Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

의 캡슐 혈청 형 Published: February 24, 2014 doi: 10.3791/51208
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology & Immunology, The University of Melbourne

Summary

Quellung 반응은 폐렴 구균 혈청 형을위한 황금 표준 기술이다.이 기술은 현미경 특정 폐렴 구균 항혈청을 이용하여 일반적으로 세계 기준과 연구 실험실에서 사용된다.

Abstract

폐렴 구균의 90 가지 캡슐 혈청 형 (폐렴 구균)가있다. 뿐만 아니라 폐렴 역학을 이해하기위한 도구 것으로, 캡슐 혈청 형 백신의 효능과 효과 연구를위한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다. Quellung 반응은 폐렴 구균 캡슐 혈청 형에 대한 황금 표준 방법입니다. 방법은 캡슐 형 다당류에 대한 감독 모으고 특정 항혈청과 폐렴 구균 세포 현탁액을 테스트하는 것을 포함한다. 항원 항체 반응은 미시적으로 관찰된다. 세균 세포 현탁액 1) 준비, 유리 슬라이드에 세포 및 항혈청의 2) 혼합, 3) 현미경을 사용 Quellung 반응을 읽기 : 프로토콜은 세 가지 주요 단계가 있습니다. Quellung 반응을 수행 할 합리적으로 간단하고 적당한 현미경 및 항혈청을 사용할 수 있습니다 어디든지 적용 할 수있다.

Introduction

연쇄상 구균 폐렴 (폐렴 구균)는 질병의 부담이 자원이 부족한 국가의 1에 주로 떨어지는, 매년 5 세 미만 약 80 만 어린이의 죽음에 대한 책임이 있습니다. 폐렴 구균 질환은 패혈증, 수막염과 폐렴이 심한 생명을 위협하는 감염으로 급성 중이염과 같은 지역화 감염 정도에 이르기까지 다양합니다. 폐렴 구균의 90 캡슐 혈청 형 3, 4를 설명 하였다. 현재 폐렴 구균 백신은 침습성 질환 (5, 6)의 대부분을 담당하는 혈청 형에 대한 보호 기능을 제공합니다. 그러나, 백신의 광범위한 사용은 비 인두 운송 및 침입 질병 7, 8 두, nonvaccine 혈청 형에 의해 백신에 포함 된 혈청 형의 교체와 관련이있다. 이 역학에 대한 혈청 형의 중요성을 강조감시 및 장기 백신 영향 9 연구.

폐렴 구균 입력을위한 황금 표준 메서드는 먼저 1902 년에 네우 펠드에 의해 기술 된 Quellung 반응으로 알려진 캡슐 반응 시험 (오스트리아 10 참조). 일치의 높은 수준의 실험실 사이, 그리고 Quellung 반응 및 다른 혈청 형의 방법으로 11 ~ 13 사이에서 발견되었습니다. Quellung 반응 10, 14 ~ 16의 몇 가지 변형이 있습니다. 여기서 설명한 방법은 카운터 얼룩이나 오일 침지 렌즈의 사용을 필요로하지 않으며, 오히려, 준비된 시편의 방울​​ 타이핑 혈청과 혼합하고 400X 배율 하에서 즉시 조사했다.

Quellung 반응은 일반적으로 시판되는 항혈청을 사용하여 수행된다. 여기에 설명 된 방법보다 비용 효과적인 만드는 다른 방법 (16, 17)에 비해 적게 항혈청을 이용한다. 일단 ISOL식사는 긍정적 인 반응이 관찰 될 때까지 순차적으로 항혈청 풀 테스트되어, 폐렴으로 확인됩니다. 각 풀 항혈청 91 폐렴 구균 혈청 형 (18)에 대해 제기 항혈청의 다른 혼합물을 포함합니다. 풀이 구축되면, 반응성 풀에 포함 된 개별 타입 및 그룹 항혈청은 순서대로 개별적으로 테스트된다. 그룹 항혈청 (예 : 그룹 22 항혈청은 혈청 형 22F 및 22A와 반응) 특정 그룹의 모든 혈청과 반응하는 반면 형 항혈청은 일반적으로, 하나의 혈청 (예, 타입 1 항혈청은 혈청 형 1과 반응)과 반응. 그룹 내의 일부 혈청 형은 추가 인자 항혈청 (예를 들어 혈청 형 22F는 요소 (22B)와 반응 아니지만 22C)를 사용하여 구별된다. 혈청 형이 (19, 20)을 판정 할 때까지이 경우 테스트는 모든 관련 인자 항혈청으로 계속된다. Quellung 반응은 간단하고 신속 14이며 모든 L로 수행 될 수있다aboratory이는 좋은 품질의 현미경 및 항혈청의 적절한 세트가 장착되어 있습니다.

