Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

المحفظة المصلي من Published: February 24, 2014 doi: 10.3791/51208
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology & Immunology, The University of Melbourne

Summary

رد فعل الانتباج هو المعيار الذهبي لتقنية التصنيف المصلي العقدية الرئوية. هذه التقنية يستخدم المجهر وأمصال مضادة للمكورات الرئوية محددة، ويستخدم عادة في المختبرات المرجعية والبحثية في جميع أنحاء العالم.

Abstract

هناك أكثر من 90 الأنماط المصلية المحفظة مختلفة من المكورات العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و). فضلا عن كونها أداة لفهم وبائيات المكورات الرئوية، ويمكن المصلي المحفظة توفير معلومات مفيدة لفعالية اللقاح وتأثير الدراسات. رد فعل الانتباج هو الأسلوب المعيار الذهبي لالمكورات الرئوية المحفظة المصلي. ينطوي على طريقة اختبار تعليق خلية المكورات الرئوية مع أمصال مضادة المجمعة ومحددة موجهة ضد السكاريد المحفظة. ويلاحظ ردود الفعل ضد مستضد مجهريا. بروتوكول لديه ثلاث خطوات رئيسية: 1) إعداد تعليق خلية البكتيرية، 2) خلط الخلايا وأمصال مضادة على شريحة زجاجية، و3) قراءة رد الفعل الانتباج باستخدام المجهر. رد فعل الانتباج بسيط معقول لأداء ويمكن تطبيقها في أي مكان هي المجهر مناسبة وأمصال مضادة المتاحة.

Introduction

العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) هي المسؤولة عن وفاة ما يقدر ب 800،000 طفل دون سن الخامسة سنويا، مع انخفاض عبء المرض في الغالب في البلدان الفقيرة في الموارد 1. الأمراض الرئوية وتتراوح في شدتها من التهابات موضعية مثل التهاب الأذن الوسطى الحاد إلى التهاب حاد تهدد الحياة مثل تعفن الدم، والتهاب السحايا والالتهاب الرئوي 2. وقد وصفت أكثر من 90 الأنماط المصلية المحفظة من المكورات الرئوية 3، 4. لقاحات المكورات الرئوية الحالية توفير الحماية ضد الأنماط المصلية التي هي المسؤولة عن معظم الأمراض الغازية 5، 6. ومع ذلك، فقد ارتبط انتشار استخدام اللقاحات مع استبدال الأنماط المصلية تضمينها في اللقاح عن طريق الأنماط المصلية nonvaccine، سواء في النقل البلعوم وأمراض الغازية 7، 8. هذا يسلط الضوء على أهمية المصلي لالوبائيةالمراقبة وأثر اللقاح على المدى الطويل يدرس 9.

طريقة المعيار الذهبي للكتابة المكورات الرئوية هو اختبار رد فعل المحفظة، والمعروفة باسم تفاعل الانتباج، وصف لأول مرة من قبل نويفلد في عام 1902 (انظر النمساوية 10). تم العثور على درجة عالية من التوافق بين المختبرات، وبين رد فعل الانتباج وأساليب أخرى المصلي 11-13. هناك العديد من الاختلافات في رد فعل الانتباج 10، 14-16. الطريقة الموضحة هنا لا تتطلب استخدام وصمة عار العداد أو عدسة الغمر النفط، بل قطرة من العينة مستعدة مختلطة مع مصل الكتابة ودرست على الفور تحت 400X التكبير.

عادة ما يتم إجراء رد فعل الانتباج باستخدام أمصال مضادة متاحة تجاريا. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم أقل أمصال مضادة مقارنة مع بعض الأساليب الأخرى 16، 17، مما يجعلها أكثر فعالية من حيث التكلفة. مرة واحدة في ISOLيأكلون يتم التعرف على والمكورة الرئوية، يتم اختباره بشكل تسلسلي مع حمامات أمصال مضادة حتى لوحظ من ردود الفعل الإيجابية. كل مصل يحتوي على بركة مخاليط مختلفة من أمصال مضادة التي أثيرت ضد المكورات الرئوية الأنماط المصلية 91 18. مرة واحدة يتم تأسيس تجمع، يتم اختبار نوع الفردية والجماعية أمصال مضادة التي تم تضمينها في بركة على رد الفعل بشكل فردي في التسلسل. نوع أمصال مضادة تتفاعل عموما مع النمط المصلي واحد (على سبيل المثال نوع 1 مصل يتفاعل مع النمط المصلي 1)، في حين أن مجموعة أمصال مضادة تتفاعل مع جميع الأنماط المصلية في مجموعة معينة (مثل المجموعة 22 مصل يتفاعل مع الأنماط المصلية 22F و22A). يتم التمييز بعض الأنماط المصلية داخل مجموعات أخرى باستخدام عامل أمصال مضادة (على سبيل المثال المصلي 22F يتفاعل مع عامل 22B، ولكن ليس 22C). في هذه الحالة هو استمرار اختبار مع جميع العوامل ذات الصلة أمصال مضادة حتى يتم تحديد النمط المصلي 19، 20. رد فعل الانتباج بسيطة وسريعة 14 ويمكن القيام بها في أي ليترaboratory التي هي مجهزة تجهيزا مع المجهر نوعية جيدة ومجموعة مناسبة من أمصال مضادة.

Protocol

1. إعداد تعليق خلية لكتابة

  1. باستخدام العقيمة المتاح 1 ميكرولتر حلقة، واتخاذ الاجتياح صغيرة من ليلة وضحاها ثقافة نقية جديدة من المكورات الرئوية نمت على أجار الصلبة غير انتقائية الحصان الدم وتطعيم 100 ميكرولتر القلب ضخ (مرحبا) مرق. يجب أن يظهر التعليق أن يكون مجرد عكر واضح. تستنهض الهمم بلطف أنبوب ليستحلب.
    ملاحظة: وسائل الإعلام الأخرى مثل الدماغ القلب تسريب مرق قد تكون أيضا مناسبة. بالإضافة إلى ذلك المصل (مثل تركيز النهائي من 10٪ (V / V) مصل الحصان) والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 1 ساعة قبل الاستخدام يمكن استخدامها لتعزيز التفاعل.

2. فحص كثافة تعليق خلية

كما ستستخدم تعليق خلية أعدت في الخطوة 1.1 مثل مراقبة سلبية، وينبغي التحقق من كثافة الخلية قبل إضافة الأمصال الكتابة.

  1. باستخدام حلقة 1 ميكرولتر، ونقل قطرة من اللقاح أعدت في الخطوة 1.1 في الصعود إلى غلاسق المجهر الشريحة.
  2. باستخدام زوج من ملقط، ضع ساترة دائرية صغيرة على تعليق.
  3. باستخدام إعداد المرحلة على النقيض، ومراقبة إعداد المجهر تحت التكبير 400X، للتحقق من كثافة تعليق (الشكل 1A).
    1. إذا كان اللقاح هو ثقيل جدا (الشكل 2A)، إضافة المزيد من المرق إلى تعليق خلية في الخطوة 1.1 لتخفيف ذلك. المزيج بلطف مرة أخرى.
    2. إذا كان اللقاح خفيفة جدا، على سبيل المثال، هناك <50 الخلايا المرئية في مجال المجهرية (الشكل 2B)، إضافة المزيد من البكتيريا في إعداد تعليق خلية في الخطوة 1.1 والمزيج بلطف.
      ملاحظة: مع الخبرة، وكثافة تعليق الخلية يمكن الحكم عن طريق هز وعقد يصل إلى الضوء، حيث يجب أن تظهر ليكون مجرد عكر واضح.
  4. كرر الخطوات من 2،1-2،3 حتى عدد مناسب من الخلايا واضحة في مجال المجهرية.
    ملاحظة: الشرائح الزجاج وcoverslIPS تشكل خطرا الحادة. بعد الاستخدام، والملوثة الشرائح وcoverslips مع المواد المعدية ويجب التخلص في وعاء واقية الحادة.

3. الكتابة

  1. نقل ~ 1 ميكرولتر من اللقاح استعداد (على سبيل المثال باستخدام 1 ميكرولتر حلقة) على شريحة المجهر والزجاج. تجاهل حلقة في وعاء واقية الحادة.
  2. إضافة حجم مساو (1 ميكرولتر ملء غانة) من درجة حرارة الغرفة مصل على الشريحة وتخلط جيدا مع كل من قطرات الحلقة.
  3. باستخدام زوج من ملقط، ضع ساترة دائرية صغيرة على التعليق، مع الحرص على عدم لمس قطرة. وضع ساترة على تعليق على الفور بعد إضافة أمصال مضادة لمنع السوائل على الشريحة من الجفاف.
  4. باستخدام المجهر، ومراقبة وقف في إطار المرحلة على النقيض مع 400X التكبير. ويلاحظ وجود رد فعل سلبي عندما الانتباج ضئيلة أو معدومة "تورم" من الخلايا الرئوية يمكن أن ينظر إليه في 400X التكبير، على غرار ما لوحظ في تعليق خلية المكورات الرئوية مع عدم وجود أمصال مضادة المضافة (مراقبة سلبية). ويلاحظ وجود رد فعل الانتباج إيجابية عندما تظهر خلايا الموسع أو "منتفخة" وأكثر وضوحا بالمقارنة مع الخلايا في السيطرة السلبية.
    ملاحظة: ينبغي التحقيق في التفاعلات ملتبسة أخرى، على سبيل المثال من خلال دراسة رد فعل بعد 5-10 دقيقة الحضانة في درجة حرارة الغرفة، أو بتكرار تفاعل مع أكثر مصل.
  5. إجراء الاختبار المصلي المكورات الرئوية مع المتعاقبة حمامات أمصال مضادة الفردية حتى لوحظ من ردود الفعل الإيجابية. بدلا من ذلك، وحمامات يمكن تطبيقها في 'جولات' تبعا الإصابة المحلية من الأنماط المصلية.
    ملاحظة: اختبار في "جولات" يضمن أن تحتوي على حمامات الأجسام المضادة إلى الأنماط المصلية الأكثر شيوعا هي أول اختبار، والتقليل من الجهد والتكلفة. اختبار المتزامن لعدة برك يوفر أيضا ضوابط سلبية إضافية، والتي يمكن أن تكون مفيدة في interpretation. إذا كان كل برك في 'جولة' خاصة سلبية، اختبار عزل مع الجولات اللاحقة من برك.
  6. اختبار عزل باستخدام النوع المناسب أو مجموعة مصل الواردة في المسبح رد الفعل. عند الاقتضاء، استخدام عامل أمصال مضادة لمزيد من التفريق بين المصلي.
    ملاحظة: يتم استخدام مفاتيح لأمصال مضادة للمكورات الرئوية الموردة من قبل الشركة المصنعة في اختيار المناسبة للسباحة، نوع أو جماعة أو عامل أمصال مضادة وتفسير النتائج (بما في ذلك أي ردود فعل عبر).
  7. إذا تم الحصول على نتائج سلبية مع جميع حمامات، اختبار عزل مع Omniserum كاشف (يحتوي على أجسام مضادة ضد الأنماط المصلية 91 21). إذا كان لا يزال لم يلاحظ رد فعل الانتباج إيجابية عند اختبار عزل المكورات الرئوية مع كاشف Omniserum، وهذا قد يكون بسبب عزل يعبر عن كبسولة ضئيلة أو معدومة، أو أن الأجسام المضادة ضد المصلي غير الممثلة في Omniserum. ويمكن أن تشمل هذه الفئة الأخيرة الأنماط المصلية الجديدة.
    8. </ رأ>

Representative Results

يحدث رد فعل الانتباج إيجابية عندما يربط نوع محدد الضد إلى كبسولة من المكورة الرئوية، مما يؤدي إلى تغيير في معامل الانكسار في 10. عندما ينظر إليها تحت المجهر، والبكتيريا تظهر "منتفخة" وأكثر وضوحا 14. يبين الشكل 1A الخلايا الرئوية في مرق مرحبا. عند إضافة نوع محدد المصل المضاد للتعليق البكتيرية، المكورات الرئوية تظهر "منتفخة"، الانكسار وأكثر تنوعا (الشكل 1B).

عدد كبير جدا من الخلايا البكتيرية تضاف إلى المرق قد يؤدي إلى تجميع الخلايا أو ردة فعل سلبية كاذبة. ويبين الشكل 2 قائح الخلايا الرئوية في مرق مرحبا التي هي "ثقيلة جدا" (الشكل 2A) أو "خفيفة جدا" (الشكل 2B).

08fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
الشكل 1. الانتباج رد الفعل السلبي والإيجابي. محضرات المصلي 9V المكورات الرئوية عزل مع عدم وجود مصل (1A) ومع مجموعة 9 مصل (1B) كان ينظر تحت التكبير 400X. يظهر هذا الأخير "تورم" والتقريب من الخلايا البكتيرية ينظر عادة في رد فعل الانتباج إيجابية.

الرقم 2
الشكل 2. ثقيلة جدا وخفيفة جدا قائح. محضرات تعليق خلية المكورات الرئوية التي هي ثقيلة جدا (2A) أو خفيفة جدا (2B)، عندما ينظر تحت التكبير 400X.

Discussion

خطوة حاسمة في هذه التقنية هو ضمان ويستخدم ثقافة نقية لإعداد التعليق جنبا إلى جنب مع إضافة عدد مناسب من الخلايا البكتيرية إلى المرق. تجدر الإشارة إلى أن النمو مستعمرة والتشكل على لوحات أجار يختلف بين عزلات المكورات الرئوية المختلفة. تنتج بعض المستعمرات جافة وخشنة، والذي يمكن أن يكون صعبا لسلخ مع حلقة ولا يستحلب جيدا في المرق. لهذا السبب، فإن اكتساح أكبر من البكتيريا قد تكون مطلوبة عند إعداد تعليق خلية. في أي حال، لا بد من أن الخلايا الفردية، وليس الركام، واضحة في السيطرة السلبية حتى يمكن مقارنة حجمها النسبي للخلايا مع أمصال مضادة المضافة. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الخلايا البكتيرية كثيرة جدا في ردة فعل سلبية كاذبة، حيث وجود فائض من مستضد محفظي قد تمنع رد فعل الانتباج 10. لهذا السبب، من المهم لإنشاء تعليق البكتيرية مع كثافة الخلية مناسبة (الشكل 1). وسوسيمكن الحفاظ على التقاعد لعدة أشهر عن طريق إضافة عدة قطرات من الفورمالين المركزة. وهذا يتيح أسهل اختبار دفعة وأيضا يعقم مرق الحد من مخاطر العدوى المكتسبة من المختبرات؛ على الرغم من هذا يجب أن يكون وزنه ضد المخاطر السلامة من الفورمالين والمناولة، والتي هي سامة، أكالة، مسرطنة، توعية، والقابلة للاشتعال. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن بعض العزلات تظهر ردود الفعل أضعف في وجود الفورمالين (لا تظهر البيانات).

ويتم فحص ردود الفعل الانتباج باستخدام المجهر. استخدام النقيض من المرحلة يعزز من وضوح الكبسولة. في بعض المختبرات، وينظر رد الفعل باستخدام زيت الغمر في 1،000 X التكبير 14، 16. بالإضافة إلى ذلك، استخدام بعض المختبرات وصمة عار مكافحة (الميثيلين الأزرق) لمواصلة تعزيز وضوح رد فعل إيجابي 10 و 16 و 22. ينظر إلى الطريقة المعروضة هنا من دون نفط طmmersion وتحت التكبير 400X 15، 17. هذه الطريقة سريعة وبسيطة وسهلة نسبيا لقراءة 23.

فمن المهم للحفاظ على إجراءات جيدة لمراقبة الجودة الداخلية لضمان إجراءات أمصال مضادة والاختبار في النظام. المشاركة في برنامج لضمان الجودة الخارجية غالبا ما تكون مفيدة.

وجود قيود كبيرة للتفاعل الانتباج لالمصلي من المكورات الرئوية هي التكلفة العالية للأمصال مضادة المطلوبة. ومع ذلك، وهذا هو الحد الأدنى في البروتوكول أعلاه نظرا لكمية صغيرة من مصل المستخدمة لكل رد فعل. وقد وصفت عدة طرق أخرى لالمكورات الرئوية التصنيف المصلي 23، 24. ومع ذلك، لا يزال الانتباج معيار الذهب، وتطوير أساليب جديدة يتطلب توحيد ضد رد الفعل الانتباج 23. باستخدام أمصال مضادة مناسبة، ويمكن أيضا أن تستخدم في تفاعل الانتباج لتحديد واكتب قبعات أخرىالندبة البكتيريا المنتجة 25. رد فعل الانتباج تلعب دورا محوريا في توصيف الأنماط المصلية للمكورات الرئوية الحالية والناشئة، وكذلك توفير المعلومات عن نجاعة اللقاح والتأثير طويل الأجل من التطعيم على النقل والمرض.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس (مشروع PneuCarriage، منحة 52099) وبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة فيكتوريا. بفضل ايلين دان، جانيت ستراكان، وكيم هير لقراءة نقدية للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pneumococcus (Neufeld) antisera SSI Diagnostica http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Bring all antisera to room temperature before use
Pneumococcus (Omni) antiserum SSI Diagnostica 2438 Bring all antisera to room temperature before use
Optical Microscope Leica Microsystems Leica DML
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl Copan CD175S01
Horse Blood Agar (HBA) plates Thermo Fisher Scientific PP2001 http://www.thermofisher.com.au/
Bring to room temperature before use
Heart Infusion (HI) broth Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne 40HIN Bring to room temperature before use
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm Lomb Scientific 7101 Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container
Circular glass coverslips NeuVitro GG-5
*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers
*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  3. Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
  4. Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
  5. Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  6. Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
  7. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
  8. Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
  9. Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
  10. Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
  11. Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
  12. Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
  13. Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
  14. Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
  15. Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
  16. Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
  17. Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
  18. SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
  19. Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
  20. Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
  21. Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
  22. Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
  23. Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
  24. Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
  25. Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).

Tags

علم المناعة، العدد 84،
المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; باستخدام تفاعل الانتباج
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. … More

Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction. J. Vis. Exp. (84), e51208, doi:10.3791/51208 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter