Summary
De Queliung reactie is de gouden standaardtechniek voor de serotypering Streptococcus pneumoniae. Deze techniek maakt gebruik van een microscoop en specifieke pneumokokken antisera en wordt vaak gebruikt in referentie-en onderzoekslaboratoria wereldwijd.
Abstract
Er zijn meer dan 90 verschillende capsulaire serotypes van Streptococcus pneumoniae (pneumokok het). Maar ook als een instrument voor het begrijpen van pneumokokken epidemiologie, kan kapselvorming serotypering nuttige informatie voor een werkzaamheid van het vaccin en de impact studies. De Queliung reactie is de gouden standaard methode voor het pneumokokken capsulaire serotypering. De werkwijze omvat het testen van een pneumococcen celsuspensie met gepoolde en specifieke antisera gericht tegen het capsulaire polysaccharide. De antigeen-antilichaam reacties worden microscopisch waargenomen. Het protocol bestaat uit drie stappen: 1) bereiding van een bacteriële celsuspensie, 2) mengen van cellen en antisera op een glasplaatje, en 3) het lezen van de Queliung reactie met behulp van een microscoop. De Queliung reactie is redelijk eenvoudig uit te voeren en kan worden gebruikt wanneer een geschikte microscoop en antisera beschikbaar.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumokok het) is verantwoordelijk voor de dood van naar schatting 800.000 kinderen onder de leeftijd van vijf jaar, met de last van de ziekte voornamelijk vallen in arme landen 1. Pneumokokken ziekten in ernst variëren van gelokaliseerde infecties zoals acute otitis media tot ernstige levensbedreigende infecties zoals sepsis, meningitis en longontsteking 2. Meer dan 90 capsulaire serotypen van pneumokokken beschreven 3, 4. Voor pneumococcen vaccins bieden bescherming tegen serotypen die van het merendeel van invasieve ziekten 5, 6 zijn. Echter, wijdverspreid gebruik van vaccins is geassocieerd met vervanging van serotypen in het vaccin door nonvaccine serotypen, zowel in nasofaryngeale vervoer en invasieve ziekte 7, 8. Dit benadrukt het belang van serotypering voor epidemiologischesurveillance en lange termijn vaccin impactstudies 9.
De gouden standaard werkwijze voor pneumococcen typen is het capsulaire reactietest, bekend als de Queliung reactie, eerst beschreven door Neufeld in 1902 (zie Oostenrijkse 10). Een hoge mate van overeenstemming gevonden tussen laboratoria, en tussen de Queliung reactie en andere serotypering methoden 11-13. Er zijn verschillende variaties van de Queliung reactie 10, 14-16. De hier beschreven methode is het gebruik van een teller beits of olie immersie objectief vereisen, maar eerder een druppel voorbereide monster wordt gemengd met de typen serum onmiddellijk onder 400x vergroting onderzocht.
De Queliung reactie wordt gewoonlijk uitgevoerd in de handel verkrijgbare antisera. De hier beschreven methode gebruikt minder antisera vergelijking met andere methoden 16, 17, waardoor het meer kosteneffectief. Zodra een isolat is geïdentificeerd als pneumococcus, is achtereenvolgens getest met antisera zwembaden tot een positieve reactie waargenomen. Elk zwembad antiserum bevat verschillende mengsels van antiserum opgewekt tegen 91 pneumokokkenserotypes 18. Wanneer de pool wordt vastgesteld, worden de afzonderlijke soort en groep antisera die zijn opgenomen in het reactieve pool individueel getest sequentie. Type antisera algemeen reageren met een serotype (bijv. type 1 antiserum reageert met serotype 1), terwijl groep antisera reageren met alle serotypen in een bepaalde groep (bv. Groep 22 antiserum reageert met serotypen 22F en 22A). Sommige serotypen binnen groepen zijn verder gedifferentieerd met behulp van factor antisera (bijv. serotype 22F reageert met factor 22b, maar niet 22c). In dit geval testen wordt voortgezet met alle relevante factor antisera tot serotype wordt bepaald 19, 20. De Queliung reactie is eenvoudig en snel 14 en kan in elke l worden uitgevoerdaboratory die is uitgerust met een goede kwaliteit microscoop en geschikte reeks van antiserum.
Protocol
1. Voorbereiding celsuspensie voor het typen
- Met behulp van een steriele 1 pi loop, neem een kleine zwaai van verse nachts zuivere cultuur van pneumokokken gekweekt op vaste selectieve paard bloed agar en te enten 100 pl Heart Infusion (HI) bouillon. De schorsing moet verschijnen alleen zichtbaar troebel zijn. Schud voorzichtig de buis te emulgeren.
Opmerking: Andere media zoals Brain Heart Infusion bouillon, geschikt kunnen zijn. Toevoeging van serum (bijv. een eindconcentratie van 10% (v / v) paardenserum) en incubatie bij 37 ° C gedurende ongeveer 1 uur voor gebruik worden gebruikt om de reactie verhogen.
2. Controleren Dichtheid celsuspensie
De celsuspensie bereid in stap 1.1 wordt ook gebruikt als negatieve controle en worden gecontroleerd celdichtheid vóór toevoegen van de typen sera.
- Met een 1 pi lus overdracht een daling van de bereid in stap 1.1 inoculum op een glass microscoop glijbaan.
- Met behulp van een tang, plaats een kleine ronde dekglaasje over de schorsing.
- Met fasecontrast instelling acht het preparaat microscopisch onder 400X vergroting, de dichtheid van de suspensie (figuur 1A) controleren.
- Als het inoculum te zwaar (figuur 2A), voeg meer bouillon aan de celsuspensie in stap 1.1 te verdunnen. Meng opnieuw.
- Als het inoculum te licht is, bijvoorbeeld, er <50 cellen zichtbaar in het microscopische gebied (figuur 2B), voeg meer bacteriën aan de celsuspensie bereiding in stap 1.1 en meng.
Opmerking: Met ervaring, kan de dichtheid van de celsuspensie worden beoordeeld door schudden en houden tegen het licht, waar zou blijken alleen zichtbaar troebel zijn.
- Herhaal stappen 2.1-2.3 totdat een geschikt aantal cellen zijn zichtbaar in het microscopische gebied.
Opmerking: Glasplaten en coverslips vormen een gevaar slijpsel. Na gebruik worden dia's en dekglaasjes besmet met infectieus materiaal en moet worden afgevoerd in een biohazard naaldencontainer.
3. Typen
- Overdracht ~ 1 ui van het bereide inoculum (bijvoorbeeld met een 1 pi lus) op het microscoopglaasje. Gooi de lus in de biohazard naaldencontainer.
- Voeg een gelijk volume (1 pl lusvol) van kamertemperatuur antiserum op de glijbaan en meng beide druppels goed met de lus.
- Met behulp van een tang, plaats een kleine ronde dekglaasje over de schorsing, het verzorgen van de daling niet aan te raken. Plaats het dekglaasje op de suspensie onmiddellijk na toevoeging van antiserum te voorkomen dat de vloeistof in de dia uitdroogt.
- Met behulp van een microscoop, observeert de opschorting op grond van fase-contrast met 400X vergroting. Een negatieve Queliung reactie wordt waargenomen bij onbelaste "zwelling" van het pneumococcen cellen kan worden gezien bij 400X vergroting, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in de pneumococcen celsuspensie zonder antiserum toegevoegd (negatieve controle). Een positieve Queliung reactie wordt waargenomen wanneer de cellen lijken vergrote of "gezwollen en beter zichtbaar in vergelijking met de cellen in de negatieve controle.
Opmerking: Bij onduidelijke reacties moet verder worden onderzocht, bijvoorbeeld door het onderzoeken van de reactie na 5-10 minuten incubatie bij kamertemperatuur of door herhaaldelijk reactie met meer antiserum. - Voeren pneumokokken serotypering met opeenvolgende tests van afzonderlijke antisera zwembaden tot een positieve reactie wordt waargenomen. Als alternatief kan zwembaden worden toegepast in 'rondes', afhankelijk van de lokale incidentie van serotypen.
Opmerking: Tests 'rondes' zodat de pools met antilichamen tegen de meest voorkomende serotypen eerst getest minimaliseren moeite en kosten. Gelijktijdig testen van verschillende zwembaden biedt ook extra negatieve controles, die nuttig kan zijn in interpretation. Als alle zwembaden in een bepaalde 'rond' zijn negatief, test het isolaat met latere rondes van zwembaden. - Test het isolaat met behulp van het juiste type of groep antiserum vervat in de reactieve zwembad. In voorkomend geval, gebruiken factor antisera om verder te differentiëren het serotype.
Opmerking: Sleutels tot pneumokokken antisera van de fabrikant worden gebruikt in de selectie van geschikte zwembad, type, groep of factor antisera en interpretatie van de resultaten (inclusief eventuele kruisreacties). - Indien negatieve resultaten worden verkregen met alle zwembaden, test het isolaat met Omniserum reagens (bevat antilichamen tegen 91 serotypes 21). Indien een positief Queliung reactie wordt nog niet waargenomen bij het testen van een pneumokokken te isoleren met de Omniserum reagens, kan dit zijn omdat de isolaat is de uiting van weinig of geen capsule, of dat antilichamen tegen het serotype zijn niet vertegenwoordigd in de Omniserum. Deze laatste categorie kan nieuwe serotypes. </ Ol>
Representative Results
Een positieve Queliung reactie optreedt bij typespecifieke antilichaam aan de capsule van de pneumococcus, wat leidt tot een verandering in de brekingsindex 10. Wanneer bekeken onder een microscoop, de bacteriën lijken 'gezwollen en zichtbaarder 14. Figuur 1A toont pneumococcen cellen HI bouillon. Wanneer typespecifieke anti-serum wordt toegevoegd aan de bacteriële suspensie, pneumokokken lijken "gezwollen", refractie en meer afgerond (Figuur 1B).
Te veel bacteriële cellen toegevoegd aan de bouillon kan leiden tot aggregatie van cellen of een vals negatieve reactie. Figuur 2 toont inocula van pneumokokken cellen in HI bouillon die 'te zwaar' (Figuur 2A) of 'te licht' (Figuur 2B).
08fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
Figuur 1. Negatieve en positieve Queliung reactie. Bereidingen van serotype 9V pneumococcen isolaat zonder antiserum (1A) en groep 9 antiserum (1B), werden bekeken onder 400 x vergroting. Dit laatste geeft de 'zwelling' en afronding van bacteriële cellen meestal gezien in een positieve Queliung reactie.
Figuur 2. Te zwaar en te licht inocula. Bereidingen van pneumokokken cel suspensies die te zwaar (2A) of te licht (2B) zijn, wanneer bekeken onder 400X vergroting.
Discussion
Een kritische stap in deze techniek zorgen voor een zuivere kweek wordt gebruikt om de suspensie samen met het toevoegen van een geschikt aantal bacteriecellen op de bouillon. Opgemerkt moet worden dat de groei kolonie morfologie op agarplaten verschilt per pneumococcen isolaten. Sommige produceren droge en ruwe koloniën, die moeilijk kan zijn om af te halen met een lus en niet goed emulgeren in de bouillon. Daarom kan een groter bereik van bacteriën vereist bij het bereiden van de celsuspensie. In elk geval is het noodzakelijk dat individuele cellen en niet aggregaten, in de negatieve controle duidelijk dat de relatieve grootte kan worden vergeleken met de cellen met antisera toegevoegd. Bovendien kan te veel bacteriële cellen resulteren in een vals negatieve reactie, waarin een overschrijding van kapselvorming antigeen de Queliung reactie 10 kan remmen. Daarom is het belangrijk om een bacteriële suspensie met een geschikte celdichtheid (fig. 1) te creëren. De suspensioen kan gedurende enkele maanden worden bewaard door toevoeging van enkele druppels geconcentreerde formaline. Hierdoor kan gemakkelijker batch testen en ook steriliseert de bouillon verminderen van het risico van laboratorium verworven infecties, hoewel dit moet worden afgewogen tegen het veiligheidsrisico van de behandeling van formaline, dat is giftig, bijtend, kankerverwekkend, sensibiliserende en ontvlambaar. Bovendien hebben we opgemerkt dat sommige isolaten vertonen zwakke reacties in aanwezigheid van formaline (gegevens niet getoond).
Queliung reacties worden onderzocht met behulp van een microscoop. Het gebruik van fasecontrast verhoogt de zichtbaarheid van de capsule. In sommige laboratoria wordt de reactie weergegeven met olie-immersie bij 1000-voudige vergroting 14, 16. Bovendien hebben sommige laboratoria een teller vlek (methyleenblauw) verder de zichtbaarheid van een positieve reactie 10, 16, 22. De hier gepresenteerde methode wordt bekeken zonder olie-immersion en onder 400X vergroting 15, 17. Deze methode is snel, eenvoudig en relatief gemakkelijk te lezen 23.
Het is belangrijk om goede interne kwaliteitscontrole handhaven zorgen antisera en testprocedures volledig. Deelname aan een extern programma voor kwaliteitsbewaking is vaak heilzaam.
Een belangrijke beperking van de Queliung reactie voor serotypering van pneumokokken is de hoge kosten van de antisera vereiste. Dit is echter geminimaliseerd bovengenoemde protocol vanwege de kleine hoeveelheid antiserum voor elke reactie. Verschillende andere werkwijzen zijn beschreven voor de serotypering pneumococcen 23, 24. Echter, Queliung blijft de gouden standaard en de ontwikkeling van nieuwe methoden vereist standaardisatie tegen de Queliung reactie 23. Met behulp van geschikte antisera, kan de Queliung reactie ook worden gebruikt om andere kappen identificeren en typule producerende bacteriën 25. De Queliung reactie is instrumenteel in de identificatie van de huidige en opkomende pneumokokkenserotypes, alsmede het verschaffen van informatie over de werkzaamheid van het vaccin en het effect op lange termijn van de vaccinatie op vervoer en ziekte.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation (PneuCarriage project, Grant 52.099) en operationele infrastructuur Support Program de Victoriaanse regering. Dankzij Eileen Dunne, Janet Strachan, en Kim Hazen voor het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
| Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
| Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
| Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
| Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
| *Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
| *Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |
References
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
- Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
- Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
- Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
- Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
- Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
- Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
- Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
- Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
- Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
- Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
- Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
- Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
- SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
- Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
- Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
- Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
- Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
- Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
- Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
- Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).