Protocol

1. 타이핑에 대한 세포 현탁액의 준비

  1. 멸균 일회용 1 μL 루프를 사용하여 고체 비 선택적 말 혈액 한천에 성장 폐렴 구균의 신선한 하룻밤 순수 배양의 작은 스윕을 100 ㎕의 심장 주입 (HI) 배양액을 접종. 서스펜션은 눈에 띄게 혼탁 한 것으로 나타납니다. 부드럽게 유화 튜브를 교반.
    참고 : 뇌 심장 주입 국물 같은 다른 미디어도 적합 할 수있다. 혈청 (10 % 예를 들면 최종 농도 (v / v) 말 혈청) 및 사용 전 약 1 시간 동안 37 ° C에서 배양을 첨가하여 반응을 향상시키기 위해 사용될 수있다.

2. 세포 현탁액의 농도를 확인

단계 1.1에서 제조 한 세포 현탁액은 음성 대조군으로 사용되며, 입력 혈청을 추가하기 전에 셀 밀도에 대해 검사되어야한다.

  1. 1 μL 루프를 사용 GLAS 상 단계 1.1에서 제조 한 균액의 저하를 전송할의 현미경 슬라이드.
  2. 포셉 한 켤레를 사용하여 서스펜션에 작은 원형의 커버 슬립을 배치합니다.
  3. 위상차 설정을 사용하여 현탁액의 농도 (도 1a)을 확인하기 위해 현미경으로 400 배의 배율 하에서 제제를 관찰한다.
    1. 접종은 (그림 2A) 너무 무거운 경우, 희석하는 단계 1.1에서 만든 세포 현탁액에 더 많은 국물을 추가합니다. 조심스럽게 다시 섞는다.
    2. 접종이 너무 가벼운 경우에, 예를 들어, 50 세포 단계 1.1에서 만든 세포 현탁액 준비에 더 많은 박테리아를 추가하고 부드럽게 섞는다, 미세한 필드 (그림 2B)에서 볼 수 <있습니다.
      참고 : 경험을 바탕으로, 세포 현탁액의 밀도가 떨고 그냥 눈에 띄게 혼탁이 의심되는 빛에 들고으로 판단 할 수있다.
  4. 세포의 적절한 숫자가 미세한 필드에 표시 될 때까지 반복 2.1-2.3 단계를 반복합니다.
    참고 : 유리 슬라이드 및 coverslIPS는 날카로운 위험을 제시한다. 사용 후, 슬라이드 커버 슬립은 전염성 물질로 오염되어 생물의 날카로운 물건 용기에 처리해야합니다.

3. 타자

  1. 유리 현미경 슬라이드에 (예를 들어, 1 μL 루프를 사용하여) 준비된 접종 ~ 1 μl를 전송합니다. 생물의 날카로운 물건 용기에 루프를 폐기하십시오.
  2. 슬라이드에 상온 항혈청의 동량 (1 μL의 백금이)를 첨가하고 모두 루프 잘 방울 섞는다.
  3. 포셉 한 쌍을 사용하여, 드롭를 만지지 않도록주의하면서, 서스펜션에 작은 원형의 커버 슬립을 배치합니다. 마르지 슬라이드의 유체를 방지하기 위해 즉시 항혈청을 추가 한 후 정지에 커버 슬립을 놓습니다.
  4. 현미경을 사용하여, 400 배의 배율 위상차에 따라 서스펜션을 관찰합니다. 폐렴 구균 세포의 '팽창'거의 또는 전혀 (40)에서 볼 수 없습니다 때 부정적인 Quellung 반응은 관찰더 항혈청과 폐렴 구균 세포 현탁액에서 관찰되는 것과 유사한 0X 배율 (음성 대조군)을 추가했다. 대조군의 세포에 비해 세포가 확대 또는 '팽윤'더 볼 때 나타나는 Quellung 양성 반응이 관찰된다.
    참고 : 모호한 반응을 실온에서 50-10 분간 배양 한 후, 이상 항혈청과 반응을 반복하여 반응을 조사함으로써, 예를 들어 더 조사한다.
  5. 긍정적 인 반응이 관찰 될 때까지 각각의 항혈청 풀의 연속적인 테스트와 폐렴 구균 혈청 형을 실시한다. 또한, 풀은 혈청 형의 지역 빈도에 따라 '라운드'에 적용 할 수 있습니다.
    참고 : '라운드'의 테스트는 가장 흔한 혈청​​ 형에 대한 항체를 포함하는 풀을 먼저 테스트되도록, 노력과 비용을 최소화. 여러 풀의 동시 테스트는 interp에 유용 할 수있는 추가 부정적인 컨트롤을 제공합니다retation. 특히 '라운드'의 모든 풀을 부의 경우, 풀의 다음 라운드로 분리를 테스트합니다.
  6. 반응성 풀에 포함 된 적절한 유형 또는 그룹 항혈청을 사용하여 분리를 테스트합니다. 적절한 경우, 추가 혈청 형을 구별하는 요소 항혈청을 사용합니다.
    참고 : 제조업체에서 제공하는 폐렴 구균 항혈청에 키가 적절한 풀, 유형, 그룹 또는 인자 항혈청 (있는 교차 반응을 포함하여) 결과의 해석의 선택에 사용됩니다.
  7. 부정적인 결과가 모든 풀을 얻을 경우, (91 혈청 형 (21)에 대한 항체를 포함) Omniserum 시약 분리를 테스트합니다. Omniserum 시약 분리 폐렴을 테스트 할 때 긍정적 Quellung 반응이 여전히 발견되지 않는 경우 분리가 거의 없거나 전혀없는 캡슐을 발현 또는 혈청 형에 대한 항체가 Omniserum에 표시되지 않도록되어 있으므로,이 일 수있다. 후자는 새로운 혈청 형을 포함 할 수있다.
    8. </ OL>

Representative Results

형식 별 항체 굴절률 (10)의 변화로 이어지는, 폐렴 구균의 캡슐에 바인딩 할 때 긍정적 인 Quellung 반응이 발생합니다. 현미경으로 볼 때, 박테리아는 '부어'와 14 개의 표시가 나타납니다. 그림 1A는 HI 국물에 폐렴 구균 세포를 보여줍니다. 형식 별 항혈청이 세균 현탁액에 첨가 될 때, 폐렴 구균 (그림 1B), '부어'굴절 더 둥근 나타납니다.

국물에 추가 너무 많은 박테리아 세포는 세포의 응집 또는 위음성 반응이 발생할 수 있습니다. (그림 2A) 또는 '너무 빛'(그림 2B) '너무 무거운'이다 HI 국물에 폐렴 구균 세포의 접종 2는 그림.

08fig1highres.jpg "SRC ="/ files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
그림 1. 부정과 긍정적 인 Quellung 반응. 혈청 형 9V의 폐렴 구균의 준비가 더 항혈청 (1A)로 및 그룹 9 항혈청으로 분리 (1B), 400 배 배율에서 조회되었습니다. 후자는 '팽윤'전형적 Quellung 양성 반응을 보이는 세균 세포의 라운딩 나타낸다.

그림 2
그림 2. 너무 무겁고 너무 가벼운 접종. 400 배 배율에서 볼 (2A) 너무 가벼운 (2B) 너무 무거운 폐렴 구균 세포 현탁액의 준비.

Discussion

이 기술에서 중요한 단계는 순수 배양 브로스에 균체의 적절한 수를 더한 함께 현탁액을 제조하는 데 사용되는 약속된다. 그것은 한천 접시에 식민지의 성장과 형태가 다른 폐렴 구균 균주 사이에서 변화 주​​목해야한다. 일부는 루프를 잡을하고 국물에 잘 유화 없습니다 어려울 수 있습니다 건조하고 거친 식민지를 생산하고 있습니다. 세포 현탁액을 준비 할 때 그 때문에, 박테리아의 큰 청소가 필요할 수있다. 어떤 경우에는, 자신의 상대적인 크기는 항혈청으로 세포에 비교 될 수 있도록 개별 셀, 그리고 골재, 음성 대조군에 첨가 명백한 것이 필수적이다. 또한, 너무 많은 박테리아 세포의 캡슐 항원의 과잉 Quellung 반응 (10)을 억제 할 수 위음성 반응이 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, 최적 셀 밀도 세균 현탁액 (도 1)를 생성하는 것이 중요하다. 지속연금 농축 포르말린 몇 방울을 첨가하여 몇 달 동안 유지 될 수있다. 이것은 쉽게 배치 테스트를 가능하게하고 또한 실험실 취득한 감염의 위험을 감소 국물을 살균, 이것은 독성, 부식성, 발암 성, 민감하고, 가연성 처리 포르말린의 안전 위험, 비교 검토해야하지만. 또, 몇 가지 균주는 포르말린 (데이터는 도시되지 않음)의 존재 하에서 약한 반응을 보여줄 것을 관찰했다.

Quellung 반응은 현미경을 사용하여 검사합니다. 위상차의 사용은 캡슐의 시인성을 향상시킨다. 일부 실험실에서, 반응은 1,000 X 배율 (14, 16)에 기름 침수를 사용하여 볼 수 있습니다. 또한, 일부 실험실은 더 긍정적 인 반응을 10, 16, 22의 가시성을 향상시키기 위해 카운터 얼룩 (메틸렌 블루)를 사용합니다. 여기에 제시된 방법은 석유 나없이 볼mmersion 및 400X 배율 15, 17 세 미만. 이 방법은 빠르고, 간단하고 23 비교적 읽기 쉽다.

그것은 항혈청 및 테스트 절차를 순서에 보장하기 위해 좋은 내부 품질 관리 절차를 유지하는 것이 중요합니다. 외부 품질 보증 프로그램에 참여하는 것은 종종 유용합니다.

폐렴 구균의 혈청 형에 대한 Quellung 반응의 주요 제한은 필요 항혈청의 고비용이다. 그러나이 때문에 각 반응에 사용되는 항혈청의 소량으로 상기 프로토콜에서 최소화된다. 몇 가지 다른 방법은 폐렴 구균 23, 24 혈청 형에 대해 설명 하였다. 그러나 Quellung는 황금 표준 남아 새로운 방법의 개발은 Quellung 반응 (23)에 대한 표준화가 필요합니다. 해당 항혈청을 사용 Quellung 반응은 또한 다른 캡을 식별하고 입력하는 데에 이용 될 수있다ULE 박테리아 (25)을 생산. Quellung 반응이 현재 및 신흥 폐렴 구균 혈청 형의 특성뿐만 아니라, 백신의 효능 및 포가 및 질환에 대한 백신의 장기적인 영향에 대한 정보를 제공하는 수단이다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (PneuCarriage 프로젝트 그랜트 52099)와 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 지원되었다. 아일린 던 자넷 스트라 칸, 그리고 원고의 중요한 읽기 김 토끼 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pneumococcus (Neufeld) antisera SSI Diagnostica http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Bring all antisera to room temperature before use
Pneumococcus (Omni) antiserum SSI Diagnostica 2438 Bring all antisera to room temperature before use
Optical Microscope Leica Microsystems Leica DML
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl Copan CD175S01
Horse Blood Agar (HBA) plates Thermo Fisher Scientific PP2001 http://www.thermofisher.com.au/
Bring to room temperature before use
Heart Infusion (HI) broth Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne 40HIN Bring to room temperature before use
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm Lomb Scientific 7101 Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container
Circular glass coverslips NeuVitro GG-5
*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers
*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  3. Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
  4. Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
  5. Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  6. Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
  7. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
  8. Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
  9. Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
  10. Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
  11. Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
  12. Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
  13. Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
  14. Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
  15. Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
  16. Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
  17. Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
  18. SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
  19. Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
  20. Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
  21. Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
  22. Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
  23. Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
  24. Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
  25. Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).

Tags

면역학 제 84, Quellung 혈청 형 네우 펠드 폐렴
의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; Quellung 반응을 이용하여
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. … More

Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction. J. Vis. Exp. (84), e51208, doi:10.3791/51208 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter