşıyan ikinci - TBSV veya Citrus tristeza virüsü p23 p19, pCassp plazmide ( pCassp19) ve 35S promoteri oranının sırasıyla 04:01 (PGR-P23), altında PGR ikili plasmid içinde.

5. Western Blot Analizi

  1. N. rastgele yaprak örnekleri toplamak benthamiana, N. talaş veya N. excelsiana 4-7 dpi'de bitki ve ince bir toz halinde sıvı azot içinde toz haline.
  2. % 0.5 Triton 1x PBS tampon maddesinin üç sayılarınıX-100, her bir örnek için.
  3. Yavaşça 4 ° C'de 15 dakika boyunca sallayın ekstre örnekleri
  4. 5 dakika için özü Spin ve temiz bir Eppendorf tüpüne toplam çözünür protein toplar.
  5. 1x PBS ekstraksiyon tamponu içerisinde uygun bir seyreltme (1:100 01:50) ile özü seyreltilir ve 5 x numune tamponu (250 mM Tris-HCI [pH 6.8],% 10 SDS,% 0.5 bromofenol mavisi,% 50 gliserol ekleyin nihai konsantrasyon 1 x v / v, ve 500 mM DTT).
  6. 5 dakika için kaynatılır örnekleri.
  7. 10% SDS-PAGE ile ayrı proteinler, Immobilon-P Transfer membranı üzerine transfer ve% 0.5 I-blok ile bloke eder.
  8. 1:5,000 da poliklonal tavşan anti-GFP antiserumu kullanarak HAC1 1 saat boyunca bloke etme çözeltisi içinde 1:1,000 de fare anti-poli-histidin GFP monoklonal antikor kullanılarak tespit eder.
  9. Birincil Antikor etiketleme işleminden sonra, 10 dakika 1 x PBST-20 ile her biri için membranlar üç defa yıkamak ve 1:5,000 da konjüge-a turp peroksidaz (HRP) bağlı anti-tavşan antikoru ya da HRP-konjügatı ile inkübe1 GFP ve HAC1 tespiti için saat, sırasıyla 1:10,000 d anti-fare antikoru.
  10. SuperSignal West Pico Chemiluminescent alt-tabakası kullanılarak Western blot işleyin.
  11. Protein bant yoğunluğu analiz ve bant kalibre miktarda elde etmek GeneTools Yazılımını kullanın.

Protein üretimi: (örnek kalibre miktarı x seyreltme) /, yüklü olan örnek miktarı) = 4 mg / kg x.
Denklem: Protein üretimi (P), Kalibre miktar (C), numune (D) seyreltilmesi ve yüklenen Numune miktarı (S).

6.. Zimogramı Assay

  1. Toplayın pBID4-LicKM-sızmış N. benthamiana rasgele doku örnekleri alındı.
  2. Western blot analizi için yukarıda tarif edilen ile aynı yöntem kullanılarak ekstrakte proteinleri ve daha sonra% 0.1 lichenan 10% SDS-PAGE ile analiz jeller dahildir.
  3. Elektroforezisten sonra, 100 mM Tris-HCI [pH 8.0] ve% 0.1 Triton X (yıkama tampon maddesi içinde 10 dakika her biri için köpükler iki kez yıkayın-100) Ve daha sonra 1 saat boyunca 65 ° C 'de yıkama tamponu içinde inkübe edilir.
  4. İnkübasyondan sonra, yıkama tamponu atmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.5 Congo kırmızısı ile jeller leke.
  5. 10 dakika her biri için Milli-Q su içinde köpükler üç kez yıkayın ve likenaz aktivitesi görselleştirmek için 1 M NaCI ekleyin. Saflaştırılmış protein bakteriyel likenaz enzim aktivitesi için bir pozitif kontrol olarak kullanıldı.

7. GFP Görüntüleme

  1. Bir elle tutulan uzun dalga boylu bir UV lambası kullanılarak bütün geçici olarak transforme edilmiş bitkilerde GFP floresans algılama görsel yapın.
  2. Fotoğraf geçici bir Sarı 8 üzerinden bir dijital kamera ile bitkiler dönüştürülmüş, 52 filtresi (pozlama süresi 15 saniye) ES.
  3. Western Blot görüntüleri elde edilir bir GeneGnome üzerinde GeneSnap yazılımı kullanarak saflaştınldı ve GFP standardına dayalı bir kalibrasyon eğrisi ile, GeneTools yazılımını kullanarak analiz sonuçlarını ölçmek.
  4. Purifi göre bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak HAC1 proteinini ölçmekİnfluenza virüsünün A/Indonesia/05/05 gerginlik ed HAC standart protein.
  5. 3-4 ortalama değerlerini hesapla Tüm deneyler için çoğaltır.

Representative Results

Bitki büyümesi için besin gereksinimleri. Hidroponik bitki büyüme ortamına (Taşyünü) ve besin çözeltisi kullanılması N. muntazamlığını benthamina büyüme ve ortadan kaldırır karmaşıklığı (mekanik, düzenleyici ve verim) bitki yetiştirme için toprak kullanarak ilişkilidir. Biz N. büyüdü benthamina bitki büyüme ve biyokütle birikimi için uygun koşulları belirlemek için piyasada mevcut gübre ıslatılır Taşyünü levhalar üzerine. Biz,% 95-100 tohum çimlenmesi görülmektedir. Biz fosfor eksik besin solüsyonu çimlenmeyi ve N. büyümesini desteklemek için başarısız bulundu, çünkü biri, fosfor gibi çimlenme ulaşmak için kritik olduğuna dikkat etmelidir benthamina tohumları (Şekil 1A).

Agrobacterium büyüme ve bitki sağlığı ve protein üretimi sızma medyanın etkileri. Biz t verimliliğini optimize etmek için çeşitli medya koşulları test ettikBüyük ölçekli üretim için o agroinfiltration tekniği. Bakteriler (A. tumefaciens GV3101 suşu) pBID4-GFP yapıyı taşıyan farklı ortam koşulları (YEB, LB veya AB) O / N yetiştirilen ve santrifüje tabi tutulur ve 1 x Murashige ve ihtiva eden indüksiyon ortamına (MMA) (içerisinde yeniden süspanse edildi, ya Skoog [MS] temel tuz karışımı, 10 mM MES pH 5.6, 20 g / L sukroz ve 200 uM asetosiringon) ya da bitki infiltrasyon için kullanmadan önce, 0.5 'lik bir 600 Milli-Q su içinde seyreltilmiştir. Bu, su içinde seyreltilmiş bakteri ile bitkilerin vakum infiltrasyonu önceki raporlarda 42,48 herhangi infiltrasyon ortam ile elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilir protein üretiminin neden olduğu görülmektedir. Bunun aksine, YEB veya LB ortamında yetiştirilen seyreltilmemiş Agrobacterium ile infiltrasyon N. tam solma ile sonuçlanmıştır AB ortamı içinde büyütülmüştür seyreltilmemiş Agrobacteria infiltre bitkilerin sağlık üzerinde herhangi bir etkiye sahip değildi benthamiana dat, (en az 24 saat sonrası infiltrasyonunda yapraka) gösterilmemiştir. Şekil 1B 'de gösterildiği üzere, bitkiler YEB, LB ya da AB ortamı içinde büyütülmüş ve Milli-Q su (01:05, 600 0,6-0,8 veya 1:10, A 600 0.3-0.4) göstermiştir ile seyreltilmiş Agrobacterium kültürleri ile infiltre herhangi bir belirti ve sırasıyla 1645, 1520 ve 1839 arasında bir ortalama GFP üretimi arzetmiştir. Agrobacteria (MMA), doğrudan Milli-Q su içinde seyreltilmiş Agrobacterium (göre protein üretiminde belirtileri ve anlamlı bir farklılık gösterdi santrifüjlenmiş ve herhangi bir endüksiyon ortamı içinde yeniden süspansiyon haline sırasıyla 1671 ± 102 ve 1667 ± 131 mg / kg). Bu nedenle, Milli-Q su tasfiye tesisi ile infiltrasyon Agrobacterium kültürleri seyreltilmesi önerilir ve rutin 0.5 arasında bir bir 600 elde etmek için, daha sonraki deneylerde kullanılmıştır.

Hedef ifadesi üzerine Agrobacterium süspansiyon hücre yoğunluğu ve zaman tabii Etkileri. Önümüzdeki incelendiğinde, bakteri hücre yoğunluğuinfiltrasyon ve hedef ekspresyon düzeyleri etkinliğini etkiler. Bu amaç için, pBID4-GFP, 1.0 'lık bir 600, 0.5, 0.1 ve 0.05 taşıyan Agrobacterium dört farklı hücre süspansiyonu yoğunlukları değerlendirildi. Ardından sızma, N. benthamiana bitkileri 4, 7 ve 10 dpi'de numune toplama ile görünür semptom gelişimi ve hedef ekspresyon zaman süreci izlenmiştir. 4 dpi çözünürlükte, biz Agrobakteryum farklı hücre süspansiyonu yoğunlukları ile sızmış bitkiler arasında GFP floresan fark edilebilir farklılıklar (hiçbir GFP ifade 0.05, 600 gözlendi) görülmektedir. 7 dpi olarak, GFP floresan A 600, 1.0, 0.5 ve 0.1 'lik bir hücre süspansiyonu yoğunluklarda Süzülmüş bitkilerin içindeki, ancak 0.05 arasında bulunan bir A 600 ° Süzülmüş bitkilerin daha düşüktü. Şekil 1C 'de gösterildiği gibi, bu veriler, Western lekeleme yolu ile teyit edildi, 600 A da çok düşük bir protein üretimini gösteren 4 dpi'de toplanan numunelerin analizi 600 en yüksek ve ub>. 0.05 600 alt GFP üretimi (1.199 mg / kg) gösterdi 7 dpi, bitkiler, (sırasıyla 1.662, 1.870 ve 1.890) 1.0, 0.5 ve 0.1 A 600 olarak tahmin GFP üretiminde anlamlı farklılık gösterdi. Bunun aksine, 10 dpi GFP üretiminde bir farklılık dört hücre süspansiyonu yoğunlukları (1218, 1181, 1197 ve 1304) her iki ile infiltre bitkiler arasında gözlenmiştir.

Agrobacterium alternatif suşları ile infiltrasyon. Geçici protein üretimi için uygun Agrobacterium soylarının çeşitliliğini artırmak için, vahşi tip izole test edilmiştir. Doğal ana taç-safra izole edilen bu suşlar, lütfen Dr Gelvin (Purdue Üniversitesi, West Lafayette, Indiana) tarafından verilmiştir. Geçici protein üretimi kendi programını incelemek için, N. sızmış Aşağıdaki suşlar carr ile benthamianaying pBID4-LicKM 18: A. rhizogenes (A4) ve A. vahşi tip Neşter A348, A208, A281 ve suşları (AT6, AT10 adlandırılır ve At77, sırasıyla), hem de A işlenmiş laboratuar suşları Agrobacterium tumefaciens tumefaciens GV3101, C58C1, ve 4404. Infiltre yaprakları 7 dpi'de toplandı ve LicKM ekspresyon seviyesinin, Western blot analizi ile tahmin edilmiştir. • Şekil 2A, LicKM üretimin en üst düzeyde gösterildiği gibi suşlar GV3101, A4 ve LBA4404 (~ 1750 ± 163, 1650 ± 26 ve 1450 ± 117 mg / kg, sırası ile) küçük farklılıklar ile, ile elde edilebilir İfade en düşük seviyesi C58C1 ile (~ 900 ± 102 mg / kg); (sırasıyla ~ 1.250 ± 19, 1100 ± 42 ve 1200 ± 111 mg / kg) AT6, AT10 ve At77 ile ara üretim. Likenaz enzimatik aktivitesi Zymogram tahlili kullanılarak ortaya çıkartılmıştır. Şekil 2B, herhangi biri kullanılarak infiltre bitki dokularında likenaz ürettiğini gösterirAgrobacterium türleri, enzimatik olarak aktif oldu. AT10 ile belirtiler hafif vardı zorlanma iken bir de, patolojik semptomlar (bodurluk, yaprak sapı uzaması ve curling ve yaprak curling) gösterdi A4 ve At77 suşları ile sızmış olduğunu N. benthamiana bitkiler dikkat etmelisiniz. Semptom laboratuvar GV3101 ırkına (Şekil 2C) ile infiltre N. benthamiana bitkileri gözlenmiştir.

Alternatif Nicotiana türlerin infiltrasyonu. Biz Nicotiana cins (N. benthamiana ve N. yonga) ve bir melez türler, N. iki vahşi tür türlerde biyomas üretimi ve protein üretim oranları karşılaştırılmıştır excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana). Test edilen türler, N. benthamiana, Agrobacterium-tabanlı ya da viral bazlı ekspresyon sistemi 2,34,4 kullanılarak geçici protein üretimi için yaygın olarak kullanılan bir ev sahibi9, çimlenme 4-5 hafta içinde sızma hazır ulaşır. Biyokütle optimal düzeyde oluşturmak için gerekli büyüme dönemi de N. için 4-5 hafta excelsiana ancak N. (6-7 hafta) daha uzundur excelsior. Buna ek olarak, bitki internod N. nispeten kısadır excelsior diğer Nicotiana türlere kıyasla.

Ayrıca, N. bu vakum infiltrasyon ve N. benthamiana 60 saniye boyunca 50-250 mbar'da excelsiana, bütün yaprak agroinfiltration için son derece etkili iken, N. talaş, bir vakum bu Sillwet-77 ya da S240 gibi non-iyonik yüzey aktif maddelerin varlığında, 1 dakika her biri için üç defa uygulanmıştır bile nedeniyle alt örtü ve kösele yapraklara sızmak için zordur. Ayrıca, N. çimlenme oranı excelsiana ve N. excelsior tohumları ~% 40-50 idi; % 90-100 için çimlenme oranını artırmak amacıyla, tohumlar,% 10 blea ile muamele edilmelidirtohumlamadan önce 1 saat boyunca ch. Aynı büyüme şartları, N. elde edilebilecek en yüksek biyokütle yaprak aşamasında excelsiana N ile karşılaştırıldığında yaklaşık olarak iki kat daha yüksek olduğu benthamiana (Tablo 1).

Protein üretimi N. incelenmiştir benthamiana, N. talaş ve N. excelsiana pBID4-GFP barındıran Agrobacterium GV3101 ırkına ile süzüldü. GFP birikimi Western blot analizi ile, ardından UV ışığı kullanılarak bütün infiltre yapraklarda 7 dpi'de değerlendirildi. Şekil 3A, N. GFP dağılımını göstermektedir benthamina ve N. excelsiana ve N. dengesiz dağılımı Excelsior (nedeniyle N. Excelsior bir bütün yaprak alanına sızan bir zorluk). Şekil 3B 7 dpi de üç Nicotiana türlerinden toplanan sızmış yapraklar UV ışık aydınlatması ile tahmin GFP üretim düzeyini gösterir. GFP birikebilecekyon seviyesi N. yüksekti N. benthamiana göre (~ 2.23 g / kg) excelsiana ve N. yonga (sırasıyla, ~ 1.89 ve 1.54 g / kg). N. protein üretiminin düşük düzeyde talaş düzensiz infiltrasyonu ve toplanan yaprak biriken GFP dağılımı kaynaklanmaktadır.

Biz doğrudan ışığa maruz üst yaprakları genellikle gölgelik altında yapraklarından daha (2-4 dpi) geçici GFP birikiminin erken ve yüksek düzeyde sergiledikleri görülmektedir. Ancak, bizim çalışmalarda, GFP birikimi 7 dpi en yüksek ve hiçbir GFP birikimini uninfiltrated yeni büyüyen yaprakları hariç, en yaprakları eşit olarak dağıtıldı.

Geçici protein üretimi. Vakum infiltrasyon üzerinde vakum basıncı ve süresi etkileri önemli ölçüde bir iğnesiz şırınga 42 ile elle enjeksiyonu ile uygulanan basınca kıyasla geçici ekspresyon seviyelerini artırır. Bir uygulanmasıvakum stoma yoluyla bırakır batık bitki boşaltmalarını gazları neden olur. Vakum ayrılmış ve basınç hızlı bir şekilde artar edildiğinde, Agrobacterium süspansiyon, boşaltılan gazların 50 yerine yapraklar içine sürülür.

N. yapraklarında vakum basıncı etkisini test etmek için benthamiana, 30 veya 60 saniye boyunca çeşitli vakum basıncı (50-400 mbar) altında pBID4-GFP barındıran Agrobacterium GV3101 ırkına bitkilerin infiltre. Bu (50 mbar) güçlü vakum kısaca infiltrasyon (24-48 saat) sonra doku solma ve bitki ölüme, sızmış yaprakların mekanik hasar 30 veya 60 sn sonuçlarına uygulanması olduğu gösterilmiştir. Sadece 50 yaprak alanı% 'si ve GFP üretimi (303 ± 90 mg / kg) (Şekil 4A) bir azalma düzeyi sızmasında daha hafif vakum (400 mbar) sonucu, diğer yandan, uygulama günü. Önemlisi, biz 50, 10, altında GFP üretiminde anlamlı bir fark gözlenmedi0 ve 200 mbar (1.651 ± 107, 1.688 ± 40, 1594 ± 26 mg / kg, sırasıyla) (Şekil 4A) ve hafif hayır, bitki sağlığı üzerinde zararlı etkileri 50-200 mbar vakum basınçları 30 veya 60 için uygulanmıştır sn. Bu nedenle, vakum basıncı 50-100 mbar infiltrasyonu deneyler için tavsiye edilir.

Hedef ifadesi üzerindeki vakumun süresinin etkisi, N. biri düz süzülmesiyle değerlendirildi benthamina bitkiler pBID4 barındıran GV3101 0.5 bir A 600 ile her saat -. aynı Agrobacterium kültürüne 8 saat GFP Şekil 4B GFP üretim düzeyi benzer tüm-zaman düşündüren, 8 saat kadar işaret olduğunu gösterir bu aşkın Zaman süresi, Agrobacterium, tek sarmallı DNA başlatmak kabiliyetini korur.

Protein üretimi kimyasal indüksiyon etkisi. Bazı bitki fenolik metabolitleri ve şekerler ind olabilirA. UCE virülans genleri 1,52 Tumefaciens. Bunun bir sonucu olarak, birçok kimyasal ve monosaccharaides çeşitli bitki türlerinde geçici protein üretimini artırmak için bildirilmiştir. Acetosyringone en sık A. kültürlerine ilave edilir agroinfiltration 40,53-57 önce vir operon uyarılması için tumefaciens.

Bu N. geçici GFP protein üretimi üzerindeki asetosiringon farklı konsantrasyonlarda (0, 100, 200 ve 400 uM) ve glukoz (0-4%) etkisini değerlendirmiştir GFP - benthamiana Agrobacterium GV3101 ırkına pBID4 barındıran ile süzüldü. Bu amaçla, daha önce sızma 1-3 saat boyunca asetosiringon ve glikoz konsantrasyonunu ihtiva eden farklı MMA uyarma ortamı içinde Agrobacterium hücreleri yeniden askıya alındı. Hem görsel gözlem (veriler gösterilmemiştir) ve Western blot analizi (Şekil 4C), test edilen konsantrasyon hiçbiri sonuçlarına göre,Bu bileşiklerin herhangi bir indüksiyon ortamı asetosiringon veya glukoz ihtiva kontrol ile karşılaştırıldığında GFP floresan ya da protein üretiminde önemli bir artışa neden oldu.

N. GFP ve HAC1 genlerin geçici üretimi üzerinde bir susturma bastırıcı eş infiltrasyon etkisi benthamiana bırakır. Daha önce, bir raportör protein 34 nin arttırılmış üretimi ile sonuçlanan bir susturma bastırıcı (domates çalılık büyümeyi durdurucu virüs p19 [TBSV]), transkripsiyon sonrası gen susturma (PTGS) müdahale bu ko-ekspresyonu gösterilmiştir.

Biz N. eş sızma etkisini değerlendirdi GFP raportör gen (pBID4-GFP) ve syf 19 taşıyan fırlatma vektör ile benthamina. A. önce infiltrasyonu, bir A 600 0.5 seyreltileri pBID4-GFP ve P19 barındıran tumefaciens GV3101 kültürleri, sırasıyla 1:1, 2:1, 3:01 ve 4:01. Express oranlarında karıştırılmıştırsusturma baskılayıcı iyon Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü tarafından kontrol edildi. 7 dpi (Şekil 5A) ile Western blot analizi sonuçları ile gösterildiği gibi, P19 mevcudiyeti arttırmak veya N GFP üretimini azaltmak yoktu benthamiana iki Agrobacterium süspansiyonları her oranda.

P23and p19 - - HAC1 için PTGS önlenmesi üzerine biz de iki viral gen susturma bastırıcılarının etkilerini karşılaştırdık. Fırlatma vektör pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) ve iki viral susturma baskılayıcı plasmidlerin bir taşıma Agrobacterium kültürleri, sırasıyla 04:01, bir oranında karıştırılmış bir 0.5 A 600 seyreltildi edildi ve 4-5 haftalık N. içine co-sızmış benthamina. A. bir süspansiyonu pBID4 taşıma turnefaciens - HAC1 tek başına kontrol olarak infiltre edildi. Infiltre yaprak örnekleri 3 ila 8 dpi toplanmıştır. Deney repe olduHAC1 ifade ated üç kez ve ortalama seviyeleri Western blot analizi ile tespit edilmiştir.

Şekil 5B'de, N. eş infiltrasyonu gösterildiği gibi p23 veya p19 ile benthamiana (sırasıyla 642 ± 157 ve 764 ± 108 mg / kg) 6 dpi (sırasıyla, yaklaşık olarak% 15-25) herhangi bir susturma baskılayıcı kullanılarak kıyasla HAC1 üretiminde bir artış ile sonuçlanmıştır. Bu p23 ve p19 sistemimizde etkili olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, pBID4-HAC1 P19 ile birlikte infiltre olduğu zaman HAC1 birikimi bir gün önce meydana geldiği not edilmelidir. Bu nedenle, sonuçlar HAC1 üzerinde susturma bastırıcı P19 ve GFP birikiminin etkisi geçici ifade ve / veya N, bazı proteinlerin stabilitesi selektif geliştirme düşündüren farklı olduğunu göstermektedir benthamina.

Ayrıca, gözlemlenen mevcudiyetinde ve bir susturma bastırıcı HAC1 protein eşya seviyesinin yokluğunda hem deuction 7 dpi düşüş başladı. Bu fırlatma vektör ile infiltre N. benthamiana geçici protein üretimindeki düşüş zamanlaması, hedefe-özgü olduğuna işaret etmektedir.

Fırlatma vektörü barındıran Agrobacterium hücre bankası Hedef gen stabilite, Agrobacterium canlılığı ve protein birikimi seviyesinin her yıl değerlendirilmiştir. -80 ° C'de saklanmıştır pBID4-HAC1 ile transforme GV3101 soyunun hücre bankasının gliserol stoku infiltre N geçici protein üretim düzeyinde değişiklik olmadan fazla üç yıl boyunca çok stabil olduğu gösterilmiştir benthamina bitkiler. Şekil 5C 2010, 2011, 2012 ve 2013 yıllarında Western blot tarafından tahmin HAC1 protein üretimi sırasıyla 670, 685, 566 ve 683 mg / kg, olduğunu göstermektedir. N. ortalama HAC1 üretimi benthamiana bitkileri 651 ± 49.4 mg / kg olmuştur.


Tablo 1. N. karşılaştırılması benthamina ve N. excelsiana bitki biyokütle üretimi.

Şekil 1
Şekil 1. N., geçici gen ekspresyon Western blot analizi benthamina. (A) Altı haftalık N. benthamiana 1)% 4.8 fosfor içeren bir suni gübre solüsyonunda bitkileri ve 2) bitkileri 0% fosfor ihtiva eden bir çözelti içerisinde artan gübre. Taze yaprak ağırlık eşdeğeri Yirmi beş mikrogram kulvar başına yüklenmiştir. GFP üretimi (B) Karşılaştırma pBID ile sızmış bitkiler vakumÜç farklı ortamlarda yetişen 4-GFP-barındıran Agrobacterium GV3101 kültürler: YEB, AB ve LB. GV3101 kültürler YEB olarak O / N yetiştirilen veya LB ortamı düşük hızda santrifüj edildi ve (MMA) (sütun: MMA-1 ve MMA-2, sırasıyla) indüksiyon ortamı içinde yeniden süspansiyon haline veya YEB olarak O / N yetiştirilen, LB veya AB ortamı doğrudan 01:05 veya Milli-Q su ile 1:10 seyreltilmiş (sütun: YEB / 5 ve YEB/10, AB / 5 ve AB/10, LB / 5 ve LB/10) (C) karşılaştırılması. A. farklı konsantrasyonları (1.0 A 600, 0.5, 0.1 ve 0.05) ile vakum infiltrasyonu takip eden 4, 7 ve 10 dpi'de GFP ekspresyon pBID4-GFP taşıyan GV3101 Agrobacterium tumefaciens suşu.

Şekil 2,
N. Şekil 2. Geçici likenaz üretim ve etkinliğinin karşılaştırılması, aşağıdaki vakum infiltrasyonu hatlarıyla benthamina bitkilerAgrobacteria'nın suşları kira. Agrobacteria'ı suşları (GV3101, A4, At77, C58C1, AT6, AT10 ve LBA4404'ün) Kültürleri pBID4-LicKM N. yapraklarına tek tek sızmış edildi fırlatma vektörü barındıran benthamina. Sızma yaprakları 7 dpi'de toplanmıştır. Western blotting ile nicelleştirilmiştir (A) likenaz üretimi. (B) tahlili Zymogram enzimatik aktivite ile likenaz üretimi ortaya çıkarmaktadır. Agrobacterium (C) etkisi (vahşi tip A4, AT10, At77 ve laboratuar gerilme GV3101) N. üzerine sızma 7 dpi benthamina bitki sağlığı. Taze yaprak ağırlık eşdeğeri Yirmi beş mikrogram kulvar başına yüklendi.

Şekil 3,
N. yapraklarında Şekil 3,. Geçici GFP ekspresyon benthamiana A. ile vakum süzmesi sonra 7 dpi N. excelsiana ve N. talaş GFP - fırlatma vektör pBID4 barındıran Tumefaciens. GFP birikim UV ışığı altında GFP ekspresyon (A) Görsel inceleme. (B) Western leke analizi.

Şekil 4,
Şekil 4,. Geçici GFP ekspresyonu ve bitki sağlığı ile ilgili vakum basıncı (A) etkileri. N. benthamiana bitkileri pBID4 ile infiltre edilmiş olan -. 400, 200, 100 ya da 50 mbar'lık vakum basınçlar altında GFP, 30 ya da 60 saniye vakum tutma süresi (B) Denge ve A. enfekte N. tumefaciens benthamiana Agrobacterium GV3101 pBID4-GFP AB ortamı içinde yetiştirilen ve 0.5 'lik bir A 600 seyreltildi barındıran ile süzüldü. Agroinfiltration N. bir düz süzülmesiyle gerçekleştirildi GFP geçici ifadesi üzerindeki asetosiringon ve glikoz farklı konsantrasyonlarda aynı seyreltilmiş Agrobacterium kültürü (şerit 0-8). (C) in etkisi benthamiana bitkileri her saat. PBID4 barındıran Agrobacterium GV3101 ırkına - GFP, YEB ortam içinde O / N yetiştirilen santrifüj ihtiva eden ve, 200 0, 100, 200 ya da 400 uM asetosiringon ile de% 2 glukoz içeren MMA veya MMA ya da 0.5 arasında bir A 600 için yeniden süspanse edildi 0 ° C'de glukoz ile uM asetosiringon, 1, 2 veya% 4. Agrobacterium süspansiyonları sızma önce oda sıcaklığında 3 saat boyunca muhafaza edildi.

Şekil 5,
Şekil 5,. N. geçici protein üretimine susturma bastırma etkisi benthamiana bırakır. (APBID4-GFP ko-infiltrasyonu ve farklı oranlarda P19 aşağıdaki GFP protein) Western leke analizi. 7 dpi (taze yaprak ağırlık eşdeğeri 25 ug, sıra başına yüklenmiştir.) (B)-pBID4 HAC1 taşıyan Agrobacterium kültürü toplanan numuneler bireysel p19 ya da p23 susturma baskılayıcı taşıyan bir kültürü ile 04:01 oranında karıştırılmıştır plazmidler. Agrobacterium kültürleri edilen kombinasyonları vakum bitkiler içine infiltre edilmiştir. HAC1 infiltre dokuları rekombinant protein miktarının belirlenmesi için 8 dpi kadar her gün toplandı. Agrobacterium hücre bankasının (C) kararlılık. Bitkiler protein birikimi değerlendirmek için her yıl Agrobacterium hücre bankası aynı parti ile infiltre edilmiştir. Taze yaprak ağırlık eşdeğeri elli mikrogram sokağın başına yüklenmiştir. inci büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızrakamdır.

Discussion

Bu çalışmada, fırlatma vektörünü taşıyan Agrobacterium suşları kullanılarak seçilebilir Nicotiana türlerinde rutin geçici protein üretimi için basit bir protokol agroinfiltration geliştirdik. Buna ek olarak, bizim geçici bir bitki ekspresyon sisteminde en yüksek bir araya getiren protein üretim seviyesini elde etmek için uygun koşullar belirledik.

Seyreltilmiş A. Vakum infiltrasyon N. içine fırlatma vektör pBID4 barındıran GV3101 ırkına tumefaciens benthamiana, N. excelsiana ve N. talaş gibi Alfalfa mozaik virüsü barındıran GV3101 ile infiltre Pisum sativum gibi diğer bitki türlerine göre 7 dpi olan hedef protein üretiminin yüksek seviyeleri ile sonuçlanmıştır - ya da salatalık mozaik 35S promotörün kontrolü altında GFP raportör geni ifade virüsü-esaslı vektörler 41 ya da Lactuca sativa, Solanum LyCOA suşu C58C1 ile infiltre persicum ve Arabidopsis thaliana beta-glukuronidaz raportör geni 57. N. taşıma tumefaciens ve N. benthamiana excelsiana% 90-95 sızma verimliliği ile, 30-60 saniye boyunca 50 mbar'daki sızmak vakum kolay oldu. Yaprak alanının geri kalan% 5-10, çünkü vakum uygulanması sırasında Agrobacterium süspansiyonu yüzeyinde yaprakların bir yüzer infiltre edilmiş değildi. Fırlatma vektör hücreden hücreye hareket 18 için yeteneğine sahip olduğu için, geçici protein birikimi 7 dpi'de tüm yaprak hem de yaprak sapı oluşur. PBID4 ekspresyon vektörü hücreden hücreye hareket edebilmektedir, ancak, sistemik 18 taşımak için değil, çünkü 10 dpi anda, tahmin edilen GFP üretim biraz daha düşük olmuştur; Bu nedenle, yeni çıkan yaprak vektörü içermeyen ve hedef üretimine katkıda bulunmazlar. Buna ek olarak, yeniden birleştirici proteinin bozulması fazla zaman mBugün 10 dpi düşük protein seviyesine katkıda bulunur. Bizim sonuçlar A'nmkidir infiltrasyon N. geçici protein üretiminin turnefaciens gerginlik GV3101 aracılı yüksek seviyede benthamina. Bundan başka, hedef proteini likenaz için N-terminal, C-terminal veya iç füzyonları (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glukanaz Clostridium thermocellum bir termostabil enzim ve birçok hedef için termostabilite kazandıran olarak tasarlanmış olabilir protein füzyon 18. N. Sızma A ile benthamiana yaprak kıvrılma, yaprak sapı uzama, ve saç: hafif ya da ciddi semptomlar ortaya çıkar genini barındıran vahşi tip suşu (AT6, AT10 ve at77) tumefaciens. Patolojik semptomlar N gözlendi Bazı genler GV3101 suşları pBID4 içine yerleştirilir ve laboratuvara dönüşmüş ise benthamina, boş pBID4 vektörü barındıran laboratuvar GV3101 ırkına ile sızmış, C58C1 veya LBA4404'tü hafif nekrotik yanıtları ve yaprak elicitedkloroz / yaprakların infiltre bölgelerinde semptomları sararma. Vahşi tip Agrobacterium veya solanaceous bitkilerde devreden suşlarının neden olduğu nekrotik semptomlar daha önce 56,57 bildirilmiştir. Nekrotik tepki tip III sekresyon sisteminde, Tip IV salgı sistemi ile bitki hücresine aktarılır bakteriyel proteinler ve / ya da flagellin'in 58-60 duyarlılık hastalık oluşturma faktörlerinin neden olabilir. Bu heterolog proteinlerin üretimi de geçici patojenik ortaya çıkarabilir ve infiltre bitkide, hipersensitif bir cevap bırakır bulduk. Birçok araştırmacı, dengeli bir şekilde dönüştürülmüş bitkiler 28,57 ile karşılaştırıldığında geçici protein üretiminin 5-20 kat daha yüksek seviyelere kadar üretilen bitki ikili vektörleri ile, farklı bitki türleri bu agroinfiltration bildirdi. Bizim veri gösteriyor ki N. benthamiana GV3101 için bildirilen GFP verim benzer bir GFP arasında pBID4-GFP geçici olarak ifade edilen yüksek düzeyde barındıran ile infiltreN. benthamiana Agrobacteria'ı PiCh-GFPSYS viral vektör (toplam çözünen proteinin% 80) 44 taşıma ile sızmış. Bizim başlatmak vektörü kullanılarak Agroinfiltration termo protein LicKM yüksek üretimi ile sonuçlanmıştır, standart bir ikili plasmid 18 ile gözlenenden daha yüksek, 50-kat.

A. enfeksiyon test etmek için turnefaciens ve fırlatma vektör istikrar, N. biri düz sızmış benthamiana pBID4-GFP plazmid GV3101 aynı Milli-Q su ile seyreltilmiş kültür kullanılarak 8 saat boyunca her saat. Bizim veri GV3101 gerginlik verimli, en az 8 saat ve pBID4 (başlatma vektörü) için enfektif olduğunu gösterdi 8 saat süren infiltrasyonu sırasında çok kararlı.

-80 ° C'de saklanır fırlatma vektör pBID4-HAC1 (hücre bankası) barındıran GV3101 soyunun gliserol stoku geçici prote değişiklik olmadan üç yıl boyunca çok stabil olduğu gösterilmiştirSüzülmüş bitkilerin üretimde.

Optimal koşullar ve 35 ile 42 gün sonra ekim altında yetiştirilir N. benthamiana bitkiler vakum infiltrasyon dolayımlı geçici gen ifadesi 40 için uygun olmuştur. (3-4 haftalık), genç bitkiler için hücre süspansiyonu yüzey ve bir vakum uygulanarak mekanik etkilerinden doku hasarı üzerinde yüzen yaprak tamamen nüfuz edilemez. 45 gün, N. daha büyük tesislerde benthamiana kullanılan en iyi ışık koşulları altında, aşama vidalama, geçici ekspresyon seviyesi düşüktür.

Düşük molekül ağırlıklı bileşikler, fenolik (asetosiringon) ve monosaccharaides (glikoz) 55,61 tumefaciens A'da vir genlerin neden olduğu bilinmektedir. Ayrıca, N. infiltrasyonu 50-600 uM konsantrasyonlarda asetosiringon varlığında, ikili vektör pCAMBIA (GFP) ile benthamiana hafif geçici artış gösterildiGen ekspresyonu 40. Biz 3 saat MMA pBID4-GFP barındıran GV3101 kültürlere bu bileşikleri ekleyerek sisteme acetosyringone ve glikozun farklı konsantrasyonlarının etkisi okudu ve GFP hiçbir fark bulunamadı. İlginç bir şekilde, pBID4-GFP barındıran ve 0.5 'lik bir A 600 için Milli-Q su içinde seyreltildi ve vir gen indüksiyonu olmadan nüfuz GV3101 kültürler neden kültürleri ile infiltre gibi GFP ile aynı miktarda ifade edilmiştir. A. tumefaciens vir gen (ler), potansiyel bitki fenolik bileşikler (asetosiringon ve sinapinik asit) ve yaprak dokusunda mevcut bitki monosaccharaides (glikoz ve fruktoz) neden olabilir. Bu nedenle, eksojen vir geninin indükleyicilerin varlığında veya yokluğunda, GFP ifade benzer düzeylerde bitki hücrelerinde GFP-ifade başlatmak vektörün çoğaltma sırasında mevcut sitoplazmik vir geninin indükleyicilerin etkisinin bir sonucu olabilir spekülasyon.

N. benthamiana geçici protein üretimi için bir model 49 ana olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, N. benthamiana 'in nispeten düşük biyokütle verim rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimi için bir uygulama engellemektedir. Optimum ana geçici, yüksek bir ifade seviyesi, serada kolay büyüme birleştirmek ve Agrobacterium infiltrasyon 2 duyarlı olmalıdır. Alternatif bir ana seçmek için, bir melez incelemeleri Nicotiana'da (N. benthamiana ve N. Excelsior), iki farklı vahşi-tip türler sızmış ve A. ile excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana) pBID4-GFP plazmid GV3101 ırkına tumefaciens. Bu üç tür arasında, GFP ekspresyon düzeyinin N. biraz daha yüksekti benthamina. N. talaş bitkiler, kendi kösele yapraklara vakum agroinfiltration güçlüğü gösterdi ve N. excelsianaüretilen, yaklaşık olarak aynı yetiştirme koşulları altında daha fazla biyo-kütle, iki kat. 7 dpi GFP geçici üretim N. nispeten benzer ve N. benthamiana excelsiana. Bu nedenle, N. excelsiana yeniden birleştirici protein üretimi için daha uygun bir ev sahibi olabilir.

Agrobacterium-aracılı geçici protein üretim geni bitki virüsü kökenli 62 bastırıcıları susturma ko-ekspresyonu ile aşılabilir PTGS 26 ile sınırlıdır. Geçici protein üretimi yukarıda infiltre dokularda 34'te PTGS inhibe TBSV of p19 proteini varlığında, 50-kat artırılabilir gösterilmiştir. Çalışmamızda, biz ayrı lansman vektörü pBID4-HAC1 ile birlikte sızmış iki viral susturulması bastırıcılarının (p19 ve p23) etkisi değerlendirildi. Bu susturma bastırıcılarının ko-infiltrasyon HAC1 sadece hafif bir artış ile, HAC1 geçici ekspresyonu üzerinde çok az etkiye sahip görünüyorduco-infiltre p23 ya da p19 varlığında protein birikimi (% 15-25). Pozitif protein üretimini etkiler için, susturma bastırıcılar, özellikle hedeflenen bitki türleri ve viral vektör 63 için geçerli olmak üzere seçilebilir gerekebilir. TMV RNA helikaz susturma aktivitesi 64,65 arasında bir bastırma sahiptir. PBID4-HAC1 ile p23 veya p19'un ko-infiltrasyonu GFP hiçbir artış ya da geçici HAC1 protein üretiminde hafif bir artışa neden olduğu gibi, bizim veri bu gözlemi doğrulamaktadır.

Sonuç olarak, değiştirilebilir ve optimize edilmiş bitki ve Agrobacterium büyüme koşulları ve vakum infiltrasyon verimliliğini iyileştirilmiştir. Bu teknoloji bir kaç saat içinde bitki materyali yüzlerce kilogram büyümek ve sızmak için bize sağladı. Biz başarıyla geçerli İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) koşullar altında endüstriyel ölçeklerde yüksek verimli aşı üretimi için tesis geçici ifade tekniği otomatik. Abo Daha fazla bilgi içinut otomasyonu ve cGMP koşullar altında alt-birim aşı adayları da dahil olmak üzere yeniden birleştirici proteinlerin üretimi için bitki geçici protein üretim sisteminin kullanımı, okuyucu web olarak adlandırılır www.fhcmb.org/ .

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Moleküler Biyoteknoloji, Ibio, Inc ve Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (hibe # HDTRA1-07-C-0054) için Fraunhofer ABD Merkezi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr tarafından cömert hediyeler kabul. Biyolojik Bilimler Bölümü, Purdue Üniversitesi (Agrobacterium tumefaciens) ve Büyük Ölçekli Biyoloji Corp Wayne Fitzmaurice'nin (N. excelsiana tohum) yanı sıra, ABD Nicotiana Koleksiyonu, North Carolina State University (N. yonga tohumlar Jennifer Nicholson Stanton Gelvin .) Yazarlar bitkiler ve mükemmel teknik yardım sağlamak için Margaret Shillingford ve Christopher Hull teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca Dr teşekkür ederim. Editoryal yardım için Stephen Streatfield ve Natasha Kushnir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, , Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Tags

Bitki Biyolojisi Sayı 86 Agroinfiltration, Geçici protein üretimi bitki bazlı ifade viral vektör,
Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V.,… More

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter