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Biology

के कुशल उत्पादन और शोधन संयोजक Murine Kindlin -3 की biophysical अध्ययन के लिए कीट कोशिकाओं से

Published: March 19, 2014 doi: 10.3791/51206
Automatic Translation
1, 1
1Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford

Summary

Kindlins integrins के माध्यम से कोशिका आसंजन के लिए मौलिक हैं, लेकिन उनमें से पढ़ाई बैक्टीरियल मेजबानों में recombinantly उन्हें व्यक्त करने में कठिनाई का सामना द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. हम यहाँ baculovirus संक्रमित कीट कोशिकाओं में उनके कुशल उत्पादन के लिए विधियों का वर्णन.

Abstract

Kindlins कोशिका की सतह रिसेप्टर्स integrins की, Talin साथ, आवश्यक coactivators हैं और भी बाहर में संकेत integrin में भाग लेने, और सेल नाभिक में जीन प्रतिलेखन के नियंत्रण. kindlins ~ 75 केडीए multidomain प्रोटीन होते हैं और एक NPxY आकृति और integrin β सबयूनिट cytoplasmic पूंछ के अपस्ट्रीम टी / एस क्लस्टर के लिए बाध्य. hematopoietically महत्वपूर्ण kindlin isoform, kindlin -3, thrombus गठन के दौरान प्लेटलेट एकत्रीकरण के लिए महत्वपूर्ण है, संक्रमण और सूजन और अस्थि अवशोषण में अस्थिशोषक podocyte गठन के जवाब में रोलिंग ल्युकोसैट. इन प्रक्रियाओं में Kindlin -3 की भूमिका व्यापक सेलुलर और शारीरिक पढ़ाई में हुई है. हालांकि, आगे के अध्ययन के लिए प्रोटीन की उच्च गुणवत्ता मिलीग्राम मात्रा में प्राप्त करने का एक कारगर तरीका के लिए एक की जरूरत है. हम एक baculovirus डी के उपयोग द्वारा पुनः संयोजक murine kindlin -3 के कुशल अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए, यहाँ वर्णित, एक प्रोटोकॉल विकसित किया हैइसके biophysical लक्षण वर्णन अनुमति देने के लिए उच्च शुद्धता पूर्ण लंबाई प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में उपज Sf9 कोशिकाओं में अभिव्यक्ति प्रणाली विखंडित. एक ही दृष्टिकोण अन्य स्तनधारी kindlin isoforms के अध्ययन में लिया जा सकता है.

Introduction

Kindlin परिवार के प्रोटीन एक महत्वपूर्ण फोकल आसंजन विधानसभा के घटक, और जटिल जीवन के लिए इसलिए जरूरी हैं. 3 स्तनधारियों में isoforms (kindlin -1, kindlin-2, और kindlin -3) कर रहे हैं जिनमें से Kindlins, Talin 1 के साथ कोशिकी रिसेप्टर्स integrins की coactivators माना जाता है. Integrin की मध्यस्थता सेल आसंजन उच्च eukaryotes में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) को कोशिका की सतह से जोड़ता है. यह ऊतक अखंडता, embryogenesis, हड्डी चयापचय, रक्तस्तम्भन, और प्रतिरक्षा में शामिल हैं जो शारीरिक घटना के ढेर में एक महत्वपूर्ण और सामान्य प्रक्रिया है. Integrin की मध्यस्थता सेल आसंजन उनके संरक्षित NPxY रूपांकनों पर integrin β सबयूनिट cytoplasmic पूंछ (सीटीएस) को Talin और kindlin के बंधन के माध्यम से अंदर बाहर संकेत पारगमन के माध्यम से सक्रिय है. kindlin प्रोटीन की जैव चिकित्सा महत्व के रूप में दूर kindlin -2 प्रतिलेखन में शामिल होने के लिए हाल ही में कई रिपोर्टों में दिखाया गया है जहां नाभिक, हालांकि फैलीअल 2,3 नियंत्रित करते हैं.

Kindlins अपने F2 उपडोमेन के केंद्र में एक pleckstrin अनुरूपता (पीएच) डोमेन से बाधित है, जो एक द्विपक्षीय सी टर्मिनल FERM (4.1 बैंड, एजरिन, radixin, moesin) डोमेन, के कब्जे से हॉलमार्क लगभग 75 केडीए की multidomain प्रोटीन, कर रहे हैं 4,5. Kindlin -2 और kindlin -3 पीएच डोमेन के अध्ययनों से यह लिपिड दूसरा दूत phosphatidylinositol-(3,4,5) trisphosphate और phosphatidylinositol-(4,5) बाइफोस्फेट 6-8 कि बांध दिखाया. हालांकि, kindlin -1 पीएच डोमेन की पढ़ाई यह बंधन से लिपिड को रोकने के लिए एक isoform विशेष नमक पुल से kindlin -1 में समझाया जा सकता है, जो एक बहुत कम समानता, साथ PtdIns (3,4,5) पी 3 के लिए बांध बताते हैं कि 9. इसके अलावा, सामने आया होने की भविष्यवाणी की है, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली 10,11 की आंतरिक पत्रक में phosphatidylserine को बांधता है कि kindlins की F1 डोमेन में डाला एक ~ 100 अमीनो एसिड पाश है. kindlin FERMTalin FERM डोमेन एक pleckstrin अनुरूपता डोमेन के अधिकारी नहीं है, हालांकि डोमेन, Talin FERM डोमेन के लिए मुताबिक़ माना जाता है. दोनों kindlins और Talin उनके FERM डोमेन की F3 क्षेत्र के माध्यम से integrin β-पूंछ पर NPxY रूपांकनों के साथ बातचीत, लेकिन Talin झिल्ली समीपस्थ एक 12-16 लक्षित करता है, जबकि kindlin, झिल्ली बाहर का मूल भाव को बांधता है. इसके अलावा दोनों Kindlins और Talin अन्य FERM प्रोटीन 11,17 में नहीं पाया जाता है कि एक ubiquitin की तरह गुना के साथ एक एन टर्मिनल F0 डोमेन के अधिकारी. Kindlin-2 के F0 डोमेन पर अध्ययन यह स्वतंत्र रूप से phosphatidylinositol-(4,5) बाइफोस्फेट समृद्ध झिल्ली से 17 कि बांध से पता चला है.

kindlins paralogue विशिष्ट ऊतक अभिव्यक्ति पैटर्न और nonredundant शारीरिक कार्यों दिखा रहे हैं. Kindlin -1 मुख्य रूप से एपिडर्मिस में व्यक्त किया है, लेकिन यह भी एक हद तक कम करने के लिए पेट, पेट, और गुर्दे, kindlin -2 सर्वत्र व्यक्त किया है, लेकिन में केंद्रित है धारीदार और चिकनीमांसपेशी और भ्रूण के विकास 4 में व्यक्त केवल kindlin है, और kindlin -3 megakaryocytes 18 में पाया kindlin -3 के सर्वोच्च एकाग्रता के साथ hematopoietic ऊतकों में व्यक्त किया है. हालांकि, हाल ही के अध्ययन कार्यात्मक प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से 19 endothelial ऊतकों में व्यक्त किया है कि सुझाव दिया है.

Kindlin -3 की वजह से खून में इसकी महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका को तीव्र चिकित्सा ब्याज की है. यह प्लेटलेट एकत्रीकरण और संक्रमण और सूजन 21,22 और अस्थि अवशोषण 23 में अस्थिशोषक podocyte गठन के जवाब में thrombus गठन 20, ल्युकोसैट रोलिंग के दौरान प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है. जीवन के लिए खतरा खून बह रहा विकारों और आवर्तक बैक्टीरियल संक्रमण 20,24,25 की विशेषता बीमारी - इसके अलावा, kindlin-3 मानव में की कमी आसंजन कमी प्रकार-III ल्युकोसैट की ओर जाता है. चूहों में Kindlin -3 नाक आउट पढ़ाई में प्रोटीन की महत्वपूर्ण समारोह का पता चलासेल आसंजन KIND3 -. / - चूहों kindlin -3 की कमी से मानव में लक्षण दिखने की वजह से निष्क्रिय प्लेटलेट integrins, गंभीर osteopetrosis, और बिगड़ा ल्युकोसैट आसंजन 20,22 करने के लिए इस तरह के गंभीर रक्तस्राव के रूप में अलग phenotypes, प्रदर्शित करते हैं.

Kindlins पर उच्च संकल्प संरचनात्मक डेटा, आज तक, इस तरह के pleckstrin अनुरूपता kindlin-1 9 और kindlin -2 26,27 के (पीएच) डोमेन और kindlin -1 11 और kindlin की F0 डोमेन के रूप में व्यक्तिगत उप डोमेन के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है -2 17. प्रत्येक kindlin पॉलीपेप्टाइड के उप डोमेन से ज्यादातर लेकिन क्लोनिंग और संरचनात्मक विश्लेषण (येट्स और गिल्बर्ट, अप्रकाशित टिप्पणियों) का विरोध किया है, और पूर्ण लंबाई प्रोटीन की पढ़ाई ई. का उपयोग पर्याप्त मात्रा में व्यक्त और सफ़ाई की कठिनाई द्वारा बाधा कर दिया गया है कोली (अप्रकाशित टिप्पणियों और Harburger एट अल. 14). Kindlin -3 और इसके फू में काफी चिकित्सा रुचि हैnction, अन्य दो परिवार के सदस्यों के साथ, और हाल ही में हम baculovirus संक्रमण 12 से प्रेरित स्पोडोप्टेरा frugiperda कोशिकाओं में पुनः संयोजक अभिव्यक्ति द्वारा यह की मिलीग्राम मात्रा में उत्पन्न. इसलिए हम यहां व्यापक संरचनात्मक अध्ययन और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त कीट सेल संस्कृति में पुनः संयोजक माउस kindlin -3 की मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए विधियों का वर्णन.

इस प्रोटोकॉल में हम एक इंजीनियर पीटकर bacmid (: 1629 BAC10 को) का उपयोग करना कि, अकेले, व्यवहार्य virions 28 उत्पादन करने में असमर्थ है. वायरल डीएनए इस तरह इस मामले में भी kindlin-3 जीन (FERMT3) और एक पुनः संयोजक में जिसके परिणामस्वरूप वायरस बेहद व्यक्त लेकिन बेमानी है जो बहुत देर जीन, जगह FERMT3 जीन में परिणाम भी शामिल है कि एक हस्तांतरण वेक्टर साथ पुनर्संयोजन द्वारा बचाया वायरस जीवन चक्र 28 के भाग के रूप में माउस kindlin -3 व्यक्त करता है कि वायरस. हम इस पहचानkindlin -3 के उत्पादन के लिए विधि अन्य अभिव्यक्ति सेनाओं में यह व्यक्त करते हैं और शुद्ध करने के प्रयास के कारण हमने क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया और कहा कि कई अभिव्यक्ति में तैनात कर सकते हैं जो POPIN वेक्टर सूट, की बहुमुखी प्रतिभा के लिए (अप्रकाशित टिप्पणियों) बेहद मुश्किल साबित हुआ लेकिन यह भी बाद 29 होस्ट करता है.

Protocol

आईएम जोन्स द्वारा विकसित 1629 और: इस प्रोटोकॉल माउस kindlin-3 जीन (FERMT3) सफलतापूर्वक बहुत देर P10 प्रमोटर के बहाव और वेक्टर bacmid BAC10 KO साथ पुनर्संयोजन की अनुमति के लिए baculovirus दृश्यों flanking पास है कि एक वेक्टर में क्लोन किया गया है कि मानता है सहयोगियों 28. इस प्रोटोकॉल के लिए, kindlin-3 जीन pOPINE 29 में क्लोन किया गया था और इस्तेमाल किया प्राइमरों और क्लोनिंग रणनीति कहीं 12 वर्णित पाया जा सकता है. FERMT3 जीन (kindlin -3) P10 baculoviral प्रमोटर के नियंत्रण में है और वेक्टर 5 'UTR/ORF603 और ओआरएफ 1629 में शामिल है और नीचे की ओर शुद्धि 29 के लिए एक सी टर्मिनल उनके 6 टैग encodes इतना है कि प्लाज्मिड इंजीनियर है.

1. कीट सेल संस्कृति और रखरखाव

  1. पिछले पुनः संयोजक baculovirus प्रवर्धन के लिए, स्पोडोप्टेरा frugiperda कोशिकाओं निलंबन संस्कृति (Sf9 कोशिकाओं) को चाहिए अनुकूलितहो गई है और बनाए रखा जाना. कीट कोशिकाओं हमेशा एक समर्पित टिशू कल्चर धूआं हुड में सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर नियंत्रित किया जाना चाहिए.
  2. कीट कोशिकाओं के निलंबन संस्कृतियों एस एफ 900 द्वितीय (SFM) 100 rpm पर झटकों के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर बोतल में 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन और साथ पूरक सीरम मुक्त तरल माध्यम में incubated हैं.
  3. कीट सेल संस्कृति घनत्व सीमा बनाये रखने 6 से 10 एक्स 1 के बीच - बंटवारे और ताजा एस एफ 900 द्वितीय मीडिया के साथ सेल संस्कृति गिराए कोशिकाओं / एमएल 7 10 एक्स 1.
    नोट: स्वस्थ कोशिकाओं के आकार में एक समान देखना चाहिए और आकार में गोलाकार होना चाहिए.
  4. संस्कृति सेल घनत्व की गणना के लिए एक hemocytometer और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक नमूना मात्रा में कोशिकाओं की गणना.

2. संयोजक baculovirus की पीढ़ी

  1. संस्कृति और 100 माइक्रोग्राम / एमएल penicilli के साथ पूरक एस एफ 900 द्वितीय मीडिया का उपयोग निलंबन में Sf9 कोशिकाओं को बनाए रखनेएन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन. 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल - baculovirus पीढ़ी के लिए, कीट कोशिकाओं 5 एक्स 5 10 की एक घनत्व रेंज को सभ्य होना चाहिए.
  2. बीज लगभग 1 एक्स 10 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन और साथ पूरक एस एफ 900 द्वितीय मीडिया के 2 मिलीलीटर में एक बाँझ 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की अच्छी तरह से प्रति 6 Sf9 कोशिकाओं. प्लास्टिक कुओं के आधार का पालन करने धूआं हुड में आरटी पर Sf9 कोशिकाओं को छोड़ दें और इस प्रकार एक monolayer के रूप में.
  3. Monolayer संस्कृति पर bacmid डीएनए और प्लास्मिड डीएनए cotransfecting द्वारा पुनः संयोजक baculovirus पीढ़ी प्रदर्शन करना.
    1. एंटीबायोटिक दवाओं (समाधान क) के बिना एस एफ 900 द्वितीय SFM के 100 μl में 1629: प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, शुद्ध BAC10 KO की 0.5 ग्राम के साथ ORF1629 baculovirus तत्वों के पास, जो शुद्ध pOPINE-mFERMT3, 1-2 ग्राम मिश्रण.
    2. एक अलग ट्यूब में, विरोधी बिना एस एफ 900 द्वितीय SFM के 100 μl के साथ Cellfectin द्वितीय अभिकर्मक के 6 μl पतलाप्रत्येक अभिकर्मक प्रतिक्रिया (समाधान बी) के लिए बायोटिक्स. कई transfections के लिए आवश्यक हैं अगर एक 'मास्टर मिश्रण', कम तरल से निपटने के लिए, यहाँ बनाया जा सकता है.
    3. दो समाधान (ए और बी, लगभग 200 μl) मिलाएं और एक लिपिड डीएनए जटिल प्रपत्र 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
    4. एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 800 μl एस एफ 900 द्वितीय SFM साथ लिपिड डीएनए परिसरों पतला. ध्यान से Sf9 सेल monolayer मीडिया aspirate और ध्यान से Sf9 monolayer के शीर्ष पर समाधान ए / बी और मीडिया विंदुक.
    5. 27 ° सीओ / एन एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं और अगले दिन प्रत्येक monolayer संस्कृति के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एस एफ 900 द्वितीय SFM का एक और 1 मिलीलीटर जोड़ें. एक और 5 दिनों के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं.
  4. संस्कृति के माध्यम से (कुल लगभग 2 मिलीलीटर) से सीधे पुनः संयोजक baculovirus फसल और एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब (उदाहरण के लिए एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब) के लिए स्थानांतरण.
    1. किसी भी Sf9 सेल debr स्पष्ट करेंआरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर centrifugation द्वारा है. उपयोग करें जब तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक स्वच्छ ट्यूब और दुकान के परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला में है और P1 चिह्नित वायरस है, जो, स्थानांतरण. इस चरण में शेष Sf9 monolayer कीट कोशिकाओं में पुनः संयोजक kindlin -3 की उपस्थिति का आकलन करने से पुनः संयोजक वायरस पीढ़ी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. 0.5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ monolayer Resuspend और 2x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर की बराबर मात्रा के साथ एक 10 μl नमूना पतला. कम से कम 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस> में गर्मी नमूने.
    1. यह उचित जेल लदान के लिए भी चिपचिपा है अगर एक माइक्रो sonicator टिप का उपयोग कर 10% आयाम पर 1 सेकंड के लिए नमूना Sonicate.

3. संयोजक baculovirus के प्रवर्धन

  1. निलंबन में वायरस के प्रवर्धन के लिए, 1.4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल घनत्व का उपयोग करें और यह (यानी 50 मिलीलीटर संस्कृति में कुल फ्लास्क मात्रा का 1/20 पर कब्जा करना चाहिएएक एल 2 फ्लास्क).
  2. निम्न सूत्र का उपयोग 0.1 के संक्रमण की बहुलता (MOI) पर P1 वायरल स्टॉक के साथ कीट सेल संस्कृति को संक्रमित करते हुए पुनः संयोजक वायरस के प्रवर्धन पाना;

    नोट: पी 1 वायरस पीढ़ी 1 10 x 7 pfu / मिलीलीटर की एक उम्मीद वायरल अनुमापांक है माना जा सकता है. हालांकि, एक पट्टिका परख पहले इस चरण के लिए किया जा सकता है.
  3. 3 दिन (72 घंटे) के लिए 100 rpm पर झटकों के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर P1 संक्रमित कीट संस्कृति सेते हैं.
  4. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर centrifugation द्वारा मीडिया से कोशिकाओं को अलग करके वायरस हार्वेस्ट. एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता द्वारा kindlin 3 प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करने से पुनः संयोजक वायरस उत्पादन की पुष्टि के लिए इस चरण में जिसके परिणामस्वरूप सेल गोली बचाओ.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस में एक स्वच्छ ट्यूब और स्टोर करने के लिए स्पष्ट वायरस समृद्ध मीडिया स्थानांतरणउपयोग करें जब तक अंधेरा. इस वायरल शेयर p2 के रूप में चिह्नित है.
    नोट: 2 एक्स 10 8 pfu / एमएल (या 100 pfu / सेल का एक प्रवर्धन दर) की एक वायरल अनुमापांक पूर्वानुमानित किया जा सकता है.

4. Baculovirus संक्रमित Sf9 में kindlin -3 की अभिव्यक्ति

  1. पूर्व शुद्धि के लिए बड़े पैमाने पर पुनः संयोजक kindlin -3 अभिव्यक्ति के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, साथ पूरक एस एफ 900 द्वितीय SFM में निलंबन में Sf9 कोशिकाओं संस्कृतियों की पर्याप्त मात्रा में वृद्धि करें. 100 rpm पर झटकों के साथ और कुल संस्कृति की मात्रा के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन संस्कृतियों सेते: 01:05 के अनुपात मात्रा फ्लास्क.
  2. 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर Sf9 के निलंबन संस्कृतियों को संक्रमित.
  3. 1% की एक अंतिम एकाग्रता के साथ Sf9 संस्कृतियों पूरक (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 1 के एक MOI देने को परिलक्षित पुनः संयोजक वायरस (P2 वायरल शेयर) के साथ पीछा किया. 100 rpm पर झटकों के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित संस्कृतियों सेते हैं.
  4. हार्वेस्ट recombinaNT kindlin-3-CHIS 1,000 XG पर centrifugation द्वारा Sf9 कोशिकाओं 72 घंटा बाद संक्रमण 6 व्यक्त   और जिसके परिणामस्वरूप सेल गोली उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस.

5. संयोजक Kindlin -3 का शोधन

  1. बर्फ पर पुनः संयोजक kindlin -3 व्यक्त पिघलना जमे baculovirus संक्रमित कीट सेल (Sf9) छर्रों.
  2. Lysis बफर के साथ thawed सेल गोली Resuspend (50 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच, 500 मिमी NaCl, 1% (v / v) बीच 20), EDTA मुक्त protease अवरोध कॉकटेल और DNase1 के 1,000-2,000 यू के साथ पूरक.
    नोट: NaCl एकाग्रता अंतर्जात Sf9 सेल प्रोटीन और नीचे की ओर शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया immobilized धातु आत्मीयता कॉलम (नीचे देखें) के बीच अविशिष्ट बातचीत को रोकने के लिए 500 मिमी के लिए निकाला जाता है जहां वैकल्पिक रूप से, संशोधित फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. डिटर्जेंट और vo साथ resuspended कोशिकाओं incubating द्वारा lyse कोशिकाओंrtexing. Sonicate एक बर्फ स्नान में आगे सेल विघटन के लिए नमूना (40% आयाम, 10 सेकंड पल्स के 10 चक्र 10 सेकंड ठंडा करने के बाद) या वैकल्पिक रूप से एक Dounce homogenizer का उपयोग करें.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 48,000 XG पर centrifugation द्वारा lysate स्पष्ट करें 1 मिलीग्राम / मिनट की दर से 4 डिग्री सेल्सियस पर एक HisTrap स्तंभ (5 एमएल स्तंभ मात्रा), lysis बफर के साथ पूर्व equilibrated, पर जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला लोड करें.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, स्पष्ट lysate पूर्व equilibrated निकल sepharose मोतियों की एक 1-5 मिलीलीटर बिस्तर मात्रा 1-2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (जैसे नी Sepharose 6 तेज प्रवाह) के साथ incubated किया जा सकता है. नी sepharose का एक स्तंभ एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह कॉलम का उपयोग करके बाध्यकारी कदम के बाद का गठन किया जा सकता है.
  5. धोने बफर के 10 कॉलम संस्करणों के साथ स्तंभ धो (50 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच, 500 मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole) अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए.
  6. Elute करने के लिए एक Äkta FPLC का उपयोग 10 मिमी / एमएल (या 10 कॉलम खंडों में) की दर से 10-500 मिमी से एक रेखीय imidazole ढाल का प्रयोग करेंबाध्य पुनः संयोजक kindlin-3-CHIS 6.
  7. आमतौर पर 300 मिमी की एक imidazole एकाग्रता में eluting kindlin-3-CHIS 6 युक्त उन भागों के साथ, Äkta FPLC का उपयोग 0.5-1 एमएल भागों में क्षालन fractionate.
  8. एसडीएस पृष्ठ से eluant की प्रोटीन संरचना का आकलन और पहली बार purifications के लिए एक विरोधी अपने 6 एंटीबॉडी या विरोधी माउस kindlin -3 एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता द्वारा पुष्टि.
  9. 20 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच, 200 मिमी NaCl एक 50 केडीए आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) के साथ एक केन्द्रापसारक प्रोटीन concentrator का उपयोग बफर और नमूना सांद्रता में dilutions की एक श्रृंखला के माध्यम से में kindlin -3 और बफर विनिमय युक्त भिन्न पूल 4 डिग्री सेल्सियस पर
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 20 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच, 200 मिमी NaCl में ओ / एन के लिए 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 केडीए के एक MWCO साथ स्लाइड-A-Lyzer डायलिसिस कैसेट का उपयोग प्रोटीन समाधान dialyze.
    नोट: के लिए आयन एक्सचेंज (नीचे देखें) NaCl के एक कम एकाग्रता,
  10. 0.5 मिलीग्राम / मिनट की दर से एक Äkta FPLC का उपयोग कर एक पूर्व equilibrated HiTrap हेपरिन हिमाचल प्रदेश स्तंभ (5 एमएल स्तंभ मात्रा) पर बफर विमर्श प्रोटीन समाधान लागू करें.
    नोट: बाध्य kindlin -3 10 मिमी / एमएल की दर से बढ़ रही है, उसी बफर में एक रेखीय NaCl ढाल (1 एम NaCl के लिए 0.2 एम NaCl) का उपयोग eluted है. Kindlin-3-CHIS6 ~ 0.6 एम NaCl में elute की उम्मीद है.
  11. 0.5-1 एमएल भागों में क्षालन fractionate और उपयुक्त हैं, एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन संरचना का आकलन करें.
    नोट: एसडीएस पृष्ठ द्वारा मूल्यांकन के रूप में एक, करीब 95% की एक प्रोटीन पवित्रता उम्मीद कर सकते हैं.
  12. 0.5-2 एमएल के एक अंतिम मात्रा करने के लिए एक 50 केडीए MWCO के साथ एक अपकेंद्रित्र प्रोटीन concentrator का उपयोग kindlin -3 और ध्यान केंद्रित युक्त पूल भिन्न.
  13. एक अंतिम चरण में, केंद्रित प्रोटीन पॉलिश और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग प्रोटीन का आदान बफर.
    1. एक र पर शुद्ध प्रोटीन लागू करेंperdex S200 (16/60) या (10/30) स्तंभ आकार के आधार पर 1 मिलीग्राम / मिनट या 0.5 मिलीग्राम / मिनट की दर पर 20 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच, 200 मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी में पूर्व equilibrated इस्तेमाल किया.
      नोट: यदि आवश्यक आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी भी फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में किया जा सकता है.
    2. इस्तेमाल किया स्तंभ आकार पर निर्भर करता है / मिनट 1 मिलीलीटर या 0.5 मिलीग्राम / मिनट की दर से स्तंभ पर बफर लगाने से आकार के अनुसार प्रोटीन शुद्ध.
      नोट: स्तंभ से eluting प्रोटीन fractionated है और 280 एनएम पर absorbance उपयोग पर नजर रखी.
    3. एक एकल absorbance शिखर fractionated और एकरूपता निर्धारित करने के लिए एसडीएस पृष्ठ द्वारा मूल्यांकन किया है, और इस कदम के बाद आम तौर पर> 95% शुद्ध है जो एसईसी, से उम्मीद की जानी चाहिए.
  14. ध्यान लगाओ एक 50 केडीए MWCO के लिए ~ 15 मिलीग्राम / एमएल, 109320 एम की एक गणना की विलुप्त होने गुणांक (ε) का उपयोग spectrophotometrically मूल्यांकन के रूप में -1 -1 सेमी <साथ एक अपकेंद्रित्र प्रोटीन concentrator का उपयोग kindlin-3-CHIS 6 शुद्ध किया/ Sup> (सभी सिस्टीन अवशेषों कम कर रहे हैं संभालने).
  15. -80 डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस और लंबी अवधि के भंडारण में भंडारण के लिए, विभाज्य पीसीआर ट्यूब और फ्लैश फ्रीज तरल नाइट्रोजन में नमूने में प्रोटीन. वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन जैव रासायनिक और biophysical तकनीकों का एक नंबर का उपयोग कर जांच के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है.

Representative Results

baculovirus संक्रमित Sf9 कोशिकाओं का उपयोग कर पुनः संयोजक माउस kindlin -3 की बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति योजनाबद्ध चित्रा 1 ए में सचित्र के रूप में, मिलीग्राम मात्रा में प्राप्त करने के लिए कम से कम दो सप्ताह लेने के लिए और एक QIAprep Miniprep किट से प्लास्मिड डीएनए का केवल एक छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है, के लिए कर सकते हैं उदाहरण. चित्रा में दिखाया गया है, और 5-7 दिनों के बाद नवगठित virions कटाई: पुनः संयोजक baculovirus की पीढ़ी माउस kindlin -3 (FERMT3) के एक इंजीनियर linearized bacmid (को 1629 BAC10) के साथ प्लाज्मिड युक्त साथ Sf9 कोशिकाओं cotransfecting द्वारा हासिल की है 1 ए. मूलतः यह 100% पुनः संयोजक वायरस में baculovirus पीढ़ी के परिणाम की विधि और पट्टिका शुद्धि 28,30 के लिए की जरूरत dispenses. एक प्रतिनिधि छोटे पैमाने पर (2 मिलीलीटर monolayer) संस्कृति मिलीलीटर की प्रति 1 10 x 7 पट्टिका गठन इकाइयों की एक उम्मीद वायरल अनुमापांक (pfu) के साथ एक पुनः संयोजक वायरस युक्त समाधान उत्पन्न करेगासंस्कृति. एक वास्तविक वायरल अनुमापांक निर्धारित करने के लिए एक पट्टिका परख प्रदर्शन कर सकते हैं लेकिन निर्माणों की एक उच्च संख्या संरचनात्मक अध्ययन के लिए परीक्षण कर रहे हैं जब यह शायद बहुत श्रम प्रधान है. वायरस पीढ़ी कदम की सफलता आम तौर पर दर्शाता है, जो इस kindlin -3 का निर्माण के लिए, Sf9 monolayer पीबीएस में resuspended किया जा सकता है और एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता द्वारा मूल्यांकन, समानांतर में एक EGFP युक्त प्लाज्मिड का उपयोग करके मूल्यांकन, या किया जा सकता है चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, एक 75 केडीए उनकी टैग प्रोटीन को इसी एक स्पष्ट बैंड. वायरस बाद में बड़े पैमाने पर (लीटर मात्रा) कीट सेल संक्रमण और पुनः संयोजक प्रोटीन अलगाव के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न करने के लिए परिलक्षित होता है. दूसरे बीतने के वायरस (P2) 0.1 के अनुमानित MOI (प्रोटोकॉल देखें) के साथ निलंबन संस्कृतियों से संक्रमण से उत्पन्न होता है. यह प्रवर्धन Sf9 निलंबन संस्कृति कुल फ्लास्क मात्रा का केवल 1/20 में रह रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. इस अतिरिक्त वेंटिलेशन सुनिश्चित करता है कि जिसके परिणामस्वरूप वीर3 दिन (72 घंटे) के बाद संक्रमण के बाद काटा हमें युक्त मीडिया, बाद में अभिव्यक्ति संस्कृति में kindlin -3 की पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न होगा. प्रवर्धित वायरस शेयर (P2) 2 x 10 6 कोशिकाओं का एक सेल घनत्व का उपयोग / एमएल प्रवर्धन 31 के दौरान 100 pfu / सेल का एक रूढ़िवादी अनुमान के आधार पर 2 एक्स 10 8 pfu / मिलीलीटर की एक उम्मीद वायरल अनुमापांक के अधिकारी मान लिया जाता है. चित्रा 1C में दिखाया गया है आम तौर पर, इष्टतम baculovirus प्रवर्धन और प्रोटीन के उत्पादन के लिए, Sf9 कोशिकाओं, आकार और गोलाकार में एक समान होना चाहिए. इसके अतिरिक्त, वायरल प्रवर्धन और प्रोटीन अभिव्यक्ति 72 घंटे के बाद संक्रमण पर अधिक से अधिक है, और दोनों में काफी 96 घंटा बाद संक्रमण पर कम कर रहे हैं.

वायरस प्रवर्धित और बड़े पैमाने पर प्रयोग में Sf9 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है एक बार पुनः संयोजक kindlin -3 आंशिक रूप से अपने इंजीनियर सी टर्मिनल उनके 6 टैग का उपयोग immobilized धातु आत्मीयता Chro की हैसियत से शुद्ध होता हैmatography, चित्रा 2 में दिखाया गया है. यह 4 डिग्री सेल्सियस शुद्धि बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण है और कहा कि पर्याप्त protease inhibitors proteolysis रोकने के लिए जोड़ा गया है. 3 चित्र में दिखाया के रूप में आंशिक रूप से शुद्ध kindlin -3, एक हेपरिन स्तंभ का उपयोग कर आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईईसी) के पास से एकरूपता के लिए आगे शुद्ध होता है. हम बजाय एक पारंपरिक आयनिक विनिमय स्तंभ की एक हेपरिन स्तंभ का उपयोग कार्यरत हैं, हम kindlin -3 एफ 1 डोमेन के भीतर एक पाली lysine खिंचाव सहित बुनियादी अवशेषों की बड़ी संख्या है, नकारात्मक आरोप लगाया सल्फेट समूहों के साथ दृढ़ता से बातचीत भविष्यवाणी की है कि के रूप में स्तंभ की. इस रणनीति Cid1 32 uridylyltransferase उदाहरण के लिए शाही सेना बाध्यकारी टर्मिनल, बुनियादी न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी पैच के साथ डीएनए और आरएनए बंधनकारी प्रोटीन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. अंत में kindlin -3 पवित्रता में दिखाया गया है, समुच्चय को हटाने और एकरूपता को प्राप्त करने के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा "पॉलिश" हैचित्रा 4. प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट बफ़र्स अक्सर संरचनात्मक विश्लेषण के लिए प्रोटीन शुद्धीकरण में प्रयोग किया जाता मानक बफ़र्स हैं. आम तौर पर, फॉस्फेट आधारित बफ़र्स, संरचनात्मक अध्ययन के लिए प्रोटीन की शुद्धि के लिए कारण (विशेष रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगों के लिए) क्रिस्टलीकरण बूंदों में फॉस्फेट क्रिस्टल के गठन के लिए विशेष रूप से क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग परहेज कर रहे हैं. चित्रा 5 में दिखाया गया है लेकिन, जैसा कि हम, बफ़र्स kindlin-3 के लिए स्थिर रहे थे, जो निर्धारित करने के लिए एक Thermofluor आधारित थर्मल पारी परख प्रदर्शन किया. संक्षेप में, एक शुद्ध प्रोटीन समाधान इसलिए एक 2 आयामी स्क्रीन बनाने, पीएच और सोडियम क्लोराइड सांद्रता की एक रेंज को कवर बफ़र्स में पतला है. प्रोटीन के पिघलने के तापमान रेंज 20-95 डिग्री सेल्सियस (293-368 कश्मीर) से जोड़ प्रोटीन कोर के भीतर हाइड्रोफोबिक अवशेषों को बांधता है कि Sypro नारंगी डाई (आण्विक जांच), से प्रतिदीप्ति देख द्वारा मापा जाता है. तापमान के मध्य बिंदु वें जिस परई प्रोटीन (संक्रमण तापमान, टी एम) OPTICON मॉनिटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना की गई और कहीं 33 में वर्णित है करेंगी. Kindlin -3 एक लगातार संक्रमण तापमान (टी एम) के साथ, पीएच रेंज 7.0-9.0 भीतर उच्च सोडियम क्लोराइड सांद्रता (500 मिमी) में स्थिर होने के लिए मनाया गया 55 डिग्री सेल्सियस के यह भी Kindlin -3 की टी एम 7.0-7.5 परवाह किए बगैर सोडियम क्लोराइड एकाग्रता की पीएच सीमा के भीतर लगभग 55 डिग्री सेल्सियस था कि मनाया गया.

हम वहाँ kindlin -3 के सीमित proteolysis शुद्धि के दौरान किया गया लेकिन अत्यधिक ध्यान केंद्रित प्रोटीन (~ 15 मिलीग्राम / एमएल) की एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण बराबर तीव्रता के दो अतिरिक्त polypeptides साथ सीमित संदूषण का प्रदर्शन मिला. चित्रा 4 में दिखाया गया है विचित्र रूप से, लेकिन आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा अतिरिक्त प्रजातियों का कोई संकेत नहीं है, वहाँ है. यह इस प्रकार प्रोटीन proteases से nicked है कि सोचा है लेकिन मुड़ा और hydrodyn रहता हैपूर्ण लंबाई प्रोटीन से amically अप्रभेद्य. दिलचस्प है, Calpain एक ज्ञात प्रोटीज है कि pleckstrin अनुरूपता (पीएच) डोमेन 34 की β1-β2 पाश में है और हमारी टिप्पणियों समझा जा सकता है जो Tyrosine373, पर kindlin -3 cleaves. जब माथुर इसके अलावा, पश्चिमी सोख्ता पॉलीपेप्टाइड दोहरी में से एक एक सी टर्मिनल उनकी टैग और नक़ल की स्पष्ट आणविक वजन के पास पता चलता है कि, 75 केडीए, देशी प्रोटीन के रूप में एक ही आणविक वजन के बराबर होती है. शुद्ध रीकॉम्बीनैंट kindlin-3 लीटर प्रति Sf9 कोशिकाओं की (~ 2 जी सेल वजन) की उपज, पर सबसे अच्छा, 5 मिलीग्राम है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Baculovirus generatio की baculovirus संक्रमित कीट सेल heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति का अवलोकन. (ए) एक schematized अवलोकनSf9 कोशिकाओं में एन और kindlin -3 की अभिव्यक्ति. डीएनए वेक्टर schematics में, 5'UTR / ORF603, लाल रंग में रंग जाता है ORF1629 हरे रंग में रंग का है और, ब्याज (POI) के प्रोटीन की जीन नीले रंग का है. (बी) पुनः संयोजक baculovirus और पुनः संयोजक murine kindlin -3 उत्पादन Sf9 कोशिकाओं के छह छोटे पैमाने पर (2 मिलीलीटर monolayer) संस्कृतियों (गलियों संस्कृति के अनुसार लेबल) के एक विरोधी अपने 6 एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा,,. (सी) एस एफ 900 द्वितीय SFM में निलंबन में हो स्वस्थ Sf9 कोशिकाओं की लाइट माइक्रोस्कोपी छवि एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक और एक 35 मिमी अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान (प्रोटोकॉल देखें) को स्थानांतरित कर दिया. छवि 20X बढ़ाई है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Represeनिकल आत्मीयता की immobilized धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) द्वारा kindlin -3 की ntative शुद्धि. एसडीएस पृष्ठ शुद्ध रीकॉम्बीनैंट kindlin -3 Sf9 कोशिकाओं (~ 2 जी सेल वजन) संक्रमित baculovirus में व्यक्त murine. Adsorbed प्रोटीन (जेल ऊपर दिखाया गया है) एक imidazole ढाल का उपयोग eluted था. के रूप में निम्नानुसार लेन चिह्नित कर रहे हैं; मेगावाट, आणविक वजन मार्कर, लिस, पूरे सेल lysate, एफटी, (अपार) के माध्यम से प्रवाह, WI, 1 धोने, Wii, 2 धो लो. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (नीचे) भी पुनः संयोजक प्रोटीन पर इंजीनियर उनकी टैग की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए क्षालन भिन्न उपयोग किया गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधिkindlin -3 हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा की सरीखे शुद्धि. (ए) क्षालन प्रोफ़ाइल 0.05-1.0 एम. के NaCl एकाग्रता रेंज का उपयोग कर एक रेखीय सोडियम क्लोराइड ढाल (हरा) के तहत eluting एक एकल सममित शिखर प्रदर्शित 280 एनएम (नीला) (कम से मनाया 75 केडीए प्रोटीन की उपस्थिति का प्रदर्शन fractionated क्षालन बी) एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण, kindlin -3 (लेबल K3). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
का उपयोग चित्रा 4. प्रतिनिधि जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी और शुद्ध kindlin -3 के केंद्रित kindlin-3. (ए) जेल निस्पंदन क्षालन प्रोफ़ाइल20 डिग्री सेल्सियस पर Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच, 150 मिमी NaCl और 1 मिमी डीटीटी में एक Superdex S200 (16/60) क्षालन मात्रा के आधार पर, kindlin -3 migrates यह मुख्य रूप से मोनोमेरिक है, सुझाव है कि एक 75 केडीए प्रोटीन के लिए उम्मीद के रूप में. (बी) के एसडीएस पृष्ठ अत्यधिक ध्यान केंद्रित शुद्ध रीकॉम्बीनैंट kindlin -3 14.5 मिलीग्राम / एमएल. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
बफर स्क्रीनिंग. Kindlin-3 के लिए 5 चित्रा. Thermofluor आधारित ताप शिफ्ट परख सोडियम क्लोराइड एकाग्रता बनाम पीएच की एक दो आयामी स्क्रीन शामिल विभिन्न बफ़र्स में पतला था. संक्रमण तापमान (तापमान के मध्य अंक) के प्रतिदीप्ति द्वारा मनाया गयाhydrophobically बाध्य डाई, Sypro नारंगी (आण्विक जांच) और OPTICON मॉनिटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना की. (ए) के संक्रमण तापमान के एक 3 डी हिस्टोग्राम (बी) के 50.4 डिग्री सेल्सियस की गणना की औसत से संक्रमण के तापमान में परिवर्तन के साथ मिलकर साजिश रची है स्पष्टता के लिए सलाखों के वे अनुरूप करने के लिए जो तापमान की सीमा के अनुसार रंग के होते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

Baculovirus अभिव्यक्ति सिस्टम तेजी से लोकप्रिय और एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी सहित biophysical पढ़ाई, का उपयोग प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होते जा रहे हैं. अधिक प्रयोगात्मक की मांग होने के बावजूद baculovirus अभिव्यक्ति प्रणालियों ई. पर कई फायदे की पेशकश कोली जिनमें से एक उपयुक्त संरक्षक और बाद translational संशोधन के लिए अवसर की उपस्थिति जैसे यूकेरियोटिक मूल के प्रोटीन के लिए एक के पास देशी माहौल है. Kindlin -3 व्यक्त करने के अपने प्रयासों में, वैकल्पिक अभिव्यक्ति मेजबान स्तनधारी सेल लाइनों और बैक्टीरियल अभिव्यक्ति उपभेदों (अप्रकाशित टिप्पणियों) सहित इस्तेमाल किया गया. आम तौर पर, कई ई. कोली परीक्षण किया उपभेदों पुनः संयोजक kindlin -3 की बहुत कम मात्रा (; अप्रकाशित टिप्पणियों ~ 0.5 मिलीग्राम / संस्कृति के एल) का उत्पादन किया. हालांकि, कीट कोशिकाओं में baculovirus संचालित अभिव्यक्ति सह में, विशेष रूप से प्रभावी था औरपुनः संयोजक cytoplasmic प्रोटीन (अप्रकाशित टिप्पणियों) के एक मिलीग्राम के लिए अलग आवश्यक बड़े बायोमास पैदा करने के लिए उत्तरदायी स्तनधारी कोशिकाओं में क्षणिक अभिव्यक्ति को mparison. हम उपस्थिति यूकेरियोटिक संरक्षिकाओं kindlin -3 के कुशल उत्पादन की अनुमति दे सकता है अटकलें हैं कि.

baculoviridae कीट कोशिकाओं को संक्रमित और पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस काम में इस्तेमाल baculovirus परमाणु polyhedrosis वायरस (AcNPV) californica Autographa पर आधारित है. प्रकृति में Autographa californica (अल्फला LOPPER) कीट लार्वा को संक्रमित करता है जो AcNPV, virons इस प्रकार उनकी रिहाई के लिए आवश्यक सुरक्षा प्रदान करने के लिए एक क्रिस्टलीय प्रोटीन मैट्रिक्स में समाहित हैं जिससे occlusions के लिए फार्म polyhedrin प्रोटीन की आवश्यकता होती है. सभ्य कोशिकाओं में रोड़ा निकायों के गठन प्रतिकृति के लिए आवश्यक है और इसलिए नगण्य है नहीं है. विदेशी प्रोटीन व्यक्त करने के मामले में polyhedrin प्रोटीन जीन R किया जा सकता हैब्याज की प्रोटीन के लिए जीन के साथ एक पुनः संयोजक AcNPV में eplaced. AcNPV अन्य Lepidopteron प्रजातियों को संक्रमित कर सकते हैं और पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति सेना कीड़ा स्पोडोप्टेरा frugiperda के प्रयोजनों के लिए पोटा संबंधी अंडाशय कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं. यह है, कि इस तरह की: एक आवश्यक वायरल जीन, ORF1629, (को 1629 BAC10) एक दस्तक बाहर bacmid में जिसके परिणामस्वरूप chloramphenicol एसिटाइल ट्रांस्फ़्रेज़ की प्रविष्टि से निष्क्रिय है इतना है कि यहाँ उल्लिखित दृष्टिकोण में, AcNPV bacmid (BAC10) इंजीनियर है संक्रामक baculovirions 28 फार्म करने में असमर्थ. KO 1629 और FERMT3 युक्त स्थानांतरण वेक्टर मरम्मत भी polyhedrin प्रमोटर 28 के नियंत्रण में FERMT3 जीन शामिल किया गया है कि एक व्यवहार्य जीनोम में जिसके परिणामस्वरूप स्थानांतरण के माध्यम से निष्क्रिय ORF1629,,: linearized BAC10 साथ Sf9 कोशिकाओं की Cotransfection.

हम एक thre के माध्यम से kindlin -3 अत्यधिक शुद्ध पुनः संयोजक माउस के अलगाव के लिए एक शुद्धि प्रोटोकॉल का वर्णनई कदम chromatographic दृष्टिकोण. यहां इस्तेमाल किया तरीकों को आसानी से अन्य उनकी टैग प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है. हम आगे kindlin -3 शुद्ध करने के लिए एक आयन एक्सचेंज कदम कार्यरत लेकिन हम kindlin -3 अपनी एफ 1 डोमेन के भीतर एक पाली lysine खिंचाव सहित बुनियादी अवशेषों की एक बड़ी संख्या है, पास के रूप में यह एक आगे छद्म आत्मीयता कदम है कि विश्वास करते हैं. इसके अतिरिक्त, kindlin-3 के लिए बाध्य है और यह काम करता है, जहां प्लाज्मा झिल्ली, के cytoplasmic चेहरे के साथ बातचीत करने के लिए माना जाता है, और इसलिए हम बुनियादी अवशेषों की क्लस्टरिंग प्रोटीन नकारात्मक आरोप लगाया झिल्ली का मुकाबला करने की अनुमति देगा का अनुमान है.

शुद्धि प्रोटोकॉल में वर्णित बफ़र्स मानक माना जाता है और अक्सर संरचनात्मक जीव विज्ञान में किया जाता है. thermofluor परख (चित्रा 5) kindlin -3 पीएच 6.0 से ऊपर सबसे बफर की स्थिति में स्थिर है कि यह दर्शाता है. Β1: kinldin -3 का अध्ययन करते हैं तो यह हमारे प्रयोगों सूचित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी और महत्वपूर्ण थाNaCl 12 की कम मात्रा के साथ पीएच 6.1 पर उत्कृष्ट स्पेक्ट्रा सामने आए जो एनएमआर, द्वारा एक पूंछ बातचीत.

किसी भी biophysical अध्ययन किए जाने से पहले, यह ब्याज की शुद्ध प्रोटीन वास्तव में सही ढंग से मुड़ा और कार्यात्मक रूप से सक्रिय है दिखाना है कि महत्वपूर्ण है. पिछले एक प्रकाशन में हम पुनः संयोजक kindlin -3 व्यक्त की है और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, गतिशील प्रकाश बिखरने, विश्लेषणात्मक ultracentrifugation और छोटे कोण एक्स - रे बिखरने द्वारा मूल्यांकन के रूप में शुद्ध के लिए इस विधि का उपयोग कर, समाधान में एक monomer और monodispersed था कि प्रदर्शन किया, और था भी यह पिछले सेलुलर और शारीरिक पढ़ाई 14,20,22 के साथ कतार में है, जो देशी प्रोटीन, की तरह बर्ताव करता है कि इस बात की पुष्टि इस प्रकार, बंधन और झिल्ली बाहर का NPxY और β 1 ए cytoplasmic पूंछ 14 के अपस्ट्रीम सेरीन / Threonine क्लस्टर पहचानने में सक्षम. एक थर्मल स्थिरता परख का उपयोग वें सुझाव का एक अतिरिक्त तरीका हैब्याज की एक प्रोटीन की ई उचित तह, के रूप में गलत तरीके से मुड़ा हुआ प्रोटीन की वजह से उजागर हाइड्रोफोबिक अवशेषों को एक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि में परिणाम होगा.

प्रोटीन की kindlin परिवार विवो में integrins की आवश्यक coactivators के रूप में उनकी अप्रत्याशित भूमिका की खोज की थी के बाद से बहुत अधिक ध्यान का ध्यान केंद्रित किया गया है. इस recombinantly उन्हें व्यक्त करने और उनके ढांचे को हल करने के लिए ज्यादा प्रयास शुरू हो गया है. तिथि करने के लिए सीमित सफलता पूर्ण लंबाई पुनः संयोजक प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा को व्यक्त करने में सूचना दी गई है, लेकिन हम यहाँ संरचनात्मक अध्ययन संभव हो जहां के स्तर पर बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति है कि परमिट एक baculovirus प्रणाली के उपयोग का वर्णन किया है. पुनः संयोजक kindlin -3 की बड़ी मात्रा में पैदा करके हम इस इस प्रोटीन की आगे की पढ़ाई के लिए सहायता करेंगे. पुनः संयोजक murine kindlin-3 के लिए यहाँ वर्णित baculovirus संचालित विधि और शुद्धि कार्यप्रवाह भी अन्य kindlin isoforms एक्सप्रेस और शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो भी व्यक्त और भी पाली lysine हिस्सों के अधिकारी मुश्किल हो जाता है, और आगे इस तरह के जीवाणु उपभेदों में व्यक्त करने में विफल है कि न्यूक्लिक एसिड बंधनकारी प्रोटीन के रूप में अन्य cytoplasmic प्रोटीन, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम संस्कृति और Sf9 सेल के शेयरों के रखरखाव में तकनीकी सहायता के लिए Weixan लू धन्यवाद. लेटाओ एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) ग्रेजुएट छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया. RJCG एक रॉयल सोसाइटी यूनिवर्सिटी रिसर्च फैलो था. स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के ऑक्सफोर्ड डिवीजन ह्यूमन जेनेटिक्स, वेलकम ट्रस्ट कोर पुरस्कार अनुदान संख्या 090532/Z/09/Z लिए वेलकम ट्रस्ट सेंटर का हिस्सा है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf-900 II serum free media (SFM) 1x liquid Life Technologies 10902-096 store at 4 °C and warm to RT before use
Cellfectin II Reagent Invitrogen 10362-100 Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used
Streptomycin sulphate (solid) Melford S0148 Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
Penicillin G, potassium salt (solid) Melford P0580 Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate Greiner Bio-One 657160
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10100-147
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8849 Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I  Sigma D5025
HisTrap FF (5 ml) GE Heathcare 17-5286-01 Requires an Äkta FPLC machine
HiTrap Heparin (5 ml) GE Heathcare 17-0407-01 Requires an Äkta FPLC machine
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) Millipore UFC905024 15 ml capacity and a MWCO of 50 kDa protein concentrator

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विषाणु विज्ञान अंक 85 Heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति कीट कोशिकाओं, Baculovirus प्रोटीन शुद्धीकरण kindlin सेल आसंजन
के कुशल उत्पादन और शोधन संयोजक Murine Kindlin -3 की biophysical अध्ययन के लिए कीट कोशिकाओं से
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Yates, L. A., Gilbert, R. J. C.… More

Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J. Vis. Exp. (85), e51206, doi:10.3791/51206 (2014).

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