Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optimalisatie en het gebruik van Published: April 19, 2014 doi: 10.3791/51204
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

Summary

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Abstract

Agrobacterium-gemedieerde tijdelijke eiwitproductie in planten is een veelbelovend om vaccinantigenen en therapeutische eiwitten binnen een korte tijd. Echter, is deze technologie nog maar net beginnen te worden toegepast op grote schaal te produceren zo veel technologische belemmeringen voor opschaling worden nu overwonnen. Hier tonen we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het op industriële schaal voorbijgaande eiwitproductie op basis van vacuüm infiltratie van Nicotiana planten met Agrobacteriën dragen lancering vectoren. Optimalisatie van Agrobacterium teelt in AB medium maakt een directe verwatering van de bacteriecultuur in Milli-Q water, de vereenvoudiging van de infiltratie-proces. Onder de drie geteste soorten van Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. houtwol) werd gekozen als de meest veelbelovende gastheer vanwege het gemak van infiltratie, hoge reporter eiwitproductie en twee-foude hogere biomassaproductie onder gecontroleerde omstandigheden. Inductie van Agrobacterium pBID4-GFP (tabak mozaïek virus gebaseerde) met chemicaliën zoals acetosyringoon en monosaccharide had geen effect op het eiwit productieniveau. Infiltreren plant onder 50 tot 100 mbar gedurende 30 of 60 seconden resulteerde in ongeveer 95% infiltratie van plant blad weefsels. Infiltratie met Agrobacterium laboratoriumstam GV3101 toonde de hoogste eiwitproductie in vergelijking met Agrobacteria laboratoriumstammen LBA4404 en C58C1 en wild-type Agrobacteria stammen AT6, AT10, at77 en A4. Co-expressie van een viraal RNA silencing suppressor p23 of p19, in N. benthamiana resulteerde in eerdere accumulatie en verhoogde productie (15-25%) doelwiteiwit (influenzavirus hemagglutinine).

Introduction

Planten worden nu erkend als een veilige, betrouwbare, schaalbare en goedkoop platform voor de productie van heterologe recombinante biofarmaceutische en industriële eiwitten 1-3 en hebben belangrijke voordelen ten opzichte van microbiële en dierlijke celexpressiesystemen 4. Planten zijn in staat om correct gevouwen eiwitten tot expressie met post-translationele modificaties, inclusief gemonteerde multimere antilichamen 5-7. Verschillende plantaardige recombinante farmaceutische eiwitten ondergaan klinische evaluatie 8. Deze omvatten patiëntspecifieke recombinante idiotype vaccins (scFv) voor de behandeling van non-Hodgkin lymfoom 9, hemagglutinine-gebaseerde pandemie en seizoensgebonden influenzavaccin gegadigden 10,11 (Cummings et al.. Aan Vaccine ingediend), anti-Streptococcus oppervlakteantigeen I / II antilichaam voor de behandeling van tandcariës 12 en humane insuline voor de behandeling van diabetes 13. Bovendien menselijk recombinant glucocerebrosidase voor enzym-substitutietherapie bij patiënten met de ziekte van Gaucher is in Israël en de VS goedgekeurd en wordt geleverd onder de Expanded Access Program buiten de VS 14,15.

Heterologe eiwitten kunnen worden geproduceerd in stabiel getransformeerde (transgeen of transplastomic) of tijdelijk getransformeerde planten. Voorbijgaande eiwitproductie biedt verschillende voordelen ten opzichte productie in transgene planten, waaronder de korte termijn expressie en accumulatie 16 bereiken, en kan worden bereikt door bacteriële binaire vectoren of recombinante planten virale vectoren in plantenweefsels 4. De meest geavanceerde transiënt expressiesysteem is gebaseerd op het gebruik van "launch vectoren" die bestanddelen van plantenvirussen en binaire plasmiden combineren, door agroinfiltration 17,18 geleverd. Agroinfiltration van een lancering vector op basis van tabak mozaïek virus (TMV) is met succes in het lab toegepastschalen naar vaccin antigenen produceren tegen pathogenen zoals het humaan papillomavirus 19, Yersinia pestis 20, influenzavirussen A 21,22, Bacillus anthracis 23 en pokkenvirus 24 in N. benthamiana bladeren. Agrobacterium gemedieerde tijdelijke expressie is een veelbelovende werkwijze voor de gelijktijdige productie van verschillende eiwitten 2,25-27. Zo zijn plantaardige tijdelijke expressiesystemen gebruikt om tumor-specifieke recombinante antilichamen 28,29, een geglycosyleerd recombinant antilichaam tegen de epidermale groeifactor receptor 30 en een monoklonaal antilichaam specifiek voor miltvuur beschermende antigeen 31,32 produceren. Co-infiltratie van Nicotiana benthamiana planten met een target-gen en een suppressor van gene silencing resulteert in verbeterde doeleiwitexpressie 33,34.

Agroinfiltration is een gemeenschappelijke methode voor het uniform introducing bacteriën drager zijn van een gen van belang in plantaardige weefsels 35-37. Vacuüm infiltratie van Agrobacterium voor transiënte genexpressie in intacte bladeren is een snelle, schaalbare en bruikbare werkwijze voor productie van heterologe eiwitten zonder dat transgene planten 38-41 genereren. Tijdens vacuüm agroinfiltration, zijn planten ondersteboven weggeknipt en bovengrondse delen ondergedompeld in Agrobacterium schorsing. Dan vacuüm wordt toegepast waardoor gassen te evacueren van blad intercellulaire ruimten via huidmondjes. Snelle re-onder druk na release van het vacuüm resultaten in de infusie van de Agrobacterium schorsing in het blad. Na vacuüm infiltratie van Agrobacteria, zijn planten verder gekweekt en doel expressie wordt bewaakt. De hoogste doelwitexpressiecassette worden typisch waargenomen 2-3 dagen na infiltratie (dpi) met een binaire vector en 4-7 dpi met een lancering vector, waarna het expressieniveau meestal decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens is het meest gebruikte middel voor het afleveren van een gen van belang in een plant voor eiwitproductie. Agroinfiltration werkt uitzonderlijk goed in N. benthamiana maar relatief slecht in de meeste andere planten, zoals Arabidopsis thaliana 46.

In deze studie hebben we een eenvoudige, efficiënte en economische methode voor transiënte eiwitproductie in 5-6 weken oude N. benthamiana behulp A. tumefaciens infiltratie. Het grote nadeel van industriële schaal van de agroinfiltration techniek centrifugatie geoogst bacteriën en resuspensie van de bacteriële pellet in medium dat 4'-hydroxy-3 ', 5'-dimethoxyacetofenon (acetosyringoon), monosacchariden, en 2 - (N-morfolino) -ethaansulfonzuur (MES) buffer voor de inductie van de vir-genen. We zijn in staat om deze problemen te overwinnen door het optimaliseren van de Agrobacterium geweest N. benthamiana en N. houtwol, evenals in hybride N. excelsiana.

Protocol

1. Plant Growing

Voor de daaropvolgende agroinfiltration evalueerden we twee wild-type Nicotiana soorten (N. benthamiana en N. excelsior) en een hybride (N. excelsiana) hydrocultuur geteeld op steenwol in indoor faciliteiten.

  1. Geniet steenwol in een plantenvoeding oplossing.
  2. Zaaien van wild-type N. benthamiana, N. excelsior en N. excelsiana (hybride van N. benthamiana × N. excelsior) op de voedingsstoffen doorweekt steenwol oppervlak.
  3. Kweek planten van de zaden onder gecontroleerde omstandigheden (24 ° C en 40-65% relatieve vochtigheid) en een lange-dag lichtperiode (14 uur licht en 10 uur donker met verlichting van 130-150 uE m -2 s -1) voor 4-5 weken voor N. benthamiana en N. excelsiana, en 5-6 weken voor N. excelsior.

2. Constructie van vectoren voor Agroinfiltration

  1. Plaats een synthetisch reporter gen (green fluorescent protein [GFP]), full-length hemagglutinine (HA) van de A/California/04/2009 stam van het griepvirus (HAC1), en opnieuw ontworpen lichenase enzym (LicKM) 18 afzonderlijk in de lancering vector pBID4 18 (TMV-gebaseerde vector) naar pBID4-GFP, pBID4-HAC1 en pBID4-LicKM respectievelijk 18,32,41,47 verkrijgen.
  2. Introduceer 10-50 ng pBID4 dragen GFP of HAC1 in elektrocompetente cellen van A. tumefaciens stam GV3101 en LicKM in elektrocompetente cellen van A. tumefaciens stammen GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 en A4 met het gen MicroPulser electroporator.
  3. Gebruik de getransformeerde Agrobacteria voor infiltratie experimenten, tenzij anders vermeld.

3. Vacuüminfiltratie van Agrobacterium in Nicotiana Planten

  1. Grow A. tumefaciens stammen overnachting (O / N) in LB-medium, YEB medium of AB medium aangevuld met 50 mg / l kanamycine bij 28 ° C onder schudden bij 200-250 tpm.
  2. Verdun Agrobacteria in Milli-Q water tot een optische dichtheid bij 600 nm (600 A) van 0,5 of centrifuge Agrobacterium cellen gekweekt in LB of YEB of AB bij 4000 × g gedurende 10 min bij 4 ° C, resuspendeer in inductiemedium (1x MS zout, 10 mM MES, 200 pM acetosyringoon, 2% sucrose [MMA]) A 600 0,5, en roer bij kamertemperatuur gedurende 1-3 hr, tenzij anders vermeld.
  3. Infiltreren planten in een vacuümkamer door onderdompeling Nicotiana centrale lucht weefsels in Agrobacterium suspensie en toepassen van een 50-400 mbar vacuüm gedurende 30 of 60 seconden. De optimale infiltratie wordt routinematig toegepast bij 50-100 mbar gedurende 60 sec.
  4. Zodra het vacuum verbroken kunt u planten uit de vacuümkamer, spoel met water en groeien gedurende 5-7 dagen onder dezelfde groeiomstandigheden voor pre-infiltratie groei.
  5. Om de werkzaamheid te testenchemische inducerende Agrobacterium vir genen, verschillende concentraties van acetosyringoon (0, 100, 200 of 400 uM) toegevoegd aan de Agrobacteria gesuspendeerd in infiltratie buffer (1x MS, 10 mM MES, 2% glucose). Voor het effect van monosaccharide op inductie van vir gen verschillende percentages van glucose (0, 1, 2 of 4%) werden toegevoegd aan Agrobacteria gesuspendeerd in de infiltratie buffer (1x MS, 10 mM MES, 200 pM acetosyringoon). N. benthamiana planten werden geïnfiltreerd zoals vermeld in stappen 3.3 en 3.4).
  6. Agrobacterium laboratorium stammen GV3101, C58C1 en LBA4404 en wild-type stammen A4, AT06, AT10, en At77 herbergen de pBID4-LicKM vector werden verdund in Milli-Q water tot A 600 van 0.5. N. benthamiana planten werden geïnfiltreerd met elke bepaalde stam zoals vermeld in stappen 3.3 en 3.4.

4. Co-agroinfiltration Procedure voor de Viral silencing Suppressor

  1. Mix het Milli-Q-water verdund Agrobacterium GV3101 culturen die het GFP-gen en de virale zwijgen suppressor p19 van Tomato borstelige stunt virus (TBSV) op 01:01, 02:01, 03:01 en 04:01 ratio. Infiltreren N. benthamiana planten zoals hierboven beschreven.
  2. Infiltreren N. benthamiana planten met een mengsel van twee Milli-Q-water verdund Agrobacterium GV3101 culturen: de eerste die de pBID4-HAC1 plasmide en de tweede met slechts een van de silencing onderdrukkers - p19 van TBSV of p23 van Citrus tristeza virus, in de pCassp plasmide ( pCassp19) en de PGR binaire plasmide onder de 35S-promoter (PGR-P23), respectievelijk, in een verhouding 04:01.

5. Western Blot analyse

  1. Verzamel willekeurig blad monsters van N. benthamiana, N. excelsior of N. excelsiana planten op 4-7 dpi en verpulveren in vloeibare stikstof tot een fijn poeder.
  2. Voeg drie delen van 1x PBS buffer met 0,5% TritonX-100 aan elk monster.
  3. Schud de geëxtraheerde monsters gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
  4. Draai het extract gedurende 5 minuten en verzamel totaal oplosbaar eiwit in een schone Eppendorf buis.
  5. Verdun de extracten een geschikte verdunning (1:50 1:100) in 1x PBS extractiebuffer en voeg 5 x sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% broomfenolblauw, 50% glycerol v / v en 500 mM DTT) tot een uiteindelijke concentratie van 1 ×.
  6. Kook monsters gedurende 5 minuten.
  7. Afzonderlijke eiwitten door 10% SDS-PAGE, overdracht op Immobilon-P transfermembraan en blokkeren met 0,5% I-blok.
  8. Detecteren GFP met konijnen polyklonaal anti-GFP-antiserum bij 1:5000 en HAC1 met muizen anti-poly-histidine monoklonaal antilichaam bij 1:1000 in blokkerende oplossing gedurende 1 uur.
  9. Na primaire antilichaam labeling, was de membranen driemaal gedurende 10 min elk 1 x 20-PBST en geïncubeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd anti-konijn antilichaam bij 1:5000 of een HRP-conjugaatd anti-muis antilichaam bij 1:10.000 1 uur voor GFP en HAC1 detectie respectievelijk.
  10. Verwerk Western blots met behulp van de SuperSignal West Pico chemiluminescentiesubstraat.
  11. Gebruik de GeneTools Software om band intensiteit van het eiwit te analyseren en het verkrijgen van de band gekalibreerde hoeveelheid.

Eiwitproductie: (Calibrated hoeveelheid x verdunning van monster) / hoeveelheid monster geladen) x = 4 mg / kg.
Vergelijking: Eiwit productie (P), gekalibreerd hoeveelheid (C), verdunning van het monster (D) en de hoeveelheid monster geladen (S).

6. Zymogram Assay

  1. Verzamel pBID4-LicKM-geïnfiltreerd N. benthamiana willekeurige weefselmonsters.
  2. Extraheer eiwitten met dezelfde werkwijzen die hierboven beschreven voor Western blot-analyse en vervolgens analyseren met 10% SDS-PAGE met 0,1% lichenan in de gels.
  3. Na elektroforese was de gel tweemaal gedurende 10 min elk in wasbuffer (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] en 0,1% Triton X-100) En vervolgens geïncubeerd in wasbuffer bij 65 ° C gedurende 1 uur.
  4. Na incubatie gooi de wasbuffer en vlekken op de gels met 0,5% Congo Red gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  5. Spoel de gels in Milli-Q water drie keer voor 10 minuten elk, en voeg 1 M NaCl tot lichenase activiteit te visualiseren. De gezuiverde bacteriële lichenase eiwit werd gebruikt als een positieve controle voor enzymactiviteit.

7. GFP Imaging

  1. Voer een visuele detectie van GFP-fluorescentie geheel transiënt getransformeerde planten met een handbediende lange-golflengte UV-lamp.
  2. Foto transient getransformeerde planten met een digitale camera door middel van een gele 8, ES 52 filter (belichtingstijd, 15 sec).
  3. Verkrijgen beelden van Western blot analyses met behulp van de GeneSnap software op een GeneGnome en kwantificeren van de resultaten met behulp van de GeneTools software, met een kalibratiecurve gebaseerd op gezuiverde GFP standaard.
  4. Kwantificeren HAC1 eiwit met behulp van een ijklijn op basis van zuiveringed HAC eiwit norm uit de A/Indonesia/05/05 stam van het griepvirus.
  5. Bereken de gemiddelde waarden 3-4 repliceert voor alle experimenten.

Representative Results

Voedselbehoefte voor plantengroei. Het gebruik van hydrocultuur plantengroeimedium (Rockwool) en voedingsoplossing zorgt voor eenheid van N. benthamiana groei en elimineert complexiteit (mechanisch, regelgevende en efficiëntie) in verband met het gebruik van grond voor de plantenteelt. We groeiden N. benthamiana op steenwol platen geweekt in commercieel beschikbare meststoffen om de optimale omstandigheden voor de groei van planten en biomassa accumulatie bepalen. We zagen 95-100% zaadontkieming. Opgemerkt moet worden dat zoals fosfor essentieel kieming bereiken, omdat we vonden dat voedingsoplossing ontbreekt fosfor geen kieming en groei van N. ondersteunen benthamiana zaden (Figuur 1A).

Effecten van de groei Agrobacterium en infiltratie media op fytosanitaire en eiwitproductie. We hebben diverse media omstandigheden getest om de efficiëntie van de t optimaliserenhij agroinfiltration techniek voor grootschalige productie. Bacteriën (A. tumefaciens GV3101 stam) herbergt de pBID4-GFP construct werden gekweekt O / N in verschillende media omstandigheden (YEB, LB of AB), en ofwel gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in inductie medium (MMA) (met 1 × Murashige & Skoog [MS] Basale Salt Mixture, 10 mM MES pH 5,6, 20 g / l sucrose en 200 uM acetosyringone) of verdund in Milli-Q water tot A 600 van 0,5 voor het gebruik voor planten infiltratie. We zagen dat vacuüm infiltratie van planten met bacteriën verdund in water resulteerde in de productie van eiwitten die vergelijkbaar zijn met die verkregen met eventuele infiltratie media in eerdere verslagen 42,48. Daarentegen infiltratie met onverdund Agrobacterium gekweekt in YEB of LB-medium tot een volledige verwelking van N. benthamiana bladeren in minder dan 24 uur na infiltratie, terwijl onverdund Agrobacteria gegroeid in AB medium geen effect op de gezondheid van geïnfiltreerde planten had (DATeen niet weergegeven). Zoals getoond in figuur 1B, plant geïnfiltreerd met Agrobacterium culturen gekweekt in YEB LB of AB medium en verdund met Milli-Q water (01:05, A 600 van 0,6-0,8 of 1:10, A 600 van 0,3-0,4) toonde geen symptomen en vertoonde een gemiddelde GFP productie van 1645, 1520 en 1839 respectievelijk. Agrobacteria gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in inductiemedium (MMA) vertoonden geen symptomen en geen significant verschil in eiwitproductie vergelijking met Agrobacterium direct verdund in Milli-Q water ( 1671 ± 102 en 1667 ± 131 mg / kg). Daarom wordt Milli-Q water aanbevolen voor het verdunnen van Agrobacterium culturen voor planten infiltratie en werd routinematig gebruikt in onze verdere experimenten te bereiken een A 600 van 0,5.

Effecten van Agrobacterium schorsing celdichtheid en tijdsduur op doel expressie. We vervolgens onderzocht of bacteriële celdichtheidinvloed op de efficiëntie van infiltratie en niveaus van doelwitexpressiecassette. Hiertoe onderzochten we celsuspensie vier verschillende dichtheden van Agrobacterium uitvoering pBID4-GFP, A 600 van 1,0, 0,5, 0,1 en 0,05. Na infiltratie, N. benthamiana planten werden gecontroleerd op zichtbare symptomen ontwikkelen en tijd van doelgen expressie door monsters bij 4, 7 en 10 dpi. Bij 4 dpi, zagen we opmerkelijke verschillen in GFP-fluorescentie onder planten geïnfiltreerd met verschillende dichtheden celsuspensie van Agrobacterium (geen GFP expressie werd waargenomen bij 600 Een van 0,05). Op 7 dpi, GFP fluorescentie was vergelijkbaar in planten geïnfiltreerd in celsuspensie van dichtheden A 600 1.0, 0,5 en 0,1, maar lager in planten geïnfiltreerd in een A 600 van 0,05. Zoals getoond in figuur 1C, werden deze gegevens bevestigd door Western blot analyse van monsters bij 4 dpi, die zeer lage eiwitproductie bij A 600 600 A van 1,0 (1739 mg / kg). Op 7 dpi, planten vertoonden geen significante verschillen in geraamde GFP productie Een 600 van 1,0, 0,5 en 0,1 (1662, 1870 en 1890 respectievelijk), terwijl A 600 0,05 vertoonden lagere productie GFP (1.199 mg / kg). Daarentegen, bij 10 dpi geen verschillen in GFP productie werd waargenomen bij planten geïnfiltreerd met een van de vier celsuspensie dichtheden (1.218, 1.181, 1.197 en 1.304).

Infiltratie met alternatieve stammen van Agrobacterium. Om de diversiteit van Agrobacterium stammen beschikbaar voor voorbijgaande verhoging van de eiwitproductie, testten we wild-type isolaten. Deze stammen, geïsoleerd uit de kroon-gal van natuurlijke gastheren, werden vriendelijk verschaft door Dr Gelvin (Purdue University, West Lafayette, Indiana). Om hun nut in voorbijgaande eiwitproductie onderzoeken, we geïnfiltreerd N. benthamiana met de volgende stammen Carrying pBID4-LicKM 18: A. rhizogenes (A4) en A. tumefaciens wildtype Nester stammen A348, A208 en A281 (genaamd At6, AT10 en At77, respectievelijk), alsook gemanipuleerde laboratorium stammen van A. tumefaciens GV3101, C58C1 en LBA4404. De geïnfiltreerde bladeren werden bij 7 dpi verzameld en het niveau van LicKM expressie werd geschat door Western blot assay. Zoals getoond in figuur 2A, de hoogste LicKM productie kan worden bereikt met de stammen GV3101, A4 en LBA4404 (~ 1750 ± 163 1650 ± 26 en 1450 ± 117 mg / kg), met kleine verschillen; het laagste niveau van expressie (~ 900 ± 102 mg / kg) met C58C1; en intermediaire productie met At6, AT10 en At77 (~ 1250 ± 19, 1100 ± 42 en 1200 ± 111 mg / kg, respectievelijk). De lichenase enzymatische activiteit werd aangetoond middels Zymogram analyse. Figuur 2B toont dat lichenase geproduceerd geïnfiltreerd plantenweefsels met een van deAgrobacterium-stammen werd enzymatisch actief. Men moet ook rekening mee dat N. benthamiana planten geïnfiltreerd met A4 en At77 stammen toonde pathologische symptomen (dwerggroei, bladsteel rek en curling, en blad curling), terwijl met AT10 stam van de symptomen waren mild. Geen symptomen waargenomen bij N. benthamiana planten geïnfiltreerd met laboratoriumstam GV3101 (figuur 2C).

Infiltratie van alternatieve Nicotiana soorten. We vergeleken de prijzen van biomassa opwekking en eiwitproductie in twee wild-type soorten van het geslacht Nicotiana (N. benthamiana en N. excelsior) en in een hybride soort, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior). Van de geteste soorten, N. benthamiana, een veel gebruikte gastheer voor voorbijgaande eiwit productie met behulp van Agrobacterium-gebaseerde of virale-gebaseerde expressie systemen 2,34,49, bereikt infiltratie bereidheid binnen 4-5 weken na ontkieming. De noodzakelijke groei periode om het optimale niveau van biomassa te genereren is ook 4-5 weken voor N. excelsiana maar is langer (6-7 weken) voor N. excelsior. Bovendien, de plant internodien relatief kort voor N. houtwol vergelijking met andere soorten Nicotiana.

Verder hebben we geconstateerd dat vacuüm infiltratie van N. benthamiana en N. excelsiana bij 50-250 mbar gedurende 60 sec is zeer efficiënt voor agroinfiltration van hele bladeren, terwijl N. houtwol moeilijk te infiltreren vanwege het lagere luifel en leerachtige bladeren, zelfs wanneer een vacuüm driemaal werd toegepast gedurende 1 min elk in de aanwezigheid van niet-ionogene oppervlakteactieve stoffen zoals Sillwet-77 of S240. Ook de kiemkracht van N. excelsiana en N. excelsior zaden was ~ 40-50%; om de kieming te verhogen tot 90-100%, moet zaden behandeld met 10% bleach 1 uur vóór het zaaien. Onder dezelfde groeiomstandigheden, de hoogste blad biomassa die kan worden gegenereerd uit N. excelsiana is ongeveer twee keer zo hoog in vergelijking met N. benthamiana (Tabel 1).

Eiwitproductie werd in N. onderzocht benthamiana, N. excelsior en N. excelsiana geïnfiltreerd met de Agrobacterium stam GV3101 herbergen pBID4-GFP. GFP-accumulatie werd op 7 dpi geheel geïnfiltreerde bladeren met UV licht, gevolgd door Western blotanalyse. Figuur 3A toont gelijkmatige verdeling van GFP in N. benthamiana en N. excelsiana en ongelijke verdeling in N. excelsior (te wijten aan een probleem van het infiltreren van een volledige bladoppervlak van N. excelsior). Figuur 3B toont het niveau van GFP productie geschat door UV-licht verlichting in geïnfiltreerd bladeren verzameld uit de drie Nicotiana soorten op 7 dpi. De GFP geaccumuleerdening niveau hoger in N. was benthamiana (~ 2,23 g / kg) dan in N. excelsiana en N. excelsior (~ 1,89 en 1,54 g / kg, respectievelijk). Het lage niveau van de eiwitproductie in N. excelsior is het gevolg van ongelijke infiltratie en distributie van geaccumuleerde GFP in de verzamelde blad.

We zagen dat de bovenste bladeren rechtstreeks blootgesteld aan licht vertonen vaak de oudste en hoogste niveaus van voorbijgaande GFP accumulatie (bij 2-4 dpi) dan bladeren onder de luifel. In onze studies, GFP-accumulatie was het hoogst bij 7 dpi en is gelijkmatig verdeeld over de meeste bladeren, behalve niet-geïnfiltreerde nieuw groeiende bladeren die geen GFP accumulatie zien.

Effecten van vacuümdruk en duur van transiënte eiwitproductie. Vacuüm infiltratie verhoogt transiënte expressieniveaus vergelijkt druk handmatig injectie aangebracht met een naaldloze injectiespuit 42. De toepassing van eenvacuüm veroorzaakt gassen te evacueren uit ondergedoken bladeren via huidmondjes. Wanneer het vacuüm wordt verbroken en de druk snel toeneemt, wordt de suspensie van Agrobacterium gedreven in bladeren naar de geëvacueerde gas 50 vervangen.

Om het effect van vacuümdruk op de bladeren van N. testen benthamiana, we geïnfiltreerd planten met de Agrobacterium stam GV3101 herbergen pBID4-GFP onder verschillende druk vacuüm (50-400 mbar) voor 30 of 60 sec. Er werd aangetoond dat de sterkere vacuüm (minder dan 50 mbar) toegepast gedurende 30 of 60 seconden leidt tot mechanische beschadiging van geïnfiltreerde bladeren, waardoor weefsel verwelken en afsterven van de plant kort na infiltratie (24-48 uur). Anderzijds, toepassing van de mildere vacuüm (400 mbar) leidt infiltratie van slechts 50% van het bladoppervlak en een verlaagd niveau van GFP produktie (303 ± 90 mg / kg) (Figuur 4A). Belangrijk, geen verschillen in GFP productie zagen we onder 50, 100 en 200 mbar (1651 ± 107, 1688 ± 40, 1594 ± 26 mg / kg, respectievelijk) (Figuur 4A) en milde tot geen, nadelige gevolgen voor de gezondheid van planten wanneer vacuümdrukken 50-200 mbar toegepast voor 30 of 60 seconde Daarom wordt 50-100 mbar vacuüm druk aanbevolen voor infiltratie experimenten.

Het effect van de duur van het vacuüm op doel expressie werd bepaald door infiltreren een plat N. benthamiana planten per uur met een 600 van 0,5 GV3101 herbergen pBID4 -. GFP 8 uur in dezelfde Agrobacterium cultuur Figuur 4B toont dat het niveau van GFP-productie was vergelijkbaar op alle tijdstippen tot 8 uur, wat suggereert dat op deze tijd de Agrobacterium behoudt de mogelijkheid om een enkelstrengs DNA starten.

Effect van chemische inductie op eiwitproductie. Bepaalde plantfenol metabolieten en suikers kan induce virulentie genen van A. tumefaciens 1,52. Bijgevolg hebben vele chemicaliën en monosaccharaides gemeld om tijdelijke eiwitproductie in verschillende plantensoorten te verbeteren. Acetosyringone wordt meestal toegevoegd aan culturen van A. tumefaciens de vir operon induceren voordat agroinfiltration 40,53-57.

We hebben het effect van verschillende concentraties van acetosyringon (0, 100, 200 en 400 uM) en glucose (0-4%) op voorbijgaande productie GFP-eiwit in N. geëvalueerd benthamiana geïnfiltreerd met de Agrobacterium stam GV3101 herbergen pBID4 - GFP. Hiervoor hebben we opnieuw gesuspendeerd Agrobacterium cellen in MMA inductie medium dat verschillende concentraties van acetosyringoon en glucose 1-3 uur voor infiltratie. Volgens de resultaten van zowel visuele waarneming (gegevens niet getoond) en Western blot analyse (Figuur 4C), geen van de geteste concentratiesvan deze verbindingen veroorzaakte een aanzienlijke toename van GFP-fluorescentie of eiwitproductie tegenover aansturing aan inductie medium bevatte geen acetosyringoon of glucose.

Effect van co-infiltratie van een silencing suppressor op voorbijgaande productie van GFP en HAC1 genen in N. benthamiana bladeren. Eerder is aangetoond dat co-expressie van een suppressor silencing (p19 tomaat bushy stunt virus [TBSV]) interfereert met post-transcriptionele gene silencing (PTGS), resulterend in verhoogde productie van reporter eiwitten 34.

We hebben het effect van co-infiltratie van N. geëvalueerd benthamiana met de lancering vector die het GFP-reporter-gen (pBID4-GFP) en P19. Vóór infiltratie, een A 600 0,5 verdunningen van A. tumefaciens GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP en P19 werden respectievelijk gemengd in verhoudingen van 01:01, 02:01, 03:01 en 04:01. Expression van het zwijgen suppressor werd gecontroleerd door de bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter. Zoals de resultaten van Western blot-analyse op 7 dpi (figuur 5A), had de aanwezigheid van P19 verhogen of GFP productie afnemen N. benthamiana, op een verhouding van de beide Agrobacterium suspensies.

We hebben ook de effecten vergeleken van twee virale gene silencing onderdrukkers - p23and p19 - op de preventie van PTGS voor HAC1. Kweken van Agrobacterium die de lancering vector pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) en een van de twee virale silencing suppressor plasmiden werden verdund tot een A600 van 0,5, gemengd bij een verhouding van 4:1, respectievelijk, en co-geïnfiltreerd in 4-5-weken oude N. benthamiana. Een suspensie van A. tumefaciens uitvoering pBID4 - HAC1 alleen werd geïnfiltreerd als controle. De geïnfiltreerde bladeren werden verzameld van 3 tot 8 dpi. Het experiment was repeATED drie keer en het gemiddelde niveau van de HAC1 expressie bepaald door Western blot analyse.

Zoals getoond in figuur 5B, co-infiltratie van N. benthamiana met p23 en p19 leidde tot (642 ± 157 en 764 ± 108 mg / kg) een verhoging HAC1 productie vergeleken met het gebruik zonder silencing suppressor (ongeveer 15-25%, respectievelijk) en 6 dpi. Dit suggereert dat p23 en p19 zijn efficiënt in ons systeem. Er moet echter worden opgemerkt dat de accumulatie van HAC1 trad een dag eerder wanneer pBID4-HAC1 werd samen geïnfiltreerd met P19. Daarom, onze resultaten tonen aan dat de effecten van de silencing suppressor p19 op HAC1 en GFP-accumulatie verschillend suggereert selectieve versterking van tijdelijke expressie en / of de stabiliteit van sommige eiwitten in N. benthamiana.

We merkten ook op dat zowel in de aanwezigheid en in afwezigheid van een silencing suppressor het niveau van de HAC1 eiwit production begon dalende om 7 dpi. Dit geeft aan dat de timing van de daling van de voorbijgaande eiwitproductie in N. benthamiana geïnfiltreerd met de lancering vector is doelspecifiek.

De cel bank van Agrobacterium de lancering vector werd jaarlijks geëvalueerd doelwitgen stabiliteit Agrobacterium levensvatbaarheid en het eiwitgehalte accumulatie. De glycerol voorraad van de cel bank van GV3101 stam getransformeerd met pBID4-HAC1 dat werd bewaard bij -80 ° C is aangetoond dat het zeer stabiel te zijn voor meer dan drie jaar zonder veranderingen in het niveau van voorbijgaande eiwitproductie in geïnfiltreerd N. benthamiana planten. Figuur 5C toont aan dat de HAC1 eiwitproductie geschat door Western blotting in de jaren 2010, 2011, 2012 en 2013 was 670, 685, 566 en 683 mg / kg, respectievelijk. De gemiddelde HAC1 productie in N. benthamiana planten was 651 ± 49,4 mg / kg.


Tabel 1. Vergelijking van N. benthamiana en N. excelsiana plantaardige biomassa productie.

Figuur 1
Figuur 1. Western blot analyse van transiënte genexpressie in N. benthamiana. (A) Zes weken oude N. benthamiana 1) planten in een meststof oplossing met 4,8% fosfor en 2) planten groeien in een meststof oplossing met 0% fosfor. Vijfentwintig ug blad gewichtequivalent vers werd geladen per baan. (B) Vergelijking van GFP productie in planten vacuüm geïnfiltreerd met pBID4-GFP herbergen Agrobacterium GV3101 culturen gekweekt in drie verschillende media: YEB, AB en LB. GV3101 culturen gegroeid O / N in YEB of LB medium werd op lage snelheid gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in inductiemedium (MMA) (lanen: MMA MMA-1 en-2, respectievelijk) of gekweekt O / N in YEB, LB of AB media en direct verdund tot 1:05 of 1:10 met Milli-Q water (lanen: YEB / 5 en YEB/10; AB / 5 en AB/10; LB / 5 en LB/10) (C) Vergelijking. van GFP-expressie bij 4, 7 en 10 dpi na vacuüm infiltratie met verschillende concentraties (600 A van 1,0, 0,5, 0,1 en 0,05) A. tumefaciens GV3101 stam die pBID4-GFP.

Figuur 2
Figuur 2. Vergelijking van voorbijgaande lichenase productie en activiteit na vacuüm infiltratie van N. benthamiana planten met verschilhuren stammen van Agrobacteria. Culturen van Agrobacterium stammen (GV3101, A4, At77, C58C1, At6, AT10 en LBA4404) herbergen de lancering vector pBID4-LicKM werden individueel in bladeren van N. geïnfiltreerd benthamiana. Geïnfiltreerde bladeren werden verzameld op 7 dpi. (A) Lichenase productie gekwantificeerd door Western blotting. (B) Zymogram test aantonen lichenase productie door enzymatische activiteit. (C) Effect van Agrobacterium (wild-type A4, AT10, At77 en laboratoriumstam GV3101) infiltratie op N. benthamiana fytosanitaire op 7 dpi. Vijfentwintig ug blad gewichtequivalent vers werd geladen per baan.

Figuur 3
Figuur 3. Transient GFP expressie in bladeren van N. benthamiana, N. excelsiana en N. excelsior op 7 dpi na vacuüminfiltratie met A. tumefaciens herbergen de lancering vector pBID4 - GFP. (A) Visueel onderzoek van GFP-expressie onder UV-licht. (B) Western blot analyse van GFP accumulatie.

Figuur 4
Figuur 4. (A) Effecten van onderdruk op voorbijgaande GFP expressie en de gezondheid van planten. N. benthamiana planten werden geïnfiltreerd met pBID4 -. GFP onder vacuüm druk van 400, 200, 100 of 50 mbar, bij vacuüm houden van 30 of 60 seconden (B) Stabiliteit en besmettelijkheid van A. tumefaciens in N. benthamiana geïnfiltreerd met Agrobacterium GV3101 herbergen pBID4-GFP gegroeid in AB medium en verdund tot een A-600 van 0,5. Agroinfiltration werd uitgevoerd door het infiltreren van een flat van N. benthamiana planten elk uur in dezelfde verdunde Agrobacterium cultuur (lanen 0-8). (C) Effect van verschillende concentraties van acetosyringon en glucose op tijdelijke expressie van GFP. De Agrobacterium stam GV3101 herbergt pBID4 - GFP werd gegroeid O / N in YEB medium, gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd tot een A600 van 0,5 hetzij MMA bevattende 2% glucose met acetosyringoon bij 0, 100, 200 of 400 uM, of MMA met 200 pM acetosyringoon met glucose op 0, 1, 2 of 4%. De Agrobacterium suspensies werden gedurende 3 uur bij kamertemperatuur voor infiltratie.

Figuur 5
Figuur 5. Effecten van silencing onderdrukkers op voorbijgaande eiwitproductie in N. benthamiana verlaat. (A) Western blot analyse van GFP-eiwit na co-infiltratie van pBID4-GFP en P19 in verschillende verhoudingen. Monsters verzameld op 7 dpi (25 ug blad gewichtequivalent vers werd geladen per baan). (B) Een cultuur van Agrobacterium dragen pBID4-HAC1 werd individueel gemengd in een verhouding van 4:01 met een cultuur die de p19 of p23 silencing suppressor plasmiden. De resulterende combinaties van Agrobacterium culturen werden vacuüm geïnfiltreerd in planten. Geïnfiltreerde weefsels van HAC1 werden dagelijks verzameld tot 8 dpi voor recombinant eiwit kwantificering. (C) Stabiliteit van Agrobacterium cel bank. Planten werden geïnfiltreerd met dezelfde batch van de Agrobacterium cel bank elk jaar eiwitaccumulatie evalueren. Vijftig ug blad gewichtequivalent vers werd geladen per baan. Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.

Discussion

In deze studie hebben we een eenvoudige agroinfiltration protocol voor alleen tijdelijke eiwitproductie in bepaalde soorten Nicotiana middels Agrobacterium stammen die de lancering vector ontwikkeld. Bovendien hebben wij de optimale omstandigheden die de hoogste recombinante eiwitproductie niveau onze transiënte fabriek expressiesysteem bereiken.

Vacuüm infiltratie van de verdunde A. tumefaciens stam GV3101 herbergt de lancering vector pBID4 in N. benthamiana, N. excelsiana en N. excelsior resulteerde in hogere niveaus van target eiwitproductie binnen 7 dpi vergelijking met andere plantensoorten, zoals Pisum sativum geïnfiltreerd met GV3101 herbergen Alfalfa mosaic virus - of komkommer mozaïek-virus gebaseerde vectoren die de GFP reporter gen onder de 35S-promotor 41, of Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum en Arabidopsis thaliana geïnfiltreerd met de C58C1 stam van A. tumefaciens die de beta-glucuronidase reportergen 57. N. benthamiana en N. excelsiana waren gemakkelijk te stofzuigen infiltreren bij 50 mbar gedurende 30-60 sec, met 90-95% infiltratie efficiëntie. De resterende 5-10% bladoppervlak niet geïnfiltreerd vanwege een drijvende bladeren op het oppervlak van de Agrobacterium-suspensie tijdens het aanbrengen van het vacuüm. Sinds de introductie vector heeft de mogelijkheid voor cel-tot-cel beweging 18, voorbijgaande proteïne ophoping in hele bladeren en bladstelen 7 dpi. Bij 10 dpi, de geschatte GFP productie iets lager omdat pBID4 expressievector kan bewegen van cel naar cel, maar niet systemisch 18 bewegen; daarom, pas gegroeide bladeren niet de vector bevatten en niet bijdragen tot de productie van het doel. Bovendien degradatie van het recombinante eiwit tijd may dragen bij aan lagere niveau eiwit op 10 dpi. Onze resultaten toonden dat infiltratie van A. tumefaciens stam GV3101 gemedieerde hoge niveaus van voorbijgaande eiwitproductie in N. benthamiana. Verder kan doeleiwit worden gemanipuleerd als N-eindstandige, C-eindstandige of interne fusies aan lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, een thermostabiel enzym van Clostridium thermocellum en verleent thermostabiliteit vele doelwit eiwitfusie 18. Infiltratie van N. benthamiana met A. tumefaciens wild-type stammen (at6, AT10 en at77) herbergt het gen van interesse opgewekt milde of ernstige symptomen: blad curling, bladsteel rek, en curling. Geen pathologische symptomen waargenomen bij N. benthamiana geïnfiltreerd met het laboratorium stam GV3101 herbergen leeg pBID4 vector, terwijl sommige genen ingebracht in pBID4 en omgetoverd tot laboratorium stammen GV3101, C58C1 of LBA4404 uitgelokt milde necrotische reacties en bladchlorose / vergeling symptomen bij geïnfiltreerd regio's van bladeren. Necrotische symptomen veroorzaakt door wild-type Agrobacterium of ontwapend stammen in nachtschadeachtigen planten zijn eerder 56,57 gerapporteerd. De necrotische reactie kan resulteren uit virulentiefactoren van type III secretie systeem, bacteriële eiwitten overgebracht naar de plantencel door het Type IV secretie systeem, en / of gevoeligheid voor flagelline 58-60. Wij hebben gevonden dat transiënte productie van heterologe eiwitten ook kunnen opwekken pathogeniteit en een overgevoelige reactie in geïnfiltreerde bladeren. Veel onderzoekers rapporteerden dat agroinfiltration van verschillende plantensoorten met plant binaire vectoren geproduceerd tot 5-20 maal hogere niveaus van voorbijgaande eiwitproductie ten opzichte van stabiel getransformeerde planten 28,57. Onze gegevens tonen aan dat N. benthamiana geïnfiltreerd met GV3101 herbergen pBID4-GFP transiënt tot expressie hoge niveaus van GFP, die vergelijkbaar is met de GFP opbrengst gerapporteerdN. benthamiana geïnfiltreerd met Agrobacterium die de Pich-GFPSYS virale vector (tot 80% van de totale oplosbare eiwit) 44. Agroinfiltration gebruik van onze lancering vector resulteerde in hoge productie van de thermostabiele eiwit LicKM, 50-maal hoger dan deze waargenomen met behulp van een standaard binair plasmide 18.

Om de besmettelijkheid van A. testen tumefaciens en de stabiliteit van de lancering vector, we geïnfiltreerd een flat van N. benthamiana elk uur voor maximaal 8 uur met dezelfde Milli-Q-water verdund cultuur van GV3101 herbergen de pBID4-GFP plasmide. Onze gegevens laten zien dat de GV3101 stam efficiënt is besmettelijk gedurende minstens 8 uur en pBID4 (de lancering vector) is zeer stabiel tijdens de 8 uur durende infiltratie.

Glycerol voorraad van GV3101 stam die de lancering vector pBID4-HAC1 (cel bank) bewaard bij -80 ° C is aangetoond dat het zeer stabiel te zijn gedurende drie jaar zonder veranderingen in voorbijgaande protevan de productie in geïnfiltreerd planten.

N. benthamiana planten onder optimale condities en tussen 35 en 42 dagen na het zaaien gegroeid waren optimaal voor vacuüm-infiltratie gemedieerde transiënte genexpressie 40. Jongere planten (3-4 weken oud) niet volledig worden geïnfiltreerd door bladeren drijvend op de celsuspensie oppervlak en weefselschade door de mechanische werking van een vacuüm. In planten die ouder zijn dan 45 dagen, N. benthamiana builen podium, onder de optimale lichtomstandigheden gebruikt, het niveau van de tijdelijke expressie is laag.

Laag molecuulgewicht fenolische verbindingen (acetosyringoon) en monosaccharaides (glucose) daar vir genen induceren in A. tumefaciens 55,61. Bovendien infiltratie van N. benthamiana met de binaire vector pCAMBIA (gfp) in aanwezigheid van acetosyringoon bij concentraties van 50-600 pM werden licht toenemen voorbijgaandegenexpressie 40. We onderzochten het effect van verschillende concentraties van acetosyringoon en glucose in het systeem door het toevoegen van deze verbindingen GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP MMA 3 uur en vond geen verschil in GFP-expressie. Interessant, GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP en verdund in Milli-Q water tot een A 600 van 0,5 en geïnfiltreerd zonder de vir geninductie uitgedrukt dezelfde hoeveelheden GFP als die geïnfiltreerd met geïnduceerde culturen. De A. tumefaciens vir gen (en) zou kunnen worden geïnduceerd door plantfenolsamenstellingen (acetosyringoon en sinapinezuur) en plantaardige monosaccharaides (glucose en fructose) aanwezig in bladweefsel. Derhalve speculeren wij dat soortgelijke niveaus van GFP-expressie in de aanwezigheid of afwezigheid van exogeen vir gen inductoren gevolg van het effect van cytoplasmatische vir gen inductoren aanwezig tijdens replicatie van de GFP expressie vector introductie in plantencellen zijn.

N benthamiana is gebruikt als model gastheer voor voorbijgaande eiwitproductie 49. Echter, N. benthamiana 's relatief laag biomassaopbrengst belemmert de toepassing ervan voor de grootschalige productie van recombinante eiwitten. De optimale gastheer moet een hoge mate van kortstondige expressie, gemakkelijke groei in een kas combineren, zijn gevoelig voor Agrobacterium infiltratie 2. Om een alternatieve gastheer selecteren, we geïnfiltreerd twee verschillende wild-type soort Nicotiana (N. benthamiana en N. excelsior) en een hybride N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) met de A. tumefaciens stam GV3101 herbergt de pBID4-GFP plasmide. Tussen deze drie soorten, het niveau van GFP-expressie iets hoger N. benthamiana. N. excelsior planten moeite met vacuüm agroinfiltration toonden door hun leerachtige bladeren, en N. excelsianaproduceerde ongeveer twee keer meer biomassa onder dezelfde groeiomstandigheden. De voorbijgaande productie van GFP op 7 dpi is relatief vergelijkbaar in N. benthamiana en N. excelsiana. Daarom N. excelsiana kan een meer geschikte gastheer voor recombinant eiwitproductie zijn.

Agrobacterium gemedieerde tijdelijke eiwitproductie wordt beperkt door PTGS 26, die kan worden ondervangen door co-expressie van gene silencing suppressors van plantenvirus oorsprong 62. Voorbijgaande eiwitproductie werd aangetoond worden verbeterd 50-voudig in aanwezigheid van het p19 eiwit van TBSV, die PTGS in geïnfiltreerde weefsels 34 remt. In onze studie, onderzochten we het effect van twee virale silencing onderdrukkers (p19 en p23) afzonderlijk co-geïnfiltreerd met de lancering vector pBID4-HAC1. De co-infiltratie van deze zwijgen suppressors leek weinig invloed op transiënte expressie van HAC1 hebben, met slechts een lichte stijging HAC1eiwit accumulatie (15-25%) in de aanwezigheid van co-geïnfiltreerde p23 of p19. Een positieve invloed hebben eiwitproductie, kan het nodig zijn tot zwijgen onderdrukkers specifiek worden geselecteerd effectief voor de gerichte plantensoorten en virale vector 63 te zijn. TMV helicase heeft een onderdrukker van RNA-silencing activiteit 64,65. Onze gegevens bevestigen deze waarneming als co-infiltratie van p23 of p19 met pBID4-HAC1 resulteerde in een toename van GFP of een lichte stijging van de voorbijgaande HAC1 eiwitproductie.

Concluderend hebben we aangepast en geoptimaliseerd vaste Agrobacterium groei omstandigheden en verbeterde de efficiëntie van vacuüm infiltratie. Deze technologie ons in staat om te groeien en te infiltreren honderden kilo plantaardig materiaal in een paar uur. Wij hebben met succes geautomatiseerde de plant tijdelijke expressie techniek voor high-throughput vaccin productie op industriële schaal onder de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP) omstandigheden. Voor meer informatie about automatisering en het gebruik van de plantaardige voorbijgaande eiwitproductie voor de productie van recombinante eiwitten, waaronder subunit vaccin kandidaten, onder cGMP condities, wordt de lezer verwezen naar de website www.fhcmb.org/ .

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door Fraunhofer USA Centrum voor Moleculaire Biotechnologie, iBio, Inc en de Defense Advanced Research Projects Agency (subsidie ​​# HDTRA1-07-C-0054). De auteurs erkennen de gulle giften door Drs. Stanton Gelvin of Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammen) en Wayne Fitzmaurice van Large Scale Biologie Corp (N. excelsiana zaden), evenals Jennifer Nicholson van de Amerikaanse Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior zaden ). De auteurs danken Margaret Shillingford en Christopher Hull voor het leveren van planten en uitstekende technische bijstand. De auteurs danken ook Drs. Stephen Streatfield en Natasha Kushnir voor redactionele ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, , Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Tags

Plant Biology Agroinfiltration, Voorbijgaande eiwitproductie plantaardige expressie virale vector,
Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V.,… More

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter