Summary
תגובת Quellung היא טכניקת תקן זהב עבור serotyping Streptococcus pneumoniae. טכניקה זו מנצלת מיקרוסקופ ונסיובי pneumococcal הספציפי ומשמשת בדרך כלל התייחסות ומעבדות מחקר ברחבי העולם.
Abstract
ישנם מעל 90 קפסיד שונים קופסית של Streptococcus pneumoniae (pneumococcus). כמו גם להיות כלי להבנת האפידמיולוגיה pneumococcal, serotyping קופסית יכול לספק מידע שימושי למחקרי יעילות חיסון והשפעה. תגובת Quellung היא שיטת תקן זהב עבור serotyping קופסית ריאות. השיטה כרוכה בבדיקת השעיה תא pneumococcal עם נסיובי נקווה וספציפי המכוונים נגד פוליסכריד קופסית. תגובות נוגדן אנטיגן הם נצפו במיקרוסקופ. יש הפרוטוקול שלושה שלבים עיקריים: 1) הכנה של השעיה תא חיידק, 2) ערבוב של תאים ונסיובי בשקופית זכוכית, ו 3) קריאת תגובת Quellung באמצעות מיקרוסקופ. תגובת Quellung היא פשוטה למדי לביצוע ויכולה להיות מיושמת בכל מקום במיקרוסקופ ונסיובי מתאים זמינים.
Introduction
pneumoniae Streptococcus (pneumococcus) הוא אחראי למותם של 800,000 ילדים מוערכים מתחת לגיל חמש בשנה, עם הנטל של מחלה נופל בעיקר במדינות משאבים לעניים 1. מחלות דלקת ריאות טווח חומרה מזיהומים מקומיים כגון תקשורת אזנים חריפה לזיהומים מסכנים חיים קשים כגון אלח דם, דלקת קרום המוח ודלקת ריאות 2. מעל 90 קפסיד קופסית של pneumococci תוארו 3, 4. חיסוני pneumococcal הנוכחיים מספקים הגנה מפני הזנים אל כי הם אחראים למרבית מחלות 5 פולשנית, 6. עם זאת, שימוש נרחב בחיסונים נקשר עם החלפת קפסיד הכלולים בחיסון מזני nonvaccine, הן בכרכרה האף והלוע ומחלה פולשנית 7, 8. זה מדגיש את החשיבות של serotyping לאפידמיולוגייםמעקב והשפעת חיסון לטווח ארוך לומדים 9.
שיטת תקן זהב עבור הקלדת pneumococcal היא מבחן התגובה קופסית, המכונה תגובת Quellung, שתואר לראשונה על ידי נויפלד ב1902 (ראה 10 אוסטריים). רמה גבוהה של התאמה נמצאה בין מעבדות, ובין תגובת Quellung ושיטות serotyping האחרות 11-13. יש כמה וריאציות של תגובת Quellung 10, 14-16. השיטה המתוארת כאן אינה דורשת שימוש בכתם דלפק או עדשת טבילת שמן, אלא ירידה של דגימה מוכנה היא מעורבת עם סרום ההקלדה ובדקה באופן מיידי בהגדלה 400X.
תגובת Quellung מבוצעת בדרך כלל באמצעות נסיובי זמין מסחרי. השיטה המתוארת כאן משתמשת בפחות נסיובי לעומת שיטות אחרות 16, 17, מה שהופך את זה יותר חסכוני. ברגע שIsolאכלתי מזוהה pneumococcus, הוא נבדק ברצף עם בריכות נסיובי עד תגובה חיובית הוא ציין. כל נסיוב בריכה מכיל תערובות שונות של נסיובי הועלו נגד 91 קפסיד pneumococcal 18. ברגע שהברכה הוקמה, סוג הפרט ונסיובי קבוצה שנכללים בבריכת התגובה נבדקים בנפרד ברצף. נסיובי סוג בדרך כלל מגיב עם סרוטיפ אחת (לדוגמא סוג נסיוב 1 מגיב עם סרוטיפ 1), ואילו נסיובי הקבוצה להגיב בכל קפסיד בקבוצה מסוימת (לדוגמא: קבוצת 22 נסיוב מגיב עם קפסיד 22F ו22A). הזנים אל חלק בתוך קבוצות נבדלים נוסף באמצעות נסיובי גורם (למשל סרוטיפ 22F מגיב עם 22b גורם, אבל לא 22c). במקרה זה בדיקה היא המשיכה עם כל נסיובי הגורם הרלוונטי עד סרוטיפ נקבע 19, 20. תגובת Quellung היא פשוטה ומהירה 14 וניתן לבצעו בכל ליטרaboratory כי הוא מצויד במיקרוסקופ באיכות טוב וסט מתאים של נסיובי.
Protocol
1. הכנת תרחיף תא להקלדה
- שימוש μl 1 לולאה חד פעמית סטרילית, לקחת תנופה קטנה של תרבות הטהורה הלילה הטרי של pneumococci גדל על אגר דם סוס לא סלקטיבי מוצק ולחסן 100 μl לב עירוי מרק (HI). ההשעיה צריכה להיראות רק בעליל עכור. בעדינות להתסיס את הצינור לemulsify.
הערה: מדיה אחר כגון מרק מוח לב עירוי יכולה להיות גם מתאימה. תוספת של סרום (למשל ריכוז סופי של 10% (v / v) בסרום של סוס) ודגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעות לפני השימוש יכולה לשמש כדי לשפר את התגובה.
2. בבדיקה צפיפות של השעיה תא
גם ההשעיה התא מוכנה בשלב 1.1 תשמש כביקורת השלילית, וצריכה להיבדק לצפיפות תאים לפני הוספה סרה ההקלדה.
- באמצעות לולאת μl 1, להעביר טיפת הבידוד מוכן בשלב 1.1 על גלאסשקופיות מיקרוסקופ ים.
- בעזרת זוג המלקחיים, במקום coverslip מעגלי קטן על ההשעיה.
- שימוש בהגדרת שלב לעומת זאת, להתבונן בהכנה מיקרוסקופית בהגדלה 400X, כדי לבדוק את הצפיפות של ההשעיה (איור 1 א).
- אם הבידוד הוא כבד מדי (איור 2 א), להוסיף עוד מרק להשעית התא נעשתה בשלב 1.1 לדלל אותו. בעדינות מערבב שוב.
- אם הבידוד הוא קל מדי, לדוגמא, יש <50 תאים גלויים בתחום המיקרוסקופי (איור 2), להוסיף עוד חיידקים להכנת ההשעיה התא נעשתה בשלב 1.1 ולערבב בעדינות.
הערה: עם ניסיון, הצפיפות של ההשעיה התא יכולה להישפט על ידי רועד ומחזיק עד האור, שבו הוא אמור להופיע להיות פשוט בעליל עכור.
- חזור על שלבים 2.1-2.3 עד מספר מתאים של תאים נראים בשדה המיקרוסקופי.
הערה: שקופיות זכוכית וcoverslשב"ס מהווה סכנה חדה. לאחר שימוש, שקופיות וcoverslips מזוהמים עם חומר זיהומיות וחייבים להיות מסולקת למכל חד Biohazard.
3. הקלדה
- העבר ~ μl 1 של הבידוד מוכן (למשל באמצעות μl לולאה 1) על גבי שקופית מיקרוסקופ הזכוכית. מחק את הלולאה לתוך המכל החד Biohazard.
- הוסף נפח שווה (loopful μl 1) של נסיוב בטמפרטורת חדר לשקופית ומערבבים שני טיפות היטב עם הלולאה.
- בעזרת זוג המלקחיים, במקום coverslip מעגלי קטן על ההשעיה, נזהר שלא לגעת בטיפה. מקום coverslip על ההשעיה מייד לאחר התוספת של נסיובי כדי למנוע את הנוזל בשקופית מהתייבשות.
- באמצעות מיקרוסקופ, לבחון את ההשעיה תחת שלב בניגוד עם הגדלה 400X. תגובת Quellung שלילית נצפתה כאשר ניתן לראות מעט או ללא "נפיחות" של תאי דלקת ריאות ב40הגדלת 0x, בדומה למה שרואה בהשעית תא pneumococcal ללא נסיובי הוסיפה (בקרה שלילית). תגובת Quellung חיובית נצפתה כאשר התאים נראים מוגדלים או 'נפוח' וגלויים יותר בהשוואה לתאים בביקורת השלילית.
הערה: תגובות חד משמעיות צריכים להיחקר יותר, למשל על ידי בדיקת התגובה לאחר דגירה דקות 5-10 בטמפרטורת חדר, או על ידי חזרה על התגובה עם יותר נסיוב. - לנהל serotyping pneumococcal עם בדיקות רצופות של בריכות נסיובי בודדות עד תגובה חיובית הוא ציין. לחלופין, ניתן ליישם בברכות 'סיבובים' בהתאם לשכיחות המקומית של קפסיד.
הערה: בדיקה ב'סיבובים 'מבטיחה כי הבריכות המכילות נוגדנים לזנים אל הנפוצים ביותר נבדקות ראשונה, מזעור מאמץ ועלות. בדיקה מקבילה של כמה בריכות מספקת גם בקרות שליליות נוספות, שיכול להיות שימושי בinterpretation. אם כל הבריכות ב'סיבוב 'מסוים הן שליליות, לבדוק את הבודד בסיבובים הבאים של בריכות. - בדוק את הבודד באמצעות הסוג המתאים או נסיוב קבוצה בתוך הבריכה תגובתי. במידת צורך, להשתמש בנסיובי גורם להבדיל סרוטיפ נוסף.
הערה: מפתחות לנסיובי pneumococcal סופקו על ידי היצרן המשמשים בבחירת בריכה המתאימה, סוג, קבוצה או נסיובי גורם והפרשנות של תוצאות (כולל כל תגובות צולבות). - אם תוצאות שליליות שהושגו עם כל הבריכות, לבדוק את הבודד עם מגיב Omniserum (מכיל נוגדנים נגד 91 קפסיד 21). אם תגובת Quellung חיובית עדיין לא נצפתה כאשר בדיקת ריאות בודד עם מגיב Omniserum, זה יכול להיות בגלל הבודד מביע כמוסה קטנה או לא, או שנוגדנים נגד סרוטיפ אינם מיוצגים בOmniserum. הקטגוריה האחרונה עשויה לכלול קפסיד חדשים. </ Ol>
Representative Results
תגובת Quellung חיובית מתרחשת כאשר נוגדן ספציפי לסוג נקשר לכמוסה של pneumococcus, מה שמוביל לשינוי במקדם השבירה שלה 10. כאשר מתחת למיקרוסקופ, החיידקים מופיעים 'נפוחים' וגלוי יותר 14. איור 1A מראה תאי דלקת ריאות במרק HI. כאשר אנטי סרום ספציפי לסוג נוסף להשעית החיידקים, pneumococci מופיע 'נפוח', שבירה ומעוגלת יותר (איור 1).
תאי חיידקיים רבים מדי הוסיפו למרק עלולים לגרום להצטברות של תאים או תגובה שלילית כוזבת. איור 2 מראה inocula של תאי דלקת ריאות במרק HI כי הם 'כבדים מדי' (איור 2 א) או 'קל מדי' (איור 2).
"Src =" 08fig1highres.jpg / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
איור 1. תגובת Quellung שלילית וחיובית. תכשירים pneumococcal 9V סרוטיפ לבודד ללא נסיוב (1A) ועם קבוצת 9 נסיוב (1B), נתפסו בהגדלה 400X. זה האחרון מציג את "נפיחות" ועיגול של תאים חיידקיים לראות בדרך כלל בתגובת Quellung חיובית.
איור 2. כבד מדי וקל מדי inocula. הכנות של מתלי pneumococcal סלולריים, כי הם כבדים מדי (2A) או בהיר מדי (2B), כאשר הוא מוצג תחת הגדלה 400X.
Discussion
שלב קריטי בטכניקה זו הוא להבטיח תרבות טהורה משמשת להכנת ההשעיה יחד עם הוספת מספר מתאים של תאים חיידקיים למרק. יש לציין כי צמיחת מושבה ומורפולוגיה על צלחות אגר משתנים בין מבודד pneumococcal שונה. כמה לייצר מושבות יבשות ומחוספסות, שיכול להיות קשה לבחור את עם לולאה ולא emulsify גם במרק. מסיבה זו, ייתכן שתהיה צורך בתנופה גדולה יותר של חיידקים בעת הכנת ההשעיה התא. בכל מקרה, זוהי חובתו של תאים בודדים, ולא אגרגטים, ברורים בביקורת השלילית כל כך הגודל היחסי שלהם יכול להיות בהשוואה לתאים עם נסיובי הוסיפו. בנוסף, יותר מדי תאי חיידקים עלולים לגרום לתגובה שלילית כוזבת, שבו עודף של אנטיגן קופסית עשוי לעכב את תגובת Quellung 10. מסיבה זו, חשוב ליצור השעיה חיידקים עם צפיפות תאים מתאימה (איור 1). Susפנסיה יכולה להישמר במשך מספר חודשים על ידי התוספת של כמה טיפות של פורמלין המרוכז. זה מאפשר בדיקות אצווה קלים יותר וגם מעקר את מרק הפחתת הסיכון לזיהומים נרכש במעבדה, אם כי זה חייב להישקל מול סיכוני הבטיחות של פורמלין טיפול, שהוא רעיל ומאכל, מסרטנים, רגישות, ודליק. בנוסף, יש לנו ציינו כי חלק מבודד להראות תגובות חלשות יותר בנוכחות של פורמלין (מידע לא מוצג).
תגובות Quellung נבחנות באמצעות מיקרוסקופ. השימוש בניגוד שלב משפר את הנראות של הקפסולה. בחלק מהמעבדות, התגובה היא שנצפו באמצעות נפט טבילה ב1,000 הגדלה X 14, 16. בנוסף, חלק ממעבדות משתמשות כתם דלפק (מתילן כחול) כדי לשפר את הנראות של תגובה חיובית 10, 16, 22 נוסף. השיטה המוצגת כאן מוצגת ללא שמן-immersion ותחת הגדלה 400X 15, 17. שיטה זו היא מהירה, פשוט וקלה יחסית לקרוא 23.
זה חשוב לשמור על נהלי בקרת איכות פנימית טובים כדי להבטיח את נהלי נסיובי ובדיקות הם בסדר. השתתפות בתכנית אבטחת איכות חיצונית היא לעתים קרובות מועילה.
מגבלה העיקרית של תגובת Quellung לserotyping של pneumococci היא העלות הגבוהה של נסיובי הנדרש. עם זאת, זה ממוזער בפרוטוקול לעיל בשל הכמות הקטנה של נסיוב המשמשת לכל תגובה. בכמה שיטות אחרות כבר תיארו לserotyping pneumococci 23, 24. עם זאת, Quellung נשאר תקן הזהב ופיתוח השיטות חדשות דורש סטנדרטיזציה נגד תגובת Quellung 23. שימוש נסיובי המתאים, תגובת Quellung יכולה גם להיות מנוצל כדי לזהות ולהקליד כובעים אחריםULE ייצור חיידקים 25. תגובת Quellung היא סייע באפיון של זנים אל ריאות הנוכחיות ועתידית, כמו גם מתן מידע על יעילות חיסון ואת ההשפעה ארוך הטווח של חיסון בכרכרה ומחלות.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס (פרויקט PneuCarriage, גרנט 52099) ותכנית התמיכה בתשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני. תודה לאיילין דאן, ג'נט Strachan, וקים הייר לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
| Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
| Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
| Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
| Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
| *Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
| *Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |
References
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
- Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
- Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
- Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
- Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
- Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
- Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
- Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
- Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
- Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
- Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
- Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
- Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
- SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
- Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
- Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
- Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
- Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
- Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
- Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
- Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).
